CN1625603A - 前速激肽原基因中的遗传多态性 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种将前速激肽原(NKNA)基因中单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性联系起来的方法。本发明还涉及一种确定施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性的方法，该方法包括检测NKNA基因的至少一种单核苷酸多态性。所述方法基于检测NKNA基因中的特定单核苷酸多态性和参考NKNA基因多态性确定药物活性化合物在人类个体内的功效及相容性。本发明还涉及序列中包含这里所定义的多态性的分离的核酸，涉及能够和这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针，涉及包含一种或多种此类引物和探针用于检测NKNA基因多态性的诊断试剂盒，涉及包含NK－1受体拮抗剂和将药物施与接受多态性检测的人类个体的说明书的药物包，也涉及带有储存的NKNA基因多态性序列信息的计算机可读介质。

Description

前速激肽原基因中的遗传多态性
发明领域
本发明涉及一种将前速激肽原(preprotachykinin，NKNA)基因中的单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效以及相容性联系起来的方法。
本发明还涉及一种用于确定施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性的方法，该方法包括检测NKNA基因中的至少一个单核苷酸多态性。所述的方法是基于检测NKNA基因中的特定单核苷酸多态性和参考NKNA中多态性确定药物活性化合物在人类个体中的功效和相容性。本发明还涉及在序列中包含这里所定义的多态性的分离的核酸，涉及能够与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和涉及包含一种或多种这种引物和探针用于检测NKNA基因中多态性的诊断试剂盒，涉及包含NK-1受体拮抗剂和将该药物施与接受多态性测试的人类个体的说明书的药物包以及涉及一种储存了NKNA基因中多态性序列信息的计算机可读介质。
背景技术
药物遗传学是用多态性知识研究个体中的遗传变异在药物反应差异中的作用的一种手段，所述药物反应差异常常源于药物代谢中个体的差别。药物遗传学有助于确定最适合用特定药剂治疗的病人。这种手段可被用于药物研究中以帮助药物选择过程。
关于药物遗传学和多态性检测的其它用途的详情可见于Linder等(1997年)，临床化学(Clinical Chemistry)，43卷，254页；Marshall(1997年)，自然生物工艺学(Nature Biotechnology)，15卷，1249页；国际专利申请WO97/40462，生物医学光谱；和Schafer等(1998年)，自然生物工艺学(Nature Biotechnology)，16卷，33页。
另外，多态性与由DNA插入、缺失、重复和核苷酸置换引起的2000多种人体病理综合征有关。发现个体中的遗传多态性和在家族中跟踪这些变异提供了一种方法以确认临床诊断结果和诊断携带者以及临床前的和亚临床感染个体的素因和疾病状态。基于准确诊断基础上的咨询使病人能够对受感染个体中的育儿的可能性、正在进行的妊娠和早期干预作出知情决定。
与病理综合征相关的多态性高度可变并因而可能难于鉴定。因为基因中的复等位基因普遍存在，人们必须把疾病相关的等位基因从中性(与疾病无关的)多态性中区别出来。大部分等位基因都是中性多态性，这种多态性产生不可区别的、通常具活性的基因产物或者表达像眼睛颜色这样的正常可变性状。
相比之下，有些多态性等位基因与如镰状细胞贫血等临床疾病相关联。此外，疾病相关多态性的结构高度可变并可能由像发生在镰状细胞贫血中的单点突变，或者由像发生在脆性X染色体综合征和亨廷顿氏舞蹈病中的核苷酸重复片段的扩增引起。
神经激肽-1(NK-1)或者P物质是一种天然存在的属于速激肽家族中的十一肽，速激肽如此命名是因为它们在血管外平滑肌组织上的快速收缩作用。人体中的3种已知的速激肽由两种基因，即NKNA和NKNB编码。NKNA基因编码一种包含P物质和神经激肽A两者的前体，而NKNB编码一种仅含有神经激肽B的前体(神经激肽A以前被称为K物质)。使用由克隆的人类基因衍生的探针和一组啮齿类-人类体细胞杂合体，Bonner等(Cytogenet.Cell Genet.，1987年，46卷，584页)将NKNA基因确定到7q21-q22，而将NKNB基因确定到12q13-q21。速激肽的分子性质鉴定显示它们来源于称作前速激肽原的共同前体分子，通过蛋白质水解加工产生。可变剪接事件产生3种形式的信使(α、β和γ)(Proc.Nat.Acad.Sci.1987，84，881-885)。β和γ形式的前速激肽原编码P物质和神经激肽A，而α形式仅含有P物质序列。
P物质的神经肽受体(NK-1受体)是G蛋白偶联受体超家族的一员。其广泛分布在整个哺乳动物神经系统(尤其是脑和脊神经节)、循环系统和外周组织(尤其是十二指肠和空肠)，并参与调节多种不同的生物学过程。
哺乳动物速激肽P物质的中枢和外周作用与多种炎症(包括，偏头痛、类风湿性关节炎、哮喘和炎性肠病)有关，并与呕吐反射的介导和中枢神经系统(CNS)病症(例如，帕金森症(Neurosci.Res.，1996，7，187-214)、焦虑(
Can.J.Phys.，1997年，75卷，612-621页)和抑郁病(科学(Science)，1998年，281卷，1640-1645页))的调节有关。
NK-1受体拮抗剂在疼痛，头痛特别是偏头痛，阿尔茨海默氏病，多发性硬化，吗啡戒断的衰减，心血管变化，诸如由热损伤引起的水肿，诸如类风湿性关节炎之类的慢性炎症，哮喘/支气管的高反应性和包括过敏性鼻炎的其它呼吸道疾病，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎的消化道炎性疾病，眼损伤和眼的炎症中的有用性的证据在“速激肽受体和速激肽受体拮抗剂”，J.Auton.Pharmacol.，1993年，13卷，23-93页中被评论过。
另外，NK-1受体拮抗剂正在被发展用于治疗许多与速激肽尤其是P物质的过量或不均衡有关的生理失调。其中涉及P物质的疾病的实例包括诸如焦虑、抑郁和精神病(WO 95/16679，WO 95/18124和WO 95/23798)之类的中枢神经系统紊乱。
NK-1受体拮抗剂还在治疗运动病和治疗诱发的呕吐中有用。
另外，在新英格兰医学杂志(The New England Journal of Medicine)，1999年，340卷(3期)，190-195页中，描述了用一种选择性NK-1受体拮抗剂使由顺氯铂氨诱发的呕吐减弱。
在神经肽(Neuropeptides)，1998年32卷(1期)1-49页和Eur.J.Pharmacol，1998年383卷(3期)297-303页中进一步描述了NK-1受体拮抗剂用于治疗某些形式的尿失禁的有效性。
另外，US 5,972,938描述了通过施与速激肽受体拮抗剂如NK-1受体拮抗剂来治疗心理免疫或心身疾病的一种方法。
生命科学(Life Sci.)，2000年67卷(9期)985-1001页描述道，星形胶质细胞表达多种神经递质(包括P物质)的功能性受体，p物质在CNS发育、感染和损伤中对活性星形胶质细胞是一种重要的刺激。在脑肿瘤中源于星形胶质细胞的恶性神经胶质细胞被速激肽通过NK-1受体引发而释放可溶性介质并增加它们的增殖速率。
因此，选择性NK-1受体拮抗剂在癌症治疗中可能是治疗恶性神经胶质瘤的一种有用的治疗方法。
在自然(Nature)(伦敦)，2000年，405卷(6783期)180-183页中叙述道，NK-1受体基因破坏的小鼠表现出丧失对吗啡的奖赏特性。
因此，NK-1受体拮抗剂可用于治疗上瘾药物如鸦片和尼古丁的戒断综合症以及降低对这些药物的滥用/渴望。
已报道NK-1受体拮抗剂在创伤性脑损伤的治疗中也有有益的效果(2000年10月17-20日在法国La Grande Motte召开的国际速激肽会议2000上由Nimmo教授口头公开，题目是“神经激肽-1(NK-1)受体拮抗剂改善创伤性脑损伤后的神经学后果”(作者：A.J.Nimmo，C.J.Bennett，X.Hu，l.Cernak，R.Vink)。
用NK-1拮抗剂治疗的另一适应症是良性前列腺肥大(BPH)——它可以是进行性的并导致尿潴留、感染、膀胱结石和肾衰竭——且已报道在EP01109853.0中。
临床试验已经表明，病人对用药品如NK-1受体拮抗剂治疗的反应常常是不同的，因而有必要存在改良的药剂设计和治疗的方法。
令人惊奇的是已发现NKNA基因中的单核苷酸多态性可被用于确定施与人类个体的药物活性化合物如NK-1受体拮抗剂的功效和相容性。
发明内容
本发明涉及将NKNA基因中的单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性相关联的一种方法。本发明还涉及确定施与人类个体的药物活性化合物的功效和相容性的一种方法，此方法包括检测NKNA基因中的至少一个单核苷酸多态性。所述方法是基于测定所述人类个体样本中的NKNA基因中的至少—个单核苷酸多态性，这种方法包括测定如图2位置定义的在NKNA基因的内含子1内的41172位置的核苷酸，并参照NKNA基因中的多态性确定个体状态。备选地或者另外地，此方法包括测定该人类个体在如图2位置定义的NKNA基因的内含子1内的41112位置，NKNA基因的内含子5内的37434位置，NKNA基因的内含子6内的37114、37025、33949位置以及NKNA基因的3’UTR内的33612位置的核酸序列。本发明还涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多态性的分离的核酸，涉及能与这种核酸杂交的核酸引物和寡核苷酸探针和涉及包含一种或多种这样的引物和探针用于检测NKNA基因中的多态性的诊断试剂盒，涉及包含NK-1受体拮抗剂和将该药物施与接受多态性测试的人类个体的说明书的药物包并涉及一种储存了NKNA基因中的多态性序列信息的计算机可读介质。
