CN108570498A

CN108570498A - 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108570498A
Application number: CN201810516170.3A
Authority: CN
Inventors: 孙秀莲; 苏桂锋; 李轶群
Original assignee: SHANDONG WEIZHEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANDONG WEIZHEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2018-09-25
Anticipated expiration: 2038-05-25
Also published as: CN108570498B

Abstract

本发明公开了一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用，该引物探针组合物包括用于扩增CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1位点的三对特异性引物和三条特异性荧光探针。本发明引物和探针灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强，采用非对称PCR扩增和荧光探针熔解曲线分析技术相结合的方式检测基因多态性，只根据熔解峰的数量和Tm值即可有效区分不同基因型，结果判读便捷、明确、客观。单管加样即可同时检测3个基因位点的6种突变类型，操作简单、方便，提高了检测效率，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

Description

用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

华法林是间接作用的香豆素类口服抗凝药，通过抑制维生素K在肝脏细胞内合成凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ，从而发挥抗凝作用，是临床应用最广泛的口服抗凝药物，可防止血栓形成与发展，适用于预防和治疗血栓栓塞性疾病，如治疗血栓栓塞性静脉炎，降低肺栓塞的发病率和死亡率，减少外科大手术、风湿性心脏病、髋关节固定术、人工置换心脏瓣膜手术等的静脉血栓发生率。并可作为心肌梗塞的辅助用药。

华法林个体差异大、治疗窗口窄，因而调整或确定华法林剂量、避免出血等不良反应发生，一直是临床上抗凝治疗管理的重点和难点。剂量过大导致出血，严重者将危及生命，而剂量不足难以达到预期抗凝疗效。同时华法林用药的个体差异很大，达到相同作用效果，高低剂量者相差10倍以上。因此临床上如何合理使用华法林已经成为一个难题。

已知有多种因素影响华法林的剂量，如年龄、性别、种族、体表面积、饮食等，但是这些因素不足以完全解释华法林用药剂量的差异，随着分子生物学的发展，人们发现编码华法林代谢和药效的酶的基因存在遗传多态性，而且在很大程度上解释了华法林抗凝效果的个体差异和种族差异。美国FDA建议华法林在用药前应做相关基因型检测，为指导华法林的临床用药提供新的依据，从而可以做到个性化给药。

华法林有两种构象：R和S。其中S—华法林的作用占60-70％，而R—华法林只有30-40％。S—华法林主要由CYP2C9代谢生成无活性的代谢产物。CYP2C9的基因多态性与华法林剂量间的关系早已被证实。研究发现CYP2C9存在多种基因多态性，目前发现已超过60种，但最为常见的是CYP2C9*1、CYP2C9*2 和 CYP2C9*3。CYP2C9*2（rs1799853，c.430C>T）纯合突变导致酶活降低，其活性是野生型活性的16％-20％，白种人中CYP2C9*2突变频率高达11％，而在亚洲人群中则极为罕见；CYP2C9*3（rs1057910，c.1075A>C）纯合突变也导致酶活降低，其活性仅为野生型的4％-6％，在中国人中的突变频率可达3.3％。突变降低了酶活性使其底物的清除率降低，血药浓度升高，因此，需降低用药剂量，以防止不良反应的发生。CYP2C9可以解释约20％的华法林剂量。

维生素K环氧化物还原酶（VKORC）是一个多蛋白复合体，是华法林作用的靶点，也是维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，目前已有一系列VKORC1基因的单核苷酸多态性（-1639A>G）与华法林剂量的相关性报道。VKORC1基因位于16号染色体，含有3个外显子，编码163个氨基酸组成的蛋白。VKORC1激活VKORC，突变型的启动子活性高，VKORC的活性变高，凝血作用高，华法林的用量变大。VKORC1基因多态性是影响华法林用药剂量个体差异和种族差异的主要因素。VKORC1可以解释约30％的华法林剂量。

因此在临床用药过程中，应首先对患者进行CYP2C9和VKORC1的基因多态性检测，再加上年龄、性别和体重解释约61％的华法林个体用药差异。目前，根据不同基因型和年龄、体重的组合来调节华法林个体化用药的剂量公式已经比较完善。

目前，对于CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、焦磷酸测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；芯片法涉及基因特异扩增，杂交，检测等多个步骤，可进行高通量分析，但其成本较高，检测步骤复杂且对样本数量有一定的要求；高分辨率熔解曲线法步骤简单，不需要做扩增后处理，但其不含特异性荧光探针，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法，采用ARMS引物进行特异扩增，操作方法简单，无需扩增后处理，但其引物设计难以最优化，检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法。

发明内容

针对现有基因多态性检测技术存在的不足，本发明提供了一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，该组合物特异性强，检测灵敏度高，包括三对特异性引物和三条特异性荧光探针，采用该组合物通过PCR扩增能够快速、方便的同时检测出CYP2C9和VKORC1基因三个位点的六种突变类型。

本发明还提供了包含上述组合物的试剂盒，该试剂盒使用方便，操作简单，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

本发明还提供了上述组合物或试剂盒在检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性中的应用及检测方法，在检测时，单管PCR反应中即可同时检测3个基因位点的6种突变类型，灵敏度高，特异性好，无须扩增后处理，操作简单、方便，结果易判读，提高了检测效率，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

本发明具体技术方案如下：

一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，该组合物包括用于扩增CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1（-1639G>A）位点的三对特异性引物；

所述用于扩增CYP2C9*2位点的特异性引物包括正向引物CYP2C9*2-F和反向引物CYP2C9*2-R，如下:

