CN106755320A

CN106755320A - 用于检测人类oprm1基因a118g位点多态性的核酸、试剂盒及方法

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Publication number: CN106755320A
Application number: CN201611052799.4A
Authority: CN
Inventors: 邹芳; 杨惠娟; 段卫涛; 赵平锋
Original assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Current assignee: WUHAN HYGIEA BIOSCIENCE CO Ltd
Priority date: 2016-11-25
Filing date: 2016-11-25
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-25
Also published as: CN106755320B

Abstract

本发明公开了用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的检测方法，为阿片类药物，如吗啡、芬太尼、曲马多、氨酚羟考酮、度冷丁等个体化剂量给药提供指导方案。本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

Description

用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸、试剂盒及方法。

背景技术

癌痛是由癌症所致的疼痛，与肿瘤细胞侵袭机体组织所造成，真实的或可能存在的组织损伤有关，是癌症患者常见的一种并发症，严重影响晚期癌症患者的生活质量和治疗效果。据世界卫生组织(WHO)统计，确诊的肿瘤患者中至少有1/3存在着不同程度的疼痛，晚期患者更是高达60％～90％。因此，癌痛控制与癌症的早期预防、早期诊断、早期治疗被列为WHO的4项重点规划。

尽管癌痛的药物治疗及非药物治疗方法多种多样，但是，在所有止痛治疗方法中，阿片类镇痛药是癌痛治疗必不可少的药物。而药物反应的个体差异，是临床用药中的常见现象，不同个体间药物稳定剂量的差异，可达40倍以上。在临床工作中发现不同患者，有效镇痛剂量差异很大，有研究人员发现10％～30％癌症患者经阿片类药物治疗后，仍不能有效缓解癌痛。根据相关研究，除了疾病的严重程度、药物之间的相互作用，营养状况等影响个体的用药反应外，阿片类药物如吗啡、羟考酮、.美沙酮、芬太尼作用时可能受药物代谢酶、转运蛋白、受体和药物作用靶点的基因多态性影响。因此，镇痛疗效相关基因的多态性及其对癌痛治疗的影响逐渐受到关注。

人类OPRM1基因定位于染色体6q24～25，是阿片类药物遗传差异的主要候选基因。μ阿片受体是内源性和外源性阿片物质镇痛的主要靶点，OPRM1基因编码μ阿片受体，目前，已经发现人类OPRM1基因存在100多个基因多态性位点和4个连锁不平衡(LD)区。研究证实，与镇痛相关的多态性位点有A6V、N40D、R260H、R265H和S268P，其中N40D(A118G)是最常见的多态性。A118G多态性在不同民族之间突变频率有一定的差异，非洲人N40D的突变率为4.7％，欧洲人N40D的突变率15.4％，日本人该基因的发生频率为48.5％，西班牙人则为14％，而在中国人等位基因G的发生频率约为30％。

A118G(N40D)突变是位于第118位的核苷酸由腺苷酸被鸟苷酸所取代，这个替换导致了μ-阿片受体细胞外N-末端第40位氨基酸由天冬氨酸取代天冬酰胺，使μ-阿片受体丢失了一个糖基化位点。在体内外实验中都已证实A118G(N40D)多态性能够影响阿片类药物的疗效，当118G为纯合子时，β-内啡肽与受体的结合是118A纯合子的3倍，通过药物动力学和药效动力学，对吗啡代谢后的活化形式吗啡-6-萄糖醛酸(morphine-6-glucuronide，M6G)进行的研究发现，118G纯合子会降低M6G的止痛作用，从而影响吗啡的镇痛疗效。

临床研究发现，吗啡对不同OPRM1基因型携带者都有一定的镇痛效应。但镇痛效应的强弱，三种基因型却显示出不同：突变型(GG型)的受试者前后痛阈差明显低于野生型(AA型)和杂合型(AG型)，提示等剂量吗啡对发生OPRM1基因型A118G的突变型(GG型)基因女性携带者的镇痛效应，明显弱于野生型(AA型)和杂合型(AG型)。也可以说，基因型为AA对吗啡镇痛用药更为敏感，GG型的患者吗啡的需求量大于AA型的患者。因此，检测OPRM1基因多态性可作为阿片类药物(如吗啡、芬太尼、曲马多、氨酚羟考酮、度冷丁)个体化剂量给药的预测指标。

