CN101805802B

CN101805802B - 荧光定量pcr检测马秋波病毒的方法

Info

Publication number: CN101805802B
Application number: CN2010101464626A
Authority: CN
Inventors: 姚李四; 燕清丽; 张晓龙
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2030-04-12
Also published as: CN101805802A

Abstract

本发明公开了一种检测马秋波病毒荧光定量PCR检测方法，该方法包括引物和探针的获得及马秋波病毒的检测。本发明具有特异性好，灵敏度高等优点。目前，该检测方法国内外还没有相关的报道。

Description

荧光定量PCR检测马秋波病毒的方法

技术领域

本发明提供一种利用荧光定量PCR检测马秋波病毒的方法。

背景技术

马秋波病毒(machupo virus，MACV)属于沙粒病毒属(Arenavirus)，有包膜，毒粒呈多型性，大小为80～150nm。1963年首次在玻利维亚委内瑞拉暮鼠(Calomys callosus)中分离到的。病毒基因组为单负链RNA双环，分节段，细胞质内复制。几乎所有的沙粒病毒都能引起啮齿类动物持续性感染。马秋波病毒被视为沙粒病毒属中新世界病毒的代表之一。它与胡宁病毒(Junin)、瓜纳里托病毒(Guanarito)是引起人出血热重要病毒，主要症状表现为发烧、乏力、肌肉酸痛、厌食等，3-4天后会伴随头痛头晕、恶心和严重衰竭，潜伏期在1-2周。其高致病性和致死率不低于30％。

虽然，我国还未发现感染马秋波病毒的病例存在，但是随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。传染病在国际间的广泛传播与流行，已成为各国政府密切关注的政治问题。《国际卫生条例》、《中华人民共和国卫生检疫法》、都对传染病风险预警与快速决策做出了相应的规定。我国在“十一五”期间将传染病防控提升到战略的角度，予以高度重视。

目前，针对外来疫病的实验室快速检测技术主要采用的是免疫学检测及核酸检测技术，尤其是以PCR技术为代表的核酸检测技术，能够非常灵敏的检测到各种疫病病原体。但是由于PCR扩增技术经常带来特异性问题，各国科学家和技术人员都在PCR技术基础上，结合其它新技术，努力改善PCR技术的特异性和敏感度。近年来，基于PCR技术及ABITaqman探针杂交技术发展起来的实时荧光PCR技术极大地改善了传统PCR技术的特异性和敏感性以及抗污染的能力，已经越来越广泛的应用到各种疫病的检验检疫中。随着探针技术的进一步发展完善，一种新型的Hydro Easy Probes的出现，能够有效的改进Taqman探针本底信号高的缺点，并且进一步提高检测的灵敏度。本发明拟采用新型Hydro EasyProbes设计技术，开展马秋波病毒的荧光PCR检测试剂研究，使之成为应对外来疫病传入我国的有力武器，保障人民群众的生命安全和国家的卫生安全。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马秋波病毒的荧光定量PCR检测方法。该方法利用实时荧光定量PCR检测技术，设计了一对引物和探针对病毒样本进行实时定量检测。检测特异性好，灵敏度高。

本发明检测方法首先包括获得检测马秋波病毒的引物和探针的步骤，该步骤具体为：(1)筛选马秋波病毒S片段全长序列，进行同源性比对，在其保守区设计引物；(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并提交至GENEBANK中检测探针的特异性；(3)对待检测物进行实时定量分析。

在本发明上述方法中，所筛选的马秋波病毒可以是NCBI公布的所有马秋波病毒S片段全长序列。另外，本发明的方法中，可以利用DNASTAR软件进行序列的同源性比对。比对结果见图1。图中阴影部分为S基因序列高保守区。

在本发明引物和探针设计中，首先在比对的序列保守区设计上下游引物，根据引物设计原理，在保守区之间设计上游和下游引物，其中在上游引物的第16位存在简并性，下游引物的第14位存在简并性，设计位于扩增区域内的特异的探针，其中在探针的第1位和第30位分别存在简并性。引物和探针在合成时，探针5′端连接FAM荧光基团，3′端连接BHQ非荧光基团。引物的特异性增强。引物和探针序列见表1。

表1

表2为利用软件分析设计的引物和探针的参数。

表2

本发明检测方法其次包括检测马秋波病毒的步骤，该步骤具体为：

(1)核酸提取

病毒RNA提取选用QIAamp Mini kit 52906病毒RNA提取试剂盒。

(2)RT-PCR扩增

选用的扩增试剂盒为ABI公司AgPath-ID^TM One-step RT-PCR Kit。

反应体系组分及其体积见表3。

表3

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。

例如

45℃ 10分钟

95℃ 10分钟

本发明所述的方法中，探针与荧光基团相连，所述荧光基团为FAM-BHQ，其它荧光基团也同样适用，比如，FAM-TAMARA、MGB等。

所述RT-PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

附图说明

图1为DNASTAR软件分析S片段全长基因的同源性区域。

图2为引物灵敏度的检测结果。选用S片段全长基因中保守片段作为标准品。图中为病毒RNA各个浓度梯度扩增后，荧光强度随反应循环数变化的曲线，其中，横坐标为循环次数，纵坐标代表相应的校正后报告荧光强度(Rn)。