CYP2C9*2-F：5’GGATGGAAAACAGAGACTTA 3’，如SEQ ID NO:1所示；

CYP2C9*2-R：5’GTCAGTAGAGAAGATAGTAGTCCAGT 3’，如SEQ ID NO:2所示；

所述用于扩增CYP2C9*3位点的特异性引物包括正向引物CYP2C9*3-F和反向引物CYP2C9*3-R，如下:

CYP2C9*3-F：5’AACGTGTGATTGGCAGAA 3’，如SEQ ID NO:3所示；

CYP2C9*3-R：5’TAGCCCCAAACTGGAAACAAGAG 3’，如SEQ ID NO:4所示；

所述用于扩增VKORC1（-1639G>A）位点的特异性引物包括正向引物VKORC1-F和反向引物VKORC1-R，如下:

VKORC1-F：5’CTCAAGTGATCCACCCACCT 3’，如SEQ ID NO:5所示；

VKORC1-R：5’TAGAAGAGAGTAGATGTGAGAAAC 3’，如SEQ ID NO:6所示。

进一步的，上述组合物除了含有三对特异性引物外，还包括三条特异性荧光探针，如下：

（1）用于检测CYP2C9*2位点的特异性荧光探针CYP2C9*2-P：

5’CATTCTTGAACACGGTCCTCAATG 3’，如SEQ ID NO:7所示；

（2）用于检测CYP2C9*3位点的特异性荧光探针CYP2C9*3-P：

5’TCCGAAGGTCAATGTATCTCTGGACC 3’，如SEQ ID NO:8所示；

（3）用于检测VKORC1位点的特异性荧光探针VKORC1-P：

5’AATAAACAACCATTGGCCGGGTG 3’，如SEQ ID NO:9所示。

进一步的，上述三条特异性荧光探针在5’末端区域具有荧光基团，在3′末端区域具有淬灭基团，为双标记探针。这三条特异性荧光探针的荧光基团均不相同。

进一步的，所述荧光基团可以是FAM、HEX、ROX等，所述淬灭基团可以是BHQ1、BHQ2等。优选的，CYP2C9*2特异性荧光探针CYP2C9*2-P的5’端标记有FAM荧光基团，CYP2C9*3特异性荧光探针CYP2C9*3-P的5’端标记有HEX荧光基团，VKORC1特异性荧光探针VKORC1-P的5’端标记有ROX荧光基团。

进一步的，上述3条特异性荧光探针均进行了硫代修饰，所述硫代修饰位点均为5’端第1-4个碱基之间的磷酸二酯键。即每条特异性荧光探针5’端第1和2个碱基之间、第2和3个碱基之间、第3和4个碱基之间的磷酸二酯键均进行了硫代修饰。

本发明上述组合物包括三对特异性引物和三条特异性荧光探针，该三对特异性引物可以扩增出CYP2C9*2（430C>T）位点、CYP2C9*3（1075A>C）位点和VKORC1（-1639G>A）位点六种突变类型，特异性强，避免了引物之间的相互干扰。这三条特异性荧光探针能够分别检测出CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的多态性，灵敏度和准确度高。且在使用过程中，这些引物和探针可以放入同一单管、同一体系中使用，可以同时检测这3个基因位点的6种突变类型，操作简便，效率高。

进一步的，本发明提供了一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，即包括上述用于扩增CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1（-1639G>A）位点的三对特异性引物和用于检测CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1（-1639G>A）位点的三条特异性荧光探针。

进一步的，该试剂盒还包括PCR混合反应液。其中，所述PCR混合反应液包括：DNA聚合酶、10×HA Buffer、5×Probe qPCR Buffer、dNTPs、dUTP、UDG酶、ddH₂O等。所述DNA聚合酶优选为特异性抗体修饰的热启动型DNA聚合酶（High Affinity HotStart Taq ）。

进一步的，该试剂盒中还包括阳性质控品和阴性对照品。所述阳性质控品包括六种质粒载体，所述六种质粒载体如下：携带CYP2C9*2（430C>T）纯合野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体；携带CYP2C9*3（1075A>C）纯合野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体、和携带VKORC1（-1639G>A）纯合野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体的混合物。所述阴性对照品为ddH₂O。

进一步的，在试剂盒中，三对特异性引物、三条特异性探针和PCR混合反应液混合在一起进行包装，即用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液混合在一起进行包装。优选的，三对特异性引物、三条特异性探针和PCR混合反应液为16μl/反应。

进一步的，在试剂盒中（即用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液的混合物中），正向引物CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1-1.5μM（即μmol/L，下同），反向引物CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.05-0.08μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.08-0.15μM 。在本发明某一具体实施方式中，用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液的混合物中，正向引物CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1.25μM，反向引物CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.0625μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.1μM 。本发明特异性引物和特异性探针的浓度决定了荧光定量PCR为非对称扩增，正向引物浓度高，反向引物浓度低，因此PCR扩增产物中正向DNA产物远多于反向DNA产物，而特异性荧光探针可以与正向DNA产物反向互补形成杂交双链，在熔解步骤中提高检测的灵敏度和准确度。

本发明上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物（也可以称为引物探针组合物）和上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒（简称试剂盒）可以用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因的多态性，使用它们单管即可同时得到三个位点的六种突变类型，快速、灵敏，使用方便。检测人类CYP2C9和VKORC1基因的多态性，除了可以指导华法林用药外，还可以用于检测普通人群的CYP2C9和VKORC1基因的多态性，以便统计和研究CYP2C9和VKORC1基因多态性对人类其他机能的影响。因此，该引物探针组合物和试剂盒在检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性中的以非治疗或非诊断为目的的应用在本发明保护范围之内。采用该引物和探针组合物和试剂盒可以通过PCR扩增单管同时检测出CYP2C9和VKORC1基因CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点三个位点的六种突变类型，且无需对扩增产物进行后处理，简单、高效、灵敏、特异性好。

