CN102449166B - 一种单管检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单管检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法，相应的寡核苷酸、探针、探针组、试剂盒及其用途。具体地，通过检测人工熔点标签序列(AMTS)的熔点和荧光标记类型来识别多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性。

Description

一种单管检测多个单核苷酸变异或单核苷酸多态性的方法

本申请要求申请人为厦门大学的、2009年5月26日提交的第200910143480.6号和第200910143479.3号中国专利申请的优先权，这两个优先权申请的全部内容通过引用的方式并入本文，就如同其全部内容均明确撰写在本申请中一样。

技术领域

本发明涉及一种单管检测多个单核苷酸变异或多态性基因型的方法，尤其涉及一种通过人工熔点标签序列的熔点和荧光标记类型来识别多个单核苷酸变异(或SNP)位点基因型的方法。

背景技术

基因组中的变异或多态性，普遍存在于生物有机体中，它主要是指不同物种或同一物种不同个体间基因组序列的差异，包括基因编码区和非编码区序列的差异。DNA的变异或多态性反映了物种形成、选择、迁移、重组和交配体系等的进化历程，奠定了丰富多彩的生物界，是生物多样性的基础。DNA变异或多态性最简单最多见的形式就是发生在基因组中的单个核苷酸的变异或多态性，即单核苷酸变异或多态性。单核苷酸变异(或SNP)是人类基因组DNA序列中最常见的变异形式，是重要的遗传标志之一，被认为与个体的表型差异、疾病的易感性、药物的反应和抗药性等相关。这种变异或多态性现象同样广泛存在于其它物种中，也同样具有重要的生物功能。因此，单核苷酸变异或多态性的检测具有重要意义。

用于单核苷酸变异(或SNP)的检测和基因分型的方法有很多(Ragoussis，J.Annu Rev Genomics Hum Genet，2009，10，117-133)，如限制性片段长度多态性、单链构象多态性分析、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性扩增系统、寡核苷酸连接分析、反向点杂交、变性高校液相色谱、质谱分析、基因芯片、焦磷酸测序、基因测序等技术。由于这些技术都需要进行PCR的后处理操作，易造成扩增产物的污染，且分析相对比较繁琐，花费时间长，不能满足临床上快速、简便的需求。

实时聚合酶链式反应(Real-time PCR，简称实时PCR)是指扩增与检测同步进行，通过检测扩增循环中荧光信号的变化以指示扩增过程。作为一种重要的均相检测技术，实时PCR近年来被广泛用于单核苷酸变异(或SNP)的检测和基因分型。目前，根据是否使用荧光探针，实时PCR可以分为探针式和非探针式两种形式。由于探针式实时PCR增加了对模板特异性识别的探针，比非探针式实时PCR检测结果更加特异。探针式实时PCR还可以通过对不同的靶序列探针标记不同的荧光基团，达到检测多个靶序列的目的，因此探针式实时PCR相对更为常用。探针式实时PCR使用的探针有多种，即包括TaqMan探针(Livak，K.J.GeneticAnalysis，1999，14，143-149.)、TaqMan-MGB探针(Afonina，I.A.et al，Biotechniques，2002，32，4，940-944，946-949)、分子信标探针(Molecular Beacons)(Tyagi，S.et al，NatureBiotechnology，1998，16，49-53)、置换探针(Li，Q.，et al，Nucleic Acids Research，2002，30，E5.)、蝎子引物(Scorpions)(Whitcombe，D.et al，Nature Biotechnology，1999，17，804-807)、Amplifier引物(Nazarenko，I.A.，et al，Nucleic Acids Research，1997，25，1516-1521)等。这些探针用于单核苷酸变异或SNP检测时，常采用的是两条不同荧光标记的基因型特异探针来检测一个单核苷酸变异或SNP的模式，如Ruan L等人(Ruan，L.，et al.Transfusion.2007，47(9)：1637-42)在3管中实现了对6个单核苷酸变异或SNP的检测。受目前实时PCR仪检测通道的限制，该方法单管最多能同时检测3个单核苷酸变异或SNP。因此，实时PCR能够满足临床上快速、简便的需求，但是单管能检测的单核苷酸变异或SNP数量有限，对多个单核苷酸变异或SNP的检测往往需要分为数管才能完成，不能满足临床检测中对高通量的需求，且成本较高。

检测单核苷酸变异或SNP的另一种方式是在实时PCR后引入熔解曲线分析，通过探针与不同靶杂交形成熔点(Tm)的差异来识别单核苷酸变异或SNP的基因型。用这种检测模式一条检测荧光探针可以实现对一个单核苷酸变异或SNP的基因分型，与上述实时PCR通过不同颜色标记的两条探针检测一个单核苷酸变异或SNP基因型的模式相比，该方法单管检测单核苷酸变异或SNP的数量提高了一倍。如Nicklas JA等人(Nicklas，J.A.，et al.Journal of Forensic Sciences，2008，53(6)：1316-24)在6色实时PCR仪上，利用相邻杂交探针熔解曲线单管实现了对6个单核苷酸变异或SNP的基因分型。然而，该方法检测更多的单核苷酸变异或SNP仍然需要分成更多的管才能完成，仍不能满足临床上检测高通量的需求，且一条荧光检测探针只能实现对一个或少数几个单核苷酸变异或SNP的检测，成本也较高。

发明内容

为了克服现有技术操作繁琐、耗时长、易污染及通量不能满足临床需求等缺点，本发明提供一种在单一反应管内检测多个单核苷酸变异或多态性位点基因型的方法。其技术方案优选是将单核苷酸变异(或SNP)基因型用特异的人工熔点标签序列(AMTS)进行标记，通过检测一个荧光探针与多个不同的AMTS杂交形成熔解曲线峰值(熔点)的差异来区分各个单核苷酸变异(或SNP)位点的基因型，进而采用不同荧光标记的荧光探针实现单管中对多个单核苷酸变异(或SNP)基因型的同时检测。

一方面，本发明提供用于检测单核苷酸变异或多态性基因型、优选用于单管检测多个单核苷酸变异或多态性基因型的探针、探针组、试剂盒及其用于检测单核苷酸变异或多态性基因型、优选用于单管检测多个单核苷酸变异或多态性基因型的用途。

另一方面，本发明提供检测单核苷酸变异或多态性基因型、优选用于单管检测多个单核苷酸变异或多态性基因型的方法。在具体方面，本发明涉及一种通过人工熔点标签序列(AMTS)的熔点来识别多个单核苷酸变异(或SNP)位点基因型的方法。优选地，该方法首先通过杂交探针的杂交和连接反应，实现单核苷酸变异(或SNP)的AMTS标记；再进行PCR扩增和扩增后检测荧光探针的熔解曲线分析，根据熔解曲线峰值(熔点)的差异来区分各个单核苷酸变异(或SNP)位点的基因型，从而实现单管中对多个单核苷酸变异(或SNP)基因型的同时检测。