本发明基于发现NKNA基因中的单核苷酸多态性。
术语“多态性”广义上限定为包括已知发生在核苷酸序列中的所有变异，包括插入，缺失，置换和重复序列(包括二重重复)。
“多核苷酸”和“核酸”指单链或双链分子，它可以是由核苷酸碱基A、T、C和G组成的DNA，或者由碱基A、U(代替T)、C和G组成的RNA。多核苷酸可以代表编码链或者它的互补链。多核苷酸分子的序列可以与自然存在的序列相同，或者它可以包含可变密码子，此密码子编码与发现于自然存在的序列中的氨基酸相同的氨基酸(参见Lewin″基因V″(GenesV)牛津大学出版社，7章，1994年，171-174页)。另外，多核苷酸分子可以包含代表所描述的氨基酸的保守性置换的密码子。多核苷酸可以是基因组DNA或cDNA。
正如这里定义，“NKNA基因”位于人类染色体7q21.1-q31.1，是图2和SEQ ID NO.1中所示的核酸序列中存在的序列。NKNA基因包含7个外显子区，6个间插于外显子序列间的内含子序列和包括图1中阐述的NKNA基因的启动子元件的3’及5’非翻译区(3’UTR和5’UTR)。对于推测的含有129个氨基酸的蛋白质，第一个在阅读框内的ATG出现在外显子2(或者在图2中41031位置)而TAG终止密码子出现在外显子7(或者在图2中33724位置)。
本发明涉及将NKNA基因中的单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性相关联的一种方法，此方法包括检测人类个体的NKNA基因中的单核苷酸多态性和参考NKNA基因中的多态性确定药物活性化合物所施用的所述个体的状态。
本发明另一方面提供了用于将NKNA基因中的单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性相关连的一种方法，此方法包括检测人类个体的NKNA基因中的单核苷酸多态性和参考多态性确定被施与药物活性化合物的所述个体的状态，该多态性位于包含NKNA基因的图2中的至少一个或多个位置，包括33612、33949、37025、37114、37434、41112和/或41172位置。
可以通过参考在一，二，三，四，五，六，或所有七个位置的等位基因变异来确定该人类个体的状态。个体状态还可通过这里确认的一个或多个特定的多态性结合一个或多个其它单核苷酸多态性来确定。
人类个体的状态包括该个体对药物治疗的任何反应，包括生理上和心理上的反应。
术语“人类个体”包括患有或怀疑患有NK-1受体配体介导的疾病的人类个体。在每个位置，就该个体的一对等位基因来说可能是纯合的或杂合的。
等位基因变异对接受药物治疗的个体的药物治疗反应可能有直接的影响。因此本发明的方法可以用于预测对这样的药剂的临床反应和确定治疗用量。
药物活性化合物可以属于NK-1受体拮抗剂组。神经激肽受体拮抗剂在Exp.Opin.Ther.Patents，1996年，6卷，367-378页，和在Exp.Opin.Ther.Patents，1997年，7卷，43-54页中已经被评论过。这里所用的术语″NK-1受体拮抗剂″指能抑制P物质与NK-1受体结合的任何一种天然的或合成的化学化合物。大量的这样的受体拮抗剂是已知的并已被描述过。NK-1受体拮抗剂可以选自：4-苯基-吡啶衍生物，3-苯基-吡啶衍生物，2-苯基取代的苯衍生物，联苯衍生物，4-苯基-嘧啶衍生物，5-苯基-嘧啶衍生物，1，4-二氮杂环庚烷-2，5-二酮衍生物，1，3，8-三氮杂-螺[4.5]癸-4-酮衍生物和哌啶衍生物(参见EP1035115，WO0050401，WO0050398，WO0053572，WO0073279，WO0073278，EP1103546，EP1103545和WO0206236)。特此将这些文件和下面提及的所有文件完整地并入作为参考。
其它优选的在本发明中有用的NK-1受体拮抗剂是目前正在进行药物开发的下列NK-1受体拮抗剂：
GR205171：3-哌啶胺，N-[[2-甲氧基-5-[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]苯基]甲基]-2-苯基-，(2S-顺)-(Gardner等.Regul.Pep.65卷45页，1996年)
HSP-117：3-哌啶胺，N-[[2，3-二氢-5-(1-甲基乙基)-7-苯并呋喃基]甲基]-2-苯基-，二盐酸盐，(2S-顺)-
L703，606：1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-胺，2-(二苯基甲基)-N-[(2-碘代苯基)甲基-，(2S-顺)-，草酸盐(Cascieri等，Mol.Pharmacol.42卷，458页，1992)
L668，169：L-苯基丙氨酸，N-[2-[3-[[N-[2-(3-氨基-2-氧代-1-吡咯烷基)-4-甲基-1-氧代戊基]-L-甲硫酰基-L-谷氨酰胺酰基-D-色氨酰基-N-甲基-L-苯丙氨酰基]氨基]-2-氧代-1-吡咯烷基]-4-甲基-1-氧代戊基]-L-甲硫酰基-L-谷氨酰胺酰基-D-色氨酰基-N-甲基-，环(8→1)肽，[3R-[1[S*[R*(S*)]]，3R*]]-
LY 303241：1-哌嗪乙酰胺，N-[2-[乙酰基[(2-甲氧基苯基)甲基]氨基]-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)乙基]-4-苯基-，(R)-
LY 306740：1-哌嗪乙酰胺，N-[2-[乙酰基[(2-甲氧基苯基)甲基]氨基-1-(1H-吲哚-3-基-甲基)乙基]-4-环己基-，(R)-
MK-869：3H-1，2，4-三唑-3-酮，5-[[2-[1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟代苯基)-4-吗啉基]甲基]-1，2-二氢-，[2R-[2α(R*)，3α]]-
R-544：Ac-Thr-D-Trp(FOR)-Phe-N-MeBzl
Spantide III：L-正亮氨酰胺，N6-(3-吡啶基羰基)-D-赖氨酰-L-脯氨酰-3-(3-吡啶基)-L-丙氨酰基-L-脯氨酰基-3，4-二氯-D-苯基丙氨酰基-L-天冬酰胺酰基-D-色氨酰-L-苯基丙氨酰基-3-(3-吡啶基)-D-丙氨酰基-L-亮氨酰-
WIN-62，577：1H-苯并咪唑并[2，1-b]环五烷并[5，6]萘并[1，2-g]喹唑啉-1-醇，1-乙炔基-2，3，3a，3b，4，5，15，15a，15b，16，17，17a-十二氢-15a，17a-二甲基-，(1R，3aS，3bR，15aR，15bS，17aS)-
GR103，537
L758，298：膦酸，[3-[[2-[1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟代苯基)-4-吗啉基]甲基-2，5-二氢-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基]-，[2R-[2α(R*)，3α]]-
NKP608：(2R，4S)-N-[1-{3，5-二(三氟甲基)-苯甲酰}-2-(4-氯-苄基)-4-哌啶基]-喹啉-4-甲酰胺
CGP49823：(2R，4S)-2-苄基-1-(3，5-二甲基苯甲酰)-N-[(4-喹啉基)甲基]-4-胡椒碱胺，二盐酸盐
CP-96，345：(2S，3S)-顺-(2-(二苯基甲基)-N-[(2-甲氧基苯基)甲基]-1-氮杂双环[2.2.2]辛烷-3-胺(Srider等，科学251：435，1991)
CP-99，994：((2S，3S)-顺-3-(2-甲氧基苄基氨基)-2-苯基-哌啶)二盐酸盐(Desai等.，J.Med.Chem.35：4911，1992)
CP-122，721：(+)-(2S，3S)]-3-(2-甲氧基-5-三氟代甲氧基苄基)氨基-2-苯基哌啶
FK888：(N2-[(4R)-4-羟基-1-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)羰基-L-丙基]-N-甲基-N-苯基甲基-L-3-(2-萘基)-丙氨酰胺(Fujii等，Br.J.Pharm.107卷，785页，1992)
GR203040：(2S，3S和2R，3R)-2-甲氧基-5-四唑-1-基-苄基-(2-苯基-哌啶-3-基)-胺
GR 82334：[D-Pro9，]螺-γ-内酰胺]Leu10，Trp11]physalaemin-(1-11)
GR 94800：PhCO-Ala-Ala-DTrp-Phe-DPe-DPro-Pro-NIe-NH2
L 732，138：N-乙酰基-L-色氨酸
L 733，060：((2S，S)-3-((3，5-二(三氟甲基)苯基)甲氧基)-2-苯基哌啶
L 742，694：(2-(S)-(3，5-二(三氟甲基)苄基氧基)-3-(S)-苯基-4-(5-(3-氧代-1，2，4-三唑基)甲基)吗啉
L 754，030：2-(R)-(1-(R)-3，5-二(三氟甲基)苯基乙氧基)-3-(S)-(4-氟)苯基-4-(3-氧代-1，2，4-三唑-5-基)甲基吗啉
LY 303870：(R)-1-[N-(2-甲氧基苄基)乙酰基氨基]-3-(1H-吲哚-3-基)-2-[N-(2-(4-(哌啶基)哌啶-1-基)-乙酰基)氨基]丙烷
MEN11149：2-(2-萘基)-1-N-[(1R，2S)-2-N-[2(H)吲哚-3-基羰基]氨基环己烷羰基]-1-[N′-乙基-N′-(4-甲基苯基乙酰基)]二氨基乙烷(Cirillo等.，Eur.J.Pharm.341：201，1998)
PD154075：(2-苯并呋喃)-CH2OCO)-(R)-α-MeTrp-(S)-NHCH(CH3)Ph
RP-67580：(3aR，7aR)-7，7-二苯基-2-[1-亚氨基-2-(2-甲氧基苯基)-乙基]+++全氢化异吲哚-4-酮盐酸盐(Garret等.PNAS 88：10208，1991)
RPR100893：(3aS，4S，7aS)-7，7-二苯基-4-(2-甲氧基苯基)-2-[(S)-2-(2-甲氧基苯基)丙酰基]全氢化异吲哚-4-醇
