CN111088404B

CN111088404B - 一种快速检测柯萨奇病毒a16型、肠道病毒71型的rda方法及试剂盒

Info

Publication number: CN111088404B
Application number: CN202010081188.2A
Authority: CN
Inventors: 陈翀; 刘华勇; 谢婵芳; 黄嘉恩
Original assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Pushi Lihua Technology Co ltd
Priority date: 2020-02-06
Filing date: 2020-02-06
Publication date: 2024-01-02
Anticipated expiration: 2040-02-06
Also published as: CN111088404A

Abstract

本发明公开一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒，包括特异性引物对以及RDA荧光标记探针，以实现对柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）进行安全、特异、灵敏、简便的检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。此方法提供的试剂盒可省去核酸提取步骤，并在37～42℃恒温条件下、20min内实现柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的检测，特异性为100％，非常适用于现场快速检测。与普通PCR方法相比，RDA荧光法是在恒温下反应，不需变温，不需复杂仪器，而且反应时间短。因此，本发明的方法及其试剂盒具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高、成本低廉等特点，为柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，具有广阔的应用前景。

Description

一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于RDA荧光法检测技术检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型核酸的引物对、探针及相关试剂盒。

背景技术

手足口病(Hand-foot-and-mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以柯萨奇病毒A16型(Coxsachie virus 16，CA16)和肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)最为常见。手足口病是一种婴幼儿常见的传染病，多发生于5岁以下儿童，表现为发热，口痛，厌食，手、足和口腔等部位出现小疱疹或小溃疡，多数患儿一周左右自愈。手足口病病毒可通过直接接触感染者鼻咽分泌物、唾液、疱疹液或粪便进行传播。肠道病毒感染，潜伏周期为2～10天，平均3～5天，感染者发病后，一周内传染性最强，传染期可持续数周，再加上患者多为婴幼儿，病情发展快，所以更需要早期、及时发现疾病。

传统的肠道病毒检测方法包括病毒分离检测、血清免疫检测以及PCR核酸检测等方法。其中病毒分离检测方法周期长不适用临床检测，血清免疫检测的方法结果可靠性差，PCR检测法如常规PCR、RT-PCR、实时荧光定量PCR等，在病原微生物的检测方向作用重大，但其一般需要能够进行精密控温的仪器和实验室，并且对检测人员的操作要求较高，不适用于样品的现场检测，不利于基层推广，无法满足疾病防控简单、快速、准确的检测要求。疾病的早期发现和及时诊断，对疾病的诊疗和预后判断有重要的临床意义，因此建立HFMD快速检测方法尤为重要。

随着体外核酸恒温扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的十年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术已得到快速发展，如LAMP（环介导核酸扩增技术）、HDA（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）等均可在等温条件下扩增病毒核酸。这些技术只需要温度控制装置来保持一个恒定反应温度，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的 PCR 仪的依赖。若能在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广范围的应用。及时准确地发现传染病疫情对于疾病的防治和疫情的控制具有重要意义，因此研究和开发一种能在基层诊疗机构使用，在常温下快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型两种核酸的试剂盒非常有必要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）检测技术的缺陷和不足，研究得到一种同时检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型两种核酸的RDA荧光法检测试剂盒，实现对柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的快速检测，整个检测过程，从样本处理到结果完成，仅需20-30min，比常规的检测时间大大缩短，从而提高检测效率。

本发明目的在于，提供优选后的用于检测手足口病病毒的探针，所述探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1-4任一所示，其中SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3的探针用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4的探针用于检测肠道病毒71型(EV71)。

本发明另一个目的在于，提供优选后的同时检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的引物对及探针。

所述检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的探针核苷酸序列如SEQ ID NO .1或SEQ ID NO .3，SEQ ID NO .2或SEQ ID NO .4所示。

在本专利中我们采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异。

所述核苷酸序列为SEQ ID NO .1-2的探针，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代，其具体信息如下：

CA16-P1（SEQ ID NO .1）：

5’- FAM-CTGGT[THF]AGGTTGGTGCAGTTCTGACGCACC-BHQ1 -3′

EV71-P1（SEQ ID NO .2）：

5’- FAM-CAGTG[THF]GTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTC-BHQ1 -3′

所述核苷酸序列为SEQ ID NO .3的探针5’端起第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰；所述核苷酸序列为SEQ ID NO .4的探针5’端起第32位碱基T标记CY5发光基团，第34位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第36位碱基标记BHQ2淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，其具体信息如下：

CA16-P2（SEQ ID NO .3）：

CTCCCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGG[FAM-dT][THF]GG[BHQ1-dT]GCAGTTCTGACGCACC[C3-spacer] -3’

EV71-P2（SEQ ID NO .4）：

GCGGAGCACATGCTCACAAACCAGTGGGTGG[FAM-dT]G[THF]G[BHQ1-dT]CGTAACGGGCAACTC[C3-spacer] -3’

所述引物对核苷酸序列如SEQ ID NO .5和SEQ ID NO .6、SEQ ID NO .7和SEQ IDNO .8所示，所述靶标序列如SEQ ID NO .9和SEQ ID NO .10所示，所述引物核苷酸序列具体信息如下：