本发明的一个优选的具体实施方式如下：

第一步，将单核苷酸变异(或SNP)用AMTS标记：设计的AMTS添加于连接反应左侧杂交探针的5′端，左侧杂交探针的3′末端碱基就是待测单核苷酸变异(或SNP)位点所在位置，添加AMTS后的左侧杂交探针序列包括四个部分(图1)，从5′端到3′端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、任选的间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列。相应的连接反应的右侧杂交探针从5′端到3′端包括两个部分，依次是：模板结合序列和下游引物结合序列(图1)。各个部分之间可以(但是不必须)包含间隔序列。

第二步，AMTS标记的实现：通过核酸连接酶特异连接反应，左侧杂交探针与右侧杂交探针连接成为一个完整的单链核酸，就完成了由待测单核苷酸变异(或SNP)基因型到对应的AMTS熔点的转换，实现了单核苷酸变异(或SNP)的AMTS标记。

第三步，单核苷酸变异(或SNP)位点的检测：上述标记完成后，利用一对通用引物PCR扩增上述连接产物，PCR反应体系中含有与AMTS杂交的探针，PCR完成后，进行熔解曲线分析，根据熔解曲线峰就可以获得待测单核苷酸变异(或SNP)基因型信息。

所说的AMTS，是预先设计的一段寡核苷酸序列，该序列与检测荧光探针杂交后表现出特定的熔点，该熔点可以通过荧光探针检测，优选以熔解曲线的形式给出。

所说的用AMTS标记单核苷酸变异(或SNP)基因型，一般是把单核苷酸变异(或SNP)的基因型转换为可以检测的熔解曲线峰(熔点)，实现这一转换优选是通过核酸连接酶催化的连接反应完成的。

所说的左侧杂交探针的一种设计方式可以是：针对一个单核苷酸变异(或SNP)位点的两种纯合基因型设计两条型特异的左侧杂交探针，分别标记可用同一荧光探针检测的两种AMTS。这种方式根据单核苷酸变异(或SNP)的基因型可以给出三种不同的熔解曲线峰，分别是两种纯合型和一种杂合型，对应于两个不同熔点的单峰和一个杂合双峰。这种设计杂交探针方式的特点是检测每一个单核苷酸变异(或SNP)位点，需要设计两条型特异的左侧杂交探针，需要使用两种AMTS，但只需要一种荧光探针。

所说的左侧杂交探针的一种设计方式可以是：针对一个单核苷酸变异(或SNP)位点的两种纯合基因型设计的两条型特异的左侧探针，分别标记可用两个熔点相同或者相近但是序列差异很大的AMTS标记，用各自的不同荧光标记的荧光探针检测，使得待测的两种基因型的熔点相同或者相似，但荧光类型不同；这种方式根据单核苷酸变异(或SNP)的基因型可以给出三种不同的熔解曲线峰，分别是两种纯合型和一种杂合型，对应于两个近似或者相同熔点的但荧光标记不同的单峰和一个杂合双峰。这种设计杂交探针方式的特点是检测每一个单核苷酸变异(或SNP)位点，需要设计两条型特异的左侧杂交探针，需要使用两种AMTS和两种不同标记的荧光探针。

所说的左侧杂交探针的另一种设计方式是：针对一个单核苷酸变异(或SNP)位点只设计一条对应于一种纯合型的左侧杂交探针，用一种AMTS标记。这种方式根据单核苷酸变异(或SNP)的基因型同样也给出三种不同的熔解曲线峰，其中的高单峰对应匹配纯合型，低单峰对应杂合基因型，没有峰出现的情况则对应另一种纯合基因型。这种设计杂交探针方式的特点是检测每一个单核苷酸变异(或SNP)位点，只需要设计一条左侧杂交探针，只需要使用两种(或一种)AMTS，而单核苷酸变异(或SNP)基因型的识别依赖于熔解曲线峰的高度。较上述设计方式，这种设计左侧杂交探针方式一条检测荧光探针可以检测更多单核苷酸变异(或SNP)位点。

所说的检测荧光探针优选是那些与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括但是不限于，自淬灭探针(中国发明专利申请200910143480.6)、相邻探针(Bernard，P.S.，et al，American Journal of Pathology，1998，153，1055-1061)、容忍型分子信标(Hiyam H.El-Hajj，et al，Journalof Clinical Microbiology，2009，47，4，1190 1198)、只标记荧光基团的寡核苷酸探针如HyBeacon探针(French，D.J.，etal，Molecular and Cellular Probes，2001.15，363-374)、依赖嵌入染料的探针如非标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记结合荧光嵌入染料、荧光标记探针结合荧光淬灭染料(Gupta，A.P.et al，US patent application，US 2007/0020664 A1)。

本发明的一个特征是，优选地，不同的单核苷酸变异(或SNP)基因型可以使用不同的AMTS进行标记，并用同一个荧光探针进行检测这些AMTS标签，这样一种荧光标记的荧光探针就可以检测多个单核苷酸变异(或SNP)基因型。

本发明的另一特征是，优选地，所用的探针可以采用多种不同的荧光进行标记，由于一种荧光标记的荧光探针可以检测多个单核苷酸变异(或SNP)基因型，因此采用多个不同荧光标记的荧光探针可以检测更多的单核苷酸变异(或SNP)基因型。

本发明的另一特征是，优选地，针对多个单核苷酸变异(或SNP)位点的杂交探针可以相互混合进行杂交和连接反应，也就是说，在同一反应管内可以同时进行多个单核苷酸变异(或SNP)位点的杂交和连接反应。连接反应完成后，反应产物加入PCR扩增体系中，用通用的PCR上下游引物进行扩增，该反应体系中同时含有检测不同AMTS的相应荧光探针，PCR完成后，通过熔解曲线分析，就可以实现多个单核苷酸变异(或SNP)位点基因型的单管检测。

本发明的另一个特征是单核苷酸变异(或SNP)的熔解曲线峰优选地是可以人为调整的，例如，改变杂交探针的用量或者引入竞争性探针都可以调整熔解曲线峰的高度。利用这些途径，可以调整一种荧光探针所检测的各个单核苷酸变异(或SNP)的熔解曲线峰的峰高，并使之均匀化，便于结果判断，尤其是便于对峰高依赖的检测方式的结果判断。

在本发明的任何方面，如果适当的话，任何提及的单核苷酸变异可以适用于SNP，SNP也可以适用于单核苷酸变异。为了清楚起见，如果适当的话，“单核苷酸变异”和“SNP”可以互换使用。

在本发明中，上游PCR扩增引物特异结合上游引物结合序列，下游PCR扩增引物特异结合下游引物结合序列，当左侧探针3′端和右侧探针5′端(优选通过DNA连接酶)连接在一起时，在PCR扩增中能够特异扩增左侧探针和右侧探针连接的产物。

