CN104937419A - 预测受试者患癌症的风险或诊断癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的主题为预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者患癌症的方法，其包括：确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及将所述速激肽原、其剪接变体或其片段水平与患癌症的风险相关联，其中水平降低预示患癌症风险增加，或者诊断癌症，其中水平降低与癌症诊断相关。

Description

预测受试者患癌症的风险或诊断癌症的方法
本发明的主题为预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的方法，包括：
■确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的速激肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■将所述速激肽原或其片段的水平与患癌症的风险相关联，其中水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中水平降低与癌症诊断相关。
物质P(SP)为神经肽：一种十一氨基酸多肽，其作为神经递质和神经调质发挥功能。其属于速激肽神经肽家族。在差异剪接前速激肽原A基因后，物质P及其密切相关的神经肽——神经激肽A(NKA)由多蛋白前体产生。在CNS中，物质P参与疼痛传递系统。
物质P在炎性过程中起作用(Ang et al,2011)，并且在癌细胞中具有抗凋亡活性(Munoz et al,2005)。
物质P受体(神经激肽1受体)在癌症发展中起着关键作用(Fries et al,2003；Munoz et al,2010；Rameshwar,2007；Schulz et al,2006)。体外阻断物质P通路显著降低肿瘤细胞的生长(综述参见Munoz and Rossow,2009)。
Belting等(Cancer,Epidemiology,Biomarkes&Prevention)已报导了使用血管活性肽预测男性癌症风险。1991-1994年，测量了来自在基线检查前无癌症的马尔摩膳食与癌症研究的参与者(1768名男性和2293名女性)空腹血浆的MR-pro-ANP、MR-pro-ADM和肽素。作者认为在女性中，生物标志物与癌症发生之间没有关系。
本发明的主题是研究速激肽原预测癌症发生和预测癌症复发风险的预测和诊断能力。为了解决这一问题，在15年的随访期间，测量了所述瑞典前瞻性队列研究(马尔摩膳食与癌症研究)中空腹血浆的速激肽原的稳定片段(Ernst et al,2008)以及乳腺癌发生的该生物标志物的相关基线水平。
令人吃惊地，显示速激肽原是预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的有力且高度显著的生物标志物。
因此，本发明的主题为预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的方法，其包括：
●确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
●将所述速激肽原、其剪接变体或其片段水平与患癌症的风险相关联，其中水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中水平降低与癌症诊断相关。
在本发明的另一主题中，所述方法另外包括以下步骤：
●另外确定获自所述受试者的体液中神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
●另外将所述神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段水平与患癌症的风险相关联，其中神经降压素原或其片段水平增加预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中神经降压素原或其片段水平增加与癌症诊断相关。
根据本发明的另一实施方案，上述方法可另外包括以下步骤：
●另外确定获自所述受试者的体液中脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
●另外将脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段与患癌症的风险相关联，其中脑啡肽原或其片段水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中脑啡肽原或其片段水平降低与癌症的诊断相关。
根据本发明的另一实施方案，上述方法可另外包括以下步骤：
●另外确定获自所述受试者的体液中胰岛素的水平；以及
●另外将所述胰岛素水平与患癌症的风险相关联，其中胰岛素水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中水平降低与癌症诊断相关。
因此，本发明的方法包括确定体液中包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平，并且还可任选地包括选自以下的至少一种进一步确定和另外与癌症风险相关联：
●确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平，以及
●确定脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平，以及
●确定胰岛素的水平。
在本发明的一实施方案中，除了包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段外，还进一步确定了前述另外的生物标志物中的至少一种，并另外与所述癌症风险相关联。在本发明的一实施方案中，除了包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段外，还进一步确定了前述另外的生物标志物中的至少两种，并另外与所述风险相关联。在一实施方案中，确定了所有上述四种生物标志物。