CA16-F1（SEQ ID NO .5）： 5’- CTGAGTATGTACTCGGCACTATCGCAGGAG -3’；

CA16-R1（SEQ ID NO .6）： 5’- GTTGCAGTGGTTAAGAGCTGAGTCAAAAGG-3’；

EV71-F1（SEQ ID NO .7）：5’- CCATGGGCGACCATGGCAGTGGCTGCGT -3’；

EV71-R1（SEQ ID NO .8）：5’- GATTGTCACCATAAGCAGCCAATATAGG -3’。

本发明另一个目的在于，提供一种基于恒温扩增技术的检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的试剂盒。

所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应模块、阳性对照和阴性对照，以及所述的探针及所述的引物对。

优选地，所述恒温扩增反应模块为恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂。

优选地，所述恒温扩增反应混合试剂为RPA或重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）恒温扩增反应混合试剂。

优选地，所述RDA恒温扩增反应混合试剂包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的重组酶KX。

本发明另一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）的检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的试剂盒。

重组酶依赖型扩增技术（Recombinase-dependent amplification，RDA）通过以下技术方案实现：

本发明利用生物信息学方法，对批量的蛋白结构进行分析模拟和高通量虚拟筛选，并通过大量的生物学实验验证，最终找到了新的稳定性高的重组酶组合。具体地，本发明开发了一种新的重组酶组合为重组酶KX和辅助蛋白KY，所述重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，辅助蛋白KY的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

所述重组酶KX可以替代RPA反应中重组酶UvsX或RecA使用，所述KY蛋白可以替代RPA反应中UvsY蛋白使用。

重组酶KX与T4 UvsX 蛋白序列同源性为50%（201/395）。基于此重组酶组合，本团队开发了一种新的稳定性高、特异性强的重组酶依赖型扩增技术（RDA）的检测方法和检测系统。本发明中重组酶KX的制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。且基于此重组酶组合开发的扩增技术，所需引物短（18-30bp），对靶标序列的长度要求低，适用性广。进一步的，该技术对核酸靶标序列的检测特异性好、灵敏度高，可在25-42℃的恒温条件下实现高灵敏、高精度的快速分子检测，检测成本低廉、操作方便快捷，具有广阔的应用前景。

所述重组酶KX和蛋白KY来源于Escherichia phage phT4A噬菌体，Escherichiaphage phT4A属于Myoviridae科，Tevenvirinae亚科中Slopekvirus属。

所述重组酶KX和蛋白KY能够在大肠杆菌中实现大量可溶性表达。

具体地作为一种可选择的方案，其制备方法如下：

S1. 将目的基因表达片段导入表达载体中，得到重组表达载体；

S2. 将所述重组表达载体转入表达菌，得到重组工程菌；

S3. 对所述重组工程菌进行诱导培养，经过工程菌富集和超声破碎后离心得到未纯化的重组酶；

S4. 将未纯化的重组酶经过层析纯化得到重组酶KX。纯化得到的重组酶KX在低温不出现凝结或沉淀的现象。

其中，步骤S1中所述目的基因表达片段含有如SEQ ID NO.11所示的核酸序列，所述目的基因表达片段的 5’端具有BamHI 酶切位点黏性末端，所述目的基因表达片段的 3’端具有Sall 酶切位点黏性末端。

优选地，步骤S1中所述表达载体为pET-28a载体。

优选地，步骤S2中所述表达菌为大肠杆菌。

该制备工艺简单，产量和稳定性大幅提高，量产成本低。

优选地，所述重组酶依赖型扩增技术（RDA）的反应体系，即RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉试剂包括如下试剂：重组酶KX、KY蛋白、gp32蛋白、链置换DNA 聚合酶、逆转录酶、核酸外切酶、肌酸激酶、磷酸肌酸、Tris-缓冲液、醋酸钾或醋酸钠、PEG20000或PEG35000、DTT、dNTPs、dATP、探针、引物对、醋酸镁。优选地，上述反应体系还包括检测模板，如待检样本DNA或RNA。

优选地，所述反应体系的反应条件为25-42℃下反应10-60min。

更优选地，所述反应体系的反应条件为39℃反应30min。

所述重组酶依赖型扩增技术（RDA）反应体系的反应原理为：（1）RNA反转录成DNA；（2）重组酶与18-30bp 的特异性引物结合形成的重组酶-引物复合体，在双链 DNA 模板中寻找靶位点；（3）重组酶-引物复合体识别模板特异性序列后，发生定位并引发链交换，单链结合蛋白随即结合被置换的 DNA 链形成的D-Loop结构；（4）重组酶-引物复合体水解体系中的 dATP 构象改变，重组酶解离后引物 3' 端暴露并被 DNA 聚合酶识别，DNA 聚合酶按照模板序列在引物3' 端启动DNA 合成；（5）DNA 聚合酶具有链置换功能，在引物延伸的同时继续解开模板的双螺旋 DNA 结构，DNA合成过程继续进行；（6）两条引物扩增完成即形成一个完整的扩增子；（7）在反应体系中dATP水解为重组酶供能后变成dADP，磷酸肌酸能在肌酸激酶的催化下将其磷酸基转移到dADP分子中形成dATP，从而恢复反应体系中dATP的水平。上述过程不断重复，最终实现核酸的高效扩增。