上游引物结合序列是和上游PCR扩增引物结合的序列(因此，上游引物结合序列的长度和序列足以和上游PCR扩增引物特异结合以实现特异PCR扩增即可)，优选是通用上游引物结合序列，例如，同一个单核苷酸变异位点的左侧探针中的上游引物结合序列都相同，或者，多个(例如2-30个，2-20个，2-16个，2-10个，如2、3、或4个或者更多个)不同单核苷酸变异位点的左侧探针中的上游引物结合序列都相同，或者在同一PCR扩增反应管中的上游引物结合序列都相同。

在使用通用上游引物结合序列时，优选使用与通用上游引物结合序列特异结合的上游PCR扩增引物。

上游PCR扩增引物和上游引物结合序列的特异结合优选是指，例如上游PCR扩增引物不和无关的上游引物结合序列或者其它无关序列结合并产生显著的扩增，

下游引物结合序列是和下游PCR扩增引物结合的序列(因此，下游引物结合序列的长度和序列足以和下游PCR扩增引物特异结合以实现特异PCR扩增即可)，优选是通用下游引物结合序列，例如，同一个单核苷酸变异位点的右侧探针中的下游引物结合序列都相同，或者，多个(例如2-30个，2-20个，2-16个，2-10个，如2、3、或4个或者更多个)不同单核苷酸变异位点的左侧探针中的下游引物结合序列都相同，或者在同一PCR扩增反应管中的下游引物结合序列都相同。

间隔序列可以按照本领域的知识设计，优选不影响左侧探针和右侧探针与靶序列的特异结合和连接、特异PCR扩增和溶解曲线分析，其长度可以是例如1-30个核苷酸，优选1-20个，1-15个，2-10个，2-5个，或者5-10个核苷酸。

人工熔点标签序列是一段寡核苷酸序列，该寡核苷酸与检测荧光探针杂交后表现出特定的熔点和/或荧光类型。人工熔点标签序列的序列可以是与检测荧光探针杂交后足以实现熔解曲线分析以确定其特定的熔点和荧光类型的序列。荧光类型通常由检测荧光探针提供。其长度可以是，例如是例如10-100个核苷酸，例如10-80个，10-50个，例如20-40个，20-50个，20-80个，30-40个，30-50个，或者30-60个核苷酸。一般而言，优选地，在一个PCR扩增反应管中，每个人工熔点标签序列和一个特定单核苷酸变异基因型对应，因而每个人工熔点标签序列和一个特定的左侧探针或者左侧探针的模板杂交序列对应，即，每一个左侧探针包含一个特定的人工熔点标签序列。但是，也可以是，在一个PCR扩增反应管中，一个人工熔点标签序列和多个单核苷酸变异基因型对应。在不同PCR扩增反应管中包含的人工熔点标签序列可以相同或者不同，

通常，不同人工熔点标签序列的序列不同。优选地，在同一PCR扩增反应管中，1或多个(例如2-16个，2-10个，2-8个，如2、3、4、8个或者更多个)不同单核苷酸变异位点的左侧探针中的人工熔点标签序列都能够和同一个检测荧光探针杂交，但是，不同的人工熔点标签序列和该同一检测荧光探针之间杂交体的熔点不同(优选相差1-10摄氏度，优选至少相差1、2、3、4摄氏度，例如1-4，2-4，2-5，3-4摄氏度)。

左侧探针和右侧探针的模板杂交序列是能够和待检测的靶序列(模板)杂交的序列，优选杂交是特异性杂交，优选是与靶序列完全互补，但是也可以由一个或者数个(例如1-5个)错配。模板杂交序列的长度可以是5-200个，例如5-100个，5-50个，例如5-30个核苷酸，5-20个，5-15个，或者5-10个。左侧探针的模板杂交序列3’端核苷酸和待测的单核苷酸变异的特定基因型相同或者互补。

检测荧光探针优选是本发明的自淬灭荧光探针。

本发明的基本原理：

针对不同的单核苷酸变异(或SNP)设计型特异的杂交探针，杂交探针包括左侧杂交探针和右侧杂交探针(图1)。左侧杂交探针又包括四个组成部分，从5′端到3′端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列；左侧杂交探针包括两个部分，从5′端到3′端依次是：模板结合序列和下游引物结合序列。通过此方式将单核苷酸变异(或SNP)基因型用特异的人工熔点标签序列(AMTS)进行标记。

在一个具体实施方案中，实现本发明的整个过程主要包括三个阶段：杂交探针的杂交和连接、PCR扩增、熔解曲线分析。如图2所示，基因组DNA模板经过变性后，杂交探针与之杂交，若左侧探针完全与模板匹配，则在核酸连接酶的作用下，左侧杂交探针与右侧杂交探针连接成为一个完整的单链核酸，这就完成了由待测单核苷酸变异(或SNP)基因型到对应的AMTS熔点的转换，实现了单核苷酸变异(或SNP)的AMTS标记；进一步通过PCR反应对单链核酸进行扩增；最后进行熔解曲线分析，通过检测荧光探针与不同的AMTS杂交形成熔解曲线峰值(熔点)的差异来区分各个单核苷酸变异(或SNP)位点的基因型。

通过PCR-融解曲线分析方法来检测单核苷酸变异的方法在申请人为厦门大学的、2009年5月26日提交的第2009 10143480.6号中国专利申请和同一申请人于2010年5月26日以该申请为优先权提交的PCT申请中有记载。

在DNA热变性过程中，有50％DNA变性解链时的温度称为双链DNA的解链温度，又称熔解解温度或熔点(Tm)。在溶剂固定的前提下，双链DNA的Tm值是固定不变的。当DNA双链完全互补时，形成的双链结构较为稳定，使DNA双链解开所需温度较高，故Tm值也较高；DNA双链不完全互补时，形成的双链结构较不稳定，使双链解开所需温度较低，故Tm值也较低，而且Tm降低的程度也是依赖不完全互补的具体序列的。

基于上述理论(但不限于上述理论)，探针与靶杂交形成双链结构，与完全匹配的靶杂交，则形成的双链结构的Tm值较高，若与不完全匹配的靶杂交时，形成的双链结构Tm值较低。因此，若能检测到探针Tm值的变化，就能判断靶核酸序列是否存在变异，乃至变异的具体类型。

