JP2010042001A

JP2010042001A - Ｂ型肝炎ウイルス検出用オリゴヌクレオチド

Info

Publication number: JP2010042001A
Application number: JP2009192306A
Authority: JP
Inventors: Marie-Philippe Biron; マリー−フィリップ・ビロン
Original assignee: Bio Rad Pasteur SA
Current assignee: Bio Rad Innovations SAS
Priority date: 2003-12-16
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2010-02-25
Also published as: CA2549059C; CA2549059A1; EP1544311A1; WO2005061737A1; EP1544311B1; AU2004303612B2; ES2332712T3; JP2007514435A; AU2004303612A1; DE60330160D1; ATE449194T1; US20080280287A1; JP4463826B2

Abstract

【課題】２つの試験を組み合わせる必要がなく、非常に低い濃度から非常に高い濃度までのＨＢＶの明確かつ簡便な定量を可能にする診断キットを提供する。
【解決手段】ＨＢＶ核酸の増幅によるＢ型肝炎ウイルスの迅速かつ高感度な検出のための特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、ならびにそれらを使用する方法。これらの検出試験を実施するために有用なキット。非常に広い定量範囲で、遺伝子型Ａ〜Ｇ由来のＨＢＶ核酸を、特に迅速かつ高感度に検出する手段、プライマーおよびプローブ。
【選択図】なし

Description

本発明は、増幅によるＢ型肝炎ウイルスの迅速かつ高感度な検出のためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ、ならびにそれらを使用する方法に関する。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）はヘパドナウイルスファミリーのメンバーである。これらは、通常とは異なり、逆転写によって複製する二本鎖ＤＮＡウイルスである。このウイルスのいくつかのバリアントが記載されている。ＨＢＶは慢性肝炎の主要な原因因子であり、肝硬変および肝細胞ガンに関連付けられている。Ｂ型肝炎ウイルスはヒト集団における風土病であり、世界の多くの部分における過度の風土病（hyperendemic）である。世界人口の３分の１より多くがＢ型肝炎ウイルスに感染していると推定されている。人口の約５％はＨＢＶの慢性キャリアであり、全てのキャリアのほぼ２５％が、慢性肝炎、硬変および原発性肝細胞ガンのような重篤な肝臓疾患を発達させる。ＨＢＶ感染は毎年百万より多くの死を引き起こす。

種々の型の抗原に対する抗体および細胞媒介免疫応答が感染の間に誘発される。Ｂ型肝炎ウイルスでの感染に対する免疫応答は少なくとも以下の３つの抗原に対するものである：Ｂ型肝炎表面抗原、コア抗原（ＨＢｃＡｇ）およびｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）。表面抗原は、大部分の患者の血清中に、潜伏期の後期の間、すなわち感染後２〜８週で出現し、急性疾病の間に持続し、表面抗原に対する抗体が検出可能になると急激に減少する。コア抗原に対するＩｇＭは、表面抗原の出現後２〜１０週で血清中に見出される。これはウイルス複製の量および持続期間と相関する。Ｂ型肝炎ｅ抗原については、これは感染肝細胞によって分泌されるが、結局、大部分の個体において、ＨＢｅＡｇから抗ＨＢｅへのセロコンバージョンが観察され、これは感染肝細胞の免疫クリアランスに関連する。

ＨＢＶ抗原および抗体を検出および測定するためにイムノアッセイが開発されている。

しかし、そのようなイムノアッセイは偽陰性結果を生じ得る。実際、免疫学的方法が対象のセロコンバージョン期内に実施される場合、循環している抗原または抗体が見出されないことから、ＨＢＶ感染は検出されないままであり得る。従って、ＨＢＶ核酸の検出に依存する診断方法は、ウイルスのより初期の検出を可能にするより正確な方法を提供する。

いくつかの診断キットがこの分野において市販されている。例えば、ＡｍｐｌｉｃｏｒＨＢＶＭｏｎｉｔｏｒおよびＣｏｂａｓＡｍｐｌｉｃｏｒＨＢＶＭｏｎｉｔｏｒ（ＲｏｃｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｙｓｔｅｍｓ）、ＶｅｒｓａｎｔＨＢＶＤＮＡ（ｂＤＮＡ、ＢａｙｅｒＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）ならびにＤｉｇｅｎｅＨｙｂｒｉｄ−Ｃａｐｔｕｒｅ２ＨＢＶＤＮＡｔｅｓｔ（ＤｉｇｅｎｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。しかし、これらの試験は一般に４ｌｏｇ以下の制限された定量範囲を有している：ＡｍｐｌｉｃｏｒＨＢＶＲｏｃｈｅについては１０^３〜４１０^６コピー／ｍｌ（ＣｏｂａｓＨＢＶＲｏｃｈｅについては２１０^２〜２１０^５コピー／ｍｌ）、ＶｅｒｓａｎｔＨＢＶＢａｙｅｒについては７１０^５〜５１０^９コピー／ｍｌ、そしてＤｉｇｅｎｅＨＢＶＤＮＡについては７１０^５〜５．６１０^９コピー／ｍｌ（ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＤｉｇｅｎｅＨＢＶＤＮＡについては４．７１０^３〜５．７１０^７コピー／ｍｌ）。従って、これら全ての試験の主な不利益は、これらのいずれもが非常に低い濃度から非常に高い濃度までのＨＢＶの明確かつ簡便な定量を可能にしないという事実にある。それゆえ、実際、正確な結果を得るために、特に低および高ウイルス濃度レベルの場合に、少なくとも２つの試験を組み合わせることがしばしば必要である。