基于上述反应体系构建一种基于重组酶依赖型扩增技术（RDA）检测柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）的试剂盒，包括核酸提取试剂，RDA恒温扩增反应模块，阳性对照和阴性对照，所述的探针及所述的引物对。

优选地，所述RDA恒温扩增反应模块为RDA恒温扩增反应混合试剂的冻干粉。

优选的，所述RDA恒温扩增反应模块包含重组酶KX 60-600 ng/μL、KY蛋白16-192ng/μL、单链结合蛋白gp32 100-1000 ng/μL、链置换DNA聚合酶3-100 ng/μL、核酸外切酶30~200U、肌酸激酶0.1-0.8 mg/ml、磷酸肌酸25-75 mM、逆转录酶200U、Tris缓冲液20-100mM、PEG2.5%-10%、醋酸钾或醋酸钠0-150 mM、dATP 1-5 mM、dNTPs 150-600 nM each、DTT 1-12mM、探针150nM-600nM、引物对150-600nM。

优选地，Tris-缓冲液为Tris-tricine。

优选地，Tris- tricine的浓度为100mM。

所述核酸提取试剂包括Buffer A、Buffer B。Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；阳性对照为含有柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）保守基因的pUC57质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

本发明再一个目的在于，提供一种基于重组酶依赖型扩增技术的检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的检测方法。

所述检测方法包括以下步骤：提取待测样品的核酸，以待测样品的核酸为模板，在柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）的引物对、探针及RDA冻干粉试剂、Buffer A和Buffer B存在下进行实时荧光RDA反应，根据实时荧光RDA扩增曲线分析待测样品；其中反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟。

优选的，包含以下步骤：

1）样本处理

将20μL Buffer A和5μL 阳性对照/阴性对照/待检样本（拭子液/组织研磨液/抗凝全血）震荡混匀，室温静置10-15min；

2）体系配制及检测

加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 60秒，30个循环，此处采集荧光信号，30min可完成检测；

3）结果判定

按反应体系产生的荧光值达到阈值的时间即阈值时间(Time Threshold，Tt)为进行结果判读。

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；

②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值 < 25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

c.若25min≤Tt值<30min，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是25min≤Tt值<30min，应参照阴性对照Tt值，若阴性对照Tt值≥30min，则判断为阳性。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供的试剂盒用于检测咽拭子/粪便/疱疹液/脑脊液/肛拭子/血清样本中的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型RNA，具有操作简单、快速、灵敏的特点，为柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。

2、本发明提供的试剂盒采用RDA恒温扩增检测方法，在37～42℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，不需变温，不需复杂仪器。反应时间短，20-30min即可完成反应，特异性为100％，检测灵敏度为10 copies/μl。

3、本发明RDA方法中重组酶KX 蛋白和KY蛋白在扩增过程中对靶标序列具有高度特异性，只有引物和模板序列完全互补才启动扩增，使扩增的特异性大大提高，从而实现无本底背景的高效恒温核酸扩增。

附图说明

图1为本发明实施例1重组酶筛选中4个蛋白的ATP水解活性结果图。

图2为本发明实施例1重组酶筛选中 4个蛋白的恒温扩增反应的琼脂糖凝胶图。

图3为本发明实施例1中KX蛋白三维结构图。

图4为本发明实施例1中KY蛋白七聚体三维结构图。

图5为本发明实施例1中RDA荧光法检测试剂盒检测方法建立FAM通道的结果图。

图6为本发明实施例1中RDA荧光法检测试剂盒检测方法建立ROX通道的结果图。

图7为本发明实施例2中RDA荧光法检测试剂盒FAM通道灵敏度测试结果图。

图8为本发明实施例2中RDA荧光法检测试剂盒ROX通道灵敏度测试结果图。

图9为本发明实施例3中RDA荧光法检测试剂盒FAM通道特异性测试结果图。

图10为本发明实施例3中RDA荧光法检测试剂盒ROX通道特异性测试结果图。

图11为本发明实施例4中RDA荧光法检测试剂盒37度稳定性测试结果图。

图12为本发明实施例4中RDA荧光法检测试剂盒37度稳定性测试结果图。

图13为本发明实施例4中RDA荧光法检测试剂盒37度稳定性测试结果图。

图14为本发明实施例4中RDA荧光法检测试剂盒37度稳定性测试结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

除非另有说明，本发明采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLECΜLARCLONING:A LABORATORY MANUAL )，第2次编辑( 1989 )；《当代分子生物学实验手册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECΜLAR BIOLOGY )( F .M .奥苏贝尔( F .M .Ausubel )等人编辑，( 1987 ))；《酶学方法》( METHODS IN ENZYMOLOGY )系列(学术出版公司)：《PCR2:实用方法》( PCR 2:A PRARVICAL APPROACH )( M .J .麦克弗森( M .J .MacPherson )、B.D .黑姆斯( B .D .Hames )和G .R .泰勒( G .R .Taylor )编辑( 1995 ))、哈洛(Harlow )和拉内( Lane )编辑( 1988 )《抗体：实验室手册》( ANTIBODIES ,A LABORATORYMANUAL )，以及《动物细胞培养》( ANIMAL CELL CΜLTURE )(R .I .弗雷谢尼(R .I.Freshney )编辑(1987 ))。

