CN105525036B

CN105525036B - 一种乙型肝炎病毒hbv实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN105525036B
Application number: CN201410519528.XA
Authority: CN
Inventors: 尹华立; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2019-07-16
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN105525036A

Abstract

本发明公开了一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。包括：捕获探针、HBV引物T7引物和nT7引物、HBV检测探针、M‑MLV反转录酶和T7 RNA聚合酶等试剂。本发明方法能够高特异性、高灵敏度、低污染、快速地对含有乙型肝炎病毒的血清或血浆样品进行核酸扩增检测，具有检测效率高，准确度高的特点，能够检测出HBV的A‑I 9个基因型，具有广阔的应用前景。

Description

一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病毒的生物医学检测技术领域，具体涉及将特异性靶标捕获技术和实时荧光核酸恒温扩增检测技术结合的乙型肝炎病毒(HBV)的核酸恒温扩增检测中使用的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)，肝癌患者中，75％以上由HBV所致。

我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导致的肝硬化和肝癌死亡约30余万例，新发乙型肝炎病例约50～100万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。

HBV已发现有9个基因型(A～I)，每个基因型又可分为不同亚型，且存在基因型之间的重组现象。我国已发现A、B、C、D基因型，中东部地区以B、C基因型占优势，其中北方地区(长江以北)主要为C2亚型；南方大部分地区流行株为B2、C2、C1亚型，并有少部分D基因型；西部地区尤其是新疆地区以D基因型为主，西部藏族居民中以C/D重组基因型为主；A型和B1亚型罕见。

乙型肝炎病毒的主要检测方法有：血清学检查、生化学检查及分子生物学法。病毒分离培养和血清学方法，繁杂费时，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的需要。PCR法需要经历几十个温度变化的循环过程，扩增反应时间长，且产物为DNA，易污染。

核酸检测主要涉及核酸提取与和核酸扩增检测。

目前血清和血浆中病毒核酸的提取方法主要有煮沸裂解法、离心柱提取法及磁珠法。煮沸裂解法不能有效去除抑制成分，且易于污染；柱提取法操作过程复杂，效率低，且不易于实现自动化；磁珠法能快速实现核酸的分离与纯化，易于实现自动化操作。

国内已有多种基于实时荧光PCR技术检测HBV-DNA的试剂盒应用于实际检测中，这些试剂盒所提供的HBV-DNA提取方法主要是煮沸法，但是，有很多不足之处：1)特异性不是很好，不能检测出所有HBV的九个基因型(A-I)；2)核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失，同时由于采用了水浴或金属浴的高温加热步骤，容易造成气溶胶污染。3)检测灵敏度低，大部分约在500IU/ml左右；

实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT)是一种直接针对核酸(DNA和RNA)快速扩增RNA并检测的方法，与检测DNA的实时荧光PCR相比，不同之处，前者检测体系多了一个逆转录反应的步骤，核酸扩增在一个温度下进行(42℃)，无需热循环。采用M-MLV逆转录酶和T7RNA聚合酶进行核酸扩增，相对于其它核酸扩增技术，反应抑制物更少，能有效减少假阴性结果。然而，SAT技术在不同种类病毒的检测中应用所面临的问题各不相同，需要具体分析病毒的特性结合实际样本溶液基质进行专门、针对性地设计。目前尚无针乙型肝炎病毒DNA进行实时荧光恒温扩增检测的试剂盒，进一步，能同时对乙型肝炎病毒DNA和RNA的提取、并扩增的核酸恒温扩增检测产品也未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速，高准确度，污染易控，设备简单，成本低的乙型肝炎病毒DNA检测试剂盒，同时进一步提供可实现HBVDNA和RNA同步扩增检测的产品。此外，本试剂盒也解决了现有技术中的乙型肝炎检测试剂盒特异性及敏感性不好，不能检测出所有HBVA-I九个基因型的技术问题。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光恒温扩增检测试剂盒，包含有一条乙型肝炎病毒的靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的引物T7和nT7，和一条用于与所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的检测探针；所述检测引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列1所示，nT7引物序列如序列表中序列2所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

所述试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

所述试剂盒包含的捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

进一步，所述的试剂盒所包含的捕获探针为序列表中序列4与序列5的混合物，按1:1～6:1比例(v/v)混合组成。

此外，所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

进一步，所述试剂盒还包含有HBV内标和内标检测探针，可以有效监控假阴性的存在；所述HBV内标为乙型肝炎病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

再进一步，所述试剂盒包含病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HBV扩增检测液、SAT酶液、HBV阳性对照、HBV阴性对照、HBV内标和稀释液，其中：

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液1：含NaCl和SDS；

洗涤液2：矿物油；

HBV扩增检测液：含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HBV检测探针和内标检测探针；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

HBV阳性对照；含乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀释液或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；

