CN107365850A - 一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，属于单核苷酸多态性检测技术领域。本发明提供的在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法包括以下步骤：1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果。本发明提供的检测方法在单管中同时检测多个SNP位点，节省了时间，降低了成本，检测的准确度高，适合于大规模基因型筛选。

Description

一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法
技术领域
本发明涉及单核苷酸多态性检测技术领域，具体涉及一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术
大约90％的人类基因变异都表现在DNA单个碱基的变化上，称为单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP的检测为致病基因的鉴定、药物靶向治疗的建立以及个体化给药提供了可能。因此，低成本、高效率、操作简便的检测SNP的新技术就显得尤为紧迫和重要。
近几年，以荧光基团标记的探针技术已经广泛用于快速的SNP基因分型。其中碱基猝灭技术是一种不依赖鸟嘌呤的单荧光标记的单探针技术，仅需要一对引物和一个探针，就可以实现SNP的筛查。研究表明碱基猝灭技术与DNA测序技术具有一致性，适合大规模的基因分型研究。目前，碱基猝灭探针技术已在单一荧光通道单管中成功完成了对多种基因的SNP位点的检测(如A1AT、线粒体DNA、MT2A基因、ABCC11、PROC基因、CYP4F2基因、EPHX1基因以及VKORC1基因等)。但是，该技术仅在单一荧光通道单管仅能检测1～2个SNP位点，具有很大的局限性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法。本发明提供的检测方法在单管中同时检测多个SNP位点，节省了时间，降低了成本，检测的准确度高，适合于大规模基因型筛选。
本发明提供了一种在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；
2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；
3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；
所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道。
优选的是，所述荧光基团包括：FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的多个。
优选的是，不同探针所对应的Tm值独立地大于25℃。
优选的是，所述靶基因为基因组DNA。
优选的是，每25μL步骤2)的反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl21.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM前引物0.1μL，100μM后引物0.1μL，10μM标记探针各0.1μL，ddH2O补足至25μL。
优选的是，所述步骤2)聚合酶链反应的条件为：95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环。
优选的是，所述步骤3)中的熔解曲线根据所述收集到的荧光信号通过PCR熔解曲线分析程序得到。
优选的是，所述PCR熔解曲线分析程序的条件为：95℃30s，25℃4min，然后以0.1℃/s的温度转化率升温至80℃。
优选的是，所述PCR熔解曲线分析程序由LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪进行。
优选的是，所述LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪针对不同的荧光基团设置荧光检测通道。
本发明提供了一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法。本发明提供的检测方法采用不同的荧光基团标记探针，通过聚合酶链反应(PCR)结合熔解曲线分析检测多位点突变。本发明提供的检测方法能够在单管中同时检测多个SNP位点，操作步骤简单，操作周期和成本低，检测结果与基因测序结果一致，准确度高，能够适合于大规模基因型筛选。
附图说明
图1为本发明中碱基猝灭探针技术检测SNP的原理图；
图2为本发明中单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法的原理流程图；
图3为本发明中单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法的技术路线图；
图4为本发明实施例1提供的单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法同时对apoM rs707921，apoM rs707922和MCP-1 rs1024611的分型结果；
图5为本发明实施例1提供的基因测序技术对apoM rs707921,apoM rs707922和MCP-1rs1024611的分型结果。
图6为本发明实施例1提供的碱基猝灭探针技术分别对apoM rs707921,apoMrs707922和MCP-1rs1024611的分型结果；
图7为本发明实施例2提供的单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法同时对apoM rs707921，apoM rs707922,apoM rs805264和MCP-1 rs1024611的分型结果；
图8为本发明实施例2提供的基因测序技术对apoM rs805264的分型结果。
图9为本发明实施例2提供的碱基猝灭探针技术对apoM rs805264的分型结果。
具体实施方式
本发明提供了一种在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；
2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；
3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；
所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道。
本发明采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值。本发明对所述荧光基团的种类和数量没有特殊的限定，采用本领域技术熟知的常规现有荧光基团即可。在本发明中，所述荧光基团优选包括：FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的多个。