实施例1 一种柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）RDA荧光法检测试剂盒

（1）重组酶KX和KY蛋白的获取

已报道的重组酶UvsX稳定性差，难以量产和长期保存，为了解决这一问题，本研发团队利用生物信息学方法，通过对大批量的蛋白结构进行分析模拟，最终找到了一种新的重组酶KX及其辅助蛋白KY。

在本实施例中，研发团队通过提取重组酶结构中的关键功能位点信息，如DNA结合位点、ATP水解位点等，映射到蛋白质三维空间结构，获取二级结构信息和三级结构信息，通过综合一级结构序列的功能残基、二级结构特征和三级结构空间距离，构建了一个用于重组酶蛋白结构筛选的数据模型。通过从SwissProt、PDB数据查找在一级结构与重组酶蛋白匹配的模板，初步筛选出312个蛋白序列，然后分别进行二级结构和三级结构比对，计算相似性分值，根据相似性评分排名，模拟筛选出了15个疑似有重组酶活性的蛋白。

将这15个蛋白分别构建重组蛋白表达载体，分别表达纯化后，检测其水解ATP的能力，其中有4个蛋白有ATP水解活性，分别为KX、X-1、X-2、X-3蛋白。实验中使用萤火虫荧光素酶 ATP 生物发光检测试剂盒，严格按照说明书的操作进行实验，结果如图1所示。

将有ATP水解活性4个蛋白配制成恒温扩增体系进行扩增反应，结果如图2所示，N为阴性对照，P为加入T4UvsX扩增的阳性对照，1~4分别加入的蛋白为KX、X-1、X-2、X-3，其中只有KX蛋白有扩增活性。KX蛋白源自Escherichia phage phT4A噬菌体，其三维结构图如图3所示。

以同样的方法，我们筛选出了重组酶KX源自Escherichia phage phT4A噬菌体的辅助蛋白KY，其三维结构图如图4所示。其中辅助蛋白KY需以七聚体的形式发挥活性作用。

最终获得用于RDA扩增的重组酶KX，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；重组酶KY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQID NO.14所示。

（2）柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型检测引物及探针设计与筛选

通过NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)查找柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型全基因序列，使用Clone manager软件和BLAST进行同源性比对和序列分析，从中选择在本病原的种内保守，种间变异的序列做为靶标区域。经过对两种病毒的全基因组序列比对和同源性分析后，最终选择保守的基因作为靶标基因，以此目的片段进行RDA检测引物和探针设计。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成靶标基因DNA质粒，引物和探针序列。筛选出的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型高度保守序列如下：

柯萨奇病毒A16型靶标序列(SEQ ID NO.9)：

CGCTTTACTGGTGGCTGTGCTGCCTGAGTATGTACTCGGCACTATCGCAGGAGGGACCGGGAACGAGAATTCTCATCCTCCCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGGTTGGTGCAGTTCTGACGCACCCTTACGTGCTAGACGCAGGGATCCCTTTGAGCCAATTGACTGTGTGCCCACATCAGTGGATTAACTTAAGAACTAATAATTGTGCAACCATTATAGTTCCATATATGAATACAGTCCCTTTTGACTCAGCTCTTAACCACTGCAACTTTGGTCTACTGGTCATCCCGGTGGTGCCATTAGATTT

肠道病毒71型靶标序列(SEQ ID NO.10)：

GCACAACCCCAGTGTAGATCAGGCTGATGAGTCACTGCAACCCCCATGGGCGACCATGGCAGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGAGAAATCCATGGGACGCTCTAATTCTGACATGGTGTGAAGAGCCTATTGAGCTAGCTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACATGCTCACAAACCAGTGGGTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCTTTTATTCCTATATTGGCTGCTTATGGTGACAATCAAAAAGTTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGTGCAACAG

本实施例中采用RDA技术引物设计原则进行设计，上游引物和下游引物长度18-30bp，根据上述两种病毒靶标基因保守序列，每个靶标设计3条上游引物和下游引物，3对引物两两配对形成9个组合进行最佳引物组合筛选。

通过一系列的实验筛选和评价，确定最佳引物组合，具体为：

CA16-F1（SEQ ID NO .5）： 5’- CTGAGTATGTACTCGGCACTATCGCAGGAG -3’；

CA16-R1（SEQ ID NO .6）： 5’- GTTGCAGTGGTTAAGAGCTGAGTCAAAAGG-3’。

EV71-F1（SEQ ID NO .7）：5’- CCATGGGCGACCATGGCAGTGGCTGCGT -3’；

EV71-R1（SEQ ID NO .8）：5’- GATTGTCACCATAAGCAGCCAATATAGG -3’。

在本专利中我们采用两种方案设计RDA荧光标记探针，第一种方案为：在靶标区域选择25-35bp保守序列为探针序列，5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代。第二种方案为：探针长度为 46-52 个核甘酸，其中至少 30 个位于 THF 位点的 5’端，另外至少 15 个位于其 3’端。