目前，市面上用于检测OPRM1基因多态性A118G位点的方法主要有直接测序法、基因芯片和液相芯片法及PCR-RFLP法。直接测序的方法虽然称为金标准，但其检测灵敏度低，操作流程较复杂，样本易污染，耗时较长，且检测成本较高。基因芯片法和液相芯片法同样操作过程复杂，检测成本高，检测周期长，且结果准确性不高，容易发生样本污染，导致假阳性结果。PCR-RFLP法操作复杂，样本多时，易造成PCR产物的交叉污染，且容易出现酶切不充分或酶切过度，而出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。以上缺点限制了这四种方法在实际临床工作中的发展和应用，无法满足快速指导临床评估的需求。因此，一种快速、准确且低成本的新型检测方法成为了迫切需求。

发明内容

为克服以上现有检测人类OPRM1基因多态性方法的不足，本发明的目的是提供一组用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸。本发明的另一个目的是提供一种用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的试剂盒及其检测方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一组用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸，该核酸包括检测针对A118G位点的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针，其中，所述野生型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

如上所述的核酸，优选的，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，和/或所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

一种用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的试剂盒，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类OPRM1基因A118G位点的野生型和突变型，所述试剂盒包括如上所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，和/或质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

如上所述的试剂盒，优选地，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：无核酸酶水。

一种检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的方法，该方法包括以下步骤：

(1)从样本中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

(3)收集荧光信号，选择对应荧光基团的荧光检测模式，基线调整取3～15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；

(4)结果判定：待测样本的所述野生型反应体系和所述突变型反应体系的荧光信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值△Ct值来确定样本DNA的基因型。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，所述野生型体系和所述突变型体系还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000n mol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

如上所述的方法，优选地，步骤(2)中，所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，在各自的所述野生型体系和所述突变型体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述公用检测探针的终浓度为200nmol/L，所述内部质控的引物对的终浓度均为150nmol/L，所述质控探针的终浓度为100n mol/L；所述检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1；

所述确定样本DNA的基因型，如下：

△Ct＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

△Ct＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

如上所述的方法，优选地，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以无核酸酶水为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；

在步骤(4)中，所述阳性对照的野生型体系和突变型体系的FAM均有明显的扩增曲线，且FAM信号的Ct值≤25，和/或JOE有明显的扩增曲线且JOE信号的Ct值≤25，符合要求，检测结果可靠；所述阴性对照的野生型体系和突变型体系的FAM都没有明显的扩增曲线，符合要求，检测结果可靠，否则应重新配置检测体系，重新进行检测。

本发明提供了一组用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸及试剂盒，同时建立具有特异性强、灵敏度高、准确度高、操作简单的检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的检测方法，为阿片类药物(如吗啡、芬太尼、曲马多、氨酚羟考酮、度冷丁)个体化剂量给药提供指导方案。

本发明提供的检测方法采用完全闭管操作，操作简单、方便快捷、通过直接探测PCR过程中荧光信号值的获得检测的结果，不需要PCR后处理或电泳检测，克服了常规PCR技术的易污染、出现假阳性，能有效避免非特异性扩增难题，并且适合大批量样本的检测。

本发明提供的检测试剂盒及方法，用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性时，为了避免漏检、及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，设有内部质控，为了判断检测体系是否正常，还设有阴性对照和检测引物的阳性对照；为了避免假阴性及漏检，设有阳性对照，其阳性对照检测呈阳性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；为了避免假阳性及漏检，设有阴性对照，其阴性对照检测呈阴性结果，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；检测试剂盒及方法设计严谨，有效避免漏检、错检的可能。