本发明所述不同的荧光基团通过标记不同的SNP位点的探针，能够实现在同一PCR体系中检测多位点的突变。本发明利用不同荧光基团的不同的性质进行多位点单核苷酸多态性的检测，在本发明中，大部分荧光基团如FAM、HEX，TET，JOE，TAMRA，Texas Red，ROX等标记的探针，当与靶DNA序列在较低温度(如30℃)下杂交时，各荧光基团发出的荧光被碱基猝灭，当温度缓慢升高(如温度升高转换率为0.1℃/s)时，探针熔解脱离靶DNA序列，各荧光基团的荧光增强；与其他荧光基团相反，荧光基团CY3和CY5标记的探针，当与靶DNA序列在较低温度下杂交时，荧光基团CY3和CY5的荧光增强，当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA序列，荧光基团CY3和CY5发出的荧光却被碱基猝灭。本发明基于荧光基团的上述特性，利用聚合酶链反应(PCR)结合熔解曲线分析检测多位点突变，本发明基因分型的结果取决于探针的Tm的变化，本发明对Tm值检测用仪器并没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的检测Tm值的仪器即可，如LightCycler 480Ⅱ。本发明利用LightCycler480Ⅱ检测仪检测得到熔解曲线，根据熔解曲线中Tm的变化检测出纯合野生型或纯合突变型(两者均显示一个熔解谷或熔解峰)和杂合子(显示出两个熔解谷或熔解峰)。荧光增量变化最大时的温度称为熔解温度(Tm)。突变型基因的Tm值与野生型基因的Tm值明显不同，由此将不同基因型区分开来。
在本发明中，所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点。本发明所述不同的单核苷酸位点在基因组DNA上的位置没有具体限定。所述不同的探针依据待检测的单核苷酸位点进行设计，本发明对所述探针的设计方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的探针设计原理及软件进行设计即可。在本发明中，不同的探针所对应的熔解温度Tm值也不同。本发明不同Tm值探针对应的熔解曲线出现的位置不同，能够更好地区分不同的SNP位点，防止不同SNP位点的熔解曲线交叉重叠以至于部分基因型无法显示。在本发明中，探针的Tm值大于25℃。
在本发明中，所述靶基因为基因组DNA，所述靶基因上有SNP位点。
本发明对探针标记的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的探针标记方法即可，如选择生物公司进行。
得到标记探针后，本发明将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应。本发明通过上述聚合酶链反应实现对靶基因的检测。本发明对所述反应体系没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PCR反应体系即可。在本发明中，每25μL步骤2)的反应体系优选包括：10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl21.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM前引物0.1μL，100μM后引物0.1μL，10μM标记探针各0.1μL，ddH2O补足至25μL。在本发明中，所述前引物和后引物为根据靶基因进行设计的引物，本发明对引物设计的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的引物设计方法即可。
本发明对所述聚合酶链反应的反应条件也没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PCR的常规反应条件即可。在本发明中，所述步骤2)聚合酶链反应的反应条件优选为：95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环。
本发明提供的在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，在PCR仪器上利用不同的荧光通道收集荧光信号，最终根据PCR产物熔解曲线的熔解温度(Tm)的变化实现多位点单核苷酸多态性的检测。
聚合酶链反应进行完上述程序后，转换为荧光信号收集程序开始对荧光信号的持续收集，本发明对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道。本发明根据所述收集到的荧光信号通过荧光信号收集程序，即PCR熔解曲线分析程序得到熔解曲线，所述PCR熔解曲线分析程序的条件为：95℃30s，25℃4min，然后以0.1℃/s的温度转化率升温至80℃。所述PCR熔解曲线分析程序在LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪上进行。在本发明中，所述LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪针对不同的荧光基团设置荧光检测通道。所述PCR熔解曲线分析程序与步骤2)聚合酶链反应为连续式反应。在本发明中，所述不同荧光基团对应的荧光检测通道的发射光谱优选无交叉。
以上述9种荧光基团为例，有465～510nm,533～580nm，533～610nm和618～660nm四个通道，当选择互相不交叉的荧光通道时，在不同的通道中选择对应的荧光基团，然后标记探针。本发明优选选择荧光通道不交叉的荧光基团进行标记。
荧光基团 荧光通道(nm)
FAM 465～510
CY3 533～580
HEX 533～580
TET 533～580
JOE 533～580
Texas Red 533～610
ROX 533～610
CY5 618～660
TAMRA 533～580
其中533～580nm和533～610nm通道之间会有交叉，当出现荧光光谱交叉时，采用以下方法避免或排除光谱交叉干扰：通常情况下，不同荧光物质的荧光光谱不会完全重叠，利用不同荧光光谱之间荧光光谱不重叠的差异，可以将来自于两种荧光物质的荧光信号鉴别开来。在本发明中，当某一种或几种荧光基团的荧光强度太高时，可以降低标记物浓度，也就是降低了干扰荧光基团的荧光强度。本发明对荧光信号收集的装置没有特殊的限制，选取能够自动生成熔解曲线的仪器即可，在本发明中，步骤3)优选利用LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪对荧光信号进行收集和分析。
本发明所述检测方法是基于碱基猝灭探针技术，所述碱基猝灭探针技术原理图如图1所示(选取荧光基团FAM为例)：当探针与靶DNA序列在较低温度下杂交时，FAM发出的荧光被碱基猝灭(a)；当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA序列，FAM发出的荧光增强(b)。