在上述方法的一个具体实施方案中，其中除了包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段外，还确定了其他的生物标志物并与所述风险相关联，“另外关联”是指通过考虑由个别生物标志物获得的癌症发展的相对风险因素而确定的生物标志物水平的组合分析。
多于一种标志物的组合分析作为一个实例在实施例5中说明。本领域技术人员知道可进行多于一种标志物或参数的组合分析的统计方法。
在上述方法的一实施方案中，速激肽原、其剪接变体或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约80pmol/L或80pmol/L以下，优选约60pmol/L或60pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约45.6pmol/L或45.6pmol/L以下，优选约40pmol/L。
在上述方法的一实施方案中，神经降压素原或其片段水平增加为阈值以上的水平，其中所述阈值为约78pmol/l PNT或78pmol/l PNT以上，优选约100pmol/l或100pmol/l以上，更优选约150pmol/l。
在上述方法的一实施方案中，脑啡肽原或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约75pmol/L或75pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约40.4pmol/L。
在上述方法的一实施方案中，胰岛素水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约70pmol/l。
阈值必须根据使用的校准方法来理解，并且上述值必须根据本文实施例1、3和4中使用的测定和校准方法来理解。
在一具体实施方案中，所述受试者为女性。在一具体实施方案中，所述受试者为女性，并且所述癌症为乳腺癌。
在一具体实施方案中，所述癌症为肺癌。
癌症的其他实例可选自乳腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。
在整个本说明书中，术语速激肽原和速激肽原A(PTA)同义使用。该术语包括速激肽原A的所有剪接变体，即αΡΤΑ、βΡΤΑ、γΡΤΑ和δΡΤΑ。在整个本说明书中，应理解术语速激肽原的片段还包含物质P和神经激肽。
术语“确定包含物质P和神经激肽的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平”通常是指确定对前述分子内区域的免疫反应性。这意味着并非必须选择性测量某一片段。应理解用于确定包含物质P和神经激肽的速激肽原或其至少5个氨基酸的片段水平的结合剂，与包含所述结合剂的结合区域的任何片段相结合。所述结合剂可为抗体或抗体片段或非IgG支架。
因此，在一实施方案中，本发明的主题为确定男性或女性获得癌症如乳腺癌、肺癌等的易感性。
马尔摩研究中获得的数据揭示了男性受试者患癌症的风险与获自所述男性受试者的体液中速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段水平之间的关联性；然而，该关联性对于当前数据集并无统计显著性，尽管在男性中也存在速激肽原、其剪接变体或其片段水平降低下癌症风险增加的明显趋势。然而，本发明的方法对于男性受试者也同样具有价值，但在本研究中，对于男性所观测到的效应相比女性并不强。这可能主要是由于男性群体中癌症发生的数目较低。
如本文所用的术语“受试者”是指活的人或非人有机体。优选地，在本文中所述受试者为人类受试者。
术语“水平降低”是指某一阈值水平以下的水平。术语“水平增加”是指某一阈值以上的水平。体液可选自血液、血清、血浆、尿液、脑脊液(csf)和唾液。
在具体实施方案中，所述体液为血液、血清或血浆。
在本发明的一实施方案中，在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者从未被诊断过患有癌症。
在另一实施方案中，在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者在先前已被诊断为患有癌症且已治愈，并且确定了患癌症复发的风险，或者预测了癌症复发。
速激肽原可具有以下序列：
SEQ ID NO.1(速激肽原A(1-107)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
体液中可确定的速激肽原的片段可以，例如选自以下片段：
SEQ ID NO.2(速激肽原1-37,P37)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA
SEQ ID NO.3(物质P)
RPKPQQFFGLM(-NH2)
SEQ ID NO.4(神经肽K)
DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.5(神经肽γ)
GHGQISHKRHKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.6(神经激肽1)
HKTDSFVGLM(-NH2)
SEQ ID NO.7(C-端侧翼肽,PTA 192-107)
ALNSVAYERSAMQNYE
SEQ ID NO.8(PTA同种型α)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO.9(PTA同种型β)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO.10(PTA同种型σ)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR
SEQ ID NO.11(PTA同种型γ)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRRSEQ
SEQ ID NO.12(PTA3-22)
GANDDLNYWSDWYDSDQIK
SEQ ID NO.13(PTA 21-36)
IKEELPEPFEHLLQRI
