KR101248426B1

KR101248426B1 - 변이된 ＨＢＶＳ 항원을 이용한 ＨＢｅ 항원 음성 만성 Ｂ형 간염 진단용 키트

Info

Publication number: KR101248426B1
Application number: KR1020100085942A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 이승애
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-02
Filing date: 2010-09-02
Publication date: 2013-03-28
Also published as: KR20120022382A

Abstract

본 발명은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변이된 S 항원 유전자 또는 단백질을 검출하여, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 진단할 수 있는 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트를 사용할 경우, HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적인 변이된 HBV S 항원 유전자 또는 단백질을 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 S 항원 유전자 또는 단백질을 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.

Description

변이된 ＨＢＶＳ 항원을 이용한 ＨＢｅ 항원 음성 만성 Ｂ형 간염 진단용 키트{A Diagnostic Kit for HBeAg-Negative Chronic Hepatitis B Using Mutated HBV S Antigen}

본 발명은 변이된 HBV S 항원을 이용한 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변이된 S 항원 유전자 또는 단백질을 검출하여, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 진단할 수 있는 진단용 키트에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계적으로 약 3억 명 이상이 감염되어 있으며, 궁극적으로 급, 만성 감염, 간경변증, 간세포암 등을 일으켜 만성 질환 이환율 및 사망률을 증가시킨다.

상기 HBV에 의하여 유발되는 질환 중의 하나인 HBe 항원 음성 만성 B형 간염은 HBV에 감염된 환자에서 생성되는 HBV 외피(envelope) 항원인 HBe항원이 검출되지 않는 만성 B형 간염을 의미하는데, 상기 질환은 HBe 항원생산과 연관된 preC 혹은 C 프로모터 영역에 유전자 변이가 발생한 변종 HBV에 의하여 발병하는 것으로 알려져 있다(참조: Hadziyannis S.J. et al., Viral. Hepat. Rev., 1:7-36, 1995). 상기 변종 HBV는 야생형 HBV보다도 숙주의 면역체계에 의한 공격을 회피할 가능성이 높기 때문에, 상기 변종 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 또는 상기 간염으로부터 유래된 간질환을 앓고 있는 환자는 전세계적으로 점차 증가되고 있는 실정이다(참조: Funk M.L. et al., J. Viral. Hepat., 9:52-61. 2002).

임상적 측면에서 HBe 항원 음성 만성 B형 간염은 일반적인 B형 간염에 비하여, HBV DNA 양이 적고, 간경변, 간암 등으로 간질환이 악화되는 증상과 밀접하게 연관되어 있으며, 자연적으로 치료될 확률이 상대적으로 매우 낮고, 인터페론을 이용한 치료효과 역시 상대적으로 저조하다고 알려져 있는 바, HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 조기진단할 수 있는 방법의 개발이 요구되었다(참조: Hadziyannis S.J. et al., Viral. Hepat. Rev., 1:7-36, 1995; Brunetto M.R. et al., J. Hepatol., 6:263-270, 2002).

한편, HBV의 표면 항원(S 항원)은 HBV의 가장 외막에 있기 때문에 숙주의 방어 면역 반응 및 백신의 주요 표적으로 지적되어 왔고, 특히, S 항원 중에서도 HBV에서 가장 바깥에 위치하는 부위인 100 내지 160 번째 아미노산에 속하는 부위인 주요 친수성 영역(major hydrophilic region, MHR)은 HBV 간염의 진행과 관련된 면역회피 유전자 변이의 주요 표적으로서, 인위적인 백신 및 면역항체에 의해 유도되는 유전자 변이의 주요표적으로서 알려져 있다. 이처럼 유전자 변이된 S 항원은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 같이 숙주의 면역활성을 회피할 수 있을 뿐만 아니라, 간세포 독성을 심화시킬 수도 있어, 임상증상의 악화와 S 항원의 유전자 변이 빈도와의 상관관계가 있을 것으로 추론할 수 있다.

