KR100764850B1 - Ｈｂｖ ｓ항원을 이용한 ｂ형 간염 진단용 키트 - Google Patents

Ｈｂｖ ｓ항원을 이용한 ｂ형 간염 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 간질환 환자에 특이적인 HBV의 변형된 S항원 유전자를 검출할 수 있는 B형간염 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 B형간염 진단용 키트를 사용할 경우, 유전형 C의 B형 간염을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 B형간염의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
간질환, HBV S 항원, B형 간염

Description

ＨＢＶ Ｓ항원을 이용한 Ｂ형 간염 진단용 키트{A Diagnostic Kit for Hepatitis B Employing HBV S Antigen}
도 1은 전기 각 환자로부터 수득한 PCR 절편에서 선택된 일부 시료를 제한효소인 Hinf-1로 절단하고, 이를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 2는 간염환자 특이적인 S 항원의 변이된 염기서열과 HBV 유전형 A, B, C, D의 야생형 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림이다.
도 3은 W182Ter 변이주의 유전형 S 항원을 293 cell line에 도입하기 위한 벡터의 유전자 지도이다.
도 4는 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원을 발현하는 세포에서 발현된 단백질을 W182Ter S 항원에 대한 토끼의 항체를 이용하여 웨스턴 블랏한 결과를 나타내는 사진이다.
도 5는 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원을 발현하는 세포에서 발현된 단백질의 양을 ELISA 키트를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 은 HphI ACRS(amplification created restriction site)를 이용하여 W182Ter S 항원의 유전자를 판별하는 방법을 나타내는 개략도 및 그의 결과를 나타 내는 전기영동사진이다.
본 발명의 HBV S항원을 이용한 B형간염 진단용 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 간질환 환자에 특이적인 HBV의 변형된 S항원 유전자를 검출할 수 있는 B형간염 진단용 키트에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 전세계적으로 약 3억 명 이상이 감염되어 있으며, 궁극적으로 급, 만성 감염, 간경변증, 간세포암 등을 일으켜 만성 질환 이환율 및 사망률을 증가시킨다.
HBV의 감염은 무증상 감염, 만성 간염, 간경변, 간세포암으로 이행하는 다양한 임상경과를 보이며, 이러한 임상경과에 영향을 미치는 요인으로서, HBV 염기서열 변이와 HBV 유전자형(genotype)이 주목받고 있는데, 최근의 연구결과에 의하면 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전형 C라고 보고되고 있다(참조: Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42(6):496-501, 2003). 대부분의 HBV가 유전형 B와 유전형 B에 비해 상대적으로 병원성이 높은 것으로 알려진 유전형 C를 동등한 수준으로 포함하는 것과는 달리, 국내환자에서 발견되는 유전형 C를 높은 빈도로 포함하는 HBV는 지역특이적인 변이주를 발생시킬 가능성이 높기 때문에, 이 에 대한 관심이 증폭되고 있는 실정이다.
HBV의 외피 항원(이하에서는, 편의상 "S 항원"이라 함)은 HBV의 가장 외막에 위치하고, S 항원 중에서도 HBV에서 가장 바깥에 위치하는 부위인 100 내지 160 번째 아미노산에 속하는 부위인 주요 친수성 영역(major hydrophilic region, MHR)은 HBV 간염의 감염을 방지하기 위한 백신 및 면역항체에 의해 유도되는 유전자 변이의 주요표적으로서 알려져 있다. 궁극적으로, HBV 질환이 숙주의 면역 활성에 의한 간세포 독성에 의해 유발되고 간 질환의 진행이 일반적으로 시간에 따른 연속적인 임상경과를 보인다는 관점에서 볼 때, 임상증상의 악화와 S 항원의 유전자 변이 빈도와의 상관관계가 있다는 것을 유추하기에 어렵지 않다. 또한, 국내에 존재하는 유전자형 C는 B 형에 비해 면역 제거시기가 길기 때문에, 유전자 변이에 더욱 민감하고 또한 연속적인 임상결과를 보인다고 알려져 있어, 국내 환자 유래 HBV는 다른 지역에 비해 임상증상의 악화와 S 항원의 유전자 변이주의 빈도와 더 상관관계가 있을 것으로 추론할 수 있다.
한편, S 항원에 대한 변이주는 이 부위가 백신 및 혈청학적 진단방법의 주요 표적이기 때문에, 보건 역학적으로 중요한 의미를 지닌다. S 항원에 대한 변이주 중의 일부는 기존의 혈청학적 방법으로 진단할 경우에, 위장된 음성의 결과를 나타낼 수 있음이 보고되었다(참조: Occult hepatitis B virus infection and its clinical implications, J. Viral Hepat., 9:243-257, 2002). 특히, 혈청학적 진단에 의해 S 항원 음성으로 판명된 간을 이식한 후에, 이식자의 혈청에서 HBV 변이주가 발견된 예들이 전세계적으로 보고되었고, S 항원의 유전자 변이주의 경우 백 신에 의한 항체의 형성된 사람들 사이에서도 수평적 감염을 일으킨다는 보고되었다(참조: Clinical significance of hepatitis B virus genotypes, variants, and mutants, Clin. Liver Dis., 8(2):321-352, 2004). 이러한 결과는, HBV에 관하여 지역적인 특이성을 나타내는 국내에서 발견된 HBV 특이적인 S 항원의 유전자 변이주가 발견된 가능성이 높음을 시사한다. 만일, 국내에서 발견되는 유전형 C의 빈도가 높은 HBV에서 B형 간염의 발병과 직접적으로 관련성이 있는 S 항원의 유전자 변이주를 효과적으로 검출할 수 있다면, 국내의 B형 간염환자의 확산을 예방할 수 있는 중요한 계기가 될 것으로 예상되고 있으나, 아직까지는 별다른 연구성과가 보고되지 않고 있는 실정이다.
