CN101760561A - 一种ev71病毒荧光rt-pcr检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术。本发明针对EV71(enterovirus 71)病毒基因组RNA与其他肠道病毒RNA的差异，筛选到了一套与EV71的polyprotein基因保守区结合，而与其他肠道病毒(如CA16)不发生结合的引物和探针，通过优化实验方案，实现了一步法荧光RT-PCR对EV71病毒的定量检测。具有较高的特异性和灵敏性。

Description

一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术

技术领域

本发明涉及一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，可在非常短的时间内完成临床标本中EV71病毒含量的测定，属于分子生物学领域。

背景技术

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属成员。1969年首次从美国加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿的粪便标本中分离到EV71病毒此后，EV71病毒的流行范围遍及全球。据报道，EV71在世界范围内已引起十多次大的爆发与流行。目前，人类是EV71病毒唯一已知的自然宿主，病毒主要通过人群间的密切接触传播，病毒经过被感染者的口鼻分泌物、粪便和飞沫等传播。近年来，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，2008年在中国大陆爆发的手足口病(hand-foot-and-mouth disease，HFMD)便是因EV71病毒引起的。中国大陆EV71的分子流行病学资料还不完整，EV71的采样标本主要来源于手足口病患者。中国大陆已报道的10例病毒株均为C基因型。

目前诊断方法包括：

(一)病毒分离和培养

常使用RD细胞(来源于人横纹肌肉瘤细胞)来进行病毒培养，得到初步结果需要至少一周的时间。

从HFMD患儿的脑脊液、血液、疱疹液等临床标本中分离出病毒有诊断价值，但单从咽拭子或粪便中分离到病毒不能确诊。从有上述临床症状群患者的咽拭子或粪便中重复分离到同一型病毒，且从周围患同样疾病者中也检出相同的病毒，且病毒分离率远高于正常人群，则有诊断的参考价值。

(二)测定人双份血清标本的中和抗体滴度

对于HFMD的双份血清中和实验结果来说，如果恢复期血清较急性期血清EV71或CA16中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高即可确诊；如果恢复期血清较急性期血清其它肠道病毒中和抗体滴度出现4倍或4倍以上增高可证实该肠道病毒感染，是否为病因需要其它相关实验证实；如果单份血清中和抗体滴度大于1∶256也有诊断意义，血清中和抗体滴度为1∶128判定为可疑阳性。

(三)逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)

或通过电泳进行检测，或通过荧光进行检测，但因使用两步RT-PCR，操作较为复杂，而且需要的时间比较长(通常完成全部检测需要3个小时)，电泳的方法容易导致污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，用于快速、简便的检测标本中EV71病毒的含量。

1.为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：将EV71病毒C基因型序列和coxsackievirus A16(CA16)病毒等其他肠道病毒序列进行比对，选择EV71病毒的特异、保守区设计多套PCR检测引物和探针，通过筛选来确定最佳的方案，最终确定为如下序列。

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`    (Seq No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`  (Seq No.2)

探针1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(Seq No.3)

或者与上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的碱基互补序列。

其中标记探针的荧光发光基团可以为FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

2.考虑到阳性临床标本的获取受到国家法规的管制，设计合成人工RNA序列用于标准品或阳性对照品等的制备。序列如下：

AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)(Seq No.4)

3.通过实验优化，实现了一步法荧光RT-PCR检测，RT-PCR反应组分(终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1、0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT和1.5U Taq酶。

RT-PCR运行程序可以为：先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集荧光信号)。

4.通过上述设计，可制备荧光定量RT-PCR检测试剂盒，试剂盒组成包括：

组成成分(20人份/盒)           体积

One step RT-PCR反应缓冲液     380μl

混合酶                        60μl

RNA标准品1                    20μl

RNA标准品2                    20μl

RNA标准品3                    20μl

RNA标准品4                    20μl

DEPC水                        1ml

其中，One step PCR反应组分(终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5URNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶。其中，探针1的5`端标记的发光基团为FAM，在3`端标记的淬灭基团为Eclipse。