荧光标记的探针要用于核酸序列变异检测优选需要满足以下三个条件：一是探针与靶序列杂交前后必须有荧光强度的变化；二是探针在扩增过程中必须保持完整，以用于扩增后的熔解曲线分析；三是探针不能有过强的特异性，否则具有变异的核酸序列不易与探针杂交。本发明所述的自淬灭探针则能较好的满足以上三个条件。自淬灭探针在熔解曲线分析过程中，低温阶段与靶序列杂交，这时探针与靶形成刚性、稳定的双链结构，荧光基团与淬灭基团距离较远，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因此可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，探针逐渐从靶上解离，解离下的探针呈单链自由卷曲状态，探针标记的荧光基团和淬灭基团互相靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团所吸收，此时只能检测到微弱的荧光信号。对自淬灭探针在熔解曲线分析过程中进行荧光信号的检测，就能观察到探针与靶的杂交和解离过程，形成荧光强度随着温度变化而变化的曲线，即探针的熔解曲线，对熔解曲线求导分析，就可以找到荧光变化最强的点，对应的温度即是探针的Tm值。探针与完全匹配的靶杂交时形成的双链结构Tm值最高，与具有不同序列变异的靶杂交时形成的双链Tm较低，不同的变异类型则可以形成不同的Tm值。因此，自淬灭探针熔解曲线法可以用于核酸序列变异的检测。

因此，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体的熔点，根据该熔点，可以检测待测核酸的变异。

或者，优选地，根据本发明，采用熔解曲线，可以获得探针与待测核酸之间杂交体以及探针与参照核酸之间杂交体的熔点，根据这两个熔点的差异，可以检测待测核酸的变异。参照核酸可以是例如野生型核酸。

优选地，用同一个扩增反应获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点，或者，用同一个熔解曲线测定反应物获得探针与待测核酸和参照核酸杂交体的熔点。更优选地，同一个扩增反应中包含至少一个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个核酸的变异。更优选地，同一个扩增反应中包含多个探针、至少一个参照核酸和多个待测核酸，由此检测多个待测核酸中存在的多个变异。优选地，所述多个探针标记不同的荧光基团。所述多个探针可以是至少2、3、5、7、10、15或者20个，并且最多10个、15个、20个、30或者50个或者更多，例如2-5个、2-10个，2-20个、5-10个或者5-20个。所述多个待测核酸可是例如至少2、3、5、7、10、15、或者20个，并且最多10个、20个、50个或者100个或者更多，例如2-10个、2-20个，2-50个。所述多个变异可是例如至少2、3、5、7、10、15、20、30、50、或者个100，并且最多10、20、50、100、或者200个或者更多，例如5-10个，5-20个，5-50个，10-50个，10-100个，或者10-200个。

更具体而言，溶解曲线分析可以采用如下技术方案来实施：

1.(优选用于溶解曲线分析的)用于检测靶核酸序列变异的(自淬灭)核酸探针，该探针标记了荧光基团和淬灭基团，使得与不存在靶核酸序列的情况相比，该探针和靶核酸序列杂交时荧光(或荧光强度)增加；且

该探针可以(但不必须)带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，

优选地，其中：

在所述探针的5′末端标记荧光基团而在3′末端标记淬灭基团，或在所述探针的3′末端标记荧光基团而在5′末端标记淬灭基团；

优选的是，所述探针的序列包含或者是野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列，或与所述野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列相比有若干(例如1-10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)错配，例如具有一个或多个(例如1-10个，1-5个，1-4个，1-3个，1-2个，1个或2个)单碱基的转换、颠换、插入和/或缺失的序列。

2.段落1的探针，其中所述荧光基团包括或者选自下列标记物：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALGold 540、JOE，HEX，CALOrange 560、TAMRA、CAL

Red 590、ROX、CAL

Red 610、TEXAS RED、CAL

Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5和/或Quasar 705。

3.段落1的探针，其中所述淬灭基团包括或者选自下列淬灭剂：DABCYL、BHQ类淬灭剂(如BHQ-1或BHQ-2)、ECLIPSE和/或TAMRA。

4.段落1的探针，其中所述探针由未经修饰的碱基组成。

5.段落1的探针，其中所述探针包含能增强或减弱探针结合能力的碱基。

6.段落5的探针，其中所述能增强探针结合能力的碱基包括锁定核酸碱基。

7.段落5的探针，其中所述能减弱探针结合能力的碱基包括通用结合碱基I。

8.段落1的探针，其中所述探针带有能够抵抗DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性的修饰，优选地，所述探针的5′端能够抗DNA聚合酶的5′→3′核酸外切酶活性，所述修饰可以是例如：修饰5′端碱基(例如数个碱基之间，例如第1和第2个碱基之间)之间的连接、采用经修饰的碱基衍生物或添加化学官能团。

9.段落8的探针，其中所述修饰5′端碱基之间的连接包括采用硫代磷酸化连接、甲基磷酸键连接、硼酸磷酸化连接和肽核酸连接。

10.段落9的探针，其中所述修饰5′端碱基之间的连接是在位于5′端的第一个碱基和第二个碱基之间采用硫代磷酸化连接。

11.段落8的探针，其中所述采用修饰的碱基衍生物包括采用锁定核酸。

12.段落1的探针，其中所述探针带有能够抵抗DNA聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性的修饰，优选地，所述探针的3′端能够抗DNA聚合酶的3′→5′核酸外切酶活性，所述修饰可以是例如：修饰3′端碱基(例如数个碱基之间，例如第1和第2个碱基)之间的连接、采用经修饰的碱基衍生物或添加化学官能团。

13.段落12的探针，其中所述修饰3′端碱基之间的连接包括采用硫代磷酸化连接、甲基磷酸键连接、硼酸磷酸化连接和肽核酸连接。

14.段落13的探针，其中所述修饰3′端碱基之间的连接是在位于3’端的数个碱基之间(如第一个碱基和第二个碱基之间)采用硫代磷酸化连接。

15.段落12的探针，其中所述采用修饰的碱基衍生物包括采用锁定核酸。

16.段落1-15中任一项的探针，其中所述探针是线性探针，其熔点不低于扩增所用引物的熔点，其中所述探针的长度为5-100个碱基，例如10-100个，10-50个，15到50个，20到50个，10-40个碱基，再例如10-20，20-30，30-40，15-30，20-40个，15-25个。

17.段落1-15中任一项的探针，其中所述探针是发夹结构探针，既可以是天然发夹结构探针也可以是人工发夹结构，但优选是人工发夹结构探针，即通过在探针末端人为添加靶序列无关碱基形成人工发夹结构。添加这种靶序列无关碱基的规则是，所形成的发夹结构中的臂序列中有部分或者全部碱基与靶序列互补，并且形成的臂长一般优选在2-15个碱基，优选3-7个碱基之间，更优选的是4-7个或4-6个碱基之间；其中该探针与靶序列杂交熔点不低于扩增所用引物的熔点，其中所述探针的长度为5-100个碱基，例如10-100个，10-50个，15到50个，20到50个，10-40个碱基，再例如10-20，20-30，30-40，15-30，20-40个，15-25个。

18.试剂盒，其含一个或多个段落1-16中任一项的探针，其中当有多个探针时，各探针上的荧光基团相同或不同，任选地，所述试剂盒还包含扩增引物和/或核酸聚合酶和/或扩增反应所需其它成分，所述试剂盒可用于对待测靶基因进行核酸扩增并用熔解曲线分析进行靶序列变异分析。