进一步的，本发明提供了一种使用上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物或者试剂盒来检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法（非诊断和治疗目的），具体步骤如下：

（1）提取待检样本的基因组DNA，作为DNA模板；

（2）上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液混合在一起，加入DNA模板，进行荧光PCR扩增反应；

（3）反应结束后，分析扩增产物的熔解曲线，通过熔解峰的个数和Tm值来确定CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的基因型。

采用本发明特异性引物和特异性探针，可以很好的扩增出CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的基因片段，并且特异性荧光探针能使不同基因型的熔解曲线和Tm值产生明显的、直观的差异，因此在检测时可以采用非对称PCR扩增和荧光探针熔解曲线分析技术相结合的方式，通过熔解峰的个数和Tm值即可区分不同的基因型。纯合基因型时，相对应的荧光通道熔解峰的个数为1个，杂合基因型时，相对应的荧光通道熔解峰的个数为两个；同一基因位点的野生型和突变型的熔解峰的Tm值差值≥5℃，差别明显，便于判读。因此，根据熔解峰的数量和Tm值两者结合即可有效区分不同突变型，结果判读明确、客观。同时，因为特异性荧光探针存在不同荧光基团，通过荧光通道可以区别各基因位点，因此可在单管PCR反应中同时检测3个基因位点的共6种突变类型，灵敏度高，特异性好，结果易判读，且操作简单、方便，可进行大批量样本的检测，提高了检测效率。

进一步的，步骤（2）中，将引物探针组合物、PCR混合反应液配制成PCR Mix储存于-20℃,检测时只需加入DNA模板混合，即可配成PCR反应体系，将该PCR反应体系加入一个PCR管中，进行荧光PCR扩增反应。此外，阳性质控品和阴性对照品分别替代DNA模板加到单独的含有PCR Mix的PCR管中，作为对照。

进一步的，在含有引物探针组合物、PCR混合反应液和DNA模板的PCR反应体系中，正向引物CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1-1.5μM（即μmol/L，下同），反向引物CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.05-0.08μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.08-0.15μM 。优选的，正向引物CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1.25μM，反向引物CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.0625μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.1μM 。

进一步的，所述荧光PCR扩增反应条件为：50℃，2min；95℃，预变性5min；95℃，变性10s，61℃，退火30s（采集荧光信号），72℃，延伸15s，35个循环。

进一步的，获得熔解曲线的反应条件为：95℃，1min；40℃，1min，40℃-75℃，以0.5℃梯度上升，每一增量温度保持5S（采集荧光信号）。

进一步的，本发明三个特异性荧光探针具有不同的荧光基团，在PCR反应过程中，每个特异性荧光探针需要一个荧光通道，共需要三个荧光通道。且3个荧光通道可以互为内控，每个荧光通道都至少有一个熔解峰升起，否则即为检测结果无效，因此不再需要内控基因的加入。本发明通过每个荧光通道的熔解峰的个数和Tm值来判断每个位点的基因型。基因型判定方法如下：

(1)CYP2C9*2位点荧光通道：检测熔解曲线过程中，如果出现一个熔解峰，且Tm值为58±1.5℃，则CYP2C9*2位点为纯合突变型，即（430TT）；如果出现一个熔解峰，且Tm值为63±1.5℃，则CYP2C9*2位点为纯合野生型，即（430CC）；如果出现两个熔解峰，且Tm值分别为58±1.5℃和63±1.5℃，则CYP2C9*2位点为杂合突变型，即（430CT）。

(2)CYP2C9*3位点荧光通道：检测熔解曲线过程中，如果出现一个熔解峰，且Tm值为55±1.5℃，则CYP2C9*3位点为纯合突变型，即（1075CC）；如果出现一个熔解峰，且Tm值为62.5±1.5℃，则CYP2C9*3位点为纯合野生型，即（1075AA）；如果出现两个熔解峰，且Tm值分别为55±1.5℃和62.5±1.5℃，则CYP2C9*3位点为杂合突变型，即（1075AC）。

(3) VKORC1位点荧光通道：检测熔解曲线过程中，如果出现一个熔解峰，且Tm值为57±1.5℃，则VKORC1基因为纯合突变型，即（-1639AA）；如果出现一个熔解峰，且Tm值为65.5±1.5℃，则VKORC1基因为纯合野生型，即（-1639GG）；如果出现两个熔解峰，且Tm值分别为57±1.5℃和65.5±1.5℃，则VKORC1基因为杂合突变型，即（-1639GA）。

进一步的，阳性质控品中，因含有CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点这三个位点的纯合野生型和纯合突变型六种质粒载体，因此在检测熔解曲线过程中，每个位点相应的荧光通道中均存在两个熔解峰。

进一步的，待检样本优选为全血。基因组DNA可以用酚氯仿抽提法、磁珠法或直接选用市售全血基因组DNA纯化试剂盒进行提取。待检样本可以是临床病人的样本，也可以是普通人群的样本。

进一步的，上述方法可以同时检测多个待检样本，当待检样本多个时，仅需将上述PCR Mix（即上述用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR反应液）加入不同的PCR反应管中，然后加入不同待检样本的基因组DNA，配成PCR反应体系，然后将不同的PCR反应管放入荧光定量PCR仪中进行PCR扩增即可。