HBV阴性对照：不含有乙型肝炎病毒靶标核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血浆溶液；

HBV内标：HBVICRNA稀释物；

稀释液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES。

再进一步，所述的试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)病毒核酸提取液：HEPES250-800mM，LLS4-10％，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

(2)洗涤液1：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1％SDS，EDTA1-10mM；

(3)洗涤液2：矿物油；

(4)HBV扩增检测液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10％，KCl5-40mM，HBV引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；进一步，T7引物优选浓度为2.5pmol/反应，nT7引物优选浓度为2.5pmol/反应，HBV检测探针优选浓度为5pmol/反应，内标检测探针优选浓度为5pmol/反应；

(5)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPESpH7.5、10-100mMN-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mMzincacetate、10-100mMtrehalose、40-200mMTris-HClpH8.0、40-200mMKCl、0.01-0.5mMEDTA、0.1-1％(v/v)TritonX-100和20-50％(v/v)glycerol；

(6)HBV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL的乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀释物或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；

(7)HBV阴性对照：不含有乙型肝炎病毒靶标核酸序列或不含有乙型肝炎病毒的血清或血浆溶液；

(8)HBV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mLHBVICRNA的稀释物；

(9)稀释液：25-250mMHEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄。

所述乙型肝炎病毒HBV核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，为以下表示的物质之一：

(1)用于扩增HBV靶标核酸的HBV检测引物T7和nT7，T7引物序列如序列表中序列1所示，nT7引物序列如序列表中序列2所示；

(2)用于与在T7RNA聚合酶作用下HBV靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HBV检测探针，所述HBV检测探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

(3)用于与HBV核苷酸成竞争性的内标核苷酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的HBV内标检测探针，所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

本发明提供了一种乙型肝炎病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，使用该试剂盒进行检测，与现有HBV检测相比，具有以下优点：

(1)本发明试剂盒针对HBVA-I9个基因型进行靶标筛选、引物设计，涵盖范围广，具有高准确度、高特异性，可以实现对血清、血浆等样本中的乙型肝炎病毒进行快速、准确测定。

(2)本发明试剂盒针对血清、血浆基质特点，对不同周期产生的HBVDNA和RNA进行了提取优化，设计了针对性的捕获探针及提取体系，一方面避免了现有技术中提取DNA的加热、离心等操作，简化实验步骤，易于实现自动化，对检测灵敏度有了较大提高；另一方面，实现了同步提取HBV的DNA和RNA的操作。

(3)本发明试剂盒中加入内标，可进一步有效监控假阴性的存在，提供更准确的检测结果。

(4)本发明将核酸的扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，整个过程没有升温、降温过程，大大缩短了扩增及检测时间；同时降低了对所用PCR仪的设计和生产成本。

(5)本发明扩增产物为RNA，RNA在自然界中极易降解，相对PCR扩增DNA而言，污染易控，交叉影响小。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1比对组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图2本发明组的引物对和探针序列的荧光检测结果；

图3为临床血清样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图4为临床血清样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图5为临床血浆样本SAT检测的靶标荧光检测结果；

图6为临床血浆样本SAT检测的内标荧光检测结果；

图7临床血清样本PCR的检测结果；

图8为中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品(阴性符合率)SAT检测结果；

图9为中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品(阳性符合率)SAT检测结果；

图10为中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品(灵敏度)SAT检测结果；

图11为中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品L0稀释至30IU/mlSAT检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对所要求的本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

HBV包含A-I9个基因型，要覆盖如此多的基因型，本发明人经过长期而深入的研究，充分考虑9个基因型检测的通用性，选择乙肝病毒表面抗原S基因的保守区域片段作为检测靶标，经过大量筛选和验证，开发了高特异性，高灵敏的专用引物对，和相应的检测探针，使用该特定的引物序列可对乙型肝炎病毒的核酸同时进行扩增，具有高特异性，高灵敏等优异优点，可以用于准确地检测乙型肝炎病毒。此外，HBV病毒与其他病毒复制不一样，其以RNA前病毒介导复制DNA。实际上HBV是一种逆转录病毒，HBV的复制是离不开逆转录的，HBV复制经HBVcccDNA会产生多个长度不一的mRNA。因此本发明针对机理，结合样本基质，对核酸提取体系进行了针对性的设计及优化，充分利用特异性捕获探针，实现对HBV核酸(DNA和RNA)的高效捕获和提取。

本发明通过设计专用的捕获探针，高效、特异性捕获乙型肝炎病毒DNA和RNA；核酸扩增使用M-MLV和T7RNA多聚酶来同时实现，乙型肝炎病毒的靶标可以是样本中双链DNA中的负(-)链，也可在SAT扩增反应中产生；同样靶标也可以是RNA负(-)链。通过M-MLV反转录酶产生DNA拷贝，该DNA拷贝进一步通过T7RNA多聚酶产生多个RNA拷贝，通过带有荧光标记的优化检测探针对扩增产物RNA拷贝特异结合产生荧光，并由检测仪器捕获荧光信号。