根据第一种设计方案筛选到的荧光标记探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1、SEQID NO .2所示，其5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5-10位碱基中任一位置用四氢呋喃残基（THF）替代，其具体信息如下：

CA16-P1（SEQ ID NO .1）：

5’- FAM-CTGGT[THF]AGGTTGGTGCAGTTCTGACGCACC-BHQ1 -3′

EV71-P1（SEQ ID NO .2）：

5’- FAM-CAGTG[THF]GTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTC-BHQ1 -3′

根据第二种设计方案筛选到的荧光标记探针，其所述核苷酸序列分别如SEQ IDNO .3、SEQ ID NO .4所示， SEQ ID NO .3所述的荧光标记探针5’端起第31位碱基T标记FAM发光基团，第32位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第35位碱基标记BHQ1淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰；SEQ ID NO .4所述的荧光标记探针5’端起第32位碱基T标记CY5发光基团，第34位碱基用四氢呋喃残基（THF）替代，第36位碱基标记BHQ2淬灭基团，3’端进行C3-spacer阻断修饰，其具体信息如下：

CA16-P2（SEQ ID NO .3）：

EV71-P2（SEQ ID NO .4）：

通过系列实验比对，两种探针设计方案均适用于RDA荧光检测方法，在检测的灵敏度和特异性上无明显差异，其中第一种探针设计时所需靶标保守序列较短，对核酸序列要求低，本专利后续的实施例，以第一种探针CA16-P1（SEQ ID NO .1），EV71-P1（SEQ ID NO.2）为检测探针，配制RDA恒温扩增反应体系。

（3）一种柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型检测方法的建立

本专利构建一种基于重组酶依赖型扩增技术（RDA）检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的试剂盒，包括核酸提取试剂，RDA恒温扩增反应模块，阳性对照和阴性对照，其中核酸提取试剂包括Buffer A和Buffer B， Buffer A为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通，Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；RDA恒温扩增反应模块中反应体系最优配比如表1所示，包含了本实施例所述的荧光标记探针及所述的引物；阳性对照为含有柯萨奇病毒A16型（CA16）、肠道病毒71型（EV71）保守基因的pUC57质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

表1 RDA恒温扩增反应模块反应体系配比

所述反应体系的反应条件为：25-42℃下反应10-60min。

最佳反应条件为：37℃反应30min。

本实施例中对收集的经荧光定量PCR验证为柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型阳性的拭子和分泌物样本各一例，使用本专利的多重RDA荧光法检测试剂盒测试。

具体操作如下：

步骤一、样本处理。将20μL Buffer A和5μL 阳性对照/阴性对照/待检样本震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤二、体系配制及检测。加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号，30min可完成检测；

步骤三、结果判定。

②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值 < 25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

检测结果如表2和图5、图6所示，阳性对照、阴性对照符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25min，为有效结果”的内容，各样本的Tt值均小于25min，判断为阳性。

结果表明，本实施例建立的RDA荧光法检测试剂盒的检测方法能够对待测样本中的柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型RNA进行检测。

表2 试剂盒检测方法的建立

实施例2 RDA荧光法检测试剂灵敏度测试

阳性对照为含有柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型（EV71）的保守基因的pUC57质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

具体操作如下：

步骤一、将阳性对照质粒稀释到10^4c，再10倍梯度稀释分别稀释成10^3c、10^2c、10^1c。

步骤二、样本处理。将步骤一各浓度的质粒各取5μL在EP管中，同时取阴性对照5μL在另一EP管中，分别加入20μL Buffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤三、体系配制及检测。各管加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；

步骤四、结果判定。判定标准：

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值< 25min，为有效结果；

②阴性对照：无扩增曲线出现，或者Tt值≥ 25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值< 25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表3和图7、图8所示。阴性对照Tt值无扩增曲线，符合判定标准中“无扩增曲线出现，或Tt值 ≥ 25min”的内容。10^4c、10^3c、10^2c、10^1c的Tt值均 < 25min，根据结果判定标准，10^4c、10^3c、10^2c、10^1c结果均为阳性。

即，RDA荧光法检测试剂盒的灵敏度达到10个拷贝。

表3 灵敏度测试结果

实施例3 RDA荧光法检测试剂特异性测试

将临床上收集1例柯萨奇病毒16型（Coxsachie virus16，CA16 ）、1例肠道病毒71型（Enterovirus，EV71）、1例诺如病毒（Norovirus，NV）、1例腺病毒（Adenovirus，AV）、轮状病毒（Rotavirus，RV）5种共5例经荧光定量PCR验证为对应病毒阳性的样本进行检测，检验试剂盒的特异性。