本发明提供了能够在同一体系中同时检测出CYP2C9和VKORC1基因三个位点的基因多态性的引物、探针、试剂盒以及检测方法，采用非对称PCR扩增和荧光探针熔解曲线分析技术相结合的方式，可以快速、灵敏的检测出CYP2C9和VKORC1基因三个位点的基因多态性。与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明特异性探针可以使同一基因位点的野生型和突变型熔解峰的Tm值差值≥5℃，纯合基因型和杂合基因型熔解峰的个数不同，因此只根据熔解峰的数量和Tm值即可有效区分不同基因型，结果判读便捷、明确、客观。

（2）单管加样即可同时检测3个基因位点的6种突变类型，操作简单、方便，提高了检测效率，可进行大批量样本的检测，有利于临床操作。

（3）3个荧光通道互为内控，每个荧光通道都至少有一个熔解峰升起，否则即为检测结果无效，不再需要内控基因的加入。

（4）引物和探针灵敏度高、特异性强。可以准确检测出最低上样量2ng/反应样本的基因多态性，检测限低，减少了假阴性结果的出现。对CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的其他同源基因和其他位点不产生扩增，在胆红素、胆固醇、甘油三酯等内源性干扰物和阿司匹林、蔗糖等外源性干扰物存在的情况下检测结果依然准确，抗干扰能力强。

（5）检测时全封闭反应，无需对PCR产物进行后处理，避免了PCR产物的污染，减少了假阳性结果的出现。

（6）检测速度快，从标本送检到出结果可在3个小时以内即可完成。可以同时对大批量样本进行检测，3小时内同时出检测结果，大大提高了检测效率。

附图说明

图1 本发明实施例1中CYP2C9*1/*1基因型FAM、HEX通道Tm值及熔解曲线。

图2本发明实施例1中CYP2C9*1/*2基因型FAM、HEX通道Tm值及熔解曲线。

图3本发明实施例1中CYP2C9*1/*3基因型FAM、HEX通道Tm值及熔解曲线。

图4本发明实施例1中VKORC1野生型ROX通道Tm值及熔解曲线。

图5本发明实施例1中VKORC1杂合突变型ROX通道Tm值及熔解曲线。

图6本发明实施例1中VKORC1纯合突变型ROX通道Tm值及熔解曲线。

图7本发明实施例1中CYP2C9*1/*2且VKORC1为杂合突变型FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图8本发明实施例1中CYP2C9*1/*3且VKORC1为杂合突变型FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图9本发明实施例1中CYP2C9*1/*3且VKORC1为纯合野生型FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图10本发明实施例1中阳性质控品FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图11本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，纯合基因型FAM通道的Tm值及熔解曲线。

图12本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，杂合突变基因型FAM通道的Tm值及熔解曲线。

图13本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，纯合基因型HEX通道的Tm值及熔解曲线。

图14本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，杂合突变基因型HEX通道的Tm值及熔解曲线。

图15本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，纯合基因型ROX通道的Tm值及熔解曲线。

图16本发明实施例2中DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，杂合突变基因型ROX通道的Tm值及熔解曲线。

图17本发明实施例2中正常血液样本的FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图18本发明实施例2中加入0.5mg/ml胆红素的血液样本的FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

图19本发明对比例1中 HEX通道Tm值及熔解曲线。

图20本发明对比例2 中FAM通道Tm值及熔解曲线。

图21本发明对比例3 中FAM、HEX、ROX通道Tm值及熔解曲线。

各熔解曲线图中，横坐标为温度，单位为℃；纵坐标为-d (RFU)/dT，RFU为原始荧光值。

具体实施方案

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明。

本发明根据CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1基因位点的碱基序列分别设计特异性引物和特异性荧光探针，通过非对称PCR扩增和荧光探针熔解曲线分析技术相结合，单管加样即可同时检测3个基因位点的6种突变类型。该特异性荧光探针上带有荧光基团，在本发明具体实施方式中，CYP2C9*2特异性荧光探针5’端带有FAM荧光基团，CYP2C9*3特异性荧光探针5’端带有HEX荧光基团、VKORC1特异性荧光探针5’端带有ROX荧光基团，当然，在实际操作过程中各荧光基团也可以是其他的，只要保证各特异性探针上的荧光基团不同即可。

在本发明具体实施方式中，将PCR反应所需的特异性引物和特异性荧光探针制成试剂盒，以方便使用。进一步的，在某一具体实施方式中，试剂盒除了上述特异性引物和特异性荧光探针外，还包括PCR混合反应液，该PCR混合反应液包括特异性抗体修饰的热启动型DNA聚合酶（High Affinity HotStart Taq DNA聚合酶）、10x HA Buffer、5x Probe qPCRBuffer、dNTPs、dUTP、UDG酶、ddH₂0等组分。在试剂盒中，特异性引物、特异性荧光探针和PCR混合反应液可以混合在一起配成PCR Mix混合液，然后进行包装，使用时加入DNA模板即可，方便便捷。

进一步的，试剂盒中除了上述成分外，还包括阳性质控品和阴性对照品。所述阳性质控品为6种质粒载体的混合物，分别为：携带CYP2C9*2（430C>T）纯合野生型（430CC）和纯合突变型（430TT）基因片段的质粒载体、携带CYP2C9*3（1075A>C）纯合野生型（1075AA）和纯合突变型（1075CC）基因片段的质粒载体和携带VKORC1（-1639G>A）纯合野生型（-1639GG）和纯合突变型（-1639AA）基因片段的质粒载体。所述阴性对照品为ddH₂0。阳性质控品和阴性对照品分别单独包装。

本发明具体实施方式中公开了用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的非诊断和治疗目的的检测方法，具体包括如下步骤：