试剂盒

本发明提供了一种乙型肝炎病毒的核酸检测试剂盒，包括：

捕获探针，一对扩增乙型肝炎病毒的特异性T7和nT7的引物对，以及一条检测探针。

所述的捕获探针(TCO，TargetCaptureOligo)，可与乙型肝炎病毒的靶标核酸序列特异结合，在有HBV内标时，其还可与该HBV内标序列特异结合；所述捕获探针的一种优选例，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，另一种优选例的捕获探针序列如序列5所示，此外，还有一种优选例是序列4与序列5按1:1-1:6(v/v)的混合组合；

所述引物对是一对用于在M-MLV反转录酶作用下产生HBV靶标核酸的DNA拷贝的HBV检测引物，由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列1所示，nT7引物序列如序列表中序列2所示；

所述检测探针是一条用于与在T7RNA聚合酶作用下根据所述SH靶标核酸的DNA拷贝产生的RNA拷贝特异结合的检测探针，其核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

为便于进行结果分析，试剂盒还包括：一条内标检测探针和HBV内标，HBV内标为乙型肝炎病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，在扩增体系引入内标，可以预防由于样本中可能存在的干扰物质导致的假阴性，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

所述试剂盒中还可以包括一种或多种酶。如M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶。在另一优选例中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于酶液中，所述捕获探针存在于核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

在另一优选例中，所述试剂盒包含以下组分：病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HBV扩增检测液、SAT酶液、稀释液、HBV阳性对照、HBV阴性对照、HBV内标和稀释液，各组分说明如下：

(1)病毒核酸提取液：用于提取和纯化乙型肝炎病毒核酸DNA和RNA，为含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

(2)洗涤液1：用于磁珠水相清洗，NaCl50-500mM和1wt％SDS的水溶液；

(3)洗涤液2：用于磁珠有机相清洗的矿物油；

(4)HBV扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP0.1-10mM、NTP1-20mM、T7引物2.5pmol/反应、nT7引物2.5pmol/反应、HBV检测探针5pmol/反应和内标检测探针5pmol/反应的水溶液；

(5)SAT酶液：SAT扩增所需多酶反应体系，主要含M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应；

(6)HBV阳性对照：含乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸的稀释液或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；

(8)HBV内标：10⁴-10⁸拷贝/mlHBVICRNA的稀释物；

(9)稀释液：为表面活性剂，含5-50mM(NH₄)₂SO₄和25-250mMHEPES的水溶液。

对照物

由于SAT扩增易受多种因素影响而使扩增失败，使试剂盒使用人员判断失误得出错误的结论，因此，在本发明的试剂盒中还可以设置对照物，以排除检测结果失真的情况。

本发明中可以设置的参照物包括：HBV阳性对照、HBV阴性对照和HBV内标中的一个或多个对照物。

HBV阳性对照可以是为体外转录的RNA，也可以是乙型肝炎病毒表面抗原基因的单链DNA。通过检测阳性对照，可证明试剂盒检测方法及材料无误，保证检测的准确性，同时可以监测每次检测的重复性和稳定性及试剂盒批次间的差异。

HBV内标可以是体外转录的RNA，不具有生物学活性。HBV内标作为靶标核酸的竞争性内标，可以作为参照物，用于防止假阴性结果的发生，通过检测加入有内标的样本，可了解整个扩增反应体系是否受抑制，更好的提示假阴性。

阴性对照可排除假阳性，在正确使用试剂盒检测方法和材料情况下，可保证检测的特异性。

在另一HBV阳性对照中核酸，可以通过多种方法制备所得，其中一种制备方法如下：

使用一条被磷酸化的PCR引物，与一条不被磷酸化的PCR引物，进行PCR扩增出HBV表面抗原基因片段(其核苷酸序列如序列表中SEQNo.8所示)；纯化后的PCR产物用核酸外切酶消化，被磷酸化的引物扩增链不被切割，消化后酶被加热灭活，从而获得单链DNA。

在另一制备方法中，所述HBV体外转录RNA通过以下方法制备：

(1)用化学合成法合成一段HBV表面抗原基因片段(其核苷酸序列如序列表中SEQNo.8所示)；

(2)将片段克隆到-T载体中，构建HBV阳性质粒；

(3)HBV阳性质粒转化到大肠杆菌DH5α中，命名为-T-HBV菌株，贮存于-70℃；

(4)从-T-HBV菌株中提取-T-HBV质粒，将质粒进行转录RNA纯化去除DNA，并定量、鉴定HBV体外转录RNA(SEQNo.9)。

HBV内标中的体外转录的HBVICRNA，采用化学合成法合成一段除探针检测区域序列不同，其他序列基本同HBV靶标序列区域，按上述体外转录的方法获得内标RNA(SEQNo.6)。