따라서, 유전형 C의 B형 간염의 발병과 직접적으로 관련성이 있는 S 항원의 유전자 변이주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 유전형 C의 B형 간염의 발병과 직접적으로 관련성이 있는 S 항원의 유전자 변이주를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, S항원의 182번 아미노산에서 변이가 발생한 변이주를 검출할 수 있는 키트를 이용할 경우, 유전형 C의 빈도가 높은 HBV에서 B형 간염의 발병여부를 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 S 항원의 유전적 변이주를 검출하여 B형 간염을 진단할 수 있는 진단키트를 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명자들은 HBV의 S항원에 대하여 양성반응을 나타내는 유전형 C의 HBV 환자의 혈액으로부터 DNA를 수득하고, 이에 포함된 HBV S 항원의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 일부 환자로부터 수득한 S항원 단백질의 182번 아미노산을 암호화하는 유전자가 tgg가 아닌, 정지코돈인 tga 또는 tag로 변이된 형태(이하에서는, "W182Ter"라 함)로 존재하며, 임상증상의 악화정도가 악화될 수록(보균자->만성간염->간경변->간암), W182Ter 변이율이 증가함을 알 수 있었다. 또한, HBV의 감염으로 인하여 간암이 발병된 환자의 혈액으로부터 수득한 DNA를 분석한 결과, W182Ter 이외에도 6개 아미노산 부위(39 L→P, 103 M→T, 145 G→R, 155 S→F, 160 R,K→S, 184 V→A)에서 변이를 나타내고, 이러한 변이는 간경변 및 간암환자에서만 특이적으로 나타남을 확인하였는 바, W182Ter 변이를 나타내는 HBV(이하에서는, "W182Ter 변이주"라 함)는 간염의 증상을 악화시킬 수 있는 병원성이 높은 균주이며, 병원성이 높은 것으로 알려진 유전형 C HBV와 직접적으로 관련될 것이라고 예측되었다.
또한, 전기 W182Ter 변이주는 종래의 야생형 HBV S 항원을 검출할 수 있는 ELISA 키트에 의하여 정상적으로 검출되지 않음을 확인하였는 바, 보다 효과적으로 W182Ter 변이주를 검출할 수 있는 방법을 모색한 결과, HBV S 항원의 W182Ter 변이를 유전자 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있는 키트를 개발하게 되었다.
본 발명의 일 실시태양에 의하면, HBV의 W182Ter 변이를 유전자 수준에서 검출할 수 있는 키트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Hinf-1를 포함하는 HinfI PRA(PCR-Restriction analysis) 키트이다. 상기 HinfI PRA 키트를 이용할 경우에는, 환자에서 수득한 DNA를 이용하여, W182Ter 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에 의하면, HBV의 W182Ter 변이를 유전자 수준에서 검출할 수 있는 키트는 서열번호 18 내지 21의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 HphI를 포함하는 HphI ACRS(amplification created restriction site) 키트이다. 상기 HphI ACRS 키트를 이용할 경우에도, 환자에서 수득한 DNA를 이용하여, W182Ter 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, HBV의 W182Ter 변이를 유전자 수준에서 검출할 수 있는 키트는 W182Ter 변이를 검출할 수 있는 DNA 칩을 포함한다.
즉, (ⅰ) W182Ter S 항원의 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 7 내지 17의 염기서열을 갖는 유전자 탐침; (ⅱ) 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5′말단이 티민부위에 연결된 링커; 및, (ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base) 반응을 통해 연결된 고체기판으로 구성된 DNA 칩을 포함하는 진단키트를 이용할 경우, 대량의 시료로부터 HBV의 W182Ter 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에 의하면, 유전자 수준이 아니라 단백질 수준에서 HBV의 W182Ter 변이를 검출할 수 있는 ELISA 키트를 사용할 수도 있다. 즉, (ⅰ) W182Ter S 항원에 대한 토끼의 항체가 고정된 고정기판; (ⅱ) 페록시다제가 표지된 W182Ter S 항원에 대한 염소의 항체용액; 및, (ⅲ) 페록사이드를 포함하는, B형간염 진단용 ELISA키트를 이용할 경우, DNA를 추출하지 않고서도 HBV의 W182Ter 변이를 검출할 수 있다.