与现有技术相比，本发明运用ARMS引物分野生型和突变型基因，有如下有益效果和显著进步：

(1)灵敏度高，可以准确检出低至10copies/μL的基因组DNA，检测结果可信，且对于保存时间过长以及口腔拭子这些提取浓度很低的样本能准确检出。

(2)特异性强，对于高至3×10⁴copies/μL的ABCB1基因组DNA不会出现非特异性的结果。与其他相似功能的基因不会出现交叉反应，提取出的样本直接上母液都能准确检测而不会出现非特异性。

(3)适用于多种样本类型：本发明不仅能检测常规的EDTA抗凝的全血细胞DNA，还能检测提取质量差的口腔拭子，检测结果准确度高。

(4)成本低，ARMS分型法相对Taqman探针分型法，不仅能保留Taqman的高灵敏度和高特异性，而且还能节约成本，ARMS引物合成快速简单，合成成本低，扩增效果更佳。

(5)检测速度快，整个检测过程只需要90分钟。

(6)应用Fast premix预混在反应体系中，减少了酶与样本混合的步骤，减少了样本的污染，操作更简单，一步加样，避免了气溶胶污染引起的假阳性。

(7)安全：整个试剂盒不包含有毒有害物质，对操作人员和环境无危害。

总之，本发明的优点在于：

本发明采用了特异性ARMS引物和探针阻断技术，可以特异性的检测人类OPRM1基因A118G多态性。建立实时荧光PCR扩增反应体系实现对OPRM1基因A118G多态性的快速检测；且操作简单，结果易读。同时，本方法灵敏度高，可实现10copies/μL基因的稳定检出；特异性好，3×10⁴copies/μL相似功能的基因组DNA无非特异性扩增。

附图说明

图1为本发明优选的实时荧光PCR方法检测阳性对照的扩增曲线。

图2为本发明优选的实时荧光PCR方法检测阴性对照的扩增曲线。

图3为本发明优选的试剂盒检测野生型灵敏度的扩增曲线。

图4为本发明优选的试剂盒检测突变型灵敏度的扩增曲线。

图5为本发明优选的试剂盒检测野生型精密度的扩增曲线。

图6为本发明优选的试剂盒检测突变型精密度的扩增曲线。

图7为本发明优选的试剂盒检测野生型特异性的扩增曲线。图8为本发明优选的试剂盒检测突变型特异性的扩增曲线。

图9为本发明优选的检测方法检测样本1的扩增曲线。

图10为本发明优选的检测方法检测样本2的扩增曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明做进一步详细说明，并非对本发明的限定，本发明的实施方式并不限于此，本发明提供的核苷酸序列的互补序列也可实现本发明，如无特殊说明，所用试剂为常规试剂，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1引物、探针、验证模板设计

ARMS-PCR扩增基本原理：在PCR扩增时，引物的延伸是从其3'未端开始的，而这种延伸的进行要求引物3'端的碱基与模板需完全配对，只有这样引物才能延伸，扩增才得以进行下去而得到预期的扩增产物，若引物3'端与模板不能配对，则引物的延伸即阻断，不能得到相对应的扩增产物，基于以上事实，可利用3'端含突变碱基的引物来检测靶DNA中有无相应的突变位点，此即3'特异PCR扩增。扩增阻滞突变系统及等位特异PCR，该反应系统包含两个PCR扩增反应，有两对引物但它们的3'端有差异，一为正常引物，另一为3'端编食突变的引物，正常引物只与正常模板互解，PCR时扩增相应的产物，而食突变的引物只与突变的模板附扩增出相应的产物。利用该系统进行基因突变检测时不仅能检出突变的纯合子，而且能检出杂合子个体。

本发明的具体原理是：针对人类OPRM1基因A118G位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和共用的Taqman-MGB探针和下游引物，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子中提取的基因组DNA进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。

针对人类OPRM1基因A118G位点设计野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针，通过多次试验、优化、最后获得野生型上游引物(OPRM1FW)、突变型上游引物(OPRM1FM)、公用下游引物(OPRM1R)和公用检测探针(OPRM1P)的序列，其核苷酸序列如下：