检测方法：

将本发明乙型肝炎病毒核酸恒温扩增检测试剂盒用于检测血清、血浆等样本中的乙型肝炎病毒核酸检测的操作步骤是：

1、对照品准备

1.1内标：取400μL稀释液，加入10μLHBV内标，混匀备用。

1.2阳性对照：取250μL阴性对照，加入10μL阳性对照品，混匀备用。

1.3阴性对照：取250μL阴性对照备用。

2、核酸提取

2.1在样品处理管中加入200μl-800μl病毒核酸提取液、250μl-1ml血清样本和10μl内标溶液，用病毒核酸提取液裂解待测样品中的乙型肝炎病毒，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟。

2.2将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液1振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液1和200μl洗涤液2，振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠。

2.3将样品处理管移离磁珠分离装置，管中为磁珠-核酸复合物，备用(此步应清晰可见磁珠)。

3、SAT扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用ABI7500型PCR仪60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。

3.3将微量反应管快速转至恒温荧光检测仪器(ABI7500荧光定量仪)，42℃反应60分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测60次；荧光素通道选择FAM通道(靶标信号检测，F1)和VIC通道(HEX和VIC波长相近，内标信号检测，F2)。

4、结果判定

根据SAT扩增结果得到的曲线，设定阀值线，读取dt值，判定结果。

阳性结果判断：

F1通道dt≤50，F2通道有或者无数值的样本为阳性。

阴性结果判断：

F1通道dt无数值或为50，同时F2通道dt≤50的样品为阴性。

其中，dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

与现有的HBV检测相比，本发明具有以下优点：

(1)高特异性、高纯度、低污染：针对血清与血浆等基质样本中病毒特性，优化出适合血清与血浆裂解HBV病毒的病毒核酸提取液，同时设计出HBV靶核酸的优选捕获探针，可高效、特异性捕获乙型肝炎病毒的核酸(HBVRNA和DNA)。同时，由于采取封闭式的恒温放大检测系统，整个反应过程中无需打开反应体系，因而避免了扩增子的污染。

(2)快速检测：核酸(HBVRNA和DNA)扩增与检测在同一封闭体系中同步进行，而且整个过程中没有温度的升降及循环，因而所需时间大大缩短，扩增检测只需要50分钟。

(3)污染易控：与实时荧光PCR相比，本发明的扩增产物是RNA，RNA在自然界中极易降解，所以污染控制较容易。

(4)设备简单，成本低：与实时荧光定量PCR相比，本发明所用的仪器无需升降温循环，因而设计和生产成本大幅降低。

综上所述，本发明试剂盒能够提取并检测血清或血浆样本中的乙型肝炎病毒核酸(HBVRNA和DNA)，具有特异性高、灵敏度高(可达30IU/ml)、污染低(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)及快速检测(50分钟完成扩增检测)的特点，将在乙型肝炎病毒早期感染的临床诊断中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例中所用主要原料SAT酶液、HBV核酸(单链DNA或体外转录RNA)及内标的体外转录RNA由美国RDBiosciences公司提供，7500型PCR仪为美国ABI公司产品，NTPs、dNTPs等试剂和其他仪器均为常规可商购产品。

实施例1、用于实时荧光核酸恒温扩增检测乙型肝炎病毒HBV的专用引物和探针的设计

本发明选择乙肝病毒表面抗原S基因(其核苷酸序列如序列表中序列8所示)进行引物探针设计，得到如下具体序列：

(1)用于扩增乙型肝炎病毒靶多核苷酸的nT7引物及T7引物，nT7引物核苷酸序列为：5’-GATGTGTCTGCGGCGTTTTA-3’(序列2)；T7引物核苷酸序列为：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGAACAAACGGGCAACATACCTT-3’(序列1)；

(2)用于检测乙型肝炎病毒靶多核苷酸的检测探针，其序列为：5’-CCAUCCUGCUAUGCCUCGAUGG-3’(序列3)，5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记。

在引物、探针设计过程中，会产生了诸多对引物和探针序列，比如T7引物序列：5’aatttaatacgactcactatagggagaTAGAGGACAAACGGGCAACAT3’，nT7引物序列：5’ATATTCCTCTTCATCCTGCTGCT3'，检测探针序列为5’cccgUUGGUUCUUCUGGAcggg3’(5’端用FAM荧光标记，3’端用DABCYL荧光标记)，以及SEQIDNO：1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3等。将上述各序列用专利201110071284.X中所述的反应体系进行扩增，比对灵敏度检测并选取较优者。

结果显示如图1，图2(图1为比对组，图2为本发明组)。比对组的灵敏度可检测到10²copies/反应，而本发明组的灵敏度可达10copies/反应，从扩增曲线也可看到，本发明组优于比对组。