본 발명의 B형간염 진단용 키트를 사용할 경우, 유전형 C의 B형 간염을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 B형간염의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: S 항원의 유전자 변이주의 검색
실시예 1-1: HBV 환자의 DNA 수득
HBV의 S항원에 대하여 양성반응을 나타내는 197명의 유전형 C의 HBV 환자(간암 환자 120명, 간경변 환자 39명, 간염환자 25명 및 보균자 13명)로부터 채혈한 혈액으로부터 DNA를 수득하였다. 즉, 각 환자로부터 수득한 혈액의 혈청 100㎕에 DNAzol(Molecular Research Center, Inc., USA) 500㎕를 첨가하여 1분간 혼합하고, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(50:49:1, v/v/v) 혼합용매 500㎕를 첨가한 다음, 실온에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 상층액 400㎕를 수득하였다. 전기 상층액에 이소프로판올 260㎕를 가하고 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득하고, 전기 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 다시 Tris 완충용액(pH 7.8) 30㎕에 용해시켜서 각 환자의 DNA를 수득하였다.
실시예 1-2: HBV S 항원의 염기서열 분석
전기 수득한 HBV 환자의 DNA에 존재하는 HBV DNA의 S 항원 유전자 변이양상을 분석하기 위하여, HBV의 EcoRI 절단 부위를 1로 기준으로 하여, 256 내지 776번 염기서열을 결정하고, S항원의 182번 아미노산에 해당하는 부위에서의 유전형 변이양상을 분석하였다.
먼저, 전기 실시예 1-1에서 수득한 DNA를 주형으로 하고, 정방향 프라이머 1F: 5'-aagctctgctagatcccagagt-3'(서열번호 1) 및 역방향 프라이머로 2R: 5'-catactttccaatcaatagg-3'(서열번호 2)을 사용하여 PCR을 수행하여(first denaturation: 95℃ 10분; 30 cycle: 95℃ 45 초, 58℃ 60초, 72℃ 90 초; final extension: 72℃ 5분), 18 내지 989번 염기서열을 갖는 PCR 절편을 수득하였다.
그런 다음, 전기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 정방향 프라이머 P7: 5'-gtggtggacttctctcaattttc-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 P8: 5'-cggtawaaagggactcamgat-3'(서열번호 4)을 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 256 내지 776번 염기서열을 갖는 PCR 절편(514bp)을 수득하였다.
이어, 전기 수득한 각 PCR 절편(256-776)을 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems Model 377 DNA Automatic Sequencer, Perkin-Elmer Applied Biosystems, UK)에 적용하여, 각 환자로부터 수득한 PCR 절편(256-776)의 염기서열을 결정하고, 이를 염기서열 분석프로그램(DNASTAR Megalign, Window Version 3.12e, Madison, USA)을 이용하여 GenBank에 등록된 HBV의 유전형 B 및 유전형 C의 표준 염기서열과 비교분석하여, S항원의 182번 아미노산에 해당하는 부위에서의 유 전형 변이양상을 분석하였다.
그 결과, 각 환자로부터 수득한 S항원은 HBV의 유전형 C에 해당함을 확인하였다. 아울러, 정상적인 HBV의 S항원 단백질의 182번 아미노산은 트립토판이며, 이를 암호화하는 유전자는 tgg로 알려져 있으나, 전기 수득한 각 PCR 절편에서는 S항원 단백질의 182번 아미노산을 암호화하는 유전자가 tgg가 아닌, 정지코돈인 tga 또는 tag의 형태로 존재함(W182Ter)을 확인할 수 있었다.
이를 다시 확인하기 위하여, 전기 각 PCR 절편을 제한효소인 Hinf-1로 절단하고, 이를 전기영동하였다(참조: 도 1). 도 1은 전기 각 환자로부터 수득한 PCR 절편에서 선택된 일부 시료를 제한효소인 Hinf-1로 절단하고, 이를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다. 도 1에서 보듯이, 정상적인 S항원의 182번 아미노산에 해당하는 tgg 유전자를 갖는 경우에는(1 내지 11레인 및 13 내지 15레인) 각각 274bp, 148bp 및 104bp의 절편으로 분리되었으나, S항원의 182번 아미노산에 해당하는 유전자가 정지코돈을 나타내는 경우에는(12레인) 각각 274bp, 104bp, 82bp 및 66bp의 절편으로 분리됨을 알 수 있었는데, 이는 S항원의 182번 아미노산에 해당하는 유전자가 정지코돈을 나타내면 제한효소인 Hinf-1의 절단부위가 추가로 생성되기 때문인 것으로 분석되었다.
아울러, S항원 단백질의 182번 아미노산을 암호화하는 유전자가 정지코돈을 나타내는 시료를 HBV환자의 유형에 따라 분류하였다(참조: 표 1). 이때, 변이율은 전체 환자수에 대한 변이 유전자를 갖는 환자수의 비율로 산출하였다.