このように、いずれの試料中ウイルス濃度でも、さらなる試験の実施の必要性なしに、広範囲のＨＢＶを正確に定量することの必要性が存在する。

さらに、当該分野において公知の全てのＨＢＶ遺伝子型を特異的に検出する非常に高感度な定量試験の必要性もなお存在する。

この関連で、本発明者らは、非常に広い定量範囲で、遺伝子型Ａ〜Ｇ由来のＨＢＶ核酸を、特に迅速かつ高感度に検出する手段を提供する、プライマーおよびプローブを設計した。

図１は、本発明による試験（配列番号２および配列番号３をプライマーとして、そして配列番号１２をプローブとして用いる）、ＨＢＶＰＣＲｋｉｔＲｏｃｈｅ、およびＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔ^ＴＭＬａｂＣｏｒｐによって提供される定量結果の対比較の模式図である。Ａ：本発明対ＨＢＶＰＣＲｋｉｔＲｏｃｈｅ；Ｂ：本発明対ＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔＬａｂＣｏｒｐ；Ｃ：ＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔＬａｂＣｏｒｐ対ＨＢＶＰＣＲｋｉｔＲｏｃｈｅ。図２は、本発明による試験（配列番号２および配列番号３をプライマーとして、そして配列番号１２をプローブとして用いる）による、抽出・希釈Ａｃｃｕｒｕｎ^ＴＭＨＢＶ３２５ＤＮＡ陽性コントロールのコピー数／ｍｌに対する検出シグナルの直線性の模式図である。

定義
本発明によれば、当該分野の技術範囲内のいずれかの従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術を用いてもよい。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば以下を参照のこと：Sambrook et al., 1989 ; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)] ; Transcription and Translation [B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)] ; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)] ; Immobilized Cells and Enzymes [IRL Press, (1986)] ; B. Perbal, 1984 ; F.M. Ausubel et al. (eds.), 1994。

「核酸分子」は任意の核酸をいう：核酸分子は、合成または非合成、組換えまたは天然、直鎖状または環状であってもよい。核酸分子は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれであってもよい。これらの核酸分子は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む。明示しない限り、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに相同な配列を有する鎖）に沿った５’から３’の方向の配列のみを与える通常の慣習に従って記載される。

本明細書において使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、増幅手順においてプライマーとして、または検出方法においてプローブとして使用できる核酸配列をいう。本発明に関して、これらのオリゴヌクレオチドは、目的の遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその他の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能な、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、好ましくは１００ヌクレオチド以下、より好ましくは４０ヌクレオチド以下からなる。

一本鎖形態の核酸分子が他の核酸分子に温度および溶液イオン強度の適切な条件下でアニールできる場合に、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al., 1989参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。核酸をハイブリダイズするために適切なストリンジェンシーは、当該分野において周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高ければ高いほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドについてのＴｍの値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順に低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドより長いハイブリッドについて、Ｔｍを算出するための式が導かれている（Sambrook et al., 1989, 9.50-9.51参照）。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al., 1989, 11.7-11.8参照）。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。

ＰＣＲは高ストリンジェンシー条件下で、少なくとも５０℃のアニーリング温度を使用することによって、高イオン強度緩衝液中で実施される。本発明の好ましい実施態様によれば、アニーリング工程のために選択される温度は５５℃〜６０℃の範囲であり、イオン強度はＫＣｌおよびＭｇＣｌ_２の組み合わせを使用することによって得られる。これは、各ＰＣＲサイクルのアニーリング工程の間の非特異的オリゴヌクレオチド結合に対する特異的オリゴヌクレオチド結合の高い比率を促進する。これはストリンジェントなプライマーアニーリング条件を可能にし、ＰＣＲ特異性の増加を導く。例えば、ＫＣｌ５０ｍＭとＭｇＣｌ_２６ｍＭとの組み合わせが高い特異性を与えるために適切であり得る。しかし、他のイオン強度条件を使用してもよく、それは当業者によって容易に決定され得る。