确定PTA、其剪接变体或其片段的水平可指确定针对包含物质P和神经激肽的PTA或其片段的免疫反应性。依赖于结合区域的用于确定PTA、其剪接变体或其片段的结合剂可结合多于一种的以上所示的分子。这对本领域技术人员是显而易见的。
根据本发明方法的更具体的实施方案中，确定了P37(PTA 1-37,SEQID NO.2,EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA)的水平。根据本发明的甚至更具体的实施方案中，如果多于一种的结合剂优先与PTA 1-37,SEQ ID NO.2,EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA内的两个不同区域相结合，则使用至少一种或两种与PTA1-37,SEQ ID NO.2,EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA相结合的结合剂。所述结合剂优选可为抗体或其结合片段。
在甚至更具体的实施方案中，使用结合剂确定分别与PTA 1-37内以下区域中的一个或两个相结合的PTA、其变体和片段：
GANDDLNYWSDWYDSDQIK PTA 3-22(SEQ ID NO.12)
IKEELPEPFEHLLQRI PTA 21-36(SEQ ID NO.13)
在具体的实施方案中，利用使用与PTA、其剪接变体或其片段相结合的抗体或抗体片段的免疫测定法，测量了PTA、其剪接变体或其片段的水平。可用于确定PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平的免疫测定法可包括实施例1中所示的步骤。所有阈值和值必须根据实施例1所用的测试和校准来理解。本领域技术人员可能知道，阈值的绝对值可受所使用的校准影响。这意味着本文给出的所有值和阈值应在本文(实施例1)中使用的校准环境下理解。
根据本发明，PTA或其他另外的生物标志物的诊断性结合剂选自抗体，如IgG(典型的全长免疫球蛋白)，或者包含至少重链和/或轻链的F-可变域的抗体片段，如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab-片段，包括Fab小体(minibodies)、单链Fab抗体、具有表位标记的单价Fab抗体如Fab-V5Sx2；以CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，如通过在异源结构域帮助下的多聚化而形成，例如经dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体抗体、(双特异性T-细胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，如来自不同于G的类别；单结构域抗体，如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。
在具体实施方案中，利用使用选自如下文中更详细描述的与PTA、其剪接变体或其片段或者另外的生物标志物相结合的适体、非-Ig支架的结合剂的测定法，测量了PTA、其剪接变体或其片段或者其他另外的生物标志物的水平。
可用于确定PTA、其剪接变体或其片段水平的结合剂显示与PTA、其剪接变体或其片段的亲和常数为至少107M-1，优选108M-1，优选亲和常数大于109M-1，最优选大于1010M-1。本领域技术人员了解，可考虑通过应用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致超出本发明的范围。可使用Biacore法确定结合亲和力，其在例如Biaffm,Kassel,Germany(http://www.biaffm.com/de/)提供服务分析。
亲和常数
为了确定抗体的亲和力，使用Biacore 2000系统(GE HealthcareEurope GmbH,Freiburg,Germany)，通过无标记的表面等离子体共振确定了PTA、其剪接变体或其片段与固定抗体的结合动力学。根据厂商的指导(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，使用以高密度与CM5传感器表面共价偶联的抗小鼠Fc抗体进行了可逆的抗体固定(Lorenz et al.,“Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus AugmentHost Immune Response and Open New Perspectives for AntibacterialTherapy”；Antimicrob Agents Chemother.2011January；55(1):165-173)。
人PTA对照样品可获自ICI-Diagnostics,Berlin,Germanyhttp://www.ici-diagnostics.com/。也可通过合成(在我们的实验中，我们使用了合成的P37,SEQ ID NO.2)或重组PTA、其剪接变体或其片段来校准测定。
根据本发明的方法，用于确定女性受试者患乳腺癌的风险或者诊断女性受试者乳腺癌的PTA、其剪接变体或其片段的阈值为100pmol/l以下，优选80pmol/L以下，优选60pmol/L以下，优选50pmol/L以下，优选45.6pmol/L以下，优选40pmol/L以下。这些阈值与上述校准方法相关。所述阈值以下的PTA值意味着所述受试者具有增加的患癌症的风险或者已患有癌症。
在本发明的一实施方案中，实施所述方法多于一次，以监测女性受试者患乳腺癌的风险或者监测治疗进程。在一具体实施方案中，进行所述监测是为了评估所述女性受试者对采用的预防性和/或治疗性措施的反应。
在本发明的一实施方案中，使用所述方法是为了将所述受试者分级为风险组。
本发明的主题还有用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法，其包含与PTA区域即氨基酸3-22(GANDDLNYWSDWYDSDQIK,SEQ ID NO.12)和氨基酸21-36(IKEELPEPFEHLLQRI,SEQ ID NO.13)中的两个不同区域相结合的两种结合剂，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