OPRM1FW(SEQ ID No.1)：5’-CAACTTGTCCCACTTAGAAGGCA-3’；

OPRM1FM(SEQ ID No.2)：5’-GTCAACTTGTCCCACTTAGATGGTG-3’；

OPRM1R(SEQ ID No.3)：5’-GCTTTCCTTACCTGACAATCACATAC-3’；

OPRM1P(SEQ ID No.4)：5’-CCTGTCCGACCCATG-3’

其中，野生型引物扩增产物长度为206kb，突变型引物扩增片段长度为208kb。扩增产物可作为阳性对照，即野生型阳性对照物含SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、突变型阳性对照物含SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，具体如下：

SEQ ID No.8:

5’-CAACTTGTCCCACTTAGATGGCAACCTGTCCGACCCATGCGGTCCGAACCGCACCGACCTGGGCGGGAGAGACAGCCTGTGCCCTCCGACCGGCAGTCCCTCCATGATCACGGCCATCACGATCATGGCCCTCTACTCCATCGTGTGCGTGGTGGGGCTCTTCGGAAACTTCCTGGTCATGTATGTGATTGTCAGGTAAGGAAAGC-3’。

SEQ ID No.9:

5’-GTCAACTTGTCCCACTTAGATGGCGACCTGTCCGACCCATGCGGTCCGAACCGCACCGACCTGGGCGGGAGAGACAGCCTGTGCCCTCCGACCGGCAGTCCCTCCATGATCACGGCCATCACGATCATGGCCCTCTACTCCATCGTGTGCGTGGTGGGGCTCTTCGGAAACTTCCTGGTCATGTATGTGATTGTCAGGTAAGGAAAGC-3’。

进一步，为了对实时荧光PCR反应体系和实验操作过程进行质控，同时检测样本的质量，避免漏检，本发明选用GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为内参基因，GAPDH(NC_000012.12)酶基因为管家(house keeping)基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中该基因的含量一般是恒定的，可作为荧光定量PCR的内参基因，在该基因上设计的内部控制引物和内控探针，并对内控的上下游引物进行筛选，使非模版体系(NTC)没有明显的扩增曲线(不起线)，样本有明显的扩增曲线(起线)正常。GAPDH基因作为人类基因组的保守基因，不仅可以作为试剂盒内部的质控，还可作为样本DNA的质控。通过内部质控的质控引物对、质控探针的筛选和体系优化，建立了实时荧光PCR内部质控检测体系，其中，质控引物对(GAP F、GAP R)、质控探针(GAP P)最后确定的核苷酸序列如下：

GAP F(SEQ ID No.5)：5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3’；

GAP R(SEQ ID No.6)：5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGA-3’；

GAP P(SEQ ID No.7)：5’-TGGTGCTCAGTGTAGCCCAGGATGC-3’。

作为内部质控的质控引物对进行PCR扩增时，其扩增序列的大小为98bp，将扩增序列作为内部质控阳性对照物，即包含如SEQ ID No.10所示序列，作为验证是否漏检的阳性对照。

SEQ ID No.10：

5’-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTCGGAGGGCCCCCTCAAGGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3’。

作为试剂盒特异性验证进行PCR扩增时，选择人类基因组ABCB1基因，位于7号染色体上，其C3435T基因多态性也与阿片类药物个体化用药密切相关。为试剂盒有无交叉反应验证所需，其质粒序列如SEQ ID No.11所示序列，长度为100bp。

SEQ ID No.11：

5’-TGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGATCGTGAGGGCAGCAAAGGAGGCCAACATACATGCCTTCATCGAGTCACTGCCTAATGTAAGTCTC-3’。

实施例2采用实时荧光PCR检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的方法

将实施例1筛选设计的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针进行合成，在检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，其中，荧光基团可为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，淬灭基团可为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

采用实时荧光PCR检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的方法如下：

(1)从样本中提取DNA；

(2)对提取的样本DNA进行进行人类OPRM1基因A118G位点多态性的实时荧光PCR扩增检测，采用野生型反应体系和突变型反应体系，其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；均用40μL反应体系，PCR反应液组分如下：