本明細書において使用するＤＮＡの「増幅」は、ＤＮＡ配列の混合物内の特定のＤＮＡ配列の濃度の増加を示す。増幅工程を、従来のＤＮＡまたはＲＮＡの酵素的増幅方法（例えば、特に、Kwoh et al. (1989)によって提唱されるＴＡＳ（Transcription-based Amplification System）技術、Fahy et al. (1991)によって記載される３ＳＲ（Self-Sustained Sequence Replication）技術、特許EP 329 822に記載されるＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）技術、あるいはWalker et al. (1992)によって記載されるＳＤＡ（Strand Displacement Amplification）技術、または欧州特許EP 0 320 308に記載されるLigase Chaine Reaction（ＬＣＲ）技術、またはUS 5,399,491に記載されるTranscription Mediated Amplification（ＴＭＡ）、または有利にはSaiki et al. (1988)および欧州特許EP 0 200 362およびEP 0 201 184に記載されるＰＣＲ技術、あるいは後者から誘導される技術およびその他のいずれかのインビトロにおける核酸の増幅に所望される方法）を使用するいずれかの方法によって実施し得る。

本発明に関して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用が特に意図される。

本明細書において使用する用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドの機能をいう。プライマーは、代表的には標的配列へのハイブリダイゼーション後のオリゴヌクレオチドの伸長によるか、または標的配列にハイブリダイズした場合に隣接する複数のオリゴヌクレオチドのライゲーションによる、標的配列を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドである。プローブオリゴヌクレオチドは、それがハイブリダイズする標的配列を捕獲または検出するために使用される。しかし、同じオリゴヌクレオチドプローブがプライマーとしても機能し得る。それゆえ、ＨＢＶの増幅、検出または定量のために本明細書中に開示される配列のいずれもがハイブリダイゼーションプローブとしてかまたは検出もしくは増幅のための増幅プライマーとしてのいずれかで使用され得ることが理解される。

用語「Ｂ型肝炎ウイルス」または「ＨＢＶ」は、ヘパドナウイルス科、オルトヘパドナウイルス属の基準種を示す。ＨＢＶ核酸は部分的に二本鎖の一本鎖環状ＤＮＡである。ゲノムの全長は約３０２０〜３３２０ヌクレオチド（ｎｔ）（完全長鎖について）または１７００〜２８００ｎｔ（短長鎖について）である。本明細書において使用するＨＢＶは、いずれかのサブタイプ、株、またはバリアントを意味する（例えば、サブタイプａｄ、ａｄｒ、ａｄｗ、ａｄｙｗ、ａｒ、ａｙｗ）。本発明に関して、ヌクレオチド位置は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｘ９８０７７の下に寄託されているＨＢＶゲノム配列、サブタイプａｄｗを参照して示される（配列番号１）。

用語「生物学的試料」は以下をいう：いずれかの体液、例えば、尿、血液、血清、血漿、ＬＣＲまたは肝臓バイオプシーのような組織．．．。

本発明のプローブおよびプライマー
本発明者らは、以下に規定するような特異的プライマーおよびプローブを使用してＨＢＶ核酸を増幅することによって、特に迅速かつ高感度なＨＢＶ感染の検出を達成することができることを実証した。

これらのプライマーおよびプローブを、ＨＢＶゲノムの重複領域、すなわちＨＢＶＤＮＡポリメラーゼコード領域の終わり（ＨＢＶ環状化ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）２３０７〜３２１５／１〜１６２３）およびＨＢＶＸタンパク質をコードする配列の始まり（ｎｔ１３７４〜１８３８）を含む領域にハイブリダイズするように設計した。これらのプライマーおよびプローブは、ＨＢＶゲノムの１６２ヌクレオチドのフラグメント（配列番号１のｎｔ１４４０〜１６０２にわたる領域）の増幅および検出を可能にする。

本明細書において開発された検出試験は、ＨＢＶ患者のウイルス負荷試験または血液産物の安全性スクリーニングのために高度に重要であることが判明した。

従って本発明は、配列5' GCTGAATCCCGCGGACGA 3'（配列番号２）またはその相補配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。このオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ核酸を増幅するためのセンスプライマーとして特に有用である。

本発明はまた、配列5' GTGCAGAGGTGAAGCGAAGTG 3'（配列番号３）、配列5' GTTCACGGTGGTCGCCATG 3'（配列番号４）、配列5' GTTCACGGTGGTCTCCATG 3'（配列番号５）、配列5' CGTTCACGGTGGTCGCCATGC 3'（配列番号６）および配列5' CGTTCACGGTGGTCTCCATGC 3'（配列番号７）ならびにそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶ核酸を増幅するためのアンチセンスプライマーとして特に有用である。