(1)在进行PCR扩增反应前，先进行待检测样品的基因组DNA的提取，作为DNA模板；所述基因组DNA提取的样本优选为全血。所述基因组DNA的提取方法可以用酚氯仿抽提法、磁珠法或直接选用市售全血基因组DNA纯化试剂盒进行提取。

(2)将含有三对特异性引物和三条特异性探针、PCR混合反应液的PCR Mix混合液，加入一个PCR反应管中，然后将待检测样品的基因组DNA加入该PCR反应管中，进行荧光PCR扩增反应，反应结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，通过熔解峰个数和Tm值来判断待检测样品的基因型。同时，可进行阳性对照和阴性对照，阳性对照是将阳性质控品代替待检样本的DNA,阴性对照是将阴性对照品代替待检样本的DNA。

进一步的，在PCR反应体系中，CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1-1.5μM（即μmol/L，下同），CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.05-0.08μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.08-0.15μM 。优选的，正向引物CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的终浓度均为1.25μM，反向引物CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的终浓度均为0.0625μM，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的终浓度均为0.1μM 。

下面，对于本发明特异性引物和特异性荧光探针的获得和使用该特异性引物和特异性荧光探针进行CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测方法进行详细的举例说明。下述实施例中，所用特异性抗体修饰的热启动型DNA聚合酶（High Affinity HotStart Taq DNA聚合酶）购自天根生化科技（北京）有限公司,该产品内还含有10x HA Buffer和5x Probe qPCRBuffer，dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司，dUTP、UDG酶购自近岸蛋白科技有限公司。阳性质控品的质粒载体为pMD18-T载体,购自宝生物工程（大连）有限公司，阳性质控品中的各位点基因片段中含有对应检测位点和其上下游序列，长度约800bp，为发明人扩增后构建到pMD18-T载体上，并测序验证序列正确，测序公司为生工生物工程（上海）股份有限公司。

实施例1 本发明检测试剂盒的临床应用

1、CYP2C9和VKORC1基因多态性位点的特异性引物和荧光探针设计

根据美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for BiotechnologyInformation )的dbSNP数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）公布的CYP2C9*2(rs1799853，c.430C>T)、CYP2C9*3(rs1057910，c.1057A>C)和VKORC1（rs9923231，c.-1639G>A）的SNP位点信息，设计多条用于CYP2C9和VKORC1基因多态性位点的特异性引物和特异性荧光探针，特异性引物设计在所检基因突变位点两端，特异性荧光探针覆盖所检基因突变位点，经过大量实验筛选，最终得到灵敏度高、特异性好的用于扩增CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的三对特异性引物和用于检测CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P、VKORC1-P。在CYP2C9*2-P荧光探针5’末端区域设计FAM荧光基因，3′末端区域设计BHQ1淬灭基团，在CYP2C9*3-P荧光探针5’末端区域设计HEX荧光基因，3′末端区域设计BHQ1淬灭基团，在VKORC1-P荧光探针5’末端区域设计ROX荧光基因，3′末端区域设计BHQ2淬灭基团。

并且，在这3条特异性荧光探针序列的5’端的前4个碱基间均进行了硫代修饰标记，硫代修饰的位点为5’端的前4个碱基间的磷酸二酯键，即每条特异性荧光探针的5’端的第1和2个碱基之间，第2和3个碱基之间，第3和4个碱基之间的磷酸二酯键上均进行了硫代修饰。

上述三对特异性引物和三条特异性荧光探针的序列如下表1所示：

上述三对特异性引物和三条特异性荧光探针、探针的硫代修饰均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、质粒标准品的构建

本发明构建了CYP2C9*2、CYP2C9*3和VKORC1三个突变位点的纯合突变型和纯合野生型的质粒标准品，作为阳性质控，并用于前期QPCR体系的构建。构建方式如下：

（1）根据美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for BiotechnologyInformation )的dbSNP数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）公布的CYP2C9*2(rs1799853，c.430C>T)、CYP2C9*3(rs1057910，c.1075A>C)和VKORC1（rs9923231，c.-1639G>A）的SNP位点信息，选取含有CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1位点的长度约700-800bp的片段，设计用于构建质粒的上下游引物，引物序列如下：

CYP2C9*2-PF（上游引物）：5’CCTGAAACCCATAGTGGTGC 3’

CYP2C9*2-PR（下游引物）：5’GAATAGGTAATGGGAAAAACACTGC 3’ ；

CYP2C9*3-PF（上游引物）：5’CCTTCTTTCATTTCTTCCTGTCTTC 3’

CYP2C9*3-PR（下游引物）：5’CACCCTGCCAGAAATTCCA 3’ ；

VKORC1-PF（上游引物）：5’CATTCAAGTTTTTGGAAAGATTCTACA 3’

VKORC1-PR（下游引物）：5’GGTGCCTGTAATCCCAGC 3’ ；

（2）引物对合成后，分别以人源DNA为模板进行PCR扩增，电泳后胶回收大小约700-800bp的DNA片段，将CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1位点的胶回收片段分别构建到pMD18-T载体上，重组质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

（3）根据测序结果，比对CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1各质粒的碱基序列，若其碱基为野生型，则将其定点突变为对应突变型，同理，若扩增得到的为突变型，则将其定点突变为对应野生型。（定点突变方法此处不再赘述。）

将上述制备的CYP2C9*2、CYP2C9*3、VKORC1三个位点的野生型和纯合突变型质粒，按照浓度6ng/μL将这六种质粒等比例混合，稀释10000倍，作为阳性质控品，备用。