HBV 환자의 유형에 따른 S항원 단백질의 182번 아미노산을 암호화하는 유전자의 변이율 비교(단위: 명)
HBV 환자유형 환자수 변이율
전체 정상 유전자 변이 유전자
간암 120 82 38 31.7%
간경변 39 29 10 25.6%
만성간염 25 21 4 16.0%
보균자 13 12 1 7.7%
상기 표 1에서 보듯이, 임상증상의 악화정도가 악화될 수록(보균자->만성간염->간경변->간암), 변이율이 증가함을 알 수 있었다.
따라서, S항원 단백질의 182번 아미노산을 암호화하는 유전자의 변이(W182Ter)가 간질환의 악화와 밀접한 연관이 있으며, S항원 단백질의 유전자에서 전기 W182Ter 변이여부를 검출하면, HBV의 감염여부를 효과적으로 진단할 수 있을 것으로 예측되었다. 뿐만 아니라, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Hinf-1를 포함하는, HinfI PRA(PCR-Restriction analysis) 키트를 사용할 경우, HBV에 존재하는 W182Ter S 항원 변이주를 용이하게 검출하여, 보다 효과적으로 HBV의 감염여부를 진단할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2: 간암 특이적인 W182Ter 변이주의 전체 S 항원 염기서열 분석
전기 실시예 1-2에서 간암환자에서 수득한 S항원의 유전자에서 W182Ter 변이가 높은 비율로 나타남을 확인하였는 바, 우리나라 환자에서 특이적으로 발견되는 HBV로 인한 간암환자에 존재하는 HBV의 S 항원의 유전자에서도 W182Ter 변이가 나타나는지의 여부를 확인하였다.
간암 특이적인 W182Ter 변이 단백질(서열번호 25 내지 27)을 발현시키는 변이주(Jeju HCC 31, 32 및 44)에 감염된 3 명의 환자로부터 수득한 DNA(서열번호 22 내지 24) 및 일반적인 W182Ter 변이주(Jeju-HCC 35)의 DNA를 주형으로 하고, 973bp를 증폭하는 HB-1F와 HB-2R 프라이머 쌍을 이용하여 첫 번째 PCR을 수행한 다음, 전기 PCR 산물을 주형으로 하여, S 항원의 전체 681bp의 염기를 증폭시키는 프라이머인 Cys-F(5'-atggagarcacmacatcaggattcc-3')(서열번호 5)와 Cys-R(5'-tyaaatgtatacccaaagacamaag-3')(서열번호 6)를 이용한 PCR을 수행하여, 681bp의 증폭산물을 수득하였다. DNA 정제키트(QIAEXII SYSTEM, Qiagen, Germany) 및 TOPO SYSTEM(Invitrogen, USA)을 이용하여 전기 증폭산물의 염기서열을 결정한 다음, 상기 결정된 염기서열을 DNASTAR의 Megalign 프로그램에 적용하여 227개의 아미노산으로 전환 후 기존의 GenBank에 등록된 HBV 유전형 A, B, C, D의 야생형 염기서열과 비교분석하였다(참조: 도 2).
도 2는 간염환자 특이적인 S 항원의 변이된 염기서열과 HBV 유전형 A, B, C, D의 야생형 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림이다. 도 2에서 보듯이, 간염환자 특이적인 S 항원의 변이된 염기서열은 전기 확인된 182번 아미노산에서의 변이 이외에도 6개 아미노산 부위(39 L→P, 103 M→T, 145 G→R, 155 S→F, 160 R,K→S, 184 V→A)에서 변이를 나타내고, 이러한 변이는 간경변 및 간암환자에서만 특이적으로 나타남을 확인하였다(참조: 표 2).
HBV 환자의 유형에 따른 간암 특이적인 S항원 단백질을 암호화하는 유전자의 변이율 비교(단위: 명)
HBV 환자유형 환자수 변이율
전체 정상 유전자 변이 유전자
간암 120 109 11 9.2%
간경변 39 38 1 2.6%
만성간염 25 25 0 0%
보균자 13 13 0 0%
상기 표 2에서 보듯이, 39, 103, 145, 155, 160, 182 및 184번 아미노산의 변이는 간경변 및 간암환자에서만 특이적으로 나타났으므로, 이들의 변이주를 암호화하는 유전자(서열번호 22 내지 24) 또는 이로부터 발현된 단백질(서열번호 25 내지 27)을 이용할 경우, 간경변 및 간암환자를 조기진단할 수 있을 것으로 예측되었다.
실시예 3: W182Ter 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원의 검출방법
S 항원은 HBV 백신과 진단의 주요 표적이기 때문에, 정상적인 S 항원을 검출함으로써, 간염의 발병여부를 진단하기 위한 ELISA 키트와 같은 진단키트가 사용되어 왔다. 그러나, W182Ter 변이주에서 발현된 S 항원은 정상적인 S 항원을 검출하기 위하여 제조된 종래의 EKISA 키트로는 검출할 수 없을 것으로 예상되었는 바, 본 발명자들은 W182Ter 변이주에서 발현된 S 항원이 종래의 EKISA 키트로는 검출될 수 없는 진단회피주 또는 백신회피주이며, 이를 검출하기 위한 새로운 키트를 사용하여야만 함을 입증하고자 하였다.