19.用于检测核酸是否存在变异例如单核苷酸变异或变异类型的方法，包括：

(1)针对需要检测核酸序列变异的核酸制备段落1-17中任一项的探针；

(2)扩增(例如通过PCR)含有待检测核酸的片段，在扩增前、扩增中或者扩增之后(优选在扩增前)在扩增反应中加入所述探针；

(3)扩增结束后对步骤(2)所获得的含有所述探针的扩增产物进行熔解曲线分析，根据自淬灭探针所对应的熔点(或者所述探针和待检测核酸序列之间杂交体的熔点)或者该熔点的差异来判断待检测核酸是否具有变异以及任选地判断可能的变异类型；

优选地，步骤(2)所获得的扩增产物中包含足量的完整探针用于熔解曲线分析；

优选地，步骤(2)所说的扩增是不对称PCR，即反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针杂交；

优选的，所述扩增反应中包含参照核酸或者野生型核酸。

20.段落19的方法，其中，所述探针带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，和/或，所述探针不带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，但所述扩增用酶不具有核酸外切酶活性或仅有足够低的核酸酶外切活性，使得步骤(2)所获得的扩增产物中包含足量的完整探针用于熔解曲线分析。

21.段落19的方法，其中，步骤(2)中，在扩增前加入所述探针，所述探针带有或者不带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，所说的扩增使用没有外切活性或者外切活性很低的耐热核酸聚合酶，以保证预先加入的探针在PCR反应后仍有足量的完整探针用于熔解曲线分析。

22.用于检测核酸是否存在变异例如单核苷酸变异或变异类型的方法，包括：

(1)针对基因组中一个或多个待检是否各包含一种或多种具有靶序列变异例如单核苷酸变异的待检等位核酸序列的核酸区段，制备能够覆盖所述待检核酸区段的数量的段落1-17中任一项的探针或含所述各探针的一个或多个段落18的试剂盒，并于PCR反应开始前将所述探针或所述试剂盒加入下述(2)的反应体系中；

(2)在PCR反应体系中扩增基因组中所述一个或多个待检是否各包含一种或多种具有所述靶序列变异例如单核苷酸变异的所述待检等位核酸序列的核酸区段；

(3)仍于所述反应体系中，在逐步升温下或者在逐步降温下监控步骤(1)中制备的各探针与步骤(2)中扩增的各待检等位核酸序列的相互作用所致的荧光变化，从而同时得到所述各探针所对应的熔解曲线；

(4)对通过步骤(3)得到的熔解曲线求导，并取其负导数(-dF/dT)，从而得到所述各探针所对应的熔点；及

(5)通过比较步骤(4)得到的对应于各待检等位核酸序列和各探针之间的熔解温度来分析各待检等位核酸序列间是否存在靶序列变异例如单核苷酸变异，

其中所述单核苷酸变异可以是同一物种的不同个体间的同一基因座位上的核酸序列中的一个或多个相同或不同位置的单碱基的转换、颠换、插入或缺失，且所述基因组的一个或多个核酸区段相同或不同。

优选地，步骤(2)所获得的扩增产物中包含足量的完整探针用于熔解曲线分析；

优选地，步骤(2)所说的扩增是不对称PCR，即反应混合物中一种PCR扩增引物相对过量，它所延伸而产生的链与探针杂交；

优选的，所述扩增反应中包含参照核酸或者野生型核酸。

23.段落22的方法，其中，所述探针带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，和/或，所述探针不带有能够抵抗DNA聚合酶的核酸外切酶活性的修饰，但所述扩增用酶不具有核酸外切酶活性或仅有足够低的核酸酶外切活性，使得步骤(2)所获得的扩增产物中包含足量的完整探针用于熔解曲线分析。

24.段落1-17中任一项的探针或段落18的试剂盒用于检测核酸变异例如是否存在单核苷酸变异或变异类型的用途，其中例如所述单核苷酸变异可以是同一物种的不同个体间的同一基因座位上的核酸序列中的一个或多个相同或不同位置的单碱基的转换、颠换、插入或缺失。

25.一种利用自淬灭探针通过核酸扩增溶解曲线分析检测靶序列变异或变异类型的方法，该方法使用的自淬灭探针的序列包含或者是：野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列，或与所述野生型或变异靶核酸序列的完全互补序列相比有若干(例如1到10个，1到5个，1到3个，1到2个，1个或2个)错配，例如具有一个或多个单碱基(例如1到10个，1到5个，1到3个，1到2个，1个或2个)的转换、颠换、插入和/或缺失，

所述自淬灭探针标记了荧光基团和淬灭基团，使得与不存在靶核酸序列的情况相比，该探针和靶核酸序列杂交时荧光(或荧光强度)增加；

该方法包括：在扩增反应液中预先加入自淬灭探针，在适当的反应条件下扩增，之后进行熔解曲线分析，根据自淬灭探针与靶核酸杂交体的熔点来分析是否存在变异和任选地变异的类型，

所述的反应条件是保证在核酸扩增后，有足量的完整的探针和足量的单链靶序列之间可以进行熔解曲线分析的条件，

优选地，所述探针是段落1-17任一项的探针。

附图说明

图1本发明所描述的左侧杂交连接探针和右侧杂交连接探针的组成。

图2说明了本发明的原理和步骤。自上而下包括：第一步：核酸变性和探针杂交；第二步：连接反应；第三步：PCR扩增，第四步：熔解曲线分析，其中的第一步和第二步可以合为一步，第三步和第四步也是在同一反应管内进行，而且可以整合为一个程序。

图3表示一个检测荧光探针与多个AMTS杂交后形成多个不同的熔解曲线峰。图中所用的探针是实施例1中的探针，图中的序号表示实施例1中靶序列1到8给出的熔解曲线。左侧图表示原始的熔解曲线，右侧图是求导数后的熔解曲线峰，峰值对应熔点。

图4表示一个单核苷酸多态性(SNPs)的不同纯合基因型进行分别对应一个不同的熔解曲线峰，杂合型则为另外一种熔解曲线峰型。

图5表示只用一个携带AMTS的左侧连接探针检测一个SNPs位点的情况，根据内参峰，利用熔解曲线峰的高度来区分SNP的不同基因型。图中的NTC表示阴性模板控制反应。