根据本发明用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法的一实施方案中，所述测定法的分析测定灵敏度能够定量健康受试者的PTA、其剪接变体或PTA片段，并且为<20pmol/，优选<10pmol/l，且更优选<5pmol/l。
根据本发明用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法的一实施方案中，这样的测定法为三明治测定法，优选完全自动化的测定法。其可为ELISA、完全自动化测定法或手动测定法。其可被称为POC-测试(即时测试)。自动化或完全自动化测定法的实例包括可用于以下系统中的一种的测定法：RocheAbbottSiemensBrahmsBiomerieuxAlere测试形式的实例在上文中提供。
根据本发明用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法的一实施方案中，为了检测而对所述两种结合剂中的至少一种进行了标记。标记的实例在上文中提供。
根据本发明用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法的一实施方案中，所述两种结合剂中的至少一种与固相结合。固相的实例为磁珠、聚苯乙稀管或微量滴定板。在一实施方案中使用了同源测定法，即使用时间分辨扩增穴合物发射(Time Resolved Amplified CryptateEmission,TRACE)技术。
根据本发明用于确定样品中的PTA、其剪接变体或片段的测定法的一实施方案中，所述标记选自化学发光标记、酶标记、荧光标记、放射性碘标记。
本发明的另一主题为试剂盒，其包含根据本发明的测定法，其中所述测定法中的组分可容纳于在一个或多个容器中。
根据任何前述实施方案，本发明的主题还有用于预测女性患癌症的风险或者鉴定受试者具有患癌症的风险增加的方法，其中可通过选自以下供选择的方法，将获自所述受试者的体液中PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平单独或组合其他预测性实验或临床参数用于预测受试者获得不良事件的风险：
●在获自“健康的”或“表面上健康的”受试者群体中的预定样品的总体中，比较所述受试者的体液中PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段水平的中值，
●在获自“健康的”或“表面上健康的”受试者群体中的预定样品的总体中，比较所述受试者的体液中PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段水平的四分位数，
●基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
根据任何前述实施方案，在本发明的一实施方案中，本发明的主题还有预测女性患癌症的风险或者鉴定受试者具有患癌症的风险增加的方法，其中获自所述受试者的体液中PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平单独或者组合其他预测性生物标志物。
这类有用的其他生物标志物可为神经降压素原及其至少5个氨基酸的片段，或者脑啡肽原及其至少5个氨基酸的片段，或者胰岛素。
根据本发明方法的一具体实施方案中，除了确定PTA、其剪接变体或其片段外，还确定了神经降压素原1-117或其片段的水平。
当在整个本申请中提及片段时，所述片段包含至少4或5个氨基酸。
因此，本发明的主题还有预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的方法，包括：
■确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■确定获自所述受试者的体液中神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■将所述PTA、其剪接变体或其片段以及神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段水平与患癌症的风险相关联，其中PTA、其剪接变体或其片段水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中PTA、其剪接变体或片段水平降低与癌症诊断相关，并且其中神经降压素原及其片段水平增加预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中神经降压素原及其片段水平增加与癌症诊断相关。
神经降压素原和片段可具有以下序列：
SEQ ID NO.14(神经降压素原1-147)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS
LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT
TYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK
IPYILKRQLY ENKPRRPYIL KRDSYYY
SEQ ID NO.15(神经降压素原1-125(较大的神经介素N))
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS
LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT
TYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVI KR KIPYIL
SEQ ID NO.16(神经介素N)
KIPYIL
SEQ ID NO.17(神经降压素)
pyroQLYENKPRRP YIL
SEQ ID NO.18(神经降压素原1-117)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS
LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT
IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVI
SEQ ID NO.19(神经降压素原1-132)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS
LVNNLNSPAE ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT
IYQLHKICHS RAFQHWELIQ EDILDTGNDK NGKEEVIKRK
IPYILKRQLY EN
SEQ ID NO.20(神经降压素原120-140)
KIPYILKRQL YENKPRRPYI L
SEQ ID NO.21(神经降压素原120-147)
KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY
SEQ ID NO.22(神经降压素原128-147)
QLYENKPRRP YILKRDSYYY
在具体的实施方案中，利用免疫测定法测量了神经降压素原的水平。更具体地，如Ernst等(Peptides(2006),(27)1787-1793)所述使用免疫测定法。可用于确定神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段水平的免疫测定法可包括如实施例3中所示的步骤。所有阈值和值必须根据实施例3使用的测试和校准来理解。本领域技术人员可能知道阈值的绝对值可受所使用的校准影响。这意味着本文给出的所有值和阈值应在本文(实施例3)使用的校准背景下理解。人神经降压素原-校准物可获自ICI-Diagnostics,Berlin,Germany。可选地，也可通过合成或重组P-NT 1-117或其片段来校准测定(同样参见Ernst et al,2006)。
可用于确定神经降压素原或其片段水平的结合剂显示对神经降压素原或其片段的亲和常数为至少107M-1，优选108M-1，优选亲和常数大于109M-1；最优选大于1010M-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过应用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致超出本发明的范围。可使用Biacore法确定结合亲和力，其在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)提供服务分析，同样参见上文。
根据本发明的方法，用于确定受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症(特别是女性受试者的乳腺癌)的阈值为约78pmol/l PNT或78pmol/lPNT以上，优选约100pmol/l或100pmol/l以上，更优选约150pmol/l或150pmol/l以上。在具体的实施方案中，所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以上。这些阈值与下文所述的校准方法相关。PNT值大于所述阈值意味着所述受试者具有患癌症的风险增加或者已患有癌症。
除了确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；和/或确定获自所述受试者的体液中神经降压素原(PNT)或其至少5个氨基酸的片段的水平；还可以测量获自所述受试者的体液中脑啡肽原(PENK)或其至少5个氨基酸的片段。必须理解，除了确定PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平外，还可测量获自所述受试者的体液中脑啡肽原(PENK)或其至少5个氨基酸的片段。这意味着测量单独的PTA或者与PENK或PNT组合的水平，或者组合确定PTA和PNT和PENK并与所述风险相关联。
根据本发明方法的更具体的实施方案中，除了确定神经降压素原1-117的水平，以及确定PTA、其剪接变体或其片段外，还确定了脑啡肽原(PENK)或其至少5个氨基酸的水平。
因此，本发明的主题还有用于预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的方法，其包括：
■确定获自所述受试者的体液中包含物质P和神经激肽的PTA、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■确定获自所述受试者的体液中神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平；和/或
■确定获自所述受试者的体液中脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■将所述PTA、其剪接变体或其片段的水平以及神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段和/或脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平与患癌症的风险相关联，
其中PTA、其剪接变体或其片段水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中PTA、其剪接变体或其片段水平降低与癌症的诊断相关联，并且其中神经降压素原及其片段水平增加预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中神经降压素原及其片段水平增加与癌症诊断相关，其中脑啡肽原或其片段水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中脑啡肽原或其片段水平降低与癌症诊断相关。
特别地，所述受试者可为女性，并且所述癌症为乳腺癌。上述生物标志物及生物标志物组合与女性乳腺癌发生之间的关联特别显著，且为所有根据本发明方法的具体实施方案。
脑啡肽原和片段可具有以下序列：
SEQ ID NO.23(脑啡肽原(1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF MRF