이에, HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 관련성이 있는 S 항원의 유전자 변이를 검출할 수 있다면, 상기 HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 조기에 진단할 수 있을 것으로 기대되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 연관된 HBV의 변이된 S 항원 유전자를 발굴하고, 상기 유전자를 효과적으로 검출함으로써, HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 조기 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 상기 HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 관련성이 있는 S 항원의 유전자 변이가 S 항원의 110번 아미노산인 류신을 이소류신으로 치환시킬 수 있는 유전자 변이이고, 상기 유전자 변이 또는 변이된 단백질을 검출하는 키트를 사용할 경우, HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 조기진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 HBV의 변이된 S 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 검출함으로써, 이에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 용이하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 HBV의 변이된 S 항원 단백질을 검출함으로써, 이에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 용이하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 상기 단백질을 검출하는 키트의 표적이 되는, HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된 변이된 S 항원 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 상기 유전자를 검출하는 키트의 표적이 되는, 변이된 S 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일실시태양에 의하면, 본 발명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함한다.

다른 실시태양에 의하면, 본 발명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 (ⅰ) HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된(L110I) S 항원 단백질을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11 내지 18의 염기서열을 갖는 유전자 탐침; (ⅱ) 올리고 (dT)_15,-(CH₂)₆- 및 아민기를 순차적으로 포함하고, 상기 유전자 탐침의 5'말단이 티민부위에 연결된 링커; 및, (ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함한다.

또 다른 실시태양에 의하면, 본 발명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 (ⅰ) L110I S 항원 단백질에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판; (ⅱ) 페록시다제가 표지된 L110I S 항원 단백질에 대한 염소의 항체용액; 및, (ⅲ) 페록사이드를 포함한다.

한편, 상기 본 발명의 단백질을 검출하는 키트의 표적이 되는, HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 유발시키는 S 항원 단백질은 서열번호 5 내지 7로부터 선택되는 1개의 염기서열을 가지는 유전자에 의하여 코딩되며, 서열번호 8 내지 10으로부터 선택되는 1개의 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트를 사용할 경우, HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적인 변이된 HBV S 항원 유전자 또는 단백질을 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 S 항원 유전자 또는 단백질을 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.

도 1은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적인 변이된 HBV에 존재하는 S 항원의 변이된 아미노산 서열 및 S 항원 유전자의 변이된 염기서열과 야생형 HBV에 존재하는 S 항원의 아미노산 서열 및 S 항원 유전자의 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림이다.

본 발명자들은 HBV에 감염된 간질환 환자의 혈액으로부터 DNA를 수득하고, 이에 포함된 HBV S 항원의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 일부 환자로부터 수득한 S 항원 단백질의 110번 아미노산을 암호화하는 유전자가, 정상적인 류신을 암호화하는 ctt가 아니라, 이소류신을 암호화하는 att로 변이된 형태("L110I")로 존재하며, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 환자에서 유전자 변이율이 증가함을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명자들은 S 항원에서 L110I 변이를 나타내는 HBV는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 환자에 경우 더 변이율이 높은 균주이고, 이를 조기에 진단할 경우, B형 간염으로부터 유래된 간질환의 발병을 예방할 수 있을 것으로 판단하였는 바, S 항원에서 L110I 변이를 나타내는 HBV를 유전자 또는 단백질 수준에서 검출하여, HBe 항원 음성 만성 B형 간염을 진단할 수 있는 키트를 개발하고자 하였다.

본 발명의 일 실시태양에 의하면, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머를 포함한다. 상기 키트를 이용할 경우에는, 환자에서 수득한 DNA를 이용하여, 환자에 감염된 HBV의 S 항원의 L110I 변이를 검출함으로써, 전기 변이된 S 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 용이하게 진단할 수 있다.

본 발명의 다른 실시태양에 의하면, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 (ⅰ) HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된(L110I) S 항원 단백질을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11 내지 18의 염기서열을 갖는 유전자 탐침; (ⅱ) 올리고 (dT)_15,-(CH₂)₆- 및 아민기를 순차적으로 포함하고, 상기 유전자 탐침의 5'말단이 티민부위에 연결된 링커; 및, (ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함한다. 상기 키트를 이용할 경우에는, 대량의 시료로부터 HBV의 S 항원의 L110I 변이를 검출함으로써, 전기 변이된 S 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 용이하게 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트는 (ⅰ) L110I S 항원 단백질에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판; (ⅱ) 페록시다제가 표지된 L110I S 항원 단백질에 대한 염소의 항체용액; 및, (ⅲ) 페록사이드를 포함한다. 상기 키트를 이용할 경우에는, 환자의 혈액에 존재하는 변이 단백질을 직접 검출함으로써, 전기 변이된 S 항원 단백질을 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 용이하게 진단할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: S 항원의 유전자 변이주의 검색