3、临床样本基因组提取

从临床病人全血中提取DNA，并对其进行定量，作为QPCR 检测的模板。采用AxyPrep公司的血基因组DNA小量试剂盒（Cat.No. AP-MN-BL-GDNA-250）提取，步骤如下：

1）加500uL Buffer AP1到105mL离心管中。

2）加250uL抗凝全血到Buffer AP1中，用移液器来回吸注几次，以彻底溶解残留在吸头上的血液。盖紧离心管盖子，旋涡震荡10 S。

3）加100uL Buffer AP2，旋涡震荡10 S。

4）12000g，离心10mins。

5）将制备管置于2mL离心管（试剂盒内提供）中，将步骤4中的滤液加入到制备管中，12000g离心1min。

6）弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加700uL Buffer W1A，室温放置2min，12000g离心30 S。

7）弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，加800uL已加无水乙醇的Buffer W2，12000g离心1min。

8）（可选步骤）将制备管置回到原2mL离心管中，加500uL Buffer W2到制备管中，12000g离心1min。

9）弃滤液，将制备管置回到原2mL离心管中，12000g离心1min。

10）将制备管置于另一洁净的1.5mL离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加80-200uL Buffer TE，室温静置1min。12000g离心1min，洗脱基因组DNA。（将Buffer TE预热到65℃将提高洗脱效率）。

4、DNA浓度测定

紫外分光光度计测定样本DNA提取纯度及浓度，并用ddH₂O稀释为5ng/uL。上样浓度范围0.5ng/uL-50ng/uL，推荐上样浓度为5-15ng/uL。

5、配制PCR反应体系

每个待检样本各取4μL（20ng）提取的基因组DNA作为模板，加于PCR反应管中，每个待检样本使用一个PCR反应管，共250个待检样本。各待检样本PCR反应管中组分及用量如下表2所示。

PCR反应体系除待检样本的PCR体系外，还设有NTC和阳性对照，NTC即以双蒸水为模板的阴性对照品，NTC孔加入4uL ddH₂O为模板作为阴性对照。阳性对照孔加入4μL阳性质控品为模板作为阳性对照。

6、QPCR扩增程序

将配好的PCR管盖紧，轻弹混匀，瞬时离心，进行qPCR反应。

优选的反应条件：50℃ 2min；95°C预变性5 min；95°C变性10 s，61°C退火30 s（采集FAM、HEX、ROX通道的荧光信号），72°C延伸15 s，35个循环；所述熔解曲线步骤反应条件为：95℃，1min；40℃，1min，40℃-75℃，以0.5℃梯度上升，每一增量温度保持5S（采集FAM、HEX、ROX三个荧光通道的荧光信号）。

使用仪器为Bio-Rad CFX 96 Touch。

7、结果判定

1）阈值（Threshold）设置：每个通道阈值设定以阈值线刚好超过无规则噪音线的最高点为佳。

2）FAM、HEX、ROX三个通道均至少应有一个熔解峰升起，否则说明加入样本含有PCR抑制剂或样本加入量不够，需要重新提取DNA后再做或增加样本加入量后再实验。NTC对照孔应没有信号升起,阳性对照孔每一荧光通道均应有两个熔解峰。

3）每个荧光通道的熔解峰峰高超过阈值线即为阳性结果。

8、检测结果分析

阴性对照无熔解峰出现。阳性对照的检测结果见图10：FAM通道出现Tm为57.5℃和Tm为62.5℃的430CT型熔解峰，在HEX通道出现Tm为55.5℃和Tm为62℃的1075AC型熔解峰，在ROX通道出现Tm为56℃和Tm为64.5℃的-1639GA型熔解峰，即3个通道均有两个符合野生型和突变型Tm值的熔解峰型信号升起，符合要求。

250份待检DNA样本中，检测得到的CYP2C9基因多态性为：*1/*1基因型共228例，*1/*2基因型1例，*1/*3基因型21例，未检测到*2/*3基因型样本；检测得到的VKORC1基因多态性为：VKORC1纯合野生型3例，VKORC1杂合突变型36例，VKORC1纯合突变型211例。

250份待检DNA样本中，CYP2C9基因与VKORC1基因多态性的综合统计结果为：CYP2C9*1/*2且VKORC1为杂合突变型1例，CYP2C9*1/*3且VKORC1为杂合突变型2例，CYP2C9*1/*3且VKORC1为纯合突变型18例，CYP2C9*1/*3且VKORC1为纯合野生型1例，CYP2C9*1/*1且VKORC1为纯合野生型2例，CYP2C9*1/*1且VKORC1为杂合突变型33例，CYP2C9*1/*1且VKORC1为纯合突变型193例。

其中，CYP2C9*1/*1基因型表示样本的CYP2C9*2位点为430CC型，CYP2C9*3位点为1075AA型，其熔解曲线如图1所示：FAM通道出现Tm为62.5℃的430CC型熔解峰，在HEX通道出现Tm为63.5℃的1075AA型熔解峰。

其中，CYP2C9*1/*2基因型表示样本的CYP2C9*2位点为430CT型，CYP2C9*3位点为1075AA型，其熔解曲线如图2所示：FAM通道出现Tm为58℃和Tm为62.5℃的430CT型熔解峰，在HEX通道出现Tm为63℃的1075AA型熔解峰。

其中，CYP2C9*1/*3基因型表示样本的CYP2C9*2位点为430CC型，CYP2C9*3位点为1075AC型，其熔解曲线如图3所示：FAM通道出现Tm为62.5℃的430CC型熔解峰，在HEX通道出现Tm为56℃和Tm为63.5℃的1075AC型熔解峰。