本发明所述单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法的原理图如图2所示：用不同的荧光基团标记不同SNP位点的探针同时检测多位点突变：大部分荧光基团如FAM、HEX，TET，JOE，TAMRA，Texas Red，ROX等标记的探针，当与靶DNA序列在较低温度下杂交时，各荧光基团发出的荧光被碱基猝灭，当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA序列，各荧光基团的荧光增强；与其他荧光基团相反，荧光基团CY3和CY5标记的探针，当与靶DNA序列在较低温度下杂交时，荧光基团CY3和CY5的荧光增强，当温度缓慢升高时，探针熔解脱离靶DNA序列，荧光基团CY3和CY5发出的荧光却被碱基猝灭。不同SNP位点的探针之间的TM值不同。最终不同SNP位点的基因分型取决于探针的熔解温度。
图3为单管中多位点单核苷酸多态性检测方法的技术路线图：(1)在NationalCenter for Biotechnology Information中筛选出多个SNP位点。(2)特异性引物和探针设计(包括荧光标记基团的筛选)，本发明引物的设计采用本领域技术人员熟知的方法进行设计即可，人工合成特异性引物和探针。(3)利用碱基猝灭探针技术在单管中对每一个标本进行初步的SNP位点的分型，作为对比方法验证本发明的基因分型结果。(4)在PCR上选择出多种荧光基团彼此不交叉的最佳荧光通道。(5)用不同的荧光基团标记多个SNP位点的探针，在PCR上通过不同的荧光基团互不交叉的荧光通道收集荧光信号。将本发明的基因分型结果与基因测序技术和碱基猝灭探针技术检测的结果进行比对。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
在本实施例中选择载脂蛋白M(apoM，rs707921和rs707922)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,rs1024611)作为靶基因。用6-FAM标记apoM的两个SNP位点的探针，用ROX标记MCP-1的探针。将探针和引物置于相同的PCR体系中，该体系的配制和PCR程序分析如下：PCR总反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl21.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM apoM前引物0.1μL，100μM apoM后引物0.1μL(apoMrs707921和rs707922共用一对前引物和后引物)，10μM apoM rs707921标记探针0.1μL，10μM apoM rs707922标记探针0.1μL，100μM MCP-1前引物0.1μL，100μM MCP-1后引物0.1μL，10μM MCP-1标记探针0.1μL，ddH2O补足至25μL，引物和标记前探针的序列见表1，具体序列如SEQ ID NO:1～8所示；标记后的探针如表2所示。在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行，循环参数:95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环；PCR熔解曲线分析程序：95℃30s，25℃4min，然后逐渐升至80℃(温度转换率为0.1℃/s，持续收集荧光数据)，通过FAM(465/510nm)和ROX(533/610nm)通道收集每个循环的荧光数据。
本发明同时对apoMrs707921、apoM rs707922和MCP-1 rs1024611的分型结果如图4所示，图4为在两个荧光通道中，利用单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法同时对三个SNP位点的分型结果：A图所示apoMrs707921和apoMrs707922的分型结果，B图所示MCP-1rs1024611的分型结果。①阴性标本；②DNA样本1：apoM 922GT杂合子，apoM 921CA杂合子和MCP-1GG野生型；③DNA样本2：apoM 922GG野生型，apoM 921CC野生型和MCP-1AA纯合突变型；④DNA样本3：apoM 922TT纯合突变型，apoM 921AA纯合突变型和MCP-1GA杂合子。
基因测序技术对apoM rs707921,apoM rs707922和MCP-1rs1024611的分型结果如图5所示：左侧A，B和C中的箭头所示为922的基因分型结果：(A)GG野生型；(B)GT杂合子；(C)TT纯合突变型。中间D，E和F中的箭头所示为921的基因分型结果：(D)CC野生型；(E)CA杂合子；(F)AA纯合突变型；右侧G，H和I中的箭头所示为MCP-1rs1024611的基因分型结果：(G)GG野生型；(H)GA杂合子；(I)AA纯合突变型。碱基猝灭探针技术分别对apoMrs707921,apoMrs707922和MCP-1rs1024611的分型结果如图6所示：(A)apoMrs707921；(B)apoM rs707922；(C)MCP-1rs1024611。本发明同时对三个SNP位点的分型结果(图4)与基因测序技术(图5)和碱基猝灭探针技术(图6)检测的结果具有一致性。
表1.实施例1中引物和未标记探针序列
表2实施例1中标记探针序列和荧光基团
实施例2
在本实施例中选择载脂蛋白M(apoM，rs707921,rs707922和rs805264)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1,rs1024611)作为靶基因。用6-FAM标记apoM rs707921和apoM rs707922两个SNP位点的探针，用HEX标记apoM rs805264的探针，用CY5标记MCP-1的探针。将所有的探针和引物置于相同的PCR体系中，该体系的配制和PCR程序分析如下：PCR总反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl21.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM apoM前引物0.1μL，100μM apoM后引物0.1μL(apoM rs707921和rs707922共用一对前引物和后引物),10μM apoM rs707921标记探针0.1μL，10μM apoMrs707922标记探针0.1μL，100μM apoM rs805264前引物0.1μL，100μM apoM rs805264后引物0.1μL，10μM apoM rs805264标记探针0.1μL，100μM MCP-1前引物0.1μL，100μM MCP-1后引物0.1μL，10μM MCP-1标记探针0.1μL，ddH2O补足至25μL，引物和标记前探针的序列见表3，具体序列如SEQ ID NO:1～12所示；标记后的探针如表4所示。在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行，循环参数:95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环；PCR熔解曲线分析程序：95℃30s，25℃4min，然后逐渐升至80℃(温度转换率为0.1℃/s，持续收集荧光数据)，通过FAM(465/510nm)，HEX(533/580nm)和CY5(618/660nm)通道收集每个循环的荧光数据。