图3为用本发明建立的模拟添加实验进行特异性以及灵敏度检测的结果。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。

图4为用本发明建立的方法对未知样本的RNA进行检测。其中，X轴表示循环次数，Y轴表示相应的校正后报告荧光强度。

具体实施方式

实施例1：引物灵敏度检测

1)选择已知样本S片段全长基因中高保守区片段做为标准品，将其病毒RNA浓度从10^-1依次稀释到10^-10；

2)阴性对照：无核酸酶水；

3)反应体系按照表3进行配制。

检测结果如图2、表4所示。

图2中，1-9曲线分别为标准品用无核酸酶水浓度稀释度为10^-1-10^-9扩增的曲线。

表4为引物灵敏度检测结果，表中所示的数据为阳性标准品不同稀释度的CT值。其中，CT值结果为“-”表示该引物对此浓度的样本无扩增反应。NTC为阴性对照。

从图2和表4中可以看出，引物和探针检测阳性标准品的最低检出限为10^-9。

表4

实施例2：样品模拟添加实验

1)将任意鼠肺RNA添加到阳性标准品RNA，进行梯度稀释依次从10^-1-10^-10；

2)阴性对照：非阳性鼠肺RNA；

3)反应体系按照表3进行配制。

检测结果如图3、表5所示。

图3中1-5曲线分别为标准品浓度稀释度为10^-1-10^-5扩增的曲线。从图中可以看出，引物和探针检测用非阳性鼠肺RNA稀释阳性标准品的最低检出限为10^-4。

表5中所示的数据为阳性标准品用非阳性鼠肺RNA稀释为不同梯度的CT值。其中CT值结果为“-”表示该引物对此浓度的样本无扩增反应。NTC为阴性对照。

从这个实验中可以考察到阳性样品中病毒RNA的最低检出限。

表5

实施例3：引物检测未知样本

1)对采集的未知样本进行检测，筛选马秋波病毒同时监测引物的非特异性；

2)阳性对照：病毒标准品RNA浓度为10^-3；

3)阴性对照：非阳性鼠肺RNA；

4)反应体系按照表3进行配制。

检测结果见图4及表6。

图4中只出现了一条扩增曲线为阳性对照，其余样本均无扩增。反应结果为阴性。PTC为阳性对照。

表6中的数据显示，检测未知样本结果均为阴性。

表6

结果分析：

扩增反应完成40个循环之后，引物灵敏度检测到的病毒RNA浓度稀释度为10^-9；任意非阳性鼠肺RNA添加到阳性标准品RNA梯度稀释，稀释度为10^-4；从采集到的未知样品检测结果均为阴性。结果判断：

当待检测样本的Ct(阈值)≤36时即判为阳性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国检验检疫科学研究院

中国检验检疫科学研究院

<120>荧光定量PCR检测马秋波病毒的方法

<130>Cao Xuan，Jiang Zhiying，et al.Two multiplex real time TaqMan

polymerase chain reaction systems for simultaneous detecting and

serotyping of Ureaplasma parvum.Diagnost ic microbiology and

infectious disease，2007，59：109-111

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>Machupo virus probe

<400>1

raatcttcta agccagacag tgaatgccty 30

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>Machupo virus upstream primer

<400>2

accctcaatg atgaawcaaa gaaag 25

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>Machupo virus downstream prime

<400>3

aagagtgtgc tgckctgtc 19

Claims

1.一种荧光定量PCR引物用于制备检测马秋波病毒的试剂的用途，其特征在于，利用实时荧光定量PCR检测技术，通过设计一对引物和探针对病毒样本进行实时定量检测，所设计引物和探针序列如下：

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述引物和探针的获得步骤为：(1)筛选马秋波病毒S片段全长序列，进行同源性比对，并在其保守区设计引物，(2)根据PCR扩增区域内的核苷酸序列设计特异性探针，并提交GENEBANK检测探针的特异性；对马秋波病毒的检测步骤为：首先提取病毒核酸，然后进行病毒核酸的RT-PCR扩增，最后利用所设计的引物和探针对待检测物进行实时荧光定量PCR检测。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述RT-PCR扩增具体为配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述样本包括鼠肺RNA。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在所述实时荧光定量PCR检测技术中，所述探针上连接的荧光基团包括FAM-BHQ、MGB、FAM-TAMARA。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述RT-PCR反应通过使用ABI实时PCR系统、BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪来完成。