실시예 1-1: HBV 환자의 DNA 수득

68명의 HBV에 감염된 만성 B형 간염환자(HBe 항원 음성 환자 37명, HBe 항원 양성 환자 31명) 로부터 채혈한 혈액으로부터 DNA를 수득하였다: 각 환자로부터 수득한 혈액의 혈청 100㎕에 DNAzol(Molecular Research Center, Inc., USA) 500㎕를 첨가하여 1분간 혼합하고, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(50:49:1, v/v/v) 혼합용매 500㎕를 첨가한 다음, 실온에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 상층액 400㎕를 수득하였다. 전기 상층액에 이소프로판올 260㎕를 가하고 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득하고, 전기 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 다시 Tris 완충용액(pH 7.8) 30㎕에 용해시켜서 각 환자의 DNA를 수득하였다.

실시예 1-2: HBV S 항원의 염기서열 분석

전기 수득한 각 환자의 DNA에 존재하는 HBV DNA의 S 항원 유전자 변이양상을 분석하기 위하여, HBV의 EcoRI 절단부위를 기준(1번)으로 하여, HBV의 S 지역을 포함하는 254 내지 794번까지의 540bp의 염기서열을 결정하고, S 항원의 유전형 변이양상을 분석하였다.

먼저, 전기 실시예 1-1에서 수득한 DNA를 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여(first denaturation: 95℃ 10분; 30 cycle: 95℃ 45초, 58℃ 60초, 72℃ 90초; final extension: 72℃ 5분), 2814번 내지 989번까지의 총 1,491bp 염기서열을 갖는 PCR 절편을 수득하였다.

정방향프라이머 DelF2: 5'-gggtcaccatattcttggg-3'(서열번호 1)

역방향프라이머 HB2R: 5'-catactttccaatcaatagg-3'(서열번호 2)

그런 다음, 전기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 하기의 프라이머를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 254 내지 794번째의 총 540-bp 염기서열을 갖는 PCR 절편을 수득하였다.

정방향프라이머 P7: 5'-gtggtggacttctctcaattttc-3'(서열번호 3)

역방향프라이머 P8: 5'-cggtawaaagggactcamgat-3'(서열번호 4)

이어, 수득한 각 540bp의 PCR 절편(254-294)을 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems Model 377 DNA Automatic Sequencer, Perkin-Elmer Applied Biosystems, UK)에 적용하여, 각 환자로부터 수득한 PCR 절편 중 모든 S 지역을 포함하는 총 540-bp(254-794bp) 염기서열을 결정하고, 이를 염기서열 분석프로그램(DNASTAR Megalign, Window Version 3.12e, Madison, USA)을 이용하여 GenBank에 등록된 HBV의 표준 염기서열과 비교분석하여, S 항원의 유전형 변이양상을 분석하였다(참조: 도 1).

도 1은 HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적인 변이된 HBV에 존재하는 S 항원의 변이된 아미노산 서열 및 S 항원 유전자의 변이된 염기서열과 야생형 HBV에 존재하는 S 항원의 아미노산 서열 및 S 항원 유전자의 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림으로서, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 환자로부터 수득한 시료는 J-HBV-104(서열번호 5의 S 항원 염기서열 및 서열번호 8의 S 항원 아미노산 서열), J-HBV-118(서열번호 6의 S 항원 염기서열 및 서열번호 9의 S 항원 아미노산 서열) 및 J- HBV -120(서열번호 7의 S 항원 염기서열 및 서열번호 10의 S 항원 아미노산 서열)이고, HBe 항원 양성 만성 B형 간염 환자로부터 수득한 시료는 J- HBV -61, J-HBV-154 및 J- HBV -158이다. 도 1에서 보듯이, 각 환자로부터 수득한 일부 시료에서 S 항원 유전자의 변이가 발견되었다. 즉, 정상적인 HBV의 S 항원 단백질의 110번 아미노산은 류신이고, 이를 암호화하는 유전자는 ctt이며, 일부 시료에서 수득한 PCR 절편에서는 S 항원 단백질의 110번 아미노산을 암호화하는 유전자가 ctt가 아닌, 이소류신인 att의 형태로 존재함을 확인할 수 있었다("L110I").