图6说明调节杂交探针的用量可以调整熔解曲线峰的高度。

图7说明用同一个检测荧光探针单管可以检测多个SNPs的基因型。图中表示的是用一个检测荧光探针在同一反应管内检测四个SNPs位点基因型的结果。左图是实时PCR曲线，和右图是本发明熔解曲线检测结果。标本一(Genomic DNA 1)的四个SNPs的基因型是：AA(rs1109037)、TT(rs321198)、TT(rs2076848)、CT(rs1523537)；标本二(Genomic DNA 2)的四个SNPs的基因型是：AG(rs1109037)、CC(rs321198)、AA(rs2076848)、CC(rs1523537)；标本三(Genomic DNA 3)的四个SNPs的基因型是：GG(rs1109037)、CT(rs321198)、AT(rs2076848)、TT(rs1523537)；标本四(Genomic DNA 4)的四个SNPs的基因型是：GG(rs1109037)、CT(rs321198)、AT(rs2076848)、TT(rs1523537)。

图8说明用两种荧光标记的检测荧光探针单管可以检测多个SNPs的基因型。左侧图表示用FAM通道(FAM Channel)检测FAM标记荧光探针的检测结果，右侧图表示用TET通道(TET Channel)检测TET标记荧光探针的检测结果。

图9.用AMTS四色荧光探针检测48个人类基因组SNPs基因型。

图10.用AMTS三色荧光探针检测G6PD缺乏症的9个突变基因型。

实施例

以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的方法对单核苷酸变异的基因型检测，这些并不脱离本发明描述的基本概念。

实施例1：人工熔点标签序列(AMTS)的设计

一个荧光探针可以与多个不同的寡核苷酸序列杂交，但与不同的寡核苷酸序列杂交会形成不同的熔解曲线峰，具有不同的熔点。所设计的探针和靶序列为：Probe 1，Target 1，Target 2，Target3，Target 4，Target 5，Target 6，Target 7，Target 8。

熔解曲线反应体系为：25μL反应液中含2.5μL 10×PCR缓冲液，1.5mM MgCl₂，5pmol probe 1，不加靶序列或者加入10pmol上述靶序列中的一种。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应程序为：95℃变性1min，35℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至90℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM通道荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

如见图3所示，一个检测荧光探针可以与多个带有碱基错配的靶序列杂交，并形成多个可以彼此区分的熔点梯度，本实例的probe 1与不同的靶序列至少可形成8个不同的熔点峰，图中每个熔解曲线峰对应的熔点从高到底依次是78.32℃，74.55℃，68.21℃，64.06℃，58.62℃，55.62℃，50.11℃，47.55℃，这些靶序列都可以作为人工熔点标签序列。

实施例2：通过两个不同的熔解曲线峰来实现对单核苷酸变异位点基因型的检测

以单核苷酸多态性位点(SNPrs321198)为例，针对该位点的两个纯合基因型C和T，分别设计两条型特异左侧杂交探针(SNPrs321198-1C和SNPrs321198-1T)和一条通用的右侧杂交探针(SNPrs321198-R)，每一条型特异杂交探针都携带一个独特的AMTS，两个AMTS可以与荧光探针(Probe 2)杂交，但熔点不同，据此就可以根据熔点判断基因型。其中检测探针的5′末端第一个碱基硫代磷酸化修饰，加粗的碱基用相应的LNA替代。

检测过程包括杂交和连接、PCR扩增和熔解曲线分析，具体如下：

1)杂交和连接反应：10μL连接反应体系为：0.8μL杂交缓冲液(1.5M KCl，300mM Tris-HCl pH8.5，1mM EDTA)，0.1-1nM杂交探针，1×Taq ligase缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.6，25mM KAc，10mM Mg(Ac)₂，10mM DTT，1mM NAD，0.1

Triton X-100)，1U Taq ligase，100ng基因组DNA。加入杂交连接反应液之前，基因组DNA需98℃预变性5min。杂交连接反应程序为：95℃1min；70℃2min，68℃2min，66℃2min，64℃2min，62℃2min，共6个循环。

2)PCR扩增及熔解曲线分析：25μL反应体系内含1μL连接产物，75mmol/L Tris-HCl pH9.0，20mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.01％Tween 20，50mmol/L KCl，1U Taq HS，3mmol/L MgCl₂，0.2μM Probe 2，0.1μM Primer-F，2μM Primer-R.反应程序为：95℃3min；95℃15s，55℃20s，75℃25s，50个循环；95℃1min；35℃5min；随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集TET通道的荧光信号。

如图4所示，两个纯合基因型分别对应两个独特Tm值的熔解曲线峰，当基因型为杂合时，熔解曲线会出现特异的融合峰(两个纯合基因型的Tm值差异较小时会出现融合，差异较大时，会出现两个峰)。本实例说明，SNP位点基因型的区分可以通过不同的熔点曲线峰来实现。

实施例3：通过熔解曲线峰的高度实现对SNP位点基因型的检测以SNP(rs321198)作为例子，针对该SNP的两个纯合基因型C型和T型，只设计了针对C型的左侧探针SNPrs321198-2C，该探针携带一个独特的AMTS，与荧光探针probe 1杂交。另外还针对T型设计竞争型左侧探针SNPrs321198-3T，该探针参与连接，而且可以扩增，但是该探针不携带AMTS，因此溶解曲线分析的结果应该是C型给出一个熔解曲线峰，C和T杂合性在同一位置给出一个高度低的溶解曲线峰值，而T型则没有峰出现，两个探针共用一个左侧探针SNPrs321198-R。这种峰值的高矮变化用另一个成称为内参的位点作为参照，该内参位点为纯合峰。

杂交和连接反应体系同实施例2，所不同的是连接反应体系中需加入SNPs对应的杂交探针外，还需要加入一对内参照位点(非SNP依赖的基因序列)杂交探针，该内参旨在对目标SNP熔解曲线峰的高度进行相对定量从而判断其基因型。PCR反应及熔解分析体系和程序均同实施例2。

结果见图5，在内参熔解曲线峰高度基本一致的情况下，CC纯合型的熔解曲线峰明显高出CT杂合型，而TT纯合型在该Tm值处没有出现熔解曲线峰。实验中很难保证内参峰高的一致性，但我们可通过标准化处理的方法解决该问题(如将每份样本熔解曲线峰的面积均除以对应内参熔解曲线峰的面积)。

实施例4：通过调整杂交探针的量调整各熔解曲线峰的高度同一荧光探针可以检测多条不同的AMTS，由于每个AMTS都参与竞争荧光探针，导致某些竞争力弱的AMTS对应的熔解曲线峰较低，从而影响对SNPs的基因分型。然而通过调节杂交探针的量可以调整各熔解曲线峰的高度。以三个均可以与荧光探针probe 1杂交且具有不同熔点的AMTS为例(它们分别对应SNPrs1109037的A型、SNPrs321198的C型、SNPrs2076848的A型)来说明调节杂交探针的量可以调整各熔解曲线峰的高度。杂交探针序列为SNPrs1109037-A，SNPrs1109037-R，SNPrs321198-2C，SNPrs321198-R，SNPrs2076848-A和SNPrs2076848-R。