Spendide：Tyr-D-Phe-Phe-D-His-Leu-Met-NH2
Spantide II：D-NiLys1，3-PaI3，D-CI2Phe5，Asn6，D-Trp7.0，NIe11-P物质
SR140333：(S)-1-[2-[3-(3，4-二氯苯基)-1-(3-异丙氧基苯基乙酰基)-哌啶-3-基]乙基]-4-苯基-1-azaniabicyclo[2.2.2]辛烷(Edmonts等，Eur.J.Pharm.250：403，1993)
WIN-41，708：(17β-羟基-17α-乙炔基-5α-雄甾烷并[3.2-b]嘧啶并[1，2-a]苯并咪唑
WIN-62，577：1H-苯并咪唑并[2，1-b]环戊烷并[5，6]萘并[1，2-g]喹唑啉-1-醇，1-乙炔基-2，3，3a，3b，4，5，15，15a，15b，16，17，17a-十二氢-15a，17a-二甲基-，(1R，3aS，3bR，15aR，15bS，17aS)-
SR-48，968：(S)-N-甲基-N-[4-(4-乙酰基氨基-4-苯基哌啶基)-2-(3，4-二氯苯基)-丁基]苯甲酰胺
L-659，877：环[Gln，Trp，Phe，Gly，Leu，Met]
MEN 10627：环(Met-Asp-Trp-Phe-Dap-Leu)环(2β-5β)
SR 144190：(R)-3-(1-[2-(4-苄氧基-2-(3，4-二氟苯基)-吗啉-2-基)乙基]-4-苯基哌啶-4-基)-1-二甲基脲
GR 94800：PhCO-Ala-Ala-D-Trp-Phe-D-Pro-Pro-NIe-NH2
SR-142，801：(S)-(N)-(1-(3-(1-苄氧基-3-(3，4-二氯苯基)哌啶-3-基)丙基)-4-苯基哌啶-4-基)-N-甲基乙酰胺
R820：3-吲哚基羰基-Hyp-Phg-N(Me)-Bzl
R486：H-Asp-Ser-Phe-Trp-β-Ala-Leu-Met-NH2
SB 222200：(S)-(-)-N-(a-乙基苄基)-3-甲基-2-苯基喹啉-4-甲酰亚胺
L 758，298：膦酸，[3-[[2-[1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]-2，5-二氢-5-氧代-1H-1，2，4-三唑-1-基]-，[2R-[2a(R*)，3a]]-
NK-608：(2R，4S)-N-[1-{3，5-二(三氟甲基)-苄氧基}-2-(4-氯-苄基)-4-哌啶基]-喹啉-4-甲酰胺
CGP 47899：Shilling等，Pers.Med.Chem.207，1993
MEN 11467：Evangelista等，XXIX Nat.Congr.of the Ital.Pharmacological Soc.，Florence 20-23.06.1999。
本文中提及到以上具体列举的化合物时也包括它们的可药用酸加成盐。
关于处于药物开发中的这些NK-1受体拮抗剂的其它信息可以参见出版物。
如下出版的专利和专利申请描述了其它适宜的NK-1受体拮抗剂。
美国专利5,990,125尤其描述了化合物Ia-Ie，X和XVI-XXI，并在33栏描述了其它拮抗剂，包括奎宁环、哌啶乙二胺、吡咯烷和氮杂莰烷衍生物和表现出P物质受体拮抗剂活性的相关化合物。这些拮抗剂优选以USP5,990,125第34栏所述的剂量使用。
其它适宜的NK-1受体拮抗剂描述在如下出版物中：
美国专利号(USP)
5,977,104    5,162,339    4,481,139    5,232,929
5,998,444    5,242,930    5,373,003    5,981,744
5,387,595    5,459,270    5,494,926    5,496,833
5,637,699
欧洲专利申请公开号(EP-A-)
0 360 390    0 394 989    0 428 434    0 429 366
0 430 771    0 436 334    0 433 132    0 482 539
0 498 069    0 499 313    0 512 901    0 512 902
0 514 273    0 514 274    0 514 275    0 514 276
0 515 681    0 517 589    0 520 555    0 522 808
0 528 495    0 532 456    0 533 280    0 536 817
0 545 478    0 558 156    0 577 394    0 585 913
0 590 152    0 599 538    0 610 793    0 634 402
0 686 629    0 639 489    0 694 535    0 699 655
0 699 674    0 707 006    0 708 101    0 709 375
0 709 376    0 714 891    0 723 959    0 733 632
0 776 893
PCT国际专利公开号(WO)
90/05525    90/05729    91/09844    91/18899
92/01688    92/06079    92/12151    92/15585
92/17449    92/20661    92/20676    92/21677
92/22569    93/00330    93/00331    93/01159
93/01165    93/01169    93/01170    93/06099
93/09116    93/10073    93/14084    93/14113
93/18023    93/19064    93/21155    93/21181
93/23380    93/24465    94/00440    94/01402
94/02461    94/02595    94/03429    94/03445
94/04494    94/04496    94/05625    94/07843
94/08997    94/10165    94/10167    94/10168
94/10170    94/11368    94/13639    94/13663
94/14767    94/15903    94/19320    94/19323
94/20500    94/26735    94/26740    94/29309
95/02595    95/04040    95/04042    95/06645
95/07886    95/08908    95/08549    95/11880
95/14017    95/15311    95/16679    95/17382
95/18124    95/18129    95/19344    95/20575
95/21819    95/22525    95/23798    95/26338
95/28418    95/30674    95/30687    95/33744
96/05181    96/05193    96/05203    96/06094
96/07649    96/10562    96/16939    96/18643
96/20197    96/21661    69/29304    96/29317
96/29326    96/29328    96/31214    96/32385
96/37489    97/01553    97/01554    97/03066
97/08144    97/14671    97/17362    97/18206
97/19084    97/19942    97/21702    97/49710
英国专利公开号(GB)
2 266 529    2 268 931    2 269 170    2 269 590
2 271 774    2 292 144    2 293 168    2 293 169
2 302 689
上述的NK-1受体拮抗剂的适应症是用于治疗疼痛，头痛特别是偏头痛，阿尔茨海默氏病，诸如某些抑郁性紊乱、焦虑和呕吐之类的中枢神经系统紊乱，精神病，多发性硬化，吗啡戒断的减弱，心血管变化，水肿如由热损伤引起的水肿，诸如类风湿关节炎等慢性炎症，哮喘/支气管的高反应性和包括过敏性鼻炎在内的其它呼吸道疾病，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎在内的消化道炎性疾病，眼损伤和眼炎，良性前列腺肥大，运动病，诱发性呕吐的治疗，诸如恶性神经胶质瘤等癌症，创伤性脑损伤。
优选地，NK-1受体拮抗剂是在EP1035115中公开的2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-[6-(1，1-二氧代-1λ6-硫吗啉(thiomorpholin)-4-基)-4-O-甲苯基-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺或2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-[6-(1，1-二氧代-1λ6-硫吗啉4-基)-4-(4-氟代-2-甲基-苯基)-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺。
最优选地，NK-1受体拮抗剂是在EP1035115中公开的2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶3-基)-异丁酰胺。
这些NK-1受体拮抗剂的优选适应症包括中枢神经系统紊乱，例如治疗或预防某些抑郁性紊乱，焦虑或呕吐。主要的抑郁发作已被定义为至少两周的一段时间，在这段时间内的大多数天或几乎每一天，存在抑郁情绪或者对所有或几乎所有活动丧失兴趣或快乐减退。