특히, HBe 항원 음성 만성 B형 간염환자(J-HBV-104, J-HBV-118 및 J-HBV-120)에서 L110I 변이를 암호화하는 S 항원 유전자(서열번호 5 내지 7)가 존재하였고, 이에 의하여 변이된 S 항원 단백질(서열번호 8 내지 10)이 발현될 것으로 예상되는 반면, HBe 항원 양성 만성 B형 간염환자 31명 중 1명(J-HBV-61)을 제외하고는 유전자 변이가 없는 야생형의 S 항원 유전자를 가지고 있음을 확인하였다.

아울러, 상술한 S 항원 단백질의 변이를 나타내는 시료를 HBV 환자의 유형에 따라 분류하였다(참조: 표 1). 이때, 변이율은 전체 환자수에 대한 변이 유전자를 갖는 환자수의 비율로 산출하였다.

만성 B형 간염환자의 유형에 따른 S 항원 단백질의 110번 아미노산을 암호화하는 유전자의 변이율

환자유형	환자수(변이율%)
환자유형	전체	정상	L110I
HBe 음성 만성 B형 간염환자	37명	30명(81.1%)	7명(18.9%)
HBe 양성 만성 B형 간염환자	31명	30명(96.8%)	1명(3.2%)

상기 표 1에서 보듯이, 상기 S 항원 단백질의 변이(L110I)는 HBe 항원 양성 만성 B형 간염환자에서는 한 명 발견되었으나, HBe 음성 만성 B형 간염환자에서는 7명이 발견되었으므로, 상기 S 항원 단백질의 변이가 HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 관련성이 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: DNA 칩을 이용한 변이된 S 항원 유전자의 검출

상기 실시예 1-2의 결과로부터 S 항원 단백질의 변이(L110I)가 HBe 항원 음성 만성 B형 간염과 관련성이 있음을 알 수 있었으므로, 상기 변이를 검출할 경우, 이로부터 HBe 항원 음성 만성 B형 간염의 발병여부를 진단할 수 있을 것으로 예상하고, 이를 위하여 HBV의 S 항원 유전자에서 L110I 변이를 검출할 수 있는 DNA 칩을 작제하였다.

실시예 2-1: DNA 칩의 작제

먼저, L110I 변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 다음과 같은 염기서열을 갖는 각각의 탐침을 제조하였다:

대조용 탐침:

5'-gtttgtcctctacttccaggaacatcaaca-3'(서열번호 11),

5'-tgttgatgttcctggaagtagaggacaaac-3'(서열번호 12)

검출용 탐침:

5'-ctctaattccaggaac-3'(서열번호 13),

5'-gtttgtcctctaattccaggaacatcaaca-3'(서열번호 14),

5'-tatgttgcccgtttgtcctctaattccaggaacatcaacaaccagtacgg-3'(서열번호 15),

5'-gttcctggaattagag-3'(서열번호 16),

5'-tgttgatgttcctggaattagaggacaaac-3'(서열번호 17),

5'-ccgtactggttgttgatgttcctggaattagaggacaaacgggcaacata-3'(서열번호 18)

다음으로, 올리고 (dT)₁₅, -(CH₂)₆- 및 아민기가 순차적으로 연결된 링커를 제조한 다음, 전기 제조한 각 탐침의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다. 이어, 전기 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 부착된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) SDS용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH₄ 용액(0.1g NaBH₄, 30㎖ PBS, 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차 증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 작제하였다.

실시예 2-2: DNA 칩을 이용한 L110I 변이주의 검출

전기 실시예 2-1에서 작제한 DNA 칩을 이용하여, HBV 환자로부터 L110I 변이를 검출하였다: 먼저, 전기 실시예 1에서 언급된 68명의 HBV에 감염된 간질환 환자(HBe 항원 음성 환자 38명, HBe 항원 양성 환자 31명)로부터 채취한 혈액을 RNA 추출키트(Micro-to-Midi Total RNA purification system, Life Technologies, USA)에 적용하여 각각의 mRNA를 분리하고, 역전사 키트(Platinum Biochip Reagent Kit, Genocheck, 한국) 및 시아닌 5 dGTP(Cyanine 5 dGTP, Amersham, GB)를 이용하여 전기 분리된 mRNA로부터 형광표지된 각각의 cDNA를 합성하였다.