上述结果表明，SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物对和检测探针是检测灵敏度极高的最佳引物、探针。

为便于进行结果分析，还配合试剂盒中增加的HBV内标(SEQIDNO:4)，设计了内标检测探针，HBV内标与HBV靶标核苷酸拥有相同的引物结合区，两引物之间的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，所述HBV内标可通过HBV靶标模板定点突变构建获得，可与捕获探针特异性结合，所述内标检测探针为与HBV检测探针序列、荧光标记不同的探针，所述的内标检测探针的核苷酸序列为

5’CCGACGCUCACCACGCUCCAGUCGG3’(SEQIDNO:5)，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团。

实施例2制备乙型肝炎病毒(HBV)的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

利用实施例1所提供的专用引物和探针，得到本发明乙型肝炎病毒的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒。该试剂盒包含有捕获探针(TCO，TargetCaptureOligo)、T7引物、nT7引物、检测探针、内标检测探针、内标、M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶等组分，其中：

捕获探针核苷酸序列为SEQIDNO:4、T7引物序列SEQIDNO:1、nT7引物序列为SEQIDNO:2、检测探针核苷酸序列为SEQIDNO:3，以及内标检测探针核酸序列为SEQIDNO:7。

所述的捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和HBV检测探针、内标检测探针存在于HBV扩增检测液中，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中。具体地将，所述试剂盒包含以下组分：病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HBV扩增检测液、SAT酶液、HBV阳性对照、HBV阴性对照、HBV内标和稀释液；其中，

(1)病毒核酸提取液：含捕获探针1-50μΜ、磁珠50-500mg/L的水溶液；

(2)洗涤液1：含NaCl50-500mM和1wt％SDS的水溶液；

(3)洗涤液2：用于磁珠有机相清洗的矿物油；

(4)HBV扩增检测液：含SAT所需组分，包含dNTP0.1-10mM、NTP1-20mM、HBV引物对，HBV探针及HBV内标探针浓度在2.5-10pmol/反应的水溶液；

(8)HBV内标：10⁴-10⁸拷贝/mlHBVICRNA的稀释物；

更具体地将，本试剂盒的组成如下：

(2)洗涤液1：HEPES5-50mM，NaCl50-500mM，1％SDS，EDTA1-10mM；

(3)洗涤液2:矿物油；

(4)HBV扩增检测液：Tris10-50mM，MgCl210-40mM，dNTP0.1-10mM，NTP1-20mM，PVP401-10％，KCl5-40mM，T7引物、nT7引物浓度为2.5pmol/反应、HBV检测探针5pmol/反应和内标检测探针5pmol/反应；

(6)HBV阳性对照；含10⁵-10⁸拷贝/mL乙型肝炎病毒表面抗原基因核酸稀释物或乙型肝炎病毒体外转录RNA的稀释物；

(8)HBV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mLHBVICRNA(序列如序列表中序列6所示)稀释物；

(9)稀释液：含有硫酸铵和HEPES缓冲液的溶液，具体包含HEPES25-250mM，(NH₄)₂SO₄5-50mM。

实施例3临床血清、血浆样本的实时荧光核酸恒温扩增检测

用本发明试剂盒(捕获探针、引物对、检测探针、内标检测探针的组成见实施例2)检测临床血清、血浆样本中的乙型肝炎病毒，同步比对常规PCR检测相同的血清样本。SAT检测的具体方法包括以下步骤：

1、样本采集、运输及保存

由临床医师根据实际情况进行标本采集，血清样本的采集方法为：用无菌注射器抽取1-16号受检者静脉血2mL，收集于无菌收集管中，室温不超过4小时，1600rpm离心5分钟分离出血清，转移至另一无菌离心管中备用。

血浆采集方法为：用无菌注射器抽取1-16号受检者静脉血2mL，注入含有EDTA或枸橼酸钠抗凝剂的无菌收集管中(不可用肝素抗凝)，立即轻轻颠倒混匀，室温不超过4小时，1600rpm离心5分钟分离出血浆，转移至另一无菌离心管中备用。

另设阴性对照、阳性对照(10⁶拷贝/mlHBV体外转录RNA的稀释物)各一个。

2、核酸提取

2.1在样品处理管中加入200μl病毒核酸提取液(HEPES500mM，LLS8％，捕获探针15μΜ，磁珠150mg/L)、250μl血清样本和10μl内标溶液(含2×10⁴拷贝/mLHBV内标RNA)，用病毒核酸提取液裂解待测样品中的乙型肝炎病毒，混匀，60℃保温10分钟，室温放置10分钟。

2.2将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5-10分钟。待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。加入1mL洗涤液1(HEPES25mM，NaCl150mM，1％SDS，EDTA2.5mM；)振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠，然后加入800μl洗涤液1和200μl洗涤液2，振荡均匀后静置5-10分钟，弃液体，保留磁珠。