具体操作如下：

步骤一、样本处理。将以上5例阳性样本各取5μL在EP管中，同时取试剂盒的阳性对照、阴性对照各5μL在新的EP管中，分别加入20μL Buffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤三、体系配制及检测。各管加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50 μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39 ℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；

步骤四、结果判定。判定标准：

②阴性对照：无扩增曲线出现，或者Tt值 ≥ 25min，为有效结果；

③被检样本：

a.若Tt值< 25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表4和图9、图10所示。阳性对照、阴性对照符合“①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，Tt值<25min，为有效结果；②阴性对照：无扩增曲线出现，或Tt值≥25mn，为有效结果”的内容。对应样本的Tt值均小于25min，判断为阳性；Tt≥30min或没有检测到信号，判定为阴性。

结果证明，本方法及所含试剂盒有优秀的特异性。

表4 特异性测试结果

实施例4 RDA荧光法检测试剂盒稳定性测试

液态的试剂需在低温下保存，且不能反复冻融。本试剂盒将RDA荧光法反应模块在真空干燥成粉状试剂，冻干后的粉状试剂能在常温下保存，节约了冷链运输和低温保存的成本，操作更为简易。本实施例对RDA 荧光检测试剂盒的稳定性进行验证。

具体操作如下：

将含有冻干试剂的八连管密封于含有干燥剂的铝箔袋中，保存于37℃恒温箱。分别于0天、30天、90天、180天，取反应试剂测试。

步骤一、样本处理。试剂盒的阳性对照/阴性对照各取5μL在EP管中，分别加入20μLBuffer A，震荡混匀，室温静置10-15min；

步骤二、体系配制及检测。各管加入25μL Buffer B，震荡混匀后将50 μL混合液加入RDA荧光法反应模块中，盖上管盖震荡离心，立即检测；反应程序为：39 ℃ 1分钟，30个循环，此处采集荧光信号；

步骤三、结果判定。判定标准：

③被检样本：

a.若Tt值< 25min，判断为阳性；

b.若Tt值≥30min，判断为阴性；

结果如表5和图11、图12、图13、图14所示。分别对保存了0天、30天、90天、180天的RDA荧光法反应模块试剂冻干粉进行测试，各个Tt值均小于25min，根据结果判定标准，本专利的试剂盒中试剂冻干后，在0天、30天、90天、180天的检测结果均为阳性。表明本专利的试剂盒中试剂冻干后，在37℃中能稳定保存至少3个月。

表5 37℃保存稳定性

/>

序列表

<110> 广州普世利华科技有限公司

<120> 一种快速检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的RDA方法及试剂盒

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> FAM标记荧光探针(SEQ ID NO .1)

<400> 1

ctggtcaggt tggtgcagtt ctgacgcacc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> FAM标记荧光探针(SEQ ID NO .2)

<400> 2

cagtgggtgg tgtgtcgtaa cgggcaactc 30

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> FAM标记荧光探针(SEQ ID NO .3)

<400> 3

ctccctacgc cactacacag cctggtcagg ttggtgcagt tctgacgcac c 51

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> FAM标记荧光探针(SEQ ID NO .4)

<400> 4

gcggagcaca tgctcacaaa ccagtgggtg gtgtgtcgta acgggcaact c 51

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物序列(SEQ ID NO .5)

<400> 5

ctgagtatgt actcggcact atcgcaggag 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物序列(SEQ ID NO .6)

<400> 6

gttgcagtgg ttaagagctg agtcaaaagg 30

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物序列(SEQ ID NO .7)

<400> 7

ccatgggcga ccatggcagt ggctgcgt 28

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物序列(SEQ ID NO .8)

<400> 8

gattgtcacc ataagcagcc aatatagg 28

<210> 9

<211> 312

<212> DNA

<213> 靶标序列(SEQ ID NO .9)

<400> 9

cgctttactg gtggctgtgc tgcctgagta tgtactcggc actatcgcag gagggaccgg 60

gaacgagaat tctcatcctc cctacgccac tacacagcct ggtcaggttg gtgcagttct 120

gacgcaccct tacgtgctag acgcagggat ccctttgagc caattgactg tgtgcccaca 180

tcagtggatt aacttaagaa ctaataattg tgcaaccatt atagttccat atatgaatac 240

agtccctttt gactcagctc ttaaccactg caactttggt ctactggtca tcccggtggt 300

gccattagat tt 312

<210> 10

<211> 356

<212> DNA

<213> 靶标序列(SEQ ID NO .10)

<400> 10

gcacaacccc agtgtagatc aggctgatga gtcactgcaa cccccatggg cgaccatggc 60

agtggctgcg ttggcggcct gcccatggag aaatccatgg gacgctctaa ttctgacatg 120

gtgtgaagag cctattgagc tagctggtag tcctccggcc cctgaatgcg gctaatccta 180

actgcggagc acatgctcac aaaccagtgg gtggtgtgtc gtaacgggca actctgcagc 240

ggaaccgact actttgggtg tccgtgtttc cttttattcc tatattggct gcttatggtg 300

acaatcaaaa agttgttacc atatagctat tggattggcc atccggtgtg caacag 356

<210> 11

<211> 1158

<212> DNA

<213> 重组酶KX核苷酸序列(SEQ ID NO .11)