MgCl₂：2.0～5.0mmol

dNTP：0.2～0.8mmol

各条引物：0.1～1.0μmol

各条探针：0.1～1.0μmol

DNA聚合酶采用Fast master premix：6～10μL或热启动酶0.3～0.6μL

样本DNA模板：10μL

其余用无核酸酶水补足总体积：40μL。

实时荧光PCR扩增反应条件优选为：

第一阶段：95℃5min；

第二阶段：95℃5s，58℃30s，10个循环；

第三阶段:95℃5s，58℃30s，72℃30s，35个循环；

第三阶段:35个循环中，72℃时收集荧光信号，第二阶段设有10个循环，58℃的退火延伸温度，有利于模板的富集。

将OPRM1基因A118G位点的野生型阳性对照物和突变型阳性对照物进行上述实时荧光PCR扩增反应，结果显示，所设计的检测引物及反应体系可有效扩增出OPRM1基因A118G位点的野生型和突变型。

对样本进行检测时，为避免漏检，如避免有的反应孔中未加检测样本的情况出现，在每个反应孔中设置有内部质控，其质控引物对和质控探针如实施例1中所述。应当注意的是公用检测探针与质控探针荧光基团标记为不同检测模式的荧光基团。具体的实时荧光PCR扩增反应体系组成按上述PCR反应液组分配置。对于人血液样本或咽拭子样本的DNA检测时，质控探针的信号应有明显的扩增曲线。

在探针合成时，探针与荧光和淬灭基团相连，公用检测探针的荧光-淬灭基团为优选为FAM-MGB，质控探针的荧光-淬灭基团优选为JOE-BHQ1，当然，其它荧光-淬灭基团组合也同样适用，比如，HEX-BHQ1、HEX-TAMRA、FAM-TAMRA、FAM-BHQ1、CY3-BHQ1、CY3-BHQ2等，经实验验证，均可检测人类ADRB1基因G1165C位点的基因型。

为了避免假阴性及漏检，检测方法中还设有野生型反应体系、突变性反应体系和内部质控的阳性对照(STD)，以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其阳性对照检测呈阳性结果，检测荧光信号均有明显的扩增曲线(均起线)，扩增图如图1所示，说明检测体系没有问题，不会出现假阴性结果及漏检；

为了避免假阳性及漏检，设有检测引物和内部质控的阴性对照(NTC)，以无核酸酶水为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其阴性对照检测呈阴性结果，检测荧光信号均无明显的扩增曲线(均不起线)，扩增图如图2所示，说明检测体系没有问题，不会出现假阳性结果及漏检；否则，应重新进行反应体系的配置及检测。阳性对照(STD)FAM信号Ct值作为实验数据是否有效的判定标准。

作为试剂盒特异性验证进行PCR扩增时，对含质粒序列如SEQ ID No.11所示，进行上述检测时，检测结果为阴性，说明所涉及的引物探针与其他基因无交叉反应，特异性强。

上述实时荧光PCR反应可使用的仪器包括ABI实时PCR系统(例如7000，7300，7500，7900等)；BioRad实时PCR检测系统、Stratagene定量多聚酶链反应仪(例如MX4000，MX3000，MX3005)。

实施例3用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的试剂盒

用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的实时荧光PCR试剂盒包括以下成分：

野生型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

突变型上游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

公用下游引物：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示

公用检测探针：核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

野生型阳性对照物：含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列；

突变型阳性对照物：含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列。

为了避免漏检，错检，还包括：作为内部质控的质控引物对、质控探针和质控阳性对照物，

其中，质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团，质控阳性对照物含有如SEQ IDNo.10所示的核苷酸序列。

为了防止反应体系在PCR扩增过程中挥发，影响检测效果，试剂盒还包括有矿物油。

为了便于反应体系的配置，试剂盒还包括10×PCR缓冲液；Fast Advanced MasterMix，阴性对照物：无核酸酶水。其中Fast Advanced Master Mix，可采用ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCRbuffer(Mg²⁺Plus)采用TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，也可应用市场上其他公司的PCR缓冲液与DNA聚合酶。