其中，VKORC1纯合野生型表示样本的VKORC1位点为-1639GG型，其熔解曲线如图4所示：ROX通道出现Tm为65℃的-1639GG型熔解峰。

其中，VKORC1杂合突变型表示样本的VKORC1位点为-1639GA型，其熔解曲线如图5所示：ROX通道出现Tm为56.5℃和Tm为65.5℃的-1639GA型熔解峰。

其中，VKORC1纯合突变型表示样本的VKORC1位点为-1639AA型，其熔解曲线如图6所示：ROX通道出现Tm为56.5℃的-1639AA型熔解峰。

其中，CYP2C9*1/*2且VKORC1为杂合突变型表示样本的CYP2C9*2位点为430CT型，CYP2C9*3位点为1075AA型，VKORC1位点为-1639GA型，其熔解曲线如图7所示：FAM通道出现Tm为58℃和Tm为62.5℃的430CT型熔解峰，在HEX通道出现Tm为63℃的1075AA型熔解峰，在ROX通道出现Tm为56.5℃和Tm为65.5℃的-1639GA型熔解峰。

其中，CYP2C9*1/*3且VKORC1为杂合突变型表示样本的CYP2C9*2位点为430CC型，CYP2C9*3位点为1075AC型，VKORC1位点为-1639GA型，其熔解曲线如图8所示：FAM通道出现Tm为63℃的430CC型熔解峰，在HEX通道出现Tm为55.5℃和Tm为63.5℃的1075AC型熔解峰，在ROX通道出现Tm为56.5℃和Tm为66℃的-1639GA型熔解峰。

其中，CYP2C9*1/*3且VKORC1为纯合野生型表示样本的CYP2C9*2位点为430CC型，CYP2C9*3位点为1075AC型，VKORC1位点为-1639GG型，其熔解曲线如图9所示：FAM通道出现Tm为62.5℃的430CC型熔解峰，在HEX通道出现Tm为55.5℃和Tm为63℃的1075AC型熔解峰，在ROX通道出现Tm为65℃的-1639GG型熔解峰。

从图1-9可以看出，本发明含有待检DNA模板的各PCR反应管均出现特异性扩增，各PCR产物熔解曲线的Tm值之间均能够很好地进行区分。

实施例2 CYP2C9和VKORC1基因多态性检测结果验证

实施例1的250份临床待检样本在采用上述引物和探针进行qPCR检验的同时，也采用金标准测序法进行测序，结果表明，每个待检样本金标准测序法所得的基因型与实施例1的方法所得的基因型保持一致，漏检0例，准确性为100％。

对本发明引物和探针组合物的最低检测限进行检测，步骤如下：

1.随机选取实施例1所提取的DNA样本10例，将其浓度分别稀释为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul。各样本的3个浓度的DNA模板分别上样3个重复的PCR孔，上样量为4ul,进行最低检测限检验，QPCR扩增方法同实施例1。

2.检测结果：

DNA模板浓度为1ng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul时，FAM通道的纯合型检测结果如图11所示，杂合突变型检测结果如图12所示；HEX通道的纯合型检测结果如图13所示，杂合突变型检测结果如图14所示；ROX通道的纯合型检测结果如图15所示，杂合突变型检测结果如图16所示。综合各图以及结合结果判断的方便可靠性，判定本检测试剂盒的最低检测限为2ng/反应样本，即DNA浓度为0.5ng/ul、上样量为4ul时，结果判定方便准确。

对本发明引物和探针组合物的特异性进行检测，步骤如下：

1.引物探针组合物对同源基因、其他位点基因特异性的检测

根据美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for BiotechnologyInformation )的dbSNP数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/term=）公布的CYP2C19、CYP4F2、CYP2C9*8和CYP2C9*11的序列信息，选取与CYP2C9*2、CYP2C9*3序列同源的片段，设计用于构建质粒的上下游引物，其同源基因质粒的构建方法同本试剂盒阳性质控品的构建方法，本处不再赘述。

将构建的CYP2C19、CYP4F2、CYP2C9*8和CYP2C9*11四种同源质粒按照浓度4ng/μL等比例混合，稀释10000倍，作为同源检测模板，上样量4ul，按照实施例1的方法进行PCR扩增检验，共检测3次，每次3个重复，同时与阳性质控品一起检测，检测结果发现阳性质控品的每个荧光通道均有两个熔解峰信号升起，而同源检测模板的每个荧光通道均没有熔解峰信号升起，说明本引物探针组合物的特异性为100%。

2.引物探针组合物对内源物和外源物抗干扰能力的检测

同时，本发明对内源性干扰物质胆红素、甘油三酯、胆固醇以及外源性干扰物质阿司匹林、蔗糖等进行了干扰实验，具体步骤为：

随机选取普通人群的血液样本，各取3例，分别加入内源性干扰物质——胆红素、甘油三酯、胆固醇和外源性干扰物质——阿司匹林、蔗糖，使其终浓度为胆红素0.5mg/ml、甘油三酯40mg/ml、胆固醇2mg/ml、阿司匹林0.5mg/ml、蔗糖1mg/ml，以不额外加干扰物的正常血液DNA样本为对照，然后正常提取各血液样本的DNA为模板，按照实施例1的方法进行荧光PCR检测。图17是正常血液样本的检测结果，图18为额外加入胆红素后的血液样本的检测结果。从图中可以看出，加入内源性干扰物质和外源性干扰物质的样本的检测结果与对照正常血液DNA样本的检测结果相同，胆红素不会对本发明引物探针组合物产生干扰。其他干扰物质的检测结果也与胆红素相同。结果显示，加入上述内源性干扰物质和外源性干扰物质的样本的检测结果与对照正常血液DNA样本的检测结果相同，这些干扰物质对本引物探针组合物的检测结果均无影响。