另一方面，本发明提供了一种用于确定施与人类个体的药物活性化合物的功效和相容性的方法，这种方法包括检测从个体获得的NKNA基因组序列中的单核苷酸多态性的存在，该单核苷酸多态性与药物活性化合物的功效及相容性相关并由此确定对该个体而言此药物活性化合物的功效及相容性。
优选地，本发明涉及用于确定施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性的一种方法，该方法包括检测从个体获得的NKNA基因组序列中位于包含NKNA基因的图2核苷酸序列的33612，33949，37025，37114，37434，41112，和/或41172位置中的至少一个或多个位置上的核苷酸，其中这些位置的单核苷酸多态性与药物活性化合物的能效及相容性相关，并由此确定对于该个体而言此药物活性化合物的功效及相容性。
优选地，本发明涉及确定施与人类个体的药物活性化合物的功效和相容性的一种方法，该方法包括检测从个体获得的NKNA基因序列中是否存在选自如下的单核苷酸多态性的：包含此NKNA基因的图2中的核苷酸序列的33612位置C或T，图2中的33949位置T或C，图2中的37025位置C或T，图2中的37114位置G或A，图2中的37434位置A或C，图2中的41112位置T或G，图2中的41172位置G或A，和它们的组合以及它们的反向互补序列，该单核苷酸多态性与药物活性化合物的功效及相容性相关，并由此确定施与个体的此药物活性化合物的功效及相容性。
在此方法中，药物活性化合物可以是一种NK-1受体拮抗剂。此NK-1受体拮抗剂可以是上面所描述的任何一种NK-1受体拮抗剂。
根据本发明的此方法可通过使用用于检测单核苷酸变异的任何合适方法而得以施用，比如用质谱对PCR产物的直接质量分析，对侵入性切割产物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特异性扩增(即，ARMSTM-等位基因特异性扩增，ARMS指扩增受阻突变体系(amplification refractory mutation system))，ALEXTM(扩增受阻突变系统线性延伸(amplification refractory mutation system linearextension)和COPS(竞争性寡核苷酸引发系统)，等位基因特异性杂交(ASH)，寡核苷酸连接试验(OLA)，侵入者试验，DNA芯片分析和限制性片段长度多态性(RFLP)(综述参见基因组研究(GenomeResearch)，1998年，8卷，769-776页；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100页；人类突变(Human Mutation)，2001年，17卷，475-492页)。
携有所述多态性的核酸试样方便地是从个体中获得的血液、支气管肺泡灌洗液、痰、尿液或其它体液或组织样本，可以明了，试样同样可以是对应于试样中序列的核酸序列，也就是说，在等位基因变异分析前，核酸样品中的全部或一部分区域可先用任何一种方便的技术如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)扩增。
NKNA基因中的多态性可通过对病人的核酸样品进行测序和将此序列与对照物比较来确定，或通过PCR扩增不同种族来源的无关个体的DNA中的400-600个碱基对的片段(涵盖NKNA基因的编码区和调节区)来确定。这些样品中的片段可用正向和反向引物测序，多态性可用PolyPhred软件(经华盛顿大学许可)检测而变体的等位基因频率可被确定(人类突变(Human Mutation)，2001年，17卷，243-254页)。
显然，对于对本领域技术人员来说有大量的分析方法可被用于检测在本发明的一个或多个多态位置处变异核苷酸存在与否。一般来说，等位基因变异的检测需要突变辨别技术，任选地扩增反应和任选地信号生成系统。国际专利申请WO00/06768列出了许多扩增技术和突变检测技术，其中一些是基于PCR技术的。这些技术可和许多信号生成系统联合使用，可选的信号生成系统也被列于WO00/06768。
用于检测等位基因变异的许多现行方法综述于Nollau等，临床化学(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120页；在标准教科书例如“突变检测实验指南”(Laboratory Protocols for Mutation Detection)U.Landegren编辑，牛津大学出版社，1996年和“PCR”第二版Newton&Graham编辑，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，该分子选自于以下含有多态性的序列：由图2中的位置所定义的33612位置是T的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的33949位置是C的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的37025位置是T的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的37114位置是A的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的37434位置是C的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的41112位置是G的图2的核酸序列；由图2中的位置所定义的41172位置是G的图2的核酸序列；或它们的互补链或它们的包含至少一个多态性的具有至少20个碱基的片段。
一种“分离的”NKNA核酸分子是这样一种核酸分子，它从至少一种污染性核酸分子中被鉴别和分离出来，在NKNA核酸的天然来源中该污染性核酸分子通常与它联系在一起。分离的NKNA核酸分子以非天然的形式存在或存在于非天然的环境中。因此分离的NKNA核酸分子与存在于天然细胞中的NKNA核酸分子可被区别开来。然而，分离NKNA核酸分子包括在通常表达NKNA的细胞中含有的NKNA核酸分子，在此细胞中，例如，此核酸分子在染色体中的位置不同于其在天然细胞中时的染色体位置。
还有，本发明涉及可被用做检测NKNA基因中多态性的诊断引物的等位基因特异性核酸引物，该诊断引物能够与在序列内于图2的33612位置、图2的33949位置、图2的37025位置、图2的37114位置、图2的37434位置、图2的41112位置和图2的41172位置包含多态性的核酸杂交。
本发明的另一方面是包含选自以下的序列的核酸引物：SEQ ID NO.8定义的核酸序列；SEQ ID NO.9定义的核酸序列；SEQ ID NO.10定义的核酸序列；SEQ ID NO.11定义的核酸序列，SEQ ID NO.12定义的核酸序列；SEQ ID NO.13定义的核酸序列；SEQ ID NO.14定义的核酸序列；SEQID NO.15定义的核酸序列；或者SEQ ID NO.16定义的核酸序列以及它们的反向互补序列。
等位基因特异性引物通常与恒定引物一起用于诸如PCR反应等扩增反应中，通过对位于一个特定序列位置处的一个等位基因的选择性扩增而使等位基因之间得以区分开来，例如用在ARMSTM试验中的引物。等位基因特异性引物的长度优选17-50个核苷酸，更优选大约17-35个核苷酸，最优选大约17-30个核苷酸。
优选地，等位基因特异性引物与待检测的等位基因完全地相对应，但是也可以考虑其衍生物，其中3’端大约有6到8个核苷酸与待检测的等位基因对应而不超过10个，比如不超过8，6，4，2或者1个剩余核苷酸在不显著影响引物特性的情况下可以发生变化。常常在第2和/或第3位(相对于3’端)的核苷酸被错配以优化差异引物结合和优先仅从正确的等位基因辨别引物延伸。
本发明还涉及用于检测NKNA基因中的多态性的寡核苷酸探针，该探针能特异地与在序列内包含位于图2的33612位置、图2的33949位置、图2的37025位置、图2的37114位置、图2的37434位置、图2的41112位置和图2的41172位置的多态性的核酸杂交。
术语“寡核苷酸探针”指长度至少有17个核苷酸的一种核苷酸序列，此序列与部分或全部的人类NKNA基因，特别是表达多态性的人类NKNA基因部分对应。优选长度17到50个核苷酸。一般来说这样的探针包含与基因中相应的野生型或变体座位完全互补的碱基序列。
然而，如果需要，可以引入一个或多个错配，前提是寡核苷酸探针的辨别能力不被过度影响。本发明的探针可以携有一个或多个标记以便于检测，比如在Moleaular Beacons中。
本发明还包含一种诊断试剂盒，该试剂盒含有具有NKNA基因单核苷酸多态性的一种或多种核酸引物和/或一种或多种寡核苷酸探针，所述多态性选自于：图2中33612位置的C或T，图2中的33949位置T或C，图2中的37025位置C或T，图2中的37114位置G或A，图2中的37434位置A或C，图2中的41112位置T或G，图2中的41172位置G或A，和它们的组合以及它们的反向互补序列。
本发明还提供了一种包含NK-1受体拮抗剂和用于指导那些接受NKNA基因的一个或多个位置的单核苷酸多态性检测的人类个体用药的说明书的药物包。
本发明还提供了一种包含NK-1受体拮抗剂，优选2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-3-吡啶-3-基)-异丁酰胺，和用于指导那些根据本发明的方法接受NKNA基因的一个或多个位置的单核苷酸多态性检测的人类个体用药的说明书的药物包。
本发明还提供了NK-1受体拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于在人类个体中治疗NK-1受体的配体介导的疾病，所述人类个体被诊断为在包含这种NKNA基因的图2的33612，33949，37025，37114，37434，41112，和41172位置中的至少一个或多个位置具有单核苷酸多态性。
本发明也包括已经储存了NKNA基因多态性序列信息的计算机可读介质，该多态性包括位于图2的33612，33949，37025，37114，37434，41112，和41172位置的多态性。