이어, 전기 실시예 2-1에서 작제된 DNA 칩에 전기 합성된 각 cDNA를 가하고, 혼성화반응을 12시간동안 수행한 후, 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 DNA 칩에 구비된 대조용 탐침과 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내는 시료를 확인한 결과, 전기 실시예 1-2의 표 1에서 정상적인 S 항원 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 대조용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었고, 변이된 S 항원 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었다.

따라서, 상기 DNA 칩을 포함하는 키트를 이용하면, HBV에 감염된 환자로부터 변이된 S 항원 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 S 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.

실시예 3: L110I 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용한 HBe 항원 음성 만성 B형 간염의 진단

실시예 3-1: HBe 항원 음성 만성 B형 간염 특이적인 L110I S 항원의 수득

우선, 실시예 1-2에서 수득한 L110I 변이를 갖는 S 항원 유전자(서열번호 5)와 6개의 히스티틴을 암호화하는 유전자를 pPIC9K(Invitrogen, USA) 플라스미드 벡터의 다클론부위에 순서대로 삽입하여 L110I 변이를 갖는 S 항원의 C-말단에 6개의 히스티딘 잔기가 포함된 재조합 단백질을 발현시킬 수 있는 재조합 벡터를 수득하고, 이를 제한효소 Bgl II로 처리하여 직쇄형태로 형성한 다음, 공지된 방법에 따라 피치아 균주(Pichia pastoris, GS115 strain)에 도입하여(참조: Protocol of Multi-Copy expression kit, Version F 01/03/02, Invitrogen, USA), 형질전환체를 수득하였다.

상기 수득한 형질전환체를 공지된 방법에 따라 BMGY/BMMY 배지를 사용하여 6일 동안 배양하고(참조: Protocol of Multi-Copy expression kit, Version F 01/03/02, Invitrogen, USA), 배양물을 5,000rpm으로 원심분리하여 배양된 세포를 수득하였다.

상기 수득한 세포에 1X Trypsin-EDTA(GIBCO, Invitrogen, USA)를 처리하고, 멸균한 PBS로 세척한 후, 세포용해 완충용액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 1mM EDTA, 0.1 % SDS, 1X Protease Inhibitor, Calbiochem, USA) 50㎕를 가한 다음, 초음파 처리장치(sonicator, Minonix, USA)로 처리하여, 세포 파쇄물을 수득하였다.

상기 수득한 세포 파쇄물을 50㎛ 기공 크기를 갖는 미세필터(Millipore, USA)에 가하여 여과하고, 이를 Ni-NTA 레진(Qiagen, Japan)이 충진된 컬럼에 적용한 다음, 이에 용출용 완충용액(10mM KH₂PO₄, 300mM NaCl, 20mM imidazole, 8% glycerol, 0.2% Triton X-100, pH 7.8)을 가하여, 목적하는 L110I 변이를 갖는 S 항원 단백질을 수득하였다.

실시예 3-2: L110I 변이주 특이적인 ELISA 키트의 작제

상기 실시예 3-1에서 수득한 L110I S 항원 단백질(서열번호 8) 2㎖(10㎎/㎖)과 애주번트 2㎖을 혼합하고, 전기 혼합물을 7주령 웅성 토끼에 1주 간격으로 3회 주사한 다음, 2주간격으로 2회 주사하였다. 이어, 토끼의 혈액을 일부 채취하여, L110I S 항원에 대한 역가를 측정한 다음, 심장천공법(cardiac puncture)을 이용하여 토끼의 혈액을 모두 채취하였다. 전기 채취한 혈액은 상온에서 24시간 동안 방치하여, 상층액인 혈장부분만을 수득하였다. 이어, 전기 혈장을 12% 아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법에 적용하여, 전기영동하고, L110I S 항원을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 항체부분의 분자량을 확인하였다. 전기 확인된 분자량을 분리할 수 있는 젤여과 크로마토그래피에 전기 혈장을 적용하여, L110I S 항원에 대한 토끼의 항체를 활성분획으로 수득하였다.