对比例1

将实施例1中的CYP2C9*3-R的引物序列替换为： 5’-TGGGGACTTCGAAAACATGGA-3’。将此引物与实施例1的CYP2C9*3-F、CYP2C9*3-P配合按照实施例1的方法检测CYP2C9*3位点的基因多态性，CYP2C9*3位点野生型检测结果如图19所示。从图中可以看出，在PCR过程中会有一些非特异扩增，与探针非特异结合，干扰试验结果，造成判断困难。

对比例2

将实施例1中的CYP2C9*2-P探针的序列替换为：FAM-A^*C^*A^*CTCTTGAACACGGTCCTCAATGCT-BHQ1 3’。将此探针与实施例1的CYP2C9*2-F、CYP2C9*2-R引物对配合按照实施例1的方法检测CYP2C9*2位点的基因多态性，CYP2C9*2位点野生型检测结果如图20所示。从图中可以看出，探针的序列对熔解曲线的获得至关重要，若探针序列设计存在问题，则会导致扩增产物不能与探针有效结合，干扰实验结果，造成实验结果无法判断。

对比例3

采用实施例1的引物和探针组合物检测CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的基因多态性，不同的是：在最终的PCR反应体系中，各位点所用上游引物和下游引物的浓度均为0.2um，各探针的用量不变。检测结果如图21所示，没有得到有效的熔解曲线。由此可以看出，荧光探针熔解曲线法需要与非对称扩增法相结合才能得出正确的检测结果，如果采用传统的引物用量原则进行扩增，则不能生成有效的熔解曲线。

序列表

<110> 山东维真生物科技有限公司

<120> 用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggatggaaaa cagagactta 20

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gtcagtagag aagatagtag tccagt 26

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aacgtgtgat tggcagaa 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tagccccaaa ctggaaacaa gag 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ctcaagtgat ccacccacct 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tagaagagag tagatgtgag aaac 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cattcttgaa cacggtcctc aatg 24

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

tccgaaggtc aatgtatctc tggacc 26

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

aataaacaac cattggccgg gtg 23

Claims

1.一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物，其特征是：包括用于扩增CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的三对特异性引物；

CYP2C9*2-F：5’GGATGGAAAACAGAGACTTA 3’

CYP2C9*2-R：5’GTCAGTAGAGAAGATAGTAGTCCAGT 3’；

CYP2C9*3-F：5’AACGTGTGATTGGCAGAA 3’

CYP2C9*3-R：5’TAGCCCCAAACTGGAAACAAGAG 3’；

所述用于扩增VKORC1位点的特异性引物包括正向引物VKORC1-F和反向引物VKORC1-R，如下:

VKORC1-F：5’CTCAAGTGATCCACCCACCT 3’

VKORC1-R：5’TAGAAGAGAGTAGATGTGAGAAAC 3’。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：还包括三条特异性荧光探针，如下：

（1）用于检测CYP2C9*2位点的特异性荧光探针CYP2C9*2-P：

5’CATTCTTGAACACGGTCCTCAATG 3’ ；

（2）用于检测CYP2C9*3位点的特异性荧光探针CYP2C9*3-P：

5’TCCGAAGGTCAATGTATCTCTGGACC 3’ ；

（3）用于检测VKORC1位点的特异性荧光探针VKORC1-P：

5’AATAAACAACCATTGGCCGGGTG 3’。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：所述3条特异性荧光探针均进行了硫代修饰，所述硫代修饰位点均为5’端第1-4个碱基之间的磷酸二酯键。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征是：所述三条特异性荧光探针在5’末端区域均具有荧光基团，在3′末端区域均具有淬灭基团；所述荧光基团优选为FAM、HEX或ROX，所述淬灭基团优选为BHQ1或BHQ2，各特异性荧光探针的荧光基团不同。

5.一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征是：包括权利要求2-4中任一项所述的用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征是：还包括PCR混合反应液；优选的，所述PCR混合反应液包括：DNA聚合酶、10×HA Buffer、5×Probe qPCR Buffer、dNTPs、dUTP和UDG酶。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征是：PCR混合反应液和用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物一起包装，在用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液的混合物中，CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的浓度均为1-1.5μmol/L，CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的浓度均为0.05-0.08μmol/L，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的浓度均为0.08-0.15μmol/L；优选的，CYP2C9*2-F、CYP2C9*3-F和VKORC1-F的浓度均为1.25μmol/L，CYP2C9*2-R、CYP2C9*3-R和VKORC1-R的浓度均为0.0625μmol/L，特异性荧光探针CYP2C9*2-P、CYP2C9*3-P和VKORC1-P的浓度均为0.1μmol/L。

8.根据权利要求5、6或7所述所述的试剂盒，其特征是：还包括阳性质控品和阴性对照品；优选的，所述阳性质控品为携带CYP2C9*2野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体、携带CYP2C9*3野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体和携带VKORC1野生型和纯合突变型基因片段的质粒载体的混合物；优选的，所述阴性对照品为ddH₂O。

9.权利要求2-4中任一项所述的用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物或权利要求5-8中任一项所述的用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒在检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性中的应用，其特征是：所述应用以非治疗或非诊断为目的；优选的，所述人类CYP2C9和VKORC1基因多态性指的是CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点和VKORC1位点的多态性。

10.一种检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法，其特征是：包括以下步骤：

（1）提取待检样本的基因组DNA，作为DNA模板；

（2）将上述权利要求2、3或4所述的用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的组合物和PCR混合反应液混合在一起，加入DNA模板，进行荧光PCR扩增反应；