实施例4快速检测试剂盒的制备

本实施例的试剂盒是在实施例3的基础上，制备成可以直接加入检测样本后，进行检测的试剂盒。该试剂盒有检测OPRM1的8联PCR反应条以及验证试剂盒性能分析时所需的野生型质粒、突变型质粒、内控质粒，也就是OPRM1A118G野生型、突变型阳性对照物及质控阳性对照物组成，各成分如表1所示，具体反应体系的配置见表2。每条OPRM1 8联PCR反应条的奇数管(1/3/5/7或A/C/E/G)对应检测体系为野生型反应体系A1反应液，检测OPRM1A118G野生型；偶数管(2/4/6/8或B/D/F/H)对应的检测体系为突变型反应体系A2反应液，检测OPRM1A118G突变型。每管主要成分为特异性引物、荧光探针和PCR反应液等，其中公共检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，则检测样本信号类型为FAM信号；内部质控的质控探针5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1，内部质控信号类型为JOE信号(内控作为对试剂盒、DNA质量以及操作本身的质控)；检测的引物、探针委托上海英骏生物技术有限公司合成。

表1试剂盒组成

表2反应体系的配置

其中，AB premix的全称 Fast Advanced Master Mix，购自ABI(美国应用生物系统公司)；10×PCR buffer(Mg²⁺Plus)购自TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司，经过大量试验、验证该试剂盒为一种高灵敏、高特异性、高效的检测OPRM1基因多态性的检测试剂盒。

实施例5：对实施例4中制备的试剂盒进行性能分析实验

OPRM1重组质粒购自南京金斯瑞生物科技有限公司，以现有基因工程技术人工合成的OPRM1基因A118G多态性位点含有SEQ ID NO:8所示序列为野生型质粒，含有SEQ IDNO:9所示序列为突变型质粒，人工合成含有SEQ ID NO:10所示序列为内控质粒。各质粒干粉用TE(10mmol/L，PH8.0)复溶，定量后稀释。

(1)灵敏度

取2×10¹copies/μL的野生型质粒和内控质粒1:1混合，配置成终浓度为10copies/μL的OPW-1参考品；取2×10¹copies/μL的突变型质粒和内控质粒1:1混合，配置成终浓度为10copies/μL的OPM-1参考品；取2×10¹copies/μL的野生型质粒、突变型质粒、内控质粒1:1:2体积比混合，配置成终浓度为10copies/μL的OPWM-1杂合参考品，以这三种参考品为模板，在实施例4中制备A1(OPW)和A2(OPM)体系中分别进行实时荧光PCR扩增反应。扩增反应的程序采用实施例2中方法，具体结果见图3、4。检测结果表明，本发明的荧光PCR方法特异性强，灵敏度高，10copies/μL浓度的DNA在两种体系中均可检出三种基因型。

(2)精密度

取6×10³copies/μL的OPRM1基因野生型质粒、突变型质粒、GAPDH内控质粒1:1:2体积比混合，配置成终浓度为3×10³copies/μL的杂合参考品OPWM-2为模板，在A1和A2体系中分别进行如上实时荧光PCR扩增反应。检测结果见图5、6，结果表明本发明的实时荧光PCR扩增反应重复性好(20次重复实验结果稳定，CV<5％)。

(3)特异性

ABCB1质粒人工合成于南京金斯瑞生物科技有限公司。以现有基因工程技术人工合成的ABCB1基因含有SEQ ID NO:11所示序列，分别取6×10⁴copies/μL的OPRM1和ABCB1基因的野生型质粒和内控质粒1:1混合，配置成终浓度为3×10⁴copies/μL的OPW-3和ABW-3参考品；取上述两个基因的6×10⁴copies/μL突变型质粒和内控质粒1:1混合，配置成终浓度为3×10⁴copies/μL的OPM-3和ABM-3参考品；在A1体系中分别以3×10⁴copies/μL的OPW-3和ABW-3参考品为模板，在A2体系中分别以3×10⁴copies/μL的OPM-3和ABM-3参考品为模板，后进行如上实时荧光PCR扩增反应，具体结果见图7、8。结果表明，本发明的荧光PCR方法特异性强，ABCB1基因和OPRM1基因之间无交叉反应，3×10⁴copies/μL浓度的ABCB1基因组DNA在A1和A2体系中均不能检出，表明体系的特异性好。