실시예 3-1: W182Ter S 항원의 293 세포주에서의 대량발현
실시예 3-1-1: 형질도입 플라스미드 DNA의 수득
우선, 실시예 1-2의 12레인의 시료에 포함된 DNA를 주형으로 하고, 첫 번째 프라이머 쌍인 HB-1F와 HB-2R을 이용하여 증폭한 후, 두 번째 프라이머 쌍인 Cys-F와 Cys-R을 이용하여 681bp의 증폭산물을 확인하였다. 이어, 전기 증폭산물을 회수하고, TOPO 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝한 다음, 대장균에 도입하여 형질전환하고, 이를 LB 배지에서 24시간 진탕배양한 후, 배양물로부터 전기 증폭산물이 도입된 플라스미드 DNA를 수득하였다.
전기 수득한 플라스미드 DNA 10㎕, gaattc를 인지하는 EcoRI(TaKaRa, Japan) 2㎕(30 U), 10배 제한효소 완충용액 5㎕ 및 멸균 증류수를 넣어 최종부피 50㎕로 적정하고, 37℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, 전기영동하여 681bp의 절편을 수득하였다. 한편, pIRES2-EGFP(BD Bioscience, USA) 플라스미드 10㎕를 상술한 바와 동일한 방법으로 절단하였다.
전기 수득한 681bp의 절편과 절단된 pIRES2-EGFP 플라스미드를 3:1로 혼합하고, 라가아제 1㎕(350 units)와 10배 효소 완충용액 1㎕ 및 멸균 증류수를 넣어 최종 부피 10㎕로 적정한 다음, 16℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어, 반응물을 TOPO 벡터를 이용한 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여, 전기 반응물이 도입된 플라스미드 DNA를 수득하였다(참조: 도 3). 도 3은 W182Ter 변이주의 유전형 S 항원을 293세포주에 도입하기 위한 플라스미드 DNA의 유전자 지도이다.
실시예 3-1-2: 293 세포주의 배양
293 세포주(Invitrogen, USA)를 6-웰 플레이트에 2×105세포/웰이 되도록 분주한 후, 배양액(10% Fetal Bovine Serum, 1X Antibiotic-Antimycotics, 10,000 units/mL penicillin G sodium, 10,000㎍/mL streptomycin sulfate, 25㎍/mL amphotericin B(GIBCO, Invitrogen, USA)가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium)을 가하고, 37℃에서 5%(v/v) CO2 배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다.
실시예 3-1-3: 형질도입
전기 실시예 3-1-1에서 수득한 플라스미드 DNA를 전기 실시예 3-1-2에서 배양돈 293세포주에 도입함으로써, 형질도입된 변이주를 제조하였다.
구체적으로, 4 ㎍의 플라스미드 DNA, 2M CaCl2 12.4㎕ 및 멸균 증류수를 100㎕가 되도록 혼합하고, 100㎕의 2X HBS를 가한 다음, 실온에서 20분동안 반응시켰다. 이어, 전기 반응액을 배양한 293 세포주에 직접 넣은 후 37℃, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 배양하고, 신선한 배양액으로 교체한 다음, 다시 72시간 동안 배양하여 형질전환된 세포주를 수득하였다.
실시예 3-2: 간암특이적인 W182Ter S 항원의 293 세포에서의 대량발현
실시예 2에서 결정된 간암특이적인 유전자 변이주의 DNA를 주형으로 사용한 것을 제외하고는, 전기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 293 세포에서 간암특이적인 W182Ter S 항원을 대량으로 발현할 수 있는 형질도입된 세포주를 제조하였다.
실시예 3-3: 웨스턴 블럿 및 ELISA에 의한 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원의 검출
전기 실시예 3-1 및 3-2에서 수득한 형질전환된 세포주에 1X Trypsin-EDTA(GIBCO, Invitrogen, USA)를 처리하고, 멸균한 PBS로 세척한 후, 세포용해 완충용액(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 1mM EDTA, 0.1 % SDS, 1X Protease Inhibitor, Calbiochem, USA) 50㎕를 가한 다음, 초음파 처리장치(sonicator, Minonix, USA)로 처리하여, 세포 파쇄물을 수득하였다.
전기 수득한 세포 파쇄물의 단백질 농도를 정량한 후, 12% SDS PAGE로 전기영동한 다음, 야생형 S 항원에 대한 토끼의 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이때, 2차항체로는 페록시다제가 결합된 염소의 항-토끼 항체(Zymed, USA)를 사용하였고, 발색제로는 페록사이드를 사용하였다(참조: 도 4). 도 4는 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원을 발현하는 세포에서 발현된 단백질을 W182Ter S 항원에 대한 토끼의 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행한 결과를 나타내는 사진이다. 도 4에서, 1번 레인은 야생형 S항원을 나타내고, 2번 레인은 W182Ter 변이주 S 항원을 나타내며, 3번 레인은 간암 특이적인 W182Ter S 항원을 나타낸다. 도 4에서 보듯이, 226개의 아미노산으로 구성된 야생형 S 항원은 25-kDa의 단백질을 생산하지만, 182 번째 아미노산의 정지코돈의 변이에 의한 변이주들은 181 개의 아미노산으로 구성된 19-kDa의 미성숙 S 항원 단백질을 생산함을 확인할 수 있었다.