操作步骤如下：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。

本发明与现有EV71病毒核酸PCR检测方法相比，具有以下有益的技术效果：

(1)通过序列比对及引物和探针的筛选，能对中国大陆最常见的C基因型进行检测，而对于同源性较高的其他肠道病毒(如CA16)不能进行PCR扩增。

(2)使用一步法RT-PCR完成检测，快速(仅需1.5小时)、操作简便，而且尽可能的减少了污染的发生。

具体实施方式

设计和制备引物、探针序列以及人工合成RNA序列(针对Human enterovirus71病毒的保守基因polyprotein基因<GeneBank序列号为AF302996>序列)：

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`            (Seq No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`          (Seq No.2)

探针1：5`-FAM-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-Eclipse-3`(Seq No.3)人工合成RNA序列：(Seq No.4)

AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)

上述引物和探针均在宝生物工程(大连)有限公司合成。

根据人工合成RNA序列的OD值和分子质量，计算RNA的原始浓度，将该人工合成RNA序列用DEPC处理过的水溶解并稀释成1E+7copies/ml、1E+6copies/ml、1E+5copies/ml和1E+4copies/ml，依次作为RNA标准品1-4。

按如下配方配制One step RT-PCR反应缓冲液(终浓度)：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。

按如下配方配制混合酶(终浓度)：0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。

试剂盒组成为：

组成成分(20人份/盒)        体积

One step RT-PCR反应缓冲液  380μl

混合酶                     60μl

RNA标准品1                 20μl

RNA标准品2                 20μl

RNA标准品3                 20μl

RNA标准品4                 20μl

DEPC水                     1ml

本发明提供的方法形成的试剂盒未提供mRNA提取试剂，用户可根据自身要求使用传统的酚-氯仿提取方法或购买商业化的RNA提取试剂盒。

检测步骤：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量待检的RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul。

按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃20秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。

设置好标准品的定量值，仪器可直接读取检测标本的定量结果。

SEQUENCE LISTING

<110>上海复星医药(集团)股份有限公司

     上海复星医学科技发展有限公司

     剑军，何

     懿，夏

<120>一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

agagatagcc ctccctcttg aag                    23

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aagcgcatgt cggtgaatag ctcca                  25

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agatataacg ggttacgcgc aaatgcg                27

<210>4

<211>120

<212>RNA

<213>人工序列

<400>4

agagauagcc cucccucuug aaggcacacc uaacccaaau gguuaugcua acugggauau    60

agauauaacg gguuacgcgc aaaugcguag aaagguggag cuauucaccg acaugcgcuu   120

Claims (7)

1.一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于包含一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为120bp，引物和探针序列为：

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`(Seq No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`(Seq No.2)

探针1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(S eq No.3)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于标记探针5`端的荧光发光基团为可以FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，能快速、准确的对临床标本中的EV71病毒含量进行定性或定量分析。

4.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，使用人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列如下：(Seq No.4)AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)将此人工合成序列稀释至适当浓度梯度，作为EV71病毒RNA的标准品。

5.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，RT-PCR反应组分包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mMMgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1、0.5U AMV酶、0.5U RNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT和1.5U Taq酶，RT-PCR运行程序可以为：先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集荧光信号)。

6.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，可制备荧光定量RT-PCR检测试剂盒，试剂盒组成包括：

组成成分(20人份/盒)           体积

One step RT-PCR反应缓冲液     380μl

混合酶               60μl

RNA标准品            120μl

RNA标准品            220μl

RNA标准品            320μl

RNA标准品            420μl

DEPC水               1ml

其中，One step PCR反应组分(终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5U RNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶。其中，探针1的5`端标记的发光基团为FAM，在3`端标记的淬灭基团为Eclipse。

7.根据权利要求6所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，操作步骤如下：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。