3、SAT扩增检测

3.1向样品处理管中加入40μl扩增检测液洗涤磁珠。HBV扩增检测液具体包含Tris15mM，MgCl₂15mM，dNTP2.5mM，NTP3mM，PVP401％，KCl10mM，T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为2.5pmol/反应，HBV检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应。

3.2取振荡混匀的上述反应检测液30μl加至洁净微量反应管，用ABI7500型PCR仪60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；向微量反应管中加入10μl已预热至42℃的SAT酶液，1200rpm振荡15秒钟混匀。SAT酶液中含有M-MLV反转录酶1500U/反应、T7RNA聚合酶1000U/反应、10mMHEPESpH7.5、15mMN-acetyl-L-cysteine(N-乙酰-L-半胱氨酸)、0.15mMzincacetate(乙酸锌)、20mMtrehalose(海藻糖)、100mMTris-HClpH8.0、80mMKCl、0.25mMEDTA、0.5％(v/v)TritonX-100和30％(v/v)glycerol(丙三醇)。

4、结果判定

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)

所设置阳性对照和阴性对照的dt值应满足质量控制的要求，否则实验视为无效，需要重新进行检测。

阳性结果判断：

F1通道dt≤50，F2通道有或者无数值的样本为阳性。

阴性结果判断：

F1通道dt无数值或为50，同时F2通道dt≤50的样品为阴性。

5、结果

结果显示，图3(靶标F1)中1-16号血清样本dt值<30，图4(内标F2)扩增曲线有出有不出，提示反应体系未受抑制，根据判定结果，1-16号血清样本均为阳性样本；而图5(靶标F1)中1-16号血浆样本dt值<30，图6(内标F2)扩增曲线有出有不出，显示1-16号血浆样本也都是阳性样本；可见，1-16号的血清、血浆结果完全一致，没有因样本类型的不同产生差异；同常规PCR检测相比，结果相同(图7)。

实施例4中检所乙型肝炎病毒DNA定性及定量标准品的实时荧光核酸恒温扩增检测

本检测为本发明的另一个应用：试剂盒中，捕获探针为序列4和序列5的组合，按序列4与序列5的1:3体积比混合，捕获探针浓度为30μΜ，磁珠300mg/L，其他组成、含量同实施例2。

对中检所的乙型肝炎病毒DNA定性及定量标准品中的阴性符合率、阳性符合率及灵敏度参考品进行实时荧光核酸恒温扩增检测，其中，阳性参考品为P0-P9，阴性参考品为N1-N8，灵敏度参考品为L0-L6。

结果显示，本发明试剂盒完全可以检出阳性参考品P1-P9，阳性符合率100％(图8)；N1-N8阴性参考品检出均为阴性(图9)，阴性符合率100％，特异性良好。此外，对不同梯度的L0-L6均可检出(图10)，且曲线良好，说明本试剂盒完全满足国家HBV参考盘的全部要求。

实施例5中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品L0稀释至30IU/mlSAT检测结果

为进一步了解本发明的实际检测灵敏度，用本发明试剂盒(组成见实施例4)检测临床血清样本中的乙型肝炎病毒。采用阴性血清稀释中检所乙型肝炎病毒核酸检测参考品L0至30IU/ml，重复检测10次，并设置阳性和阴性对照，步骤同实施例5。

从结果图11可见，本试剂盒重复10次均可检出30IU/ml的浓度，且曲线良好，说明本试剂盒最低灵敏度至少可保证在30IU/ml。

根据本发明的公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的乙型肝炎病毒实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不足构成对本发明限制。本领域的熟练技术人员用显而易见的相似替代物或改造，或用某些在化学上或生物结构功能相关的制剂替代在此描述的制剂，或对本发明相关内容进行变动，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海仁度生物科技有限公司

<120> 一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

<130>

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> T7引物

<400> 1

aatttaatac gactcactat agggagaaca aacgggcaac atacctt 47

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> nT7引物

<400> 2

gatgtgtctg cggcgtttta 20

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 检测探针

<400> 3

ccauccugcu augccucgau gg 22

<210> 4

<211> 62

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 捕获探针1

<400> 4

cactgaacaa atggcactag taaactgagc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

aa 62

<210> 5

<211> 60

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 捕获探针2

<400> 5

gagggaaaca uagagguucc uugagcagga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60