连接反应体系基本同实施例2，所不同的是连接反应体系中加入的左侧探针用量进从最初的用量比为5fmol∶5fmol∶5fmol调整至2fmol∶6fmol∶10fmol。PCR反应及熔解分析体系和程序均同实施例2。

结果见图6，杂交探针用量调整前，不同熔点的AMTS对应的熔解曲线峰高度差异较大，总的趋势是熔点高的AMTS对应的峰较高，熔点低的AMTS对应的峰较低；而杂交探针用量调整后(即增加较低峰对应的杂交探针对的用量，减少较高峰对应的杂交探针对的用量)，熔解曲线峰的高度达到比较一致的水平，有利于多个SNPs基因型的同时检测。

实施例5：用同一个检测荧光探针单管检测多个的基因型

同一个检测荧光探针可以与多个AMTS杂交，形成多个不同的熔解曲线峰，从而可以实现单管对多个SNPs基因型的同时检测。以4个SNPs(rs1109037、rs321198、rs2076848、rs1523537)基因型的检测为例，针对每个SNP设计相应的杂交探针组，每一条型特异左侧杂交探针都携带一个独特的AMTS，共8个AMTS可以与荧光探针(probe 1)杂交，但对应的熔点不同，据此就可以根据最终的熔解曲线峰来判断各SNP的基因型。所用杂交探针序列为：SNPrs1109037-A，SNPrs1109037-G，SNPrs1109037-R，SNPrs321198-2C，SNPrs321198-2T，SNPrs321198-R，SNPrs2076848-A，SNPSNP-rs2076848-T，SNPrs2076848-R，SNPrs1523537-C，SNPrs1523537-T和SNPrs1523537-R.

具体操作的程序同实施例2。在PCR扩增退火阶段和熔解曲线分析过程都采集FAM通道的荧光信号。结果见图7，在随机检测的4份样本中(对照方法已检测出其对应SNP的基因型)，各样本的实时PCR扩增曲线都有相应的荧光信号的升起，但根据实时PCR荧光信号升起的情况无法判断样本各SNPs位点的基因型。PCR扩增后的熔解曲线分析，则可以较直观地通过每个SNP位点所对应的熔解曲线峰得出其基因型。

实施例6：用多个不同的检测荧光探针单管检测多个SNPs的基因型

同一检测荧光探针单管可以实现对多个SNPs的基因型的同时检测，多个不同颜色标记的检测荧光探针单管可以实现对更对个SNPs的基因型的同时检测。以2个SNPs(rs1109037和rs321198)为例，针对两个SNPs设计相应的杂交探针，其中SNPrs1109037对应的杂交探针中携带的AMTS可以与检测荧光探针Probe 1杂交，SNPrs321198杂交探针中携带的AMTS可以与检测荧光探针Probe 2杂交，据此就可以不同检测荧光探针的熔解曲线峰来判断不同SNPs基因型。所用杂交探针序列为SNPrs1109037-A，SNPrs1109037-G，SNPrs1109037-R，SNPrs321198-1C，SNPrs321198-1T：5，SNPrs321198-R

杂交和连接反应、PCR扩增及熔解分析体系和程序均同实施例2。其中在PCR及熔解分析体系中加入两条检测荧光探针(Probe1和Probe 2)，分别标记FAM和TET荧光基团，在PCR扩增反应和熔解曲线分析过程中采集FAM和TET通道的荧光信号。

结果见图8，FAM通道中，SNP(rs321198)不同的基因型具有各自对应的熔解曲线峰；TET通道中，SNP(rs7520386)不同的基因型也同样对应各自的熔解曲线峰。本实例说明用不同颜色标记的检测荧光探针，可以在单管中实现对多个不同SNPs的检测。结合同一探针单管可以检测多个SNPs的基因型，在多通道检测PCR仪(4-6色)上，多条不同颜色标记的检测荧光探针就可以实现对多个SNPs的同时检测。

实施例7.用AMTS四色荧光探针检测48个人类基因组SNPs基因型

在本实施例中，我们用通过多色荧光标记检测了48个人类基因组SNPs。每一SNPs位点的两个等位纯合基因型用分别用两个AMTS标记，四个SNPs的共计8个AMTS标签用一个荧光标记的探针来检测。这样用四个荧光探针就可以检测16个SNPs的基因型。整个过程包括在同一个反应管内所有探针，按每一个SNPs的一套杂交连接探针为三个，左侧探针两个，右侧探针一个，这样48个SNPs位点共计144个探针，在杂交和连接完成后，产物分配到三个PCR扩增体系中进行扩增，该扩增体系中，包含四个自淬灭探针，分别用FAM，ROX，CAL(CAL

Red 635)，TET标记，这四个探针在每一个扩增反应管中是通用的，反应体系也完全一样，但是引物有所差别，具体如下：

1)杂交和连接反应：10μL连接反应体系为：2-20fM杂交探针，1×0.8μL Taq ligase缓冲液(20mM Tris-HCl pH7.6，25mM KAc，10mM Mg(Ac)₂，10mM DTT，1mM NAD，0.1％TritonX-100)，1U Taq ligase，100ng基因组DNA。加入杂交连接反应液之前，基因组DNA和杂交探针混合液需98℃预变性5min。杂交连接反应程序为：95℃2min；66℃2min，64℃2min，62℃2min，60℃2min，58℃2min，共6个循环。

2)PCR扩增熔解曲线分析：25μL反应体系内含1μL连接产物，75mM Tris-HCl pH9.0，20mM(NH₄)₂SO₄，0.01％Tween 20，50mM KCl，1U Taq HS，3mM MgCl₂，0.12μM Primer-F，1.2μMPrimer-R，FAM通道杂交探针0.25μM，ROX、CAL(CAL Red635)、TET通道杂交探针0.2μM。反应程序为：95℃3min；95℃5s，55℃10s，75℃15s，50个循环；95℃1min；35℃5min；随后按1℃/step的升温速率从35℃递增至89℃进行熔解曲线分析，并采集相应通道的荧光信号。图9给出了两个人基因组的SNPs基因型分析结果，根据预先设置的熔点，两个样本的48个SNPs基因型如表1所示。

实施例8.用AMTS三色荧光探针检测G6PD缺乏症的9个突变基因型

本实例通过多个不同的检测荧光探针单管检测引起中国人G6PD缺乏症常见的9个点突变。

在本实施例中，我们用通过三色荧光标记检测了引起中国人G6PD缺乏症常见的9个点突变。设计原理与检测SNPs相同。即每一突变位点两个等位纯合基因型用分别用两个AMTS标记，每三个突变的6个AMTS标签用同一个荧光标记的探针来检测，这样用三个荧光探针就可以检测9个突变位点的基因型。整个过程包括在同一个反应管内所有探针，按每一个突变的一套杂交连接探针为三个(左侧探针两个，右侧探针一个)，这样9个突变位点共计27个探针，在杂交和连接完成后，产物用一个三色PCR扩增体系中进行扩增，该扩增体系中，包含三个自淬灭探针，分别用FAM，ROX，CAL(CALRed 635)标记。具体过程同实施例7。图10给出了两个样本的突变基因型检测结果，根据预先设置的熔点，基因型如表2所示。