<400> 11

atgtcaaaca aagcactact aaaaaaactg atcaaaaact cgaatagcca aactgcatct 60

gtactttctg aaagcgacgt attcaacaat attaccatca cgcgaacccg tgtgccgatt 120

ctgaatctgg cgttgtccgg tgcgtttaac ggtggcctaa cttctggtct tacccttttc 180

gctggcccgt ccaaacactt caaatccaac ttaggtttgc ttactgtagc ggcgtatctc 240

aaaacgtatg aagatgctgt gtgcctgttc tacgattcag aaaaaggtgt tactaaatcc 300

tatctgaaat caatgggtgt tgatccggat cgtgttgtgt atactcgtat cacgacggtc 360

gagcagttgc gtaatgacgt tgtaagccag cttaacgcgc ttgaacgcgg tgataaggtg 420

attgtattcg ttgactcagt aggcaacacg gcaagtaaaa aagaacttgc tgacgcgctt 480

tctgataacg ataaacagga tatgacgcga gcaaaagcat taaaaggtat gttccgtatg 540

gttacgcctt atctggctga cctggatatc ccgatggttt gtatctgtca tacctatgac 600

acacaagaaa tgtacagcaa gaaagttatt tctggtggta ctggtttaat gtattccgct 660

gatactgcga tcatcctggg taaacaacag gtgaaagaag gtactgaggt ggtaggttat 720

gatttcatca tgaatatcga aaaatctcga ttcgtgaaag agaaatcaaa attcccgctg 780

catgttacct atgaaggcgg tattagtatg tattctggcc ttttggatct ggcaatggaa 840

atgaactttg tacagaccgt aaccaaaggc tggcgcaacc gcgctttcct gaataccgag 900

actggcgaac tcgaagttga agaaaagaaa tggcgtgagt cagaaacaaa tagcgttgaa 960

ttctggcgtc ctctgtttac tcatcaacca ttcttgaaag ctatcgaaga aaagtataag 1020

atcccagatc gtgaaatcag tgatggttcc gcgctggaag atttatacag cactgatagc 1080

atcccagatc ctgatctgga tgatgacgat atcccagaat catttgatga tatcgaagaa 1140

aacgacgaaa ttttataa 1158

<210> 12

<211> 385

<212> PRT

<213> 重组酶KX氨基酸序列(SEQ ID NO .12)

<400> 12

Met Ser Asn Lys Ala Leu Leu Lys Lys Leu Ile Lys Asn Ser Asn Ser

1 5 10 15

Gln Thr Ala Ser Val Leu Ser Glu Ser Asp Val Phe Asn Asn Ile Thr

20 25 30

Ile Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Leu Asn Leu Ala Leu Ser Gly Ala

35 40 45

Phe Asn Gly Gly Leu Thr Ser Gly Leu Thr Leu Phe Ala Gly Pro Ser

50 55 60

Lys His Phe Lys Ser Asn Leu Gly Leu Leu Thr Val Ala Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Lys Thr Tyr Glu Asp Ala Val Cys Leu Phe Tyr Asp Ser Glu Lys Gly

85 90 95

Val Thr Lys Ser Tyr Leu Lys Ser Met Gly Val Asp Pro Asp Arg Val

100 105 110

Val Tyr Thr Arg Ile Thr Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Asp Val Val

115 120 125

Ser Gln Leu Asn Ala Leu Glu Arg Gly Asp Lys Val Ile Val Phe Val

130 135 140

Asp Ser Val Gly Asn Thr Ala Ser Lys Lys Glu Leu Ala Asp Ala Leu

145 150 155 160

Ser Asp Asn Asp Lys Gln Asp Met Thr Arg Ala Lys Ala Leu Lys Gly

165 170 175

Met Phe Arg Met Val Thr Pro Tyr Leu Ala Asp Leu Asp Ile Pro Met

180 185 190

Val Cys Ile Cys His Thr Tyr Asp Thr Gln Glu Met Tyr Ser Lys Lys

195 200 205

Val Ile Ser Gly Gly Thr Gly Leu Met Tyr Ser Ala Asp Thr Ala Ile

210 215 220

Ile Leu Gly Lys Gln Gln Val Lys Glu Gly Thr Glu Val Val Gly Tyr

225 230 235 240

Asp Phe Ile Met Asn Ile Glu Lys Ser Arg Phe Val Lys Glu Lys Ser

245 250 255

Lys Phe Pro Leu His Val Thr Tyr Glu Gly Gly Ile Ser Met Tyr Ser

260 265 270

Gly Leu Leu Asp Leu Ala Met Glu Met Asn Phe Val Gln Thr Val Thr

275 280 285

Lys Gly Trp Arg Asn Arg Ala Phe Leu Asn Thr Glu Thr Gly Glu Leu

290 295 300

Glu Val Glu Glu Lys Lys Trp Arg Glu Ser Glu Thr Asn Ser Val Glu

305 310 315 320

Phe Trp Arg Pro Leu Phe Thr His Gln Pro Phe Leu Lys Ala Ile Glu

325 330 335

Glu Lys Tyr Lys Ile Pro Asp Arg Glu Ile Ser Asp Gly Ser Ala Leu

340 345 350

Glu Asp Leu Tyr Ser Thr Asp Ser Ile Pro Asp Pro Asp Leu Asp Asp

355 360 365

Asp Asp Ile Pro Glu Ser Phe Asp Asp Ile Glu Glu Asn Asp Glu Ile

370 375 380

Leu

385

<210> 13

<211> 420

<212> DNA

<213> KY蛋白核苷酸序列(SEQ ID NO .13)