실시예 3-4: ELISA 키트를 이용한 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원의 검출
전기 실시예 3-3에서 사용된 각 시료를 다시 50배 희석한 희석시료 100㎍ 및 각 세포의 배양액 100㎍를 종래의 정상적인 S 항원 검출용 ELISA 키트(Bioelisa HBsAg colour Kit, BIOKIT, Spain)에 적용하여, 발현된 단백질의 양을 비교하였다(참조: 도 5). 도 5는 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원을 발현하는 세포에서 발현된 단백질의 양을 ELISA 키트를 사용하여 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 양성 대조군은 야생형 S 항원을 처리한 것이고, 음성 대조군은 야생형 S 항원을 처리하지 않은 것이며, 1번 내지 8번은 ELISA 키트에 처리된 각각의 실험군을 나타내는데, 1번 및 3번은 야생형 S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 세포파쇄물, 2번은 W182Ter S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 세포파쇄물, 4번은 간암 특이적인 W182Ter S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 세포파쇄물, 5번 및 7번은 야생형 S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 배양액, 6번은 W182Ter S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 배양액 및 8번은 간암 특이적인 W182Ter S 항원 유전자를 도입한 293세포주의 배양액을 나타낸다.
도 5에서 보듯이, 같은 양의 시료를 사용하였음에도 불구하고, 야생형 S 항원에 비하여, W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원은 정상적으로 검출되지 못하였다. 즉, 세포배양액의 경우, 야생형 S 항원보다 W182Ter 변이주 S 항원은 약 5배 이하의 수치를 나타내었고, 간암 특이적 W182Ter 변이주 S 항원은 약 10배 이하의 낮은 수치를 나타내었다. 또한, 세포파쇄물의 경우, 야생형 S 항원보다 W182Ter 변이주 S 항원은 약 2.5배 이하의 수치를 나타내었고, 간암 특이적 W182Ter 변이주 S 항원은 약 8배 이하의 낮은 수치를 나타내었다.
실시예 3-5: W182Ter 변이주 특이적인 ELISA 키트를 이용한 W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원의 검출
W182Ter S 항원 2㎖(10㎎/㎖)과 애주번트 2㎖을 혼합하고, 전기 혼합물을 7주령 웅성 토끼에 1주 간격으로 3회 주사한 다음, 2주간격으로 2회 주사하였다. 이어, 토끼의 혈액을 일부 채취하여, W182Ter S 항원에 대한 역가를 측정한 다음, 심장천공법(cardiac puncture)을 이용하여 토끼의 혈액을 모두 채취하였다. 전기 채취한 혈액은 상온에서 24시간 동안 방치하여, 상층액인 혈장부분만을 수득하였다. 이어, 전기 혈장을 12% 아크릴아미드 겔을 이용한 전기영동법에 적용하여, 전기영동하고, W182Ter S 항원을 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 항체부분의 분자량을 확인하였다. 전기 확인된 분자량을 분리할 수 있는 젤여과 크로마토그래피에 전기 혈장을 적용하여, W182Ter S 항원에 대한 토끼의 항체를 활성분획으로 수득하였다.
또한, 상기 토끼 대신에 염소를 이용한 것을 제외하고는, 상술한 방법과 동일한 방법을 이용하여 W182Ter S 항원에 대한 염소의 항체를 수득하고, 전기 수득한 W182Ter S 항원에 대한 염소의 항체에 페록시다제를 표지하였다.
그런 다음, 상기 수득한 W182Ter S 항원에 대한 토끼의 항체를 유리판 재질의 고정기판위에 고정시키고, 전기 페록시다제가 표지된 W182Ter S 항원에 대한 염소의 항체용액 100㎕와 50%(v/v) 글리세롤이 함유된 트리스 완충용액(50mM 트리스/HCl, pH 8.0) 900㎕를 혼합하여 제 2항체를 제조하였으며, 발색제인 페록사이드(SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, PIERCE, USA)를 별도로 준비하여, W182Ter 변이주 특이적인 ElISA 키트를 제작하였다.
전기 제작된 W182Ter 변이주 특이적인 ElISA 키트를 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법으로 세포파쇄물 및 세포배양액에 포함된 S 항원을 검출한 결과, W182Ter 변이주 및 간암 특이적인 W182Ter S 항원은 정상적으로 검출되었으나, 야생형 S 항원은 정상적으로 검출되지 못하였다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때, W182Ter 변이주 및 간암 특이 W182Ter S 항원의 항원성이 야생형의 항원성과는 상당히 다르므로, 이들 변이주들은 종래의 S 항원 진단방법을 이용할 경우, 검출되지 않을 가능성이 매우 높음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 W182Ter 변이주 S 항원 특이적인 진단키트를 종래의 진단방법과 병행하여 경우, 보다 효과적으로 B형 간염을 진단할 수 있을 것으로 예측되었다.