さらに、本発明はまた、配列5' GGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTG 3'（配列番号８）、配列5' GGAGACCGCGTAAAGAGAGGTG 3'（配列番号９）、配列5' GGAGTCTGCGTAAAGAGAGGTG 3'（配列番号１０）および配列5' GGAGACTGCGTAAAGAGAGGTG 3'（配列番号１１）ならびにそれらの相補配列からなる群より選択されるアンチセンス配列からなるＨＢＶ結合配列を含む、プローブとして有用な、オリゴヌクレオチドを提供する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、上記で設計した配列の５’および／または３’末端に連結した、所望の配列に対して外来の、さらなる配列、例えば標識分子を含んでもよい。オリゴヌクレオチドはそれでもなお高ストリンジェンシー条件下でＨＢＶ中に存在する相補的核酸配列とハイブリダイズ可能であり、さらなる配列は標準的ハイブリダイゼーション条件下ではＨＢＶ核酸とハイブリダイズし得ない。

これらのさらなる配列は、スペーサー、リンカーまたは標識もしくは酵素結合のための配列などとして作用し得る。

本発明のオリゴヌクレオチド、特に配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むプローブは、検出可能に標識されていてもよい。

標準的な標識物質（例えば、酵素、放射性または蛍光性部分）をこの目的のために使用してもよい。

プローブの標識は、「リアルタイム」増幅／検出反応の間に、すなわち増幅反応が生じている間に標的配列が検出および／または定量されるＰＣＲプロセスの間に、増幅核酸の検出を容易にするために特に有利である。

そのような検出は、例えば、核酸分子ビーコン技術を使用して達成され得る（Tyagi and Kramer, 1996; Cayouette et al., 1999）。分子ビーコン技術によれば、フルオロフォアまたはクエンチャー部分のいずれか一方がプローブ配列の各末端に結合される。標的核酸の非存在下において、アーム配列は互いにアニールし、それによりループおよびヘアピンステム構造を形成し、これがフルオロフォアとクエンチャーとを一緒にする。標的核酸と接触させられると、相補的プローブ配列および標的配列がハイブリダイズする。ヘアピンステムはハイブリダイゼーションに際して形成される強固な二重らせんと共存できないので、生じるコンホメーション変化はアーム配列を引き離し、フルオロフォアおよびクエンチャーの分離を引き起こす。フルオロフォアおよびクエンチャーが分離すると、蛍光シグナルが検出可能となる。

当該分野において公知の全ての色素およびクエンチャーを使用することができる。本発明によれば、色素は好ましくはＦａｍ、Ｔｅｔ、Ｈｅｘ、Ｔａｍｒａ、ＴｅｘａｓＲｅｄおよびＣｙ５からなる群より選択され得、クエンチャーは好ましくはＤａｂｃｙｌ、ＥｃｌｉｐｓｅＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒおよびＢｌａｃｋＨｏｌｅＱｕｅｎｃｈｅｒからなる群より選択され得る。そのような分子は以下から容易に入手可能である：Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｐｒｏｌｉｇｏ．．．。

従って、本発明はまた、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有するオリゴヌクレオチドを提供する。好ましくはスペーサー配列が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１またはそれらの相補配列の配列の１つに上記部分を連結するように導入され、伸長プローブを提供する。

配列5' CGGCAGGAGTCCGCGTAAAGAGAGGTGTGCCG 3'（配列番号１２）、5' CGGCAGGAGACCGCGTAAAGAGAGGTGTGCCG 3'（配列番号１３）、5' CGGCAGGAGTCTGCGTAAAGAGAGGTGTGCCG 3'（配列番号１４）および5' CGGCAGGAGACTGCGTAAAGAGAGGTGTGCCG 3'（配列番号１５）からなるオリゴヌクレオチドはそのような伸長プローブの例であり、これもまた本発明の一部である。スペーサー配列の特定の対が、スペーサーが結合される特定のオリゴヌクレオチド配列を考慮して、ヘアピンループを形成し得るプローブを提供するために、設計された。一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分をさらに有するそのような伸長プローブは、分子ビーコンプローブとして有用である。

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の核酸とハイブリダイズさせ、そして所望により該核酸を増幅するためのプローブまたはプライマーとしての上記で規定したオリゴヌクレオチドの使用もまた本発明の範囲内である。

これに関して、本発明は、配列番号２を含むオリゴヌクレオチドならびに、少なくとも、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７を含むオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドからなる、プライマーとして使用される第１のオリゴヌクレオチドのセットをさらに提供する。特に、第１のオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号２を含むオリゴヌクレオチド、配列番号３を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４を含むオリゴヌクレオチド、配列番号５を含むオリゴヌクレオチド、配列番号６を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７を含むオリゴヌクレオチドからなり得る。好ましくは、第１のオリゴヌクレオチドのセットは以下からなる：（ｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｖ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６を含むオリゴヌクレオチド；または（ｖ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７を含むオリゴヌクレオチド；または（ｖｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５を含むオリゴヌクレオチド；または（ｖｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチド、配列番号６を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７を含むオリゴヌクレオチド。