<210> 6

<211> 677

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 内标序列

<400> 6

gaaaauuggu aauagaggua aaaagggacu caagauguug uacagacuug gcccccaaua 60

ccacaucauc cauauaacug aaagccaaac agugggggaa agcccuacga accacugaac 120

aaauggcacu aguaaacuga gccaggagaa acggacugag gcccacuccc auaggaaucu 180

ugcgaaagcc caggaugaug ggaugggaau acaagugcag uuucuguccg aagguuuugu 240

acagcaacaa gagggaaaca uagagguucc uugagcagga aucgugcagg ucuugcaugg 300

ucccgugcug guaguugagg uuccuggaag uagaggacaa acgggcaaca uaccuuggua 360

guccagaaga accaacgcuc accacgcucc auagcagcag gaugaagagg aauaugauaa 420

aacgccgcag acacauccag cgauagccag gacaaauugg aggacaggag guuggugagu 480

gauuggaggu uggggacugc gaauuuuggc caggacacgu gggugcuccc ccuagaaaau 540

ugagagaagu ccaccacgag ucuagacucu gugguauugu gaggauucuu gucaacaaga 600

aaaaccccgc cuguaacacg agcagggguc cuaggaaucc ugauguugug uucuccaugu 660

ucggugcagg gucccca 677

<210> 7

<211> 25

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 内标检测探针

<400> 7

ccgacgcuca ccacgcucca gucgg 25

<210> 8

<211> 1354

<212> DNA

<213> Hepatitis B virus

<400> 8

ggggaccctg caccgaacat ggagaacaca acatcaggat tcctaggacc cctgctcgtg 60

ttacaggcgg ggtttttctt gttgacaaga atcctcacaa taccacagag tctagactcg 120

tggtggactt ctctcaattt tctaggggga gcacccacgt gtcctggcca aaattcgcag 180

tccccaacct ccaatcactc accaacctcc tgtcctccaa tttgtcctgg ctatcgctgg 240

atgtgtctgc ggcgttttat catattcctc ttcatcctgc tgctatgcct catcttcttg 300

ttggttcttc tggactacca aggtatgttg cccgtttgtc ctctacttcc aggaacctca 360

actaccagca cgggaccatg caagacctgc acgattcctg ctcaaggaac ctctatgttt 420

ccctcttgtt gctgtacaaa accttcggac agaaactgca cttgtattcc catcccatca 480

tcctgggctt tcgcaagatt cctatgggag tgggcctcag tccgtttctc ctggctcagt 540

ttactagtgc catttgttca gtggttcgta gggctttccc ccactgtttg gctttcagtt 600

atatggatga tgtggtattg ggggccaagt ctgtacaaca tcttgagtcc ctttttacct 660

ctattaccaa ttttcttttg tctttgggta tacatttgaa ccccaataaa accaaacgtt 720

ggggctactc ccttaacttc atgggatatg tcattggaag ttggggtact ttaccgcaag 780

aacatattgt actaaaaatc aagcaatgtt ttcggaaact gcctgtaaat agacctattg 840

attggaaagt atgtcagaga attgttggtc ttttgggctt tgctgcccct tttacacaat 900

gtggctatcc tgccgtaatg cctttatatg catgtataca atctaagcag gctttcactt 960

tctcgccaac ttataaggcc tttctgtgta aacaatatct gaacctttac cccgttgccc 1020

ggcaacggtc aggtctctgc caagtgtttg ctgacgcaac ccccactgga tggggcttgg 1080

ctattggcca tcgccgcatg cgtggaacct ttgtggctcc tctgccgatc catactgcgg 1140

aactcctagc tgcttgtttt gctcgcagcc ggtctggagc gaaacttatc ggaaccgaca 1200

actctgttgt cctctctcgg aaatacacct cctttccatg gctgctagga tgtgctgcca 1260

actggatcct gcgcgggacg tcctttgtct acgtcccgtc ggcgctgaat cccgcggacg 1320

acccgtctcg gggccgtttg ggactctacc gtcc 1354

<210> 9

<211> 1354

<212> RNA

<213> Unknown

<220>

<223> 靶标RNA

<400> 9

ggggacccug caccgaacau ggagaacaca acaucaggau uccuaggacc ccugcucgug 60

uuacaggcgg gguuuuucuu guugacaaga auccucacaa uaccacagag ucuagacucg 120

ugguggacuu cucucaauuu ucuaggggga gcacccacgu guccuggcca aaauucgcag 180

uccccaaccu ccaaucacuc accaaccucc uguccuccaa uuuguccugg cuaucgcugg 240

augugucugc ggcguuuuau cauauuccuc uucauccugc ugcuaugccu caucuucuug 300