실시예 4: HphI ACRS(amplification created restriction site) 키트에 의한 W182Ter 변이주의 검출
직접염기서열 분석없이 제한효소 처리만으로 W182Ter 변이주를 검출할 수 있는 방법으로서, 다음과 같이 PCR-ACRS(Amplification Created Restriction Site) 키트를 개발하였다.
실시예 4-1: HphI ACRS 키트의 제작
화학적으로 합성한 프라이머인 Hph-I-outer-F1(5'-cacttgtattcccatcccatc-3'; sense nt. 595-615)(서열번호 18), HB-2R(5'-catactttccaatcaatagg-3'; sense nt. 989-970)(서열번호 19), Hph-I-inner-F2(5'-gtttactagtgccatttgttcggtg-3'; sense nt. 675-699)(서열번호 20) 및 Hph-I-inner-R2(5'-arcttccaattacatatcccatgaa-3'; sense nt. 896-871)(서열번호 21)과, 제한효소 HphI((주)바이오니아, 대한민국)를 포함하는 HphI ACRS 키트를 제작하였다.
실시예 4-2: HphI ACRS 키트를 이용한 W182Ter 변이주의 검출
전기 HphI ACRS 키트에 포함된 4종의 프라이머를 이용하여, 네스티드 PCR(nested PCR)을 실시하였다. 첫 번째 PCR은 실시예 1-1에서 수득한 각 환자의 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 Hph-I-outer-F1(서열번호 18)과 HB-2R(서열번호 19) 를 이용하여 수행하였다. 또한, 두 번째 PCR은 첫 번째 PCR 산물을 주형으로 하고, 프라이머 Hph-I-inner-F2(서열번호 20) 및 Hph-I-inner-R2(서열번호 21)를 이용하여 수행함으로써, 224bp의 증폭산물을 수득하였다.
그런 다음, 전기 224bp의 증폭산물 10㎕에 ggtga(n)8 부위를 인지하는 HphI(New England BioLabs, USA) 2㎕(10U), 10배 제한효소 완충용액 2㎕ 및 멸균 증류수를 넣어 최종부피를 20㎕로 맞추어, 37℃에서 하룻밤동안 반응시킨 다음, 이를 전기영동하여 증폭산물의 패턴을 확인하였다(참조: 도 6). 도 6은 HphI ACRS(amplification created restriction site)를 이용하여 W182Ter S 항원의 유전자를 판별하는 방법을 나타내는 개략도 및 그의 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 6에서 보듯이, Hph I 제한효소 좌위를 생산하기 위하여 전기 두 번째 PCR의 전방향 프라이머의 22 번째 염기를 a 대신에 g로 치환하였으므로(agtg → ggtg), W182Ter 유전자 변이주처럼 182 번째 코돈의 세 번째 염기가 g에서 a로 치환되면(tgg → tga), Hph-I 제한효소 인식위치(ggtga(n)8)가 생성되었다. 이후, Hph-I 제한효소를 처리하면, 야생형인 경우에는 절단되지 않고 224bp의 산물을 생산하는데 반하여(참조: 레인 3, 4, 9), 변이주인 경우에는 5' 말단에서 34bp 위치를 절단하게 하여 190bp의 절편이 생성됨을 확인하였다(참조: 레인 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13). 아울러, 야생형과 변이주가 혼재되어 있는 경우에는, 224bp 및 190bp의 절편이 동시에 나타남을 확인하였다(참조: 레인 3, 4). 따라서, 상기 HphI ACRS 키트를 이용할 경우, HBV의 S 항원 변이주를 용이하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: DNA 칩을 이용한 W182Ter 변이주의 검출
HBV의 S 항원 단백질 유전자에서 W182Ter 변이를 검출할 수 있는 DNA 칩을 제작하고 이를 이용하여, 환자에게서 W182Ter 변이를 검출하고자 하였다.
실시예 5-1: DNA 칩의 제작
먼저, W182Ter 변이 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 다음과 같은 염기서열을 갖는 각각의 탐침을 제작하였다:
대조용 탐침: 5'-taaacaagtcaccaagcgtcccg-3'(서열번호 7)
검출용 탐침: 5'-aagtcactaagcg-3'(서열번호 8), 5'-taaacaagtcactaagcgtcccg-3'(서열번호 9), 5'-atgatcacggtaaacaagtcactaagcgtcccgaaagggggtg-3'(서열번호 10), 5'-taaacaagtcactaagcgtcccgaaagggggtg-3'(서열번호 11), 5'-atgatcacggtaaacaagtcactaagcgtcccg-3'(서열번호 12), 5'-aagtcatcaagcg-3'(서열번호 13), 5'-taaacaagtcatcaagcgtcccg-3'(서열번호 14), 5'-atgatcacggtaaacaagtcatcaagcgtcccgaaagggggtg-3'(서열번호 15), 5'-taaacaagtcatcaagcgtcccgaaagggggtg-3'(서열번호 16), 5'-atgatcacggtaaacaagtcatcaagcgtcccg-3'(서열번호 17)
다음으로, 올리고(dT)15 , -(CH2)6- 및 아민(amine)기가 순차적으로 연결된 링커를 작제한 다음, 전기 제작한 각 탐침의 5' 말단을 링커의 티민부위에 연결시켰다. 이어, 전기 링커와 연결된 탐침을 완충용액(350mM sodium bicarbonate, ph 9.0)에 각각 50μM로 용해시키고, 알데히드가 부착된 슬라이드(silylated slide, CSS-100, CEL, USA) 표면에 어레이어(MicroGrid II, BioRobotics, USA)를 이용하여 크기 150㎛, 간격 400㎛로 점적한 후, 시프염기 반응을 수행하였다. 이어, 0.2%(w/v) SDS용액과 3차 증류수를 이용하여 순차적으로 세척하고, NaBH4 용액(0.1g NaBH4, 30㎖ PBS, 10㎖ ethanol)에 15분 동안 침지하여, 아민이 결합되지 않은 알데히드 잔기를 환원시킨 후, 3차증류수로 세척하고 건조시켜서 DNA 칩을 제조하였다.