本发明也提供了用于实施序列鉴定的方法，所述方法包括步骤：提供核酸序列，该核酸序列选自于：图2的在33612位置是T的核酸序列；图2的在33949位置是C的核酸序列；图2的在37025位置是T的核酸序列；图2的在37114位置是A的核酸序列；图2的在37434位置是C的核酸序列；图2的在41112位置是G的核酸序列；图2的在41172位置是G的核酸序列；或它们的互补链或它们的包含至少一个所述多态性的具有至少20个碱基的片段；和将所述的核酸序列与至少一个其它的核酸或多肽序列比较来确定身份。
现在已经一般性描述了本发明，通过参考特定的实施例以及下列附图将会更好理解本发明，此外包含的实施例除非另外限定，仅以举例阐述本发明为目的而不试图限制本发明。
附图简述：
图1：NKNA基因的基因组结构和发现于此基因中的多态性。外显子-内含子界限参照描述于图2的序列(相当于登记号EM-HUM1：AC004140.1的序列中的部分DNA序列)标出。多态性的位置用箭头标出。
图2：由登记号EM-HUM1：AC004140.1.所限定的、包含前速激肽原基因的PAC克隆DJ0841B21的部分基因组序列。
外显子-内含子界限在图1中被标出。该序列相当于SEQ ID NO.1，其中33301位置相当于SEQ ID NO.1的位置1，而41800位置相当于SEQ IDNO.1的位置8500。
图3：NKNA基因中的被确认的单核苷酸多态性，其位置如图2所限定。
图4：29个在41172位置的基因型测试结果的2×2列联表，其中，呕吐试验前浓度＞20纳克/毫升2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺。效果＝有：呕吐+恶心的次数小于等于3次.Fisher确切检验(双侧)：p＝0.033。实验对象的基因型根据下面的范畴分类：0-2是等位基因2(核苷酸G)纯和体(两个拷贝的等位基因2，无等位基因1拷贝)；非0-2包括等位基因1(核苷酸A)纯和体2-0(两拷贝等位基因1，无等位基因2拷贝)和杂和体1-1(一拷贝等位基因1和一拷贝等位基因2)。
实施例
除非有其它说明，实施例中涉及到的商业供应试剂根据厂商的说明书使用。
实施例1：多态性检测
所有的单核苷酸多态性是用ABI毛细管测序仪和Big Dye chemistry(ABI)通过双链DNA测序发现的。首先，NKNA基因的基因组结构来自EMBL数据库中登记号为EM-HUM1：AC004140.1的PAC克隆，通过用NKNA mRNA(在EMBL数据库中为登记号U37529.1)进行BLAST搜索找到该克隆。得到外显子-内含子界限，如图1所标明，而引物被设计去扩增基因所有的编码区及调节区。被用于扩增所有外显子的引物显示如下且也被用作测序引物。所有的多态性使用这些引物对而被靶定：
表1：用于检测多态性的寡核苷酸引物列表
  引物类型 核苷酸序列 SEO ID NO
  引物1  CATGTTTACAATACATATTGGCAC SEQ ID NO.2
  引物2  GTATATGATGAATGATG SEQ ID NO.3
  引物3  CACCCTCATTCTTCCCTGC SEQ ID NO.4
  引物4  CTTCAGTCTCACCAAAACTTG SEQ ID NO.5
  引物5  GTGCCCCTTTCCATCCTCTC SEQ ID NO.6
  引物6  GGTGTGGGTTGGTGGGTTAG SEQ ID NO.7
为检测多态性，5个不同种族来源的47个无关个体的NKNA基因被PCR扩增。用片段特异性引物对(长度18-27bp)，200-700bp片段被扩增，例如用引物对5和6得到519bp-PCR产物。片段被设计成覆盖NKNA基因的编码区和调节区。PCR产物经纯化柱纯化后，DNA用ABI毛细管测序仪及ABI Dye terminator chemistry(基于荧光的测序)测序。DNA序列中的多态性用Polyphred软件检测(Nickerson，D.等，1997：NAR 25卷(14期)：2745-2751页)，该软件在Phred，Phrap和Consed的基础上运行(所有的程序都得到了美国华盛顿大学的许可)。通过基于荧光的测序，该程序能够自动检测杂合单核苷酸替代的存在。在上面的例子中，下列两个多态性在519bp的片段中被检测到。
    41112*     T或G
    41172*     G或A
*由登记号EM-HUM1：AC004140.1中的位置限定
总之，如图3所示，NKNA基因中七种单多核苷酸多态性被检测到。
实施例2：基因型检测
a)实验对象的选择
研究方案和知情同意形式被递交给当地伦理委员会批准。所有实验对象以书面形式承诺将他们的血样用于基因型检测。如果实验对象改变主意的话，那么此承诺在不超过一个月后可被取消。
所有样品被安排新的独立的代码，在临床资料库关闭后六个月内，新代码和原代码之间的联系将被删除。这是个额外措施以确保实验对象的保密性；然而，结果是不可能根据实验对象的名字或原来的临床试验中所用的号码找到基因型信息。大约15年时间后，所有的血样和DNA样本将被销毁。
b)基因型检测实验
单个血样(9毫升)被收集在EDTA试管中。在被送到瑞士巴噻尔的Roche中心样品办公室(CSO)之前，这些血样被冷冻和保存在-20℃到-70℃之间，送到CSO后，血样被分装到三个试管中并贴上条形码标签，安排新的独立代码，以确保实验对象的匿名性。两个血样(1毫升和4毫升)被送到加利福尼亚Alameda的Roche Molecular Systems(RMS)的Roche样品仓库(RSR)，并在-80℃下保存。剩下的4毫升分装样以-80℃保存在瑞士巴噻尔的CSO。在RSR对样本采用的所有程序都是根据已制定的标准操作程序进行的，这些标准程序符合GCP指标。
用基于硅膜的提取方法(QiaAmp 96 DNA Blood kit，Valencia，CA)将DNA从400μl全血液中提取出来。对照组包括10mM Tris pH8.0，0.1mM EDTA(TE)缓冲液和从具有已知DNA产率的血液单元得到的全血。
根据在NKNA基因中的多态性发现结果，选择三种基因标记。用Germer等，基因组研究(Genorne Res.)(2000年)，10卷258-266页描述的动态PCR方法检测样本的这些单核苷酸多态性基因型。该方法原来采用合并的样本，这里修正为一个反应用一个样本。本方法在不用荧光探针的情况下可以鉴别单核苷酸多态性。
在动态热循环仪(KTC)中，双链扩增产物的生成用DNA嵌入染料和热循环仪来监控，该循环仪配有一个荧光检测CCD照相机(PE-BiosystemsGeneAmp 5700序列检测系统)。PCR扩增板的每个孔的荧光在每轮退火和变性循环时被检测。用PE-Biosystems的SDS软件测得的相对荧光达到0.5阈值的该轮循环被定义为Ct。
扩增反应被设计为等位基因特异的，以便于如果等位基因存在则扩增反应为阳性，如果等位基因不存在则扩增反应为阴性。对于每个双等位基因多态性，扩增板的一个孔设置为对等位基因1特异而第二孔设置为对等位基因2特异。对于每个待检测的多态性，设计了三个引物，即两个等位基因特异性引物和一个共用引物(表2)。等位基因1的反应包含等位基因1特异性引物和共用引物，等位基因2的反应包含等位基因2特异性引物和共用引物。每对孔的Ct值被用于计算ΔCt以用来确定等位基因信号(allelecall)。
表2：用于多态性筛选的寡核苷酸引物列表
标志 引物ID 核苷酸序列 SEQ IDNO 引物浓度(μM) 退火温度
411172 PPT1/411172  CCGGTACAGGTGAGACTTT SEQ IDNO.8 0.4 58℃
411172 PTT2/41172  CCGGTACAGGTGAGACTTC SEQ IDNO.9 0.4 58℃
411172 PTT3/41172  CAACGGATGAACCAAGATC SEQ IDNO.10 0.4 58℃
37114 PTT4/37114 AGAGAAATAGACAGATACTGTGGTAG SEQ IDNO.11 0.2 58℃
37114 PPT5/37114 AGAGAAATAGACAGATACTGTGGTAA SEQ IDNO.12 0.2 58℃
37114 PTT6/37114 ATGGATTTATAGGTGGTTAAGG SEQ IDNO.13 0.2 58℃
 37025 PTT7/37025  CAGATCTATAGGAAAGAATATAGCAC SEQ IDNO.14 0.2 58℃
 37025 PTT8/37025  CAGATCTATAGGAAAGAATATAGCAT SEQ IDNO.15 0.2 58℃
 37025 PTT9/37025  CCATTTAATCATTACCAACCTGAATC SEQIDNO.16 0.2 58℃
扩增反应的条件如下：10mM Tris pH8.0，40mM KCl，2mMMgCl2，50μm dATP，dCTP和dGTP各50μm，25μm dTTP和75μmdUTP，4％DMSO，0.2X SYBR Green I(Molecular Probes，Eugene，OR)，2％丙三醇，2单位的尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)，15单位的Stoffel Gold DNA聚合酶(参见，Nature(1996年)381卷，445-6页)和引物，每孔85μl体积。用于每个试验的引物浓度列于表2中。然后向每个孔中加入30纳克的DNA 15ul。
为了减少由预先存在的扩增反应产物引起污染的可能性，试验程序包括将dUTP掺入扩增产物和一个温育步骤以对预先存在的含dU产物作UNG降解(Longo等，基因(1990年)，93卷，125-128页)。
利用试样等分机器人(Packard Multiprobe II，Meriden，CT)，在96孔的扩增板中制备扩增反应物，板用由实验管理数据库产生的条形码标签加以标识。由机器人运行的程序的参数被设置成使交叉污染的可能性最小。对于每个板的81个样品，有5个样品重复二次，分析重复样的结果以确定它们是否匹配。