さらに好ましくは、プライマーとして使用される第１のオリゴヌクレオチドのセットは以下からなる：配列番号２および配列番号３；配列番号２および配列番号４；配列番号２および配列番号５；配列番号２、配列番号４および配列番号５；配列番号２および配列番号６；配列番号２および配列番号７；または配列番号２、配列番号６および配列番号７。

本発明のさらなる課題は、以下を含む、ＨＢＶ核酸の増幅および検出に有用な第２のオリゴヌクレオチドのセットである：
ａ）以下からなるオリゴヌクレオチドのセット：（ｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号３を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号４を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５を含むオリゴヌクレオチド；または（ｉｖ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号６を含むオリゴヌクレオチド；（ｖ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７を含むオリゴヌクレオチド；（ｖｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチド、配列番号４を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号５を含むオリゴヌクレオチド；または（ｖｉｉ）配列番号２を含むオリゴヌクレオチド、配列番号６を含むオリゴヌクレオチドおよび配列番号７を含むオリゴヌクレオチド；
ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列を含むオリゴヌクレオチド。

本発明は、以下からなる工程を包含する、生物学的試料において増幅によりＨＢＶを特異的に検出する方法をさらに提供する：
ａ）上記で規定したプライマーとして使用される第１のオリゴヌクレオチドのセットを、生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物と、オリゴヌクレオチドが試料中に存在するＨＢＶ核酸にハイブリダイズするために適切な条件下で接触させる工程；
ｂ）オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用するポリメラーゼ連鎖反応によってＨＢＶ核酸を増幅する工程；
ｃ）生物学的試料中のＨＢＶの存在を示す増幅産物を検出する工程。

好ましくは、増幅産物の検出は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１またはそれらの相補配列を含み、検出可能に標識されているオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することによって実施される。そのようなプローブはいずれの工程で導入してもよい。好適には、プローブはプライマー混合物に存在するかそれに添加される。

増幅方法は一般に以下からなる工程を包含する：
ａ）上記で規定した少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを、生物学的試料中に存在しそうなＨＢＶＤＮＡからなる鋳型ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程；
ｂ）プライマー伸長反応を実施して、プライマー伸長産物を得る工程；
ｃ）生じたＤＮＡ二重鎖を変性させて、プライマー伸長産物を鋳型ＨＢＶＤＮＡから分離する工程；プライマー伸長産物は他のプライマーのための他の鋳型ＤＮＡとして機能する；および
ｄ）同時の、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマー伸長反応、プライマー伸長産物のＤＮＡ鋳型からの分離、および標的ＤＮＡの領域の増幅のためのプライマーのハイブリダイゼーションのサイクルを繰り返す工程。

生物学的試料はいずれの型のものでもよい（例えば、生物学的流体、例えば、血液、血清、血漿、または肝臓バイオプシーによって得られるような組織試料）。より好ましくは、生物学的試料は血清または血漿である。

本発明の診断方法を、そのような生物学的試料から、例えば、標準的な抽出手順によって得られる核酸（例えば、ＤＮＡ）調製物に対して実施してもよい。

本発明はさらに、以下を含む、生物学的試料中のＨＢＶを増幅するためのキットを提供する：
− 少なくとも、プライマーとして有用な、本発明の第１のオリゴヌクレオチドのセット；および
−ＨＢＶ核酸を増幅するための手段。

増幅のための手段は、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ溶液、ＭｇＣｌ_２を含んでもよい。ＰＣＲコンタミネーションを防止するためにウラシルＤＮＡグリコシラーゼをさらに使用してもよい。

さらに、キットは、陰性コントロール（すなわち、ＨＢＶ核酸を含まない試料）、陽性コントロール（すなわち、増幅しようとするＨＢＶ領域の二本鎖核酸配列、クローン化または非クローン化）、および内部コントロール（すなわち、試料に添加された、増幅後のその検出を標的から区別できる二本鎖核酸配列）をさらに含んでもよい。

有利には、キットは上記で規定したプローブをさらに含んでもよい。例えば、キットは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１またはそれらの相補配列を含み、検出可能に標識されており、そしてプローブとして有用な合成オリゴヌクレオチドを含んでもよい。

本発明を以下の図面および実施例によりさらに説明する。

本発明が、上記オリゴヌクレオチドと比較しての配列改変（すなわち、限定された数のヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）を有するオリゴヌクレオチドを、そのような改変がオリゴヌクレオチドを使用して達成されるＨＢＶ検出の感度および／または特異性にとって有害ではないという条件で、包含することを当業者は容易に理解する。