<400> 13

atgagtttga aattagaaga tctacaaaat gaacttgaaa aggatatgct gatagatccc 60

ctcaagttgc aatcagaatc agcggatatc ccgaagattt gggctaaatg gcttcgatac 120

cattcaaacg ctaagaaaaa attgatccaa cttcatgcga aaaaagaagc tgatgtgaag 180

gatcgtatgt tgtactacac cggaaggcat gacaaagaaa tgtgcgaagt ggtgtatact 240

gggactactg aaattaaaat cgcgatcgct ggggatccga aaattgtaga aaccaacaag 300

ctgatccagt attatgacat ggtggtagat ttcaccagca aagcactgga tatcgtcaaa 360

aacaaaggat actctatcaa aaacatgtta gagatccgta aattagaaag tggtgcataa 420

<210> 14

<211> 139

<212> PRT

<213> KY蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO .14)

<400> 14

Met Ser Leu Lys Leu Glu Asp Leu Gln Asn Glu Leu Glu Lys Asp Met

1 5 10 15

Leu Ile Asp Pro Leu Lys Leu Gln Ser Glu Ser Ala Asp Ile Pro Lys

20 25 30

Ile Trp Ala Lys Trp Leu Arg Tyr His Ser Asn Ala Lys Lys Lys Leu

35 40 45

Ile Gln Leu His Ala Lys Lys Glu Ala Asp Val Lys Asp Arg Met Leu

50 55 60

Tyr Tyr Thr Gly Arg His Asp Lys Glu Met Cys Glu Val Val Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Thr Thr Glu Ile Lys Ile Ala Ile Ala Gly Asp Pro Lys Ile Val

85 90 95

Glu Thr Asn Lys Leu Ile Gln Tyr Tyr Asp Met Val Val Asp Phe Thr

100 105 110

Ser Lys Ala Leu Asp Ile Val Lys Asn Lys Gly Tyr Ser Ile Lys Asn

115 120 125

Met Leu Glu Ile Arg Lys Leu Glu Ser Gly Ala

130 135

Claims

1.一种多重检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、恒温扩增反应试剂、阳性对照和阴性对照；

所述恒温扩增反应试剂包括重组酶KX 60-600ng/μL、KY蛋白16-192ng/μL、单链结合蛋白gp32100-1000 ng/μL、链置换DNA聚合酶3-100ng/μL、逆转录酶200U、核酸外切酶30～200U、肌酸激酶0.1-0.8mg/ml、磷酸肌酸25-75mM、Tris缓冲液20～100mM、PEG 2.5％-10％、醋酸钾或醋酸钠0-150mM、dATP 1-5mM、dNTPs 150-600nM、DTT 1-12mM、探针150nM-600nM和引物对150-600nM；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和2所示，其中SEQ ID NO.1的探针用于检测柯萨奇病毒A16型(CA16)，SEQ ID NO.2的探针用于检测肠道病毒71型(EV71)，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2中5’端标记发光基团，3’端标记淬灭基团，第5位碱基位置用四氢呋喃残基THF替代，其具体信息如下：

SEQ ID NO.1：5’-FAM-CTGGT[THF]AGGTTGGTGCAGTTCTGACGCACC-BHQ1-3’；

SEQ ID NO.2：5’-FAM-CAGTG[THF]GTGGTGTGTCGTAACGGGCAACTC-BHQ1-3’；

所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；靶标序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；

所述的恒温扩增反应试剂为冻干粉试剂；所述重组酶KX的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述KY蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组酶KX的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的核酸提取试剂包括BufferA、BufferB；所述BufferA为样本裂解液，含有Tris-HCL缓冲体系、NaOH、SDS、EDTA、异硫氰酸胍、Tween80、曲拉通；所述Buffer B含有Tris缓冲体系、氯化钾、氯化镁；所述阳性对照为含有柯萨奇病毒A16型(CA16)、肠道病毒71型(EV71)靶标基因的pUC57质粒，所述阴性对照为空载体pUC57质粒。

4.一种采用权利要求3所述试剂盒的非疾病诊断目的检测柯萨奇病毒A16型、肠道病毒71型的检测方法，其特征在于，包含以下步骤：

从权利要求3所述试剂盒中取BufferA分别与阳性对照、阴性对照、待检样本震荡混匀，室温静置10-15min；加入Buffer B，震荡混匀后在混合液中加入恒温扩增反应试剂，震荡离心后采集荧光信号，反应温度为25-42℃，反应时间大于10分钟，根据扩增曲线值分析待测样品。