热循环条件如下：50℃两分钟以对任何先前污染的PCR产物作UNG降解，95℃12分钟使Stoffel Gold聚合酶活化，55个循环的在95℃下20秒变性和58℃下20秒退火，接着从60℃到95℃以1度的增量进行0.57分钟的解离步骤。扩增反应在PE Biosystems GeneAmp 5700序列检测系统(SDS)仪器(Foster City，CA)中运行。解离曲线的第一个衍生物用SDS软件得到，根据需要进行检测以证实给定反应中的荧光是由于具有明确的解离峰的特定产物的扩增所致，而不是由非特异引物-二聚物引起。产物的区分根据K.M.Ririe等，分析生物化学(Anal.Biochem.)(1997年)，245卷，154-160页的方法在PCR过程中用DNA熔解曲线分析进行。
每个扩增反应的Ct被检测，且等位基因1和等位基因2的Ct之间的差值(ΔCt)被用作实验结果。ΔCt在-3.0和3.0之间的样品被认为是杂合的(A1/A2)。ΔCt低于-3.0的样品被认为是A1纯合的(A1/A1)；ΔCt高于3.0的样品被认为是A2纯合(A2/A2)。大多数情况下，三组基因型的ΔCt之间的差异是明确的，Ct值接近3.0的样品作为有偏差样品被重新测定。
每个试验在一组20个细胞系DNA中进行，以确定具有合适基因型的细胞系以便在每个实验板(A1/A1，A1/A2，和A2/A2)上被用作对照。
细胞系DNA获得于加利福尼亚Roche Molecular Systems(RMS)Alameda的R & D Service的培养物保藏中心，用Qiagen抽提试剂盒(QiaAmp DNA Blood kits，Valencia，CA)抽提。细胞系DNA的基因型通过DNA测序来证实。三种细胞系DNA(A1/A1，A1/A2，和A2/A2)被作为每个板上临床实验样品的对照，用于检测板之间的差异。分析由对照细胞系得到的Ct值以便为临床实验样品中获得的ΔCt值确定截断值。
对于每个板，SDS软件生成包含每孔Ct值的数据文件并将其输入实验管理数据库。对针对临床试验的所有SNP实验，用独立代码标识的所有样品的Ct值的数据文件从数据库中调出来并用一种自开发程序解释成最终的基因型。基因型结果被送到统计学家手中并与同样以独立代码标识的临床数据相匹配用于统计分析。
实施例3：呕吐测试
所描述的呕吐测试在两项研究中进行，一项为单剂量增加研究(SAD)，另一为多剂量增加研究(MAD)。在SAD中，呕吐测试在摄入2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺后6和/或24小时之后进行。在MAD中，呕吐测试在14天一天一次给药后于最后一次给药之后6或24小时进行。
SAD
在SAD的第一个实验日，5、10、20、40、80、160、230和400mg的2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺以一种饮用乳液被实验对象口服。在口服此药物后6或者24小时，实验对象的下腹部被皮下注射50μg/kg的脱水吗啡。注射脱水吗啡的时间被记录下来。注射之后立即让实验对象直坐。他们一直保持这种姿势直到发生呕吐或者在脱水吗啡注射之后保持至少1小时。呕吐被定义为大约25毫升或者更多的胃内容物回吐。恶心被定义为产生较少胃内容物或不产生胃内容物的一种反胃。
预期恶心和/或呕吐在注射之后平均10分钟内出现。皮下注射一剂50ug/kg的脱水吗啡之后恶心和/或呕吐持续大约5到30分钟。呕吐和恶心的次数被记录下来。
测试组按以下“呕吐测试时的血浆浓度”的顺序排列。用阻断剂达到平台，平均有3次恶心和呕吐。如果假定这是疗效的达到点，那么本测试预测当血浆浓度达到20纳克/毫升的时候达到有效的水平。
用于分析血浆浓度和恶心及呕吐次数之间的相关性的Spearman相关性检验提示统计上非常显著的关系(p＜0.01)。
MAD
MAD的实验对象服用2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺14天。在第14天，按SAD中描述的那样进行试验。
MAD和SAD显示的结果一致。
基因型检测
SAD和MAD的所有参与者被检测图2中位置所定义的NKNA基因的41172位置的单核苷酸多态性。
因为达到疗效的最小浓度被发现是20纳克/毫升血浆浓度，因此试验检测此单核苷酸多态性是否优选存在于那些血浆浓度大于20纳克/毫升，并对实验产生反应具有恶心和呕吐少于等于三次的个体。结果如图4所示。
基因组中包含图2位置所定义的NKNA基因第41172位置的G单核苷酸多态性的实验对象与那些不含该单核苷酸多态性或者那些仅仅是杂合的实验对象相比对处理有较高疗效的反应。
                          序列表
<110>弗.哈大曼-拉罗切有限公司
<120>前速激肽原基因中的遗传多态性
<130>Case 21067
<140>EP02001937.8
<141>2002-01-31
<160>16
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>8500
<212>DNA
<213>人
<400>1
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tgtctatttt cagtcataat ttcatacata ccagaattta aagctctttt gcccattagt    4020
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tatctttgag gaaacaaact attataacca gaacaaagca agcttctgaa tatatgtctg    4140
tataataaat atctatctac ttcaagtttt ggtgagactg aagaaataaa gattccttaa    4200
aagttttata aattacacta aaacaataca atgaaaccac ttttcttaat tctatattta    4260
atattagcaa gcactctcta ttcatatatt ttatctgtta tgtaagggtc taaaatattt    4320
tatataaaat attgttattt gagctaggtt tgatttttta ggaagtcaat ttcacatttg    4380
tgtgagagtg aaatatccaa gcataattcc ttgtgttatt aataagttgt acttctcagc    4440
aagtagacct taattaaacc agattccttt ccttgatgat tataatcttc taaaaggtca    4500
ctgtttttat tttattggat attaaaagat actcctttca gaaaagttta ttagttttca    4560
catgaacaga gtacattttt tattacatag aatttttata tataattctc ttcaaagtca    4620
aatccttaga aagtaaatat gaatactatt tatttttcaa agatgaactc tttggaaagg    4680
ttactatttt aatgctagtg agagaatttc tcttggtttt tattttaata gttgagaata    4740
gagctgctac gttaatgtgg cctgctctgc cacccaatga accaaatcca tgacagggta    4800
caataggtga gtggacaata cgatgaagat agaccctttc cacttcttgt caactccggt    4860
tccattaact gagaaacaaa tttaatgacc ttcacatacc acaattttgc catctttgct    4920
gccctaagaa atgttttact gatcgagttt tcccattcaa ttaggggatt aaaaaactgc    4980
atctctaccg tcttcatttt tagtatggat tctctactca tgttcactca ctcattccat    5040
ttaattggct gctggatgac cctaataaat gacatcatta ttggaccaag catactaaaa    5100
tgagttagga gatgcctata aatgcttgtg ggggtttcgt gtttgtttgt ttgtttgttt    5160
acagtgaaag taagcttagg gggtgggtgg ctgggaagaa atatgtatgg tagatttcta    5220
atcctaggat tgaaattctt ctctaaaact aacaattgaa gggacttaaa agacattttt    5280
ttctttttta atataatgca tctctttgct aagtacaata tgtctaaaca accatattct    5340
ggatgtaata tgaatctccc ccattcttat attgtcttca ttaaacatat taagccctag    5400
agtcatgaca gaaaataagg taagataaat aaagtgaaat tcaatataat tttacattta    5460
aatttgataa atgtcaaaat aattttgaac ttacttttgt gagagatctg gccatgtcct    5520
agaagaaaga taaaattagc aaacacatat agatttgttt ttaaagatgc tacattatat    5580
cttttataaa ataatttgat tctcaaaata tgtaacattt tctatctata tattatcctg    5640