本发明同时对apoM rs707921、apoM rs707922、apoM rs805264和MCP-1rs1024611的分型结果如图7所示，图7为在三个荧光通道中，利用单管中检测多位点单核苷酸多态性的方法同时对四个SNP位点的分型结果：A图所示apoM rs707921和apoM rs707922的分型结果，B图所示apoM rs805264的分型结果，C图所示MCP-1 rs1024611的分型结果。①阴性标本；②DNA样本1：apoM 922GT杂合子，apoM 921CA杂合子,apoM 264AA纯合突变型和MCP-1GG野生型；③DNA样本2：apoM 922GG野生型，apoM 921CC野生型,apoM 264GA杂合子和MCP-1AA纯合突变型；④DNA样本3：apoM 922TT纯合突变型，apoM 921AA纯合突变型,apoM264GG野生型和MCP-1GA杂合子。
基因测序技术对apoM rs805264的分型结果如图8所示：黑色箭头所示为apoMrs805264的基因分型结果：(A)GG野生型；(B)GA杂合子；(C)AA纯合突变型。本发明同时对四个SNP位点的分型结果(如图7)与基因测序技术(如图5和8)和碱基猝灭探针技术(如图6和9)检测的结果具有一致性。
表3.实施例1中引物和未标记探针序列
表4实施例2中标记探针序列和荧光基团
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<120> 一种单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法
<130> 2017
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcatctctgt tctcatactt ctccc 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcaaagggga gtctctaagg ctct 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggattagg actcaccaag tctt 24
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtaaggtgt taaaat 16
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagaaagcat tattcaccaa gaggagc 27
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagtaaacac agggaaggtg aagggtat 28
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagctgtcac tttcc 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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<210> 10
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<212> DNA
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aggcttcccc caatctcagt 20

Claims (10)

1.一种在单管中多位点单核苷酸多态性的检测方法，包括以下步骤：
1)采用不同的荧光基团分别标记不同的探针，得到不同荧光基团标记的探针；所述不同的探针对应不同的单核苷酸位点；不同的探针具有不同的Tm值；
2)将所述步骤1)得到的标记探针和靶基因混合置于同一反应体系中进行聚合酶链反应；
3)对所述步骤2)反应体系的荧光信号进行收集，得到熔解曲线，根据所述熔解曲线的Tm值的变化得到多位点单核苷酸多态性检测结果；
所述收集过程中，不同的荧光基团对应不同的荧光检测通道。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光基团包括：FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA、Texas Red、ROX、CY3和CY5中的多个。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，不同探针所对应的Tm值独立地大于25℃。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述靶基因为基因组DNA。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，每25μL步骤2)的反应体系包括：10×PCR缓冲液2.5μL，25mM MgCl2 1.5μL，0.2mM 4×dNTPs 0.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，100μM前引物0.1μL，100μM后引物0.1μL，10μM标记探针各0.1μL，ddH2O补足至25μL。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤2)聚合酶链反应的条件为：95℃预变性5min；95℃2s，58℃10s，60℃1min，共40个循环。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤3)中的熔解曲线根据所述收集到的荧光信号通过PCR熔解曲线分析程序得到。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR熔解曲线分析程序的条件为：95℃30s，25℃4min，然后以0.1℃/s的温度转化率升温至80℃。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR熔解曲线分析程序由LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪进行。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述LightCycler480Ⅱ基因扩增检测仪针对不同的荧光基团设置荧光检测通道。
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