실시예 5-2: DNA 칩을 이용한 W182Ter 변이주의 검출
전기 실시예 5-1에서 제작한 DNA 칩을 이용하여, HBV 환자로부터 W182Ter 변이를 검출하였다.
먼저, 전기 실시예 1에서 준비된 197명의 HBV 환자(간암 환자 120명, 간경변 환자 39명, 간염환자 25명 및 보균자 13명)로부터 채취한 혈액을 RNA 추출키트(Micro-to-Midi Tatal RNA purification system, Life Technologies, USA)에 적용하여, 각각의 mRNA를 분리하였고, 역전사 키트(Platinum Biochip Reagent Kit, Genocheck, 한국) 및 시아닌 5 dGTP(Cyanine 5 dGTP, Amersham, GB)를 이용하여 전기 분리된 mRNA로부터 형광표지된 각각의 cDNA를 합성하였다.
이어, 전기 실시예 3-1에서 제조된 DNA 칩에 전기 합성된 각 cDNA를 가하고, 혼성화반응을 12시간동안 수행한 후, 혼성화반응이 종결된 DNA 칩을 평판 스캐너(GenePix Scanner 4000A, Axon Inc, USA)으로 스캔하여, 전기 DNA 칩에 구비된 대조용 탐침과 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내는 시료를 확인하였다. 그 결과, 전기 실시예 1-2의 표 1에서 정상 S 항원 단백질 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 대조용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었고, 변형된 S 항원 단백질 유전자를 갖는 것으로 판별된 환자의 시료는 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었는 바, 상기 제작된 DNA 칩을 이용하면, HBV 환자로부터 W182Ter 변이를 용이하게 검출할 수 있음을 확인하였다.
다만, 보균자의 시료 중에서 1명의 시료는 검출용 탐침과 대조용 탐침에서 모두 형광발색반응을 나타내었고, 만성간염 환자의 시료중에서는 4명의 시료가 검출용 탐침에서 형광발색반응을 나타내었고, 그 중에서도 2명의 시료는 대조용 탐침에서도 형광발색반응을 나타내었는데, 이는 HBV의 병증이 심화되면서 정상 S 항원 단백질 유전자가 변형된 S 항원 단백질 유전자로 변형되는 과정에서, 양자 유전자를 모두 포함하기 때문인 것으로 예상되었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 간질환 환자에 특이적인 HBV의 변형된 S항원 유전자를 검출할 수 있는 B형간염 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 B형간염 진단용 키트를 사용할 경우, 유전형 C의 B형 간염을 특이적으로 검출할 수 있으므로, 보다 효과적인 B형간염의 조기진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 Hinf-1를 포함하는, B형간염 진단키트.
  2. 서열번호 18 내지 21의 염기서열을 갖는 프라이머 및 제한효소 HphI를 포함하는, B형간염 진단키트.
  3. (ⅰ) W182Ter S 항원의 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 서열번호 7 내지 17의 염기서열을 갖는 유전자 탐침;
    (ⅱ) 올리고 (dT)15, -(CH2)6- 및 아민(amine)기를 순차적으로 포함하고, 전기 유전자 탐침의 5′말단이 티민부위에 연결된 링커; 및,
    (ⅲ) 표면에 알데히드가 부착되고, 전기 링커의 아민기가 표면의 알데히드기와 시프염기(Schiff's base)반응을 통해 연결된 고체기판으로 구성된 DNA 칩을 포함하는 B형간염 진단키트.
  4. 삭제
  5. 서열번호 22 내지 24(Jeju-Hcc 31, 32, 44) 중의 어느 하나의 염기서열로 구성된 간암 특이적인 HBV의 S 항원 유전자.
  6. 서열번호 25 내지 27(Jeju-Hcc 31, 32, 44) 중의 어느 하나의 아미노산서열로 구성된 간암특이적인 HBV의 S 항원 단백질.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4959323A (en) * 1985-11-04 1990-09-25 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US4959323A (en) * 1985-11-04 1990-09-25 Mt. Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Production and use of pre S polypeptides of hepatitis B virus

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