実施例：「リアルタイム」ＰＣＲによるＨＢＶの特異的検出
材料および方法：
１）試料：
ＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｇｅｎｏｔｙｐｅＰａｎｅｌ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ、カタログＨＢＶＧＴＰ）：種々の遺伝子型（３Ａ、１Ｂ、５Ｃ、１Ｄ、３Ｅ、２Ｆ）の１５人の異なる患者由来の１５個の陽性ＨＢＶ血漿試料（１〜１５番）。

ＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＷｏｒｌｄｗｉｄｅＧｅｎｏｔｙｐｅＰａｎｅｌ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ、カタログＨＢＶＧＴＰ−００２ａ）：遺伝子型Ｇの１個の陽性ＨＢＶ血漿試料（５０番）。

これらの試料全てをＶｉｓｉｂｌｅＧｅｎｅｔｉｃｓｋｉｔ（Ｔｒｕｇｅｎｅ）を用いて遺伝子型決定し、ＨＢＶＤＮＡｋｉｔＲｏｃｈｅおよびＨＢＶＤＮＡｋｉｔＮＧＩ（National Genetics Institute）ＳｕｐｅｒＱｕａｎｔによって定量した。

定量標準曲線：パネルＡｃｃｕｒｕｎ３２５ＨＢＶＤＮＡ陽性コントロール（ＢＢＩ）またはＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＧｅｎｏｔｙｐｅＰａｎｅｌ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ）由来の試料１５番の抽出希釈物の使用。

２）抽出：
ＱｉａＡｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄｍｉｎｉｋｉｔ（ｒｅｆＱｉａｇｅｎ５１１０４）（２００μｌの試料を使用）またはＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅｖｉｒｕｓｖａｃｕｕｍｋｉｔ（ｒｅｆＱｉａｇｅｎ５７７１４）（５００μｌの試料を使用）を製造業者の推奨に従って使用して、ＤＮＡを血漿試料から抽出した。

３）増幅：
ＰｌａｔｉｎｕｍｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲＳｕｐｅｒＭｉｘＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１１７３０−０１７）を使用してリアルタイムＰＣＲを実施した：６０Ｕ／ｍｌＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡＰｏｌ、４０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．４、１００ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ_２および４００μＭｄＧＴＰを含むｍｉｘ２×。ｍｉｘ１×に、１．５μＭの配列番号２のプライマー、０．３μＭの配列番号３のプライマー（または０．３μＭの配列番号４のプライマー）、０．２μＭの配列番号１２の分子ビーコンＦａｍ−ＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒプローブ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）および３ｍＭＭｇＣｌ_２（６ｍＭＭｇＣｌ_２を達成する）を添加した。次いで、抽出ＤＮＡ試料をプライマー、プローブおよびさらなるＭｇＣｌ_２を含む混合物に添加する。

増幅工程は以下のとおりであった：
− １×２分、５０℃（ＵＤＧが作用する）
− １×２分、９５℃（ＵＤＧが不活化される；ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡＰｏｌが活性化される）
− ５０×（１５秒、９４℃ − ３０秒、５５℃ − ３０秒、７２℃）
− ４℃

４）結果の解釈
各アッセイについて閾値サイクル（Ｃｔ）を決定する。これは、増幅の初期サイクルにおいて測定される蛍光のバックグラウンドレベルより有意に高いと考えられる蛍光のレベルである。既知の標的濃度のｌｏｇを、対応するＣｔに対してプロットすることによって、参照標準曲線を構築する。次いで、未知試料の濃度を、対応するＣｔを標準曲線に対してマッピングすることによって規定する。

結果
１）既存のＰＣＲベースの検出方法との比較
血漿中で希釈し、ＱｉａＡｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄｋｉｔを用いて抽出したＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｇｅｎｏｔｙｐｅｐａｎｅｌ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ）由来の１４個の試料（１〜１４番）を、本発明の試験（配列番号２および配列番号３をプライマーとして、そして配列番号１２を分子ビーコンプローブとして用いる）または以下の２つの既存の市販されているＰＣＲベースの検出試験のいずれかを用いて定量した：ＲｏｃｈｅからのＨＢＶＰＣＲｋｉｔ（２１０^９コピー／ｍｌまでを定量するように開発されたアッセイ）およびＬａｂＣｏｒｐからのＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔｋｉｔ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘによって伝えられた結果）。

ＲｏｃｈｅからのＨＢＶＰＣＲｋｉｔのプライマーおよびプローブはプレコア−コア領域の保存セグメントにおいて選択されており、ＬａｂＣｏｒｐからのＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔｋｉｔのプライマーおよびプローブはポリメラーゼ遺伝子の保存セグメントにおいて選択されている。