uugguucuuc uggacuacca agguauguug cccguuuguc cucuacuucc aggaaccuca 360

acuaccagca cgggaccaug caagaccugc acgauuccug cucaaggaac cucuauguuu 420

cccucuuguu gcuguacaaa accuucggac agaaacugca cuuguauucc caucccauca 480

uccugggcuu ucgcaagauu ccuaugggag ugggccucag uccguuucuc cuggcucagu 540

uuacuagugc cauuuguuca gugguucgua gggcuuuccc ccacuguuug gcuuucaguu 600

auauggauga ugugguauug ggggccaagu cuguacaaca ucuugagucc cuuuuuaccu 660

cuauuaccaa uuuucuuuug ucuuugggua uacauuugaa ccccaauaaa accaaacguu 720

ggggcuacuc ccuuaacuuc augggauaug ucauuggaag uugggguacu uuaccgcaag 780

aacauauugu acuaaaaauc aagcaauguu uucggaaacu gccuguaaau agaccuauug 840

auuggaaagu augucagaga auuguugguc uuuugggcuu ugcugccccu uuuacacaau 900

guggcuaucc ugccguaaug ccuuuauaug cauguauaca aucuaagcag gcuuucacuu 960

ucucgccaac uuauaaggcc uuucugugua aacaauaucu gaaccuuuac cccguugccc 1020

ggcaacgguc aggucucugc caaguguuug cugacgcaac ccccacugga uggggcuugg 1080

cuauuggcca ucgccgcaug cguggaaccu uuguggcucc ucugccgauc cauacugcgg 1140

aacuccuagc ugcuuguuuu gcucgcagcc ggucuggagc gaaacuuauc ggaaccgaca 1200

acucuguugu ccucucucgg aaauacaccu ccuuuccaug gcugcuagga ugugcugcca 1260

acuggauccu gcgcgggacg uccuuugucu acgucccguc ggcgcugaau cccgcggacg 1320

acccgucucg gggccguuug ggacucuacc gucc 1354

Claims

1.一种乙型肝炎病毒HBV实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒，包含有一条乙型肝炎病毒靶标核酸的捕获探针，一对用于靶标核酸扩增的引物T7和nT7，和一条用于与所述靶标核酸扩增产生的RNA拷贝特异结合的检测探针；还包含有HBV内标和内标检测探针；

所述引物由T7引物和nT7引物组成，T7引物序列如序列表中序列1所示，nT7引物序列如序列表中序列2所示；所述检测探针的核苷酸序列如序列表中序列3所示，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团；

所述HBV内标为乙型肝炎病毒核苷酸序列的竞争性内标，可与捕获探针特异性结合，并使用T7和nT7引物，由序列表中序列6所示的体外转录RNA；

所述内标检测探针的核苷酸序列如序列表中序列7所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针的核苷酸序列如序列表中序列5所示。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述捕获探针为序列表中序列4与序列5按1:1～6:1比例混合组成。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含有M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶，所述M-MLV反转录酶和T7RNA聚合酶存在于SAT酶液中，所述捕获探针存在于病毒核酸提取液中，所述T7引物、nT7引物和检测探针存在于扩增检测液中。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述内标检测探针的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记DABCYL淬灭基团，且所述内标检测探针存在于扩增检测液中。

7.根据权利要求1至6任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含病毒核酸提取液、洗涤液1、洗涤液2、HBV扩增检测液、SAT酶液、HBV阳性对照、HBV阴性对照、HBV内标和稀释液，其中：

病毒核酸提取液：含捕获探针和磁珠；

洗涤液1：含NaCl和SDS；

洗涤液2：矿物油；

SAT酶液：含M-MLV反转录酶、T7RNA聚合酶；

HBV内标：HBV IC RNA稀释物；

稀释液：含硫酸铵(NH₄)₂SO₄和HEPES。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中一个反应单位中各种试剂组成如下：

(1)病毒核酸提取液：HEPES 250-800mM，LLS 4-10％，捕获探针1-50μΜ，磁珠50-500mg/L；

(2)洗涤液1：HEPES 5-50mM，NaCl 50-500mM，1％SDS，EDTA 1-10mM；

(3)洗涤液2：矿物油；

(4)HBV扩增检测液：Tris 10-50mM，MgCl₂ 10-40mM，dNTP 0.1-10mM，NTP 1-20mM，PVP401-10％，KCl 5-40mM，HBV引物和探针浓度在2.5-10pmol/反应；其中T7引物浓度为2.5pmol/反应，nT7引物浓度为2.5pmol/反应，HBV检测探针浓度为5pmol/反应，内标检测探针浓度为5pmol/反应；

(5)SAT酶液：M-MLV反转录酶400-4000U/反应、T7RNA聚合酶200-2000U/反应、2-10mMHEPES pH7.5、10-100mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4mM zinc acetate、10-100mMtrehalose、40-200mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA、v/v为0.1-1％的Triton X-100和v/v为20-50％的glycerol；

(8)HBV内标：含10⁴-10⁸拷贝/mL HBV IC RNA的稀释物；

(9)稀释液：25-250mM HEPES，5-50mM(NH₄)₂SO₄。

9.权利要求1至8任一所述乙型肝炎病毒HBV核酸恒温扩增检测试剂盒中的专用试剂，包括以下表示的物质：