aggaataaag cagaaccata aatgctaaac aaattattaa tcataaaaac taaatattta    5700
aacaaacaaa tggaattttt attaagtgcc ttctatggga ttcaaaccta ggactatgag    5760
acttctgagg cctcttatta actataagac tgtaacacat cccaccttca aggctggcca    5820
cccactgaga gagagagaga aagagagaga gagagactga gagagagtga cagagagaga    5880
gagacagaga gagtgacaga gagagagaga aaccgagaga gagtgcgcaa atccatctct    5940
ttattaaaca ggcatgaccc agatcttgta tttcagccca taaaagattt tatttcactt    6000
tcctacatgt gctttcacaa tagtaaaata aagatttata ggaatgttta ccataaagag    6060
cctttaacag ggccacttgt ttttcaattg aggaatctga caagagacga attgtcatta    6120
actacatgtt ccactgaccg tgcgatgaat tcaaggaaac gatatttcta tcccaagaca    6180
aatgtactct cacctcaggg aatgctataa aatcctcttc cacatgcact tggatcatcc    6240
gcagtactac ccctggaggc ccgtgccttc cctttgtcag tttggatctt tagtcaaggg    6300
agcgcttcac tcgaatacag tgaggcatgc gaaccagatc tttccctccc cccgcgggcc    6360
cgtgcgtgcc ttagtgcggt gtgggccaat gtcgcgcctg gggaattaca cccctcttgg    6420
agtggaaatc tctattcaga gcgagagacc ctggggtact ccaggaagga gtgagcagac    6480
agggcgggct gcccaagaca cctagggacg gtcgcctatc tcaccagcat cccgtttgcc    6540
cattaatcca aagaactgct gaggcttggg tctccgggcg attctctgca gaagatgctc    6600
aaagggctcc ggcagttcct cctgggagac aaaagcacgg acaaagggcg tgtaaggcaa    6660
ccagagcgag gcacccagca acccgagccc ttccccccgc tgtactccgg ccccgaggcg    6720
tggggaggcg gccttcccca cgctcgggct gagcggggtc cctcccgagg cgctgcctct    6780
ctgcgcccct ccccgccgaa ctcgcgtccc gccccccgca agcctgccag ggcgagttag    6840
cagctggctc ggcgtcttca agcttcgagc gctttccgct ctttcctccc agcccgggga    6900
ccttccctca tctgctgcgc cgccacctga ctttgtcttg tctcggtgcc ggctttgtag    6960
agtcctcacc gccctaaatg cacacaggtg tgtgggatct ggggctgggg ctccggtggg    7020
gaagggtgac aacgctttac agacgacttt caccgttttt ccgaggcgcg ctccccagcg    7080
cctgtagcct acgagtttct aaagggagac ttcaagctac atcctcaggt ccgcaaaaca    7140
aacgtgaagg caggaaatta acttccctcc agcctccggc cctccaatcc ccctgcagct    7200
cgcgcgtgtg cccgctgctg cccgcgaccc aggcgccctc ctctgcccgt gcccagacgc    7260
tagggcagtg cagctggacc ggagcccccg aaatcccagg tcctggggga tgaaatctta    7320
cgagatttcc cgccttgtga ggatctcggg ctcatccggg agggcatccc tactgcaggg    7380
agttcctggg ccggacggtg cagccctcgg gaagaaactt gaatcgtggg cacaaaatcc    7440
cgtggggaac ccgggaaata gtgccccttt ccatcctctc gcacgcaacc gctgcctctt    7500
tccgtggtgg cggtgcgtgc cacgttaact agggtgctgt tgcgtgggaa ggtgacagct    7560
cccgagccca ggaagaaggg tgcgggccgt cctgggaagg ggcctcacct tgatctggtc    7620
gctgtcgtac cagtcggacc agtaattcag atcatcattg gctcctattt cttctgcaaa    7680
cagctgagtg gagacaagaa aaaagactgc caaggccacg aggattttca tgttggattt    7740
ctgggaaggg gtaggaggag aagacaccaa agagagaaat aatgtatcta ttaggggtgg    7800
ttatccaaga gttaaagcaa cagaattttc tgccccacaa cggatgaacc aagatcaaaa    7860
acataaggac tgaagtctca cctgtaccgg ttaggcgaga gaatcgcgtc ccaaagattc    7920
tccaaccctc ttctccctga atcccaactc ccccagcccc ctaacccacc aacccacacc    7980
ttcaaaccag gaaactctgc aggtggaaga caaagaggg  cgttggcgtt tgggaagcca    8040
gtctccccac tgtccctcgc cgcagcggcg cccccagcgc ggccacctcg gacagatgcg    8100
gggcggggtg acccgggcag ccgcggccag caccgcgcgg gcacttactg cgacggacag    8160
tcccgcgggg tgctgagttt ctctggttcc tccgagcgca cgctggtcgc tccgcactct    8220
cggtagctgc cgccgggaag gaggtccgag cgcgctcttt cgcctgctca gtgccttgcg    8280
gtatttatcc cagcctcctt gagcctccag acccacgtga cattctcccc acgcgacttt    8340
ctgctcaata tttaattagc cgcctcctct cctttcgctt gcgtgattga gagtttccga    8400
gacggtaact cgtcgatgcc cataacatct ggacccaatt gggttctaaa tgacgcaatt    8460
ttaggaaaat cgaggtctcg ccatccaatc cggagcggcc                          8500
<210>2
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ccatttaatc attaccaacc tgaatc                                           26

Claims (33)

1.一种用于将NKNA基因中的单核苷酸多态性和施与人类个体的药物活性化合物的功效及相容性联系起来的方法，该方法包括确定个体的NKNA基因中的单核苷酸多态性和参考NKNA基因中的多态性确定被施与药物活性化合物的个体的状态。
2.根据权利要求1的方法，其中确定位于包含NKNA基因的图2的核苷酸序列的33612，33949，37025，37114，37434，41112和41172位置中的至少一个或多个位置的核苷酸。
3.根据权利要求1的方法，其中确定如图2的核苷酸位置定义的NKNA基因的41172位置的核苷酸。
4.根据权利要求1至3的方法，其中NKNA基因中的单核苷酸多态性选自：
图2中的33612位置C或T，和/或
图2中的33949位置T或C，和/或
图2中的37025位置C或T，和/或
图2中的37114位置G或A，和/或
图2中的37434位置A或C，和/或
图2中的41112位置T或G，和/或
图2中的41172位置G或A，和它们的组合以及它们的反向互补序列。
5.根据权利要求1至4的方法，其中药物活性化合物是NK-1受体拮抗剂。
6.根据权利要求5的方法，其中NK-1受体拮抗剂是选自下列的化合物：
2-(3，5-二-(三氟甲基)-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺，
2-(3，5-二-(三氟甲基)-苯基)-N-[6-(l，l-二氧-1λ6-硫吗啉-4-基)-4-O-甲苯基-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺，