实施例6：临床样本DNA的提取

一、EDTA抗凝血样本

本实施例是从EDTA抗凝血样本(由武大人民医院提供)中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用天根的血液基因组DNA提取试剂盒，具体操作见该DNA提取试剂盒说明书，最后将提取的EDTA抗凝血样本DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。

二、口腔拭子样本

本实施例是从口腔拭子(由同济医院提供)中提取基因组DNA，并对其进行定量，作为PCR检测的模板。采用康为世纪的口腔拭子基因组DNA提取试剂盒，具体操作详该DNA提取试剂盒说明书，最后，将提取的口腔拭子DNA用紫外分光光度计进行定量，稀释DNA浓度到1ng/μL。实施例7：实时荧光PCR法扩增临床样本DNA

本实施例为采用实施例4制备的试剂盒、实施例6提取的DNA样本，进行实时荧光PCR扩增。

检测方法如下：

1)每次PCR反应中，同时进行非模板对照(No Template Control；NTC)、阳性对照和待测样本的检测。

2)将阳性对照物取出解冻后震荡混匀，并离心30s。

3)将8联PCR反应条取出解冻后离心30s，防止反应液在开盖时溅出。

4)将ddH₂O(NTC)、实施例6中提取的DNA样本、阳性对照物分别加入8联PCR反应条，每孔10μL。

5)将以上8联PCR反应条盖好管盖于离心机上离心30S，确保管壁上不沾有液滴。

6)将8联PCR反应条放于实时荧光PCR仪器中。

按照实施例2中的优选反应程序进行荧光PCR反应，利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过反应体系的突变型和野生型FAM信号的荧光强度差异来判断检测结果；JOE是内控信号，用于检测体系是否正常，样本是否漏加及初步判断样本DNA量是否在允许范围内，JOE信号应达到设定阈值(Ct值小于25)；FAM是检测信号，用于检测样本的基因多态性；在内控信号达到要求后，以SNP位点的突变型和野生型FAM信号达到设定阈值所需的循环次数Ct值的差值作为判断标准。其中，NTC检测结果，FAM信号都应无曲线升起，内控JOE信号可偶尔起线，符合要求；阳性对照STD检测结果，FAM信号均起线且Ct≤25，符合要求；根据野生型和突变型的Ct值的差值做如下判断：

△Ct＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

△Ct＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

样本结果判定具体见表3。

利用本发明方法对84例样本提取的DNA进行检测，其检测结果如下表4，W为野生型反应体系，M为突变型反应体系，样本的扩增曲线图此处不再全部例出，仅例出具有代表性的两个样本的扩增曲线图，具体如图9、图10所示。同时将84例样本DNA采用Sanger金标准(武汉艾康健公司测序)进行测序检测，将两者的检测能力进行比较，结果见表5。

本检测方法检测出的与“金标准”Sanger测序法的结果完全相符，说明本发明指标的试剂盒及方法检测OPRM1基因多态性准确、可靠。

表3OPRM1基因多态性检测结果判定

表4 84例样本的DNA OPRM1A118G多态性检测结果

表5本发明检测结果和sanger测序金标准比较

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉海吉力生物科技有限公司

<120> 用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸、试剂盒及方法

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

caacttgtcc cacttagaag gca 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gtcaacttgt cccacttaga tggtg 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gctttcctta cctgacaatc acatac 26

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cctgtccgac ccatg 15

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

catcaagaag gtggtgaagc ag 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tgtcgctgtt gaagtcagag ga 22