또한, 상기 토끼 대신에 염소를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여 L110I S 항원에 대한 염소의 항체를 수득하고, 전기 수득한 L110I S 항원에 대한 염소의 항체에 페록시다제를 표지하였다.

그런 다음, 상기 수득한 L110I S 항원에 대한 토끼의 항체를 유리판 재질의 고정기판위에 고정시키고, 전기 페록시다제가 표지된 L110I S 항원에 대한 염소의 항체용액 100㎕와 50%(v/v) 글리세롤이 함유된 트리스 완충용액(50mM 트리스/HCl, pH 8.0) 900㎕를 혼합하여 제2항체를 제조하였으며, 발색제인 페록사이드(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, PIERCE, USA)를 별도로 준비하여, L110I 변이주 특이적인 ELISA 키트를 제작하였다.

실시예 3-3: L110I 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용한 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 특이적인 L110I S 항원의 검출

전기 실시예 1-2에서 검출한 L110I 변이를 나타내는 7명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염환자 및 L110I 변이를 나타내지 않는 7명의 HBe 항원 양성 만성 B형 간염환자로부터 각각의 간세포를 수득하고, 각각의 세포를 파쇄한 다음, 상기 파쇄물을 상기 실시예 3-2에서 작제한 ELISA 키트에 적용하였다. 그 결과, L110I 변이를 나타내는 7명의 HBe 항원 음성 만성 B형 간염환자로부터 수득한 간세포에서는 L110I S 항원이 검출되었으나, L110I 변이를 나타내지 않는 7명의 HBe 항원 양성 만성 B형 간염환자로부터 수득한 간세포에서는 L110I S 항원과 야생형 S 항원을 포함하는 그 어떤 항원도 상기 ELISA 키트에 의하여 검출되지 않음을 알 수 있었다.

따라서, 상기 L110I 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용하면, HBV에 감염된 환자로부터 변이된 S 항원 단백질을 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 S 항원 단백질을 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 HBe 항원 음성 만성 B형 간염 및 이로부터 유래된 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> A Diagnostic Kit for Hepatitis B-Associated Hepatic Disorder Comprising HBV S Antigen <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gggtcaccat attcttggg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 catactttcc aatcaatagg 20 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtggtggact tctctcaatt ttc 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cggtawaaag ggactcamga t 21 <210> 5 <211> 464 <212> DNA <213> J-HBV-104 <400> 5 cccacgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt 60 cctccaattt gtcctggcta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc 120 atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actaccaagg tatgttgccc 180 gtttgtcctc taattccagg aacatcaaca accagcacgg gaccatgcaa aacctgcacg 240 attcctgctc aaggaacctc tatgtttccc tcatgttgct gtacaaaacc ttcggacgga 300 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Claims

삭제
(ⅰ) 야생형 HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되어(L110I), 서열번호 8 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이된 S 항원 단백질을 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 11 내지 18의 염기서열을 갖는 유전자 탐침;
(ⅱ) 올리고 (dT)_15,-(CH₂)₆- 및 아민기를 순차적으로 포함하고, 상기 유전자 탐침의 5'말단이 티민부위에 연결된 링커; 및,
(ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판을 포함하는, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 키트.
(ⅰ) 야생형 HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환되어(L110I), 서열번호 8 내지 10으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 변이된 S 항원 단백질에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판;
(ⅱ) 페록시다제가 표지된 L110I S 항원 단백질에 대한 염소의 항체용액; 및,
(ⅲ) 페록사이드를 포함하는, HBe 항원 음성 만성 B형 간염 진단용 ELISA키트.
HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적이고, 서열번호 5 내지 7로부터 선택되는 1개의 염기서열을 가지는, HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된(L110I) S 항원 단백질을 암호화하는 유전자.
HBe 항원 음성 만성 B형 간염에 특이적이고, 서열번호 8 내지 10으로부터 선택되는 1개의 아미노산 서열을 가지는, HBV의 S 항원 단백질의 110번째 아미노산이 류신에서 이소류신으로 치환된(L110I) S 항원 단백질.