本発明による試験は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ〜Ｇを特異的に検出および定量できる。

３つの試験を用いて得られた結果の全体の対比較は、本発明による試験によって提供される結果が、ＲｏｃｈｅからのＨＢＶＰＣＲｋｉｔまたはＬａｂＣｏｒｐからのＨＢＶＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔ^ＴＭの各々を用いて提供された結果と良好な相関を示すことを示す（図１）。

２）検出感度
ａ）定量範囲の直線性
本発明の試験（配列番号２および配列番号３をプライマーとして、そして配列番号１２を分子ビーコンプローブとして用いる）を用いて得られた検出シグナル（サイクル閾値）が、１ｍｌ当たりのＨＢＶＤＮＡコピー数と相関することを実証するために、ＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨＢＶｇｅｎｏｔｙｐｅｐａｎｅｌ（Ｔｅｒａｇｅｎｉｘ）由来の試料１５番を血漿中で希釈し、ＱｉａＡｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄｋｉｔを用いて抽出した。検出限界（１００コピー／ｍｌ）までの試料の漸増希釈物を用いて測定したサイクル閾値を、以下の表２に示す。コピー数とサイクル閾値との間の直線関係を図２に示す。

ＱｉａｇｅｎからのＱｉａＡｍｐＤＮＡＢｌｏｏｄｋｉｔを用いて抽出したＨＢＶ陽性試料について、コピー数のｌｏｇを閾値サイクル（Ｃｔ）に対してプロットした場合、本発明による試験は、１００〜１０^９コピー／ｍｌのＨＢＶを良好な相関係数（０．９９８）で定量することができる。

ｂ）検出感度
Ａｃｃｕｒｕｎ^ＴＭＨＢＶ３２５ＤＮＡ陽性コントロール（ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｍｅｄｉｃａ）を参照試料として使用して、本発明の試験（配列番号２および配列番号３をプライマーとして、そして配列番号１２を分子ビーコンプローブとして用いる）の感度限界を決定した。この目的で、上記で説明したように、試料を血漿中に希釈し、ＤＮＡをＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ抽出キットを用いて抽出した。以下の表３に示すこの分析の結果は、本発明による試験が、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡａｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅ抽出キットを用いて抽出したＨＢＶ陽性試料のＡｃｃｕｒｕｎ^ＴＭＨＢＶ参照を２５コピー／ｍｌほど低くまで検出可能にしたことを示す。

平均感度限界を、同じ条件下で、ＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨＢＶｇｅｎｏｔｙｐｅｐａｎｅｌ由来の１５個の試料の各々およびＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨｅｐａｔｉｔｉｓＢＷｏｒｌｄｗｉｄｅＧｅｎｏｔｙｐｅＰａｎｅｌ由来の試料５０番についてさらにアッセイし、表４にまとめる。

それゆえ、血漿中で希釈し、ＱｉａＡｍｐＭｉｎＥｌｕｔｅｖｉｒｕｓｖａｃｕｕｍｋｉｔを用いて抽出したＴｅｒａＰｒｏ^ＴＭＨＢＶｇｅｎｏｔｙｐｅｐａｎｅｌを用いて得られた本発明の試験の平均感度限界は、Ａｃｃｕｒｕｎ^ＴＭＨＢＶ３２５ＤＮＡ陽性コントロールを用いて得られた平均感度限界に非常に近いことが見出された（検出限界２５コピー／ｍｌと比較して＜３２コピー／ｍｌ）。

本発明による試験の感度限界は、ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓからのＣｏｂａｓＡｍｐｌｉｃｏｒＨＢＶＭｏｎｉｔｏｒｋｉｔ（感度限界２００コピー／ｍｌ）またはＬａｂＣｏｒｐからのＨｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓＮＧＩＳｕｐｅｒＱｕａｎｔｋｉｔ（感度限界１００コピー／ｍｌ）のような市販のＰＣＲベースの検出試験と比較して改善されている。

３）配列番号２および配列番号３のプライマーセットと配列番号２および配列番号４のプライマーセットとの比較
この比較のために、ＱｉａＡｍｐＤＮＡｂｌｏｏｄｍｉｎｉｋｉｔを用いて抽出した血漿中のＡｃｃｕｒｕｎ３２５ＨＢＶＤＮＡ陽性コントロールの希釈物を使用した。閾値サイクル（Ｃｔ）の結果を表５に示す。

両方のプライマーセットは、ＡｃｃｕｒｕｎＨＢＶの抽出希釈物を同じ感度限界で増幅したが（１０^２コピー／ｍｌ）、閾値サイクルのより良好な再現性およびより良好な相関が、配列番号２および配列番号４のプライマーセット（相関係数０．９７０）よりも配列番号２および配列番号３のプライマーセット（相関係数０．９９９）を用いて得られた。