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tggtgctcag tgtagcccag gatgc 25

<210> 8

<211> 206

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

caacttgtcc cacttagatg gcaacctgtc cgacccatgc ggtccgaacc gcaccgacct 60

gggcgggaga gacagcctgt gccctccgac cggcagtccc tccatgatca cggccatcac 120

gatcatggcc ctctactcca tcgtgtgcgt ggtggggctc ttcggaaact tcctggtcat 180

gtatgtgatt gtcaggtaag gaaagc 206

<210> 9

<211> 208

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

gtcaacttgt cccacttaga tggcgacctg tccgacccat gcggtccgaa ccgcaccgac 60

ctgggcggga gagacagcct gtgccctccg accggcagtc cctccatgat cacggccatc 120

acgatcatgg ccctctactc catcgtgtgc gtggtggggc tcttcggaaa cttcctggtc 180

atgtatgtga ttgtcaggta aggaaagc 208

<210> 10

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

catcaagaag gtggtgaagc aggcgtcgga gggccccctc aagggcatcc tgggctacac 60

tgagcaccag gtggtctcct ctgacttcaa cagcgaca 98

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tggagacaac agccgggtgg tgtcacagga agagatcgtg agggcagcaa aggaggccaa 60

catacatgcc ttcatcgagt cactgcctaa tgtaagtctc 100

Claims

1.一组用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的核酸，其特征在于，该核酸包括检测针对A118G位点的野生型上游引物、突变型上游引物、公用下游引物和公用检测探针，其中，所述野生型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述突变型上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述公用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.如权利要求1所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括内部质控，所述内部质控包括质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

3.如权利要求1或2所述的核酸，其特征在于，所述核酸还包括野生型阳性对照物、突变型阳性对照物和/或质控阳性对照物，其中，所述野生型阳性对照物含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列，所述突变型阳性对照物含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，所述质控阳性对照物含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列。

4.一种用于检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于实时荧光PCR检测人类OPRM1基因A118G位点的野生型和突变型，所述试剂盒包括：如权利要求1-3中任一所述的核酸，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团，或/和质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种。

6.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：PCR缓冲液、DNA聚合酶、矿物油、阴性对照物：无核酸酶水。

7.一种检测人类OPRM1基因A118G位点多态性的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)从样本中提取DNA；

(2)对提取的所述DNA，同时进行野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；其中，所述野生型体系中野生型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述反突变型体系中突变型引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，公用检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述公用检测探针的5＇端连接荧光基团，3＇端连接淬灭基团；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述野生型体系和所述突变型体系还包括有作为内部质控的质控引物对和质控探针，所述质控引物对的核苷酸序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，该质控探针的5＇端连接有不同于所述公用检测探针的荧光基团，3＇端连接有不同于所述公用检测探针的淬灭基团；

在步骤(2)中，在所述野生型体系和所述突变型体系中，各条引物和探针的终浓度为100-1000n mol/L；所述荧光基团为FAM、JOE、CY3、HEX、中任意一种，所述淬灭基团为MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一种；

所述实时荧光PCR扩增的反应程序为：

9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，在各自的所述野生型体系和所述突变型体系中，所述野生型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述突变型引物对的终浓度均为200nmol/L，所述公用检测探针的终浓度为200nmol/L，所述内部质控的引物对的终浓度均为150nmol/L，所述质控探针的终浓度为100n mol/L；所述检测探针的5＇端连接FAM，3＇端连接MGB，所述质控探针的5＇端连接JOE，3＇端连接BHQ1；

所述确定样本DNA的基因型，如下：

△Ct＝|野生型Ct值-突变型Ct值|≤2.5为杂合型样本；

△Ct＝野生型Ct值-突变型Ct值>2.5为突变型样本；

△Ct＝突变型Ct值-野生型Ct值>2.5为野生型样本。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，还设有阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为以含有如SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、含有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列、和/或含有如SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；所述阴性对照为以无核酸酶水为模板，进行所述野生型体系和突变型体系的实时荧光PCR扩增；