2-(3，5-二-(三氟甲基)-苯基)-N-[6-(1，1-二氧代-1λ6-硫吗啉-4-基)-4-(4氟代-2-甲基-苯基)-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺；和它们的药学上可接受的酸加成盐。
7.根据权利要求5的方法，其中NK-1受体拮抗剂是选自正在进行药物开发的命名如下的NK-1受体拮抗剂的化合物：GR205171、HSP-117、L703,606、L668,169、LY303241、LY306740、MK-869、R-544、SpantideIII、WIN-62,577、GR103,537、L758,298、NKP608、CGP49823、CP-96,345、CP-99,994、CP-122,721、FK888、GR203040、GR82334、GR94800、L732,138、L733,060、L742,694、L754,030、LY303870、MEN11149、PD154075、RP-67580、RPR100893、Spendide、Spantide II、SR140333、WIN-41,708、WIN-62,577、SR-48,968、L-659,877、MEN10627、SR144190、GR94800、SR-142,801、R820、R486、SB222200、L758,298、NK-608、CGP47899和MEN11467；或者是其药学上可接受的酸加成盐。
8.根据权利要求5至7的方法，其中NK-1受体拮抗剂被用于治疗选自下列的疾病或紊乱：疼痛，头痛，特别是偏头痛，阿尔茨海默氏病，中枢神经系统紊乱诸如某些抑郁性紊乱、焦虑和呕吐，精神病，多发性硬化，吗啡戒断的减弱，心血管变化，水肿如由热损伤引起的水肿，慢性炎症诸如类风湿关节炎，哮喘/支气管的高反应性和其它呼吸道疾病，包括过敏性鼻炎，消化道炎症，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎，眼损伤和眼炎，良性前列腺肥大，运动病，诱发性呕吐的治疗，癌症诸如恶性神经胶质瘤等，和创伤性脑损伤。
9.根据权利要求5至7的方法，其中NK-1受体拮抗剂被用于治疗或预防诸如某些抑郁性紊乱、焦虑和呕吐之类的中枢神经系统紊乱。
10.根据权利要求1至9的方法，其中使用包括选自如下的差异核酸分析技术的试验：用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
11.一种用于确定施与人类个体的药物活性化合物的功效和相容性的方法，该方法包括确定从个体获得的NKNA基因组序列中的单核苷酸多态性的存在，该单核苷酸多态性与此药物活性化合物的功效及相容性相关，和由此确定对于该个体而言此药物活性化合物的功效及相容性。
12.根据权利要求11的方法，其中确定位于包含NKNA基因的图2中的核苷酸序列的33612，33949，37025，37114，37434，41112，和41172位置中的至少一个或多个位置的核苷酸。
13.根据权利要求11的方法，其中确定位于如图2中的核苷酸位置定义的NKNA基因的41172位置的核苷酸。
14.根据权利要求11至13的方法，其中NKNA基因中的单核苷酸多态性选自：
图2中的33612位置C或T，和/或
图2中的33949位置T或C，和/或
图2中的37025位置C或T，和/或
图2中的37114位置G或A，和/或
图2中的37434位置A或C，和/或
图2中的41112位置T或G，和/或
图2中的41172位置G或A，和它们的组合以及它们的反向互补序列。
15.根据权利要求11至14的方法，其中药物活性化合物是NK-1受体拮抗剂。
16.根据权利要求15的方法，其中NK-1受体拮抗剂是选自下列的化合物：2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-甲基-N-(6-吗啉-4-基-4-O-甲苯基-吡啶-3-基)-异丁酰胺，2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-[6-(1，1-二氧-1λ6-硫吗啉-4-基)-4-O-甲苯基-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺，2-(3，5-二-三氟甲基-苯基)-N-[6-(1，1-二氧代-lλ6-硫吗啉-4-基)-4-(4-氟代-2-甲基-苯基)-吡啶-3-基]-N-甲基-异丁酰胺；和它们的药学上可接受的酸加成盐。
17.根据权利要求15的方法，其中NK-1受体拮抗剂是选自正在进行药物开发的命名如下的NK-1受体拮抗剂的化合物：GR205171、HSP-117、L703,606、L668,169、LY303241、LY306740、MK-869、R-544、SpantideIII、WIN-62,577、GR103,537、L758,298、NKP608、CGP49823、CP-96,345、CP-99,994、CP-122,721、FK888、GR203040、GR82334、GR94800、L732,138、L733,060、L742,694、L754,030、LY303870、MEN11149、PD154075、RP-67580、RPR100893、Spendide、SpantideII、SR140333、WIN-41,708、WIN-62,577、SR-48,968、L-659,877、MEN10627、SR144190、GR94800、SR-142,801、R820、R486、SB222200、L758,298、NK-608、CGP47899和MEN11467；或者是其药学上可接受的酸加成盐。
18.根据权利要求15至17的方法，其中NK-1受体拮抗剂被用于治疗选自下列的疾病或紊乱：疼痛，头痛，特别是偏头痛，阿尔茨海默氏病，中枢神经系统紊乱诸如某些抑郁性紊乱、焦虑和呕吐，精神病，多发性硬化，吗啡戒断的减弱，心血管变化，水肿如由热损伤引起的水肿，慢性炎症诸如类风湿关节炎，哮喘/支气管的高反应性和其它呼吸道疾病，包括过敏性鼻炎，消化道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎和局限性回肠炎，眼损伤和眼炎，良性前列腺肥大，运动病，诱发性呕吐的治疗，癌症诸如恶性神经胶质瘤，和创伤性脑损伤。
19.根据权利要求15至17的方法，其中NK-1受体拮抗剂被用于治疗或预防诸如某些抑郁性紊乱、焦虑和呕吐之类的中枢神经系统紊乱。
20.根据权利要求书11至19的任一项的方法，其中使用包括选自以下的差异核酸分析技术的试验：用质谱对PCR产物直接质量分析、对侵入性切割产物直接分析、直接序列分析、等位基因特异性扩增、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接试验、侵入者试验、DNA芯片分析和限制性片段长度多态性。
21.一种分离的核酸分子，其选自于：
在图2位置定义的33612位置是T的图2的核酸序列；
在图2位置定义的33949位置是C的图2的核酸序列；
在图2位置定义的37025位置是T的图2的核酸序列；
在图2位置定义的37114位置是A的图2的核酸序列；
在图2位置定义的37434位置是C的图2的核酸序列；
在图2位置定义的41112位置是G的图2的核酸序列；
在图2位置定义的41172位置是G的图2的核酸序列；
或者其互补链或其包含至少一个所述单核苷酸多态性的至少20个碱基的片段。
22.等位基因特异性核酸引物，其能够检测权利要求12中定义的图2的核苷酸序列位置中的一个或多个位置的NKNA基因的多态性。
23.根据权利要求22的核酸引物，其中的引物选自：SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.12，SEQ IDNO.13。SEQ ID NO.14，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16。
24.用于检测NKNA基因中的多态性的寡核苷酸探针，其能特异地与具有如权利要求14所定义的多态性的核酸杂交。
25.根据权利要求24的寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针的长度为17-50个核苷酸。
26.包含一种或多种权利要求22和23定义的核酸引物和/或一种或多种权利要求24和25定义的寡核苷酸探针的诊断试剂盒。
27.药物包，其包含NK-1受体拮抗剂和将该药物施与人类个体的说明书，其中所述人类个体接受过NKNA基因的一个或多个位置的单核苷酸多态性检测。
28.药物包，其包含NK-1受体拮抗剂和将该药物施与人类个体的说明书，其中所述人类个体接受过如权利要求12中所定义的一个或多个NKNA基因位置的单核苷酸多态性检测。
29.药物包，其包含NK-1受体拮抗剂和将该药物施与人类个体的说明书，其中所述人类个体根据权利要求11至20的方法接受过单核苷酸多态性检测。
30.NK-1受体拮抗剂在制备药物中的用途，该药物用来治疗人类个体的NK-1受体配体介导的疾病，所述个体被诊断为在包含NKNA基因的图2的核苷酸序列的33612，33949，37025，37114，37434，41112，和41172位置中的一个或多个位置具有单核苷酸多态性。
31.一种已经储存了NKNA基因中的多态性的序列信息的计算机可读介质，所述多态性包括下列位置的多态性
图2中位置定义的33612位置，和/或
图2中位置定义的33949位置，和/或
图2中位置定义的37025位置，和/或
图2中位置定义的37114位置，和/或
图2中位置定义的37434位置，和/或
图2中位置定义的41112位置，和/或
图2中位置定义的41172位置。
32.用于实施序列鉴定的方法，该方法包括步骤：提供权利要求21的核酸序列，和将所述的核酸序列与至少一种其它的核酸序列相比较以确定身份。
33.基本如前描述的，特别是参照前面的实施例描述的方法、核酸分子、核酸引物、寡核苷酸探针、检测试剂盒和药物包，用途和计算机可读介质。
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