表1.两个人类基因组样本的48个SNPs的检测结果

表2.G6PD缺乏症的9个突变的检测结果

实施例中所用序列

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Claims (14)

1.用于检测单核苷酸多态性的核酸探针组，包括左侧杂交探针和右侧杂交探针，其中

左侧杂交探针的3'末端碱基是待测单核苷酸多态性位点所在位置，左侧杂交探针包括四个组成部分，从5'端到3'端的依序是：上游引物结合序列、间隔序列、人工熔点标签序列即AMTS、模板杂交序列；

右侧杂交探针包括两个组成部分，从5'端到3'端依次是：模板结合序列和下游引物结合序列，

所述探针组还包含与AMTS杂交的荧光探针。

2.用于检测多个单核苷酸多态性的探针组，包括或者由如下探针组成：针对每一个单核苷酸多态性基因型的左侧杂交探针和右侧杂交探针，以及与AMTS杂交的荧光探针；其中，左侧杂交探针的3'末端碱基是待测单核苷酸多态性位点所在位置，左侧杂交探针包括四个组成部分，从5'端到3'端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列；右侧杂交探针包括两个部分，从5'端到3'端依次是：模板结合序列和下游引物结合序列。

3.用于检测多个单核苷酸多态性的探针组，包括或者由如下探针组成：针对至少一种单核苷酸多态性基因型的左侧杂交探针和右侧杂交探针，以及与AMTS杂交的荧光探针；其中，左侧杂交探针的3'末端碱基是待测单核苷酸多态性位点所在位置，左侧杂交探针包括四个组成部分，从5'端到3'端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列；右侧杂交探针包括两个部分，从5'端到3'端依次是：模板结合序列和下游引物结合序列；

其中，该探针组包含针对多种即2种以上，2－50种，2－40种，2－30种，2－20种，2－10种或2－5种待检测单核苷酸多态性的左侧杂交探针和右侧杂交探针。

4.权利要求3的探针组，其中，针对每一种待检测的单核苷酸多态性位点有两个左侧杂交探针和一个右侧杂交探针，其中的一个左侧杂交探针的3'端与该位点的一种基因型互补，另一个左侧杂交探针的3'端与该位点的另一种基因型互补。

5.权利要求3的探针组，其中，针对每一种待检测的单核苷酸多态性，包含针对该单核苷酸多态性位点的两种纯合基因型设计的两条型特异的左侧杂交探针，分别标记可用同一荧光探针检测的但熔点不同的AMTS，使得待测的两种基因型的熔点不同，但荧光类型相同；所包含的右侧杂交探针可以相同或者不同。

6.权利要求3的探针组，其中，针对每一种待检测的单核苷酸多态性，包含针对该单核苷酸多态性位点的两种纯合基因型设计的两条型特异的左侧杂交探针，分别标记可用两个熔点相同或者相近但是序列差异很大的AMTS标记，用各自的不同荧光标记的荧光探针检测，使得待测的两种基因型的熔点相同或者相似，但荧光类型不同；所包含的右侧杂交探针可以相同或者不同。

7.权利要求3的探针组，其中，针对每一种待检测的单核苷酸多态性，仅包含针对该单核苷酸多态性位点的一种纯合型设计的一条特异的左侧杂交探针，并用一种AMTS标记，使得该基因型只有一个熔点和一种荧光类型，基因型通过熔解曲线峰的高度加以判断；所包含的右侧杂交探针可以相同或者不同。

8.用于检测多个单核苷酸多态性的试剂盒，包含：权利要求2-7任一项的探针组。

9.权利要求2-7任一项的探针组或者权利要求8的试剂盒用于检测多个单核苷酸多态性基因型的用途。

10.权利要求2-7任一项的探针组在制备用于检测多个单核苷酸多态性的试剂盒中的用途。

11.单管检测多个单核苷酸多态性基因型的方法，包括：

（1）获得针对每一个单核苷酸多态性位点基因型的AMTS标记：设计的AMTS添加于连接反应左侧杂交探针的5'端，左侧杂交探针的3'末端碱基是待测单核苷酸多态性位点所在位置，添加AMTS后的左侧杂交探针序列包括四个部分，从5'端到3'端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列；相应的连接反应的右侧杂交探针从5'端到3'端包括两个部分，依次是：模板结合序列和下游引物结合序列；

（2）通过核酸连接酶特异连接反应，左侧杂交探针与右侧杂交探针连接成为一个完整的单链核酸，由此实现SNPs的AMTS标记；

（3）用通用引物PCR扩增上述连接产物，PCR反应体系中含有或者PCR完成之后加入与AMTS杂交的荧光探针，PCR完成后，进行熔解曲线分析。

12.单管检测多个单核苷酸多态性基因型的方法，包括：

（1）获得针对每一个单核苷酸多态性位点基因型的AMTS标记，一组AMTS共用一种荧光探针检测，再根据探针标记的荧光基团的类型，使得每一个基因型获得一个熔点和荧光类型两个参数；设计的AMTS添加于连接反应左侧杂交探针的5'端，左侧杂交探针的3'末端碱基是待测单核苷酸多态性位点所在位置，添加AMTS后的左侧杂交探针序列包括四个部分，从5'端到3'端的依次顺序是：通用上游引物结合序列、间隔序列、AMTS序列、模板杂交序列；相应的连接反应的右侧杂交探针从5'端到3'端包括两个部分，依次是：模板结合序列和下游引物结合序列；将针对所有单核苷酸多态性位点基因型的所有探针组混合，与模板进行杂交；

（2）通过核酸连接酶特异连接反应，左侧杂交探针与右侧杂交探针连接成为一个完整的单链核酸，由此实现单核苷酸多态性基因型的AMTS标记，获得熔点和荧光类型两个参数；

（3）用通用引物PCR扩增上述连接产物，PCR反应体系中含有或者PCR完成之后加入与AMTS杂交的荧光探针，PCR完成后，进行熔解曲线分析，根据熔点和荧光标记类型，识别出AMTS，从而获得对应的各个单核苷酸多态性位点的基因型。

13.权利要求11或12的方法，其中步骤（3）所述荧光探针是与靶序列杂交能生成特征熔解曲线峰并给出熔点的荧光探针，包括自淬灭探针、相邻探针、容忍型分子信标、只标记荧光基团的HyBeacon探针、依赖嵌入染料的非标记探针结合荧光嵌入染料、荧光标记结合荧光嵌入染料和荧光标记探针结合荧光淬灭染料。

14.权利要求11或12的方法，其中步骤（3）所述荧光探针是自淬灭荧光探针。

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