参考文献
- Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)
- Cayouette M, Sucharzuk A, Moores J, Tyagi S, and Kramer FR (1999) Using molecular beacons to monitor PCR product formation. Strategies Newsl. 12:85-88.
- Fahy et al. (1991) PCR Meth. Appl., 1, 25-33
- Kwoh et al. (1989) PNAS, 86, 1173-1177
- Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
- Saiki et al., (1988), Science, 239:487
- Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York
- Tyagi S and Kramer FR (1996) Nature Biotechnol., 16, 303-308
- Walker et al. (1992) P.N.A.S, 89, 392-396
- Yaron et al., (1979) Analytical Biochemistry 95: 228-235

Claims

配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチド。
配列番号２またはその相補配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号２からなる、請求項２記載のオリゴヌクレオド。
配列番号３またはその相補配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号４またはその相補配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号６またはその相補配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
配列番号７またはその相補配列からなる、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の核酸とハイブリダイズさせ、そして所望により該核酸を増幅するためのプローブまたはプライマーとしての、請求項１〜７のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドの使用。
ＨＢＶ由来の核酸とハイブリダイズさせるためのプローブとしての、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドの使用。
オリゴヌクレオチドが配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列からなる、請求項９記載の使用。
オリゴヌクレオチドが配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有する、請求項９記載の使用。
オリゴヌクレオチドが配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択される配列からなり、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有する、請求項１１記載の使用。
オリゴヌクレオチドが配列番号１２またはその相補配列からなり、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有する、請求項１２記載の使用。
オリゴヌクレオチドが配列番号１２からなり、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有する、請求項１３記載の使用。
配列番号２からなるオリゴヌクレオチドならびに、少なくとも、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなるオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドのセット。
以下からなる、請求項１５記載のオリゴヌクレオチドのセット：
（ｉ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３からなるオリゴヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４からなるオリゴヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号５からなるオリゴヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号６からなるオリゴヌクレオチド；
（ｖ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号７からなるオリゴヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチド、配列番号４からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号５からなるオリゴヌクレオチド；ならびに
（ｖｉｉ）配列番号２からなるオリゴヌクレオチド、配列番号６からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号７からなるオリゴヌクレオチド。
配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号３からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１６記載のオリゴヌクレオチドのセット。
配列番号２からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号４からなるオリゴヌクレオチドからなる、請求項１６記載のオリゴヌクレオチドのセット。
以下を含むオリゴヌクレオチドのセット：
ａ）請求項１５、１６、１７または１８記載のオリゴヌクレオチドのセット；および
ｂ）配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチド。
以下を含む、請求項１９記載のオリゴヌクレオチドのセット：
ａ）請求項１５〜１８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドのセット；および
ｂ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群より選択される配列からなり、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有するオリゴヌクレオチド。
以下を含む、請求項２０記載のオリゴヌクレオチドのセット：
ａ）請求項１７または１８記載のオリゴヌクレオチドのセット；および
ｂ）配列番号１２からなり、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有するオリゴヌクレオチド。
以下からなる工程を包含する、生物学的試料において増幅によりＨＢＶを特異的に検出する方法：
ａ）請求項１５〜１８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドのセットを、生物学的試料または生物学的試料から得られた核酸調製物と、オリゴヌクレオチドが試料中に存在するＨＢＶ核酸にハイブリダイズするために適切な条件下で接触させる工程；
ｂ）オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してＨＢＶ核酸を増幅する工程；
ｃ）生物学的試料中のＨＢＶの存在を示す増幅産物を検出する工程。
ＨＢＶ核酸がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項２２記載の方法。
増幅産物の検出が、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、検出可能に標識されているオリゴヌクレオチドをプローブとして使用することによって実施される、請求項２２または２３記載の方法。
オリゴヌクレオチドが配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、一方の末端にフルオロフォア部分を、そして他方の末端にクエンチャー部分を有する、請求項２４記載の方法。
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５である、請求項２４または２５記載の方法。
以下を含む、生物学的試料中のＨＢＶを増幅するためのキット：
− 少なくとも、プライマーとして有用な、請求項１５〜１８のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドのセット；
−ＨＢＶ核酸を増幅するための手段。
増幅産物の検出のための手段をさらに含む、請求項２７記載のキット。
ＨＢＶ核酸を増幅するための手段がポリメラーゼ連鎖反応による増幅のための手段である、請求項２７または２８記載のキット。
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含み、検出可能に標識されており、そしてプローブとして有用なオリゴヌクレオチドを含む、請求項２７〜２９のいずれか１項記載のキット。
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１およびそれらの相補配列からなる群より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドが、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５である、請求項３０記載のキット。