可在体液中确定的脑啡肽原片段可以，例如选自以下片段：
SEQ ID NO.24(合成-脑啡肽,脑啡肽原1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADENFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
SEQ ID NO.25(Met-脑啡肽)
YGGFM
SEQ ID NO.26(Leu-脑啡肽)
YGGFL
SEQ ID NO.27(脑啡肽原90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
SEQ ID NO.28(脑啡肽原119-159,中间区域的脑啡肽原-片段,MRPENK)
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
SEQ ID NO.29(Met-脑啡肽-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL
SEQ ID NO.30(脑啡肽原172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEQ ID NO.9(脑啡肽原193-203)
VGRPEWWMDYQ
SEQ ID NO.31(脑啡肽原213-234)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME
SEQ ID NO.32(脑啡肽原213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGFM
SEQ ID NO.33(Met-脑啡肽-Arg-Phe)
YGGFMRF
确定包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的水平可意指确定针对包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的免疫反应性。用于确定依赖于结合区的包含Leu-脑啡肽和Met-脑啡肽的脑啡肽原或其片段的结合剂可与多于一种如上所示的分子相结合。这对本领域技术人员是显而易见的。
根据本发明方法的更具体的实施方案中，确定了MRPENK(SEQ IDNO.28:(脑啡肽原119-159,中间区域的脑啡肽原片段,MRPENK)的水平，其为DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS。
在具体实施方案中，利用免疫测定法，使用与脑啡肽原或其片段相结合的抗体或抗体片段测量了脑啡肽原或其片段的水平。可用于确定脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段水平的免疫测定法可包括实施例4中所示的步骤。所有阈值和值必须根据实施例4使用的测试和校准来理解。本领域技术人员知道，阈值的绝对值可受所用的校准影响。这意味着本文给出的所有值和阈值应在本文使用的校准背景下理解(实施例4)。
根据本发明，脑啡肽原(和/或神经降压素原及其片段)的诊断结合剂选自：抗体，如IgG(一种典型的全长免疫球蛋白)，或包含重链和/或轻链的至少F-可变域的抗体片段，如化学偶联的抗体(抗原结合片段)，包括但不限于Fab-片段，包括Fab小体、单链Fab抗体、具表位标记的单价Fab抗体，例如Fab-V5Sx2；以CH3结构域二聚化的二价Fab(小抗体)；二价Fab或多价Fab，例如通过在异源结构域的帮助下多聚化而形成的，如经dHLX结构域的二聚化，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab')2-片段、scFv-片段、多聚化的多价或/和多特异性scFv-片段、二价和/或双特异性双体抗体、(双特异性T-细胞连接物)、三功能抗体、多价抗体，例如，来自不同于G的类别；单结构域抗体，如来源于骆驼或鱼免疫球蛋白的纳米抗体。
在具体实施方案中，利用使用选自以下更详细描述的与脑啡肽原或其片段相结合的适体、非-Ig支架的结合剂的测定法，测量了脑啡肽原或其片段(和/或神经降压素及其片段)的水平。
可用于确定脑啡肽原或其片段(和/或神经降压素原及其片段)水平的结合剂显示与脑啡肽原(和/或神经降压素原及其片段)的亲和常数为至少107M-1，优选108M-1，优选亲和常数大于109M-1，最优选大于1010M-1。本领域技术人员知道，可以考虑通过应用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和力，并且这一措施不会导致超出本发明的范围。可使用Biacore法确定结合亲和力，其在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)提供服务分析，参见上文。
人脑啡肽原对照人样品可获自ICI-Diagnostics,Berlin,Germanyhttp://www.ici-diagnostics.com/。该测定法也可通过合成(在我们的实验中，我们使用了合成的MRPENK,SEQ ID NO.28)或重组脑啡肽原或其片段来进行校准。
根据本发明的方法，用于确定受试者患癌症的风险(特别是乳腺癌症风险)或者诊断受试者癌症(特别是乳腺癌)的脑啡肽原(PENK)阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约75pmol/L或75pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约40.4pmol/L。在具体的实施方案中，所述阈值为约40.4pmol/l。这些阈值与下文所述的校准方法相关。PENK值在所述阈值以下意味着所述受试者具有增加的患癌风险或者已患有癌症。
在本发明的一实施方案中，实施所述方法多于一次，以监测受试者患癌症，特别是女性受试者患乳腺癌的风险，或者监测治疗进程。在一具体的实施方案中，进行所述监测是为了评估所述受试者对采用预防性和/或治疗性措施的反应。
在本发明的一实施方案中，使用所述方法是为了将所述受试者，特别是女性受试者分级为风险组。
根据任何前述实施方案，本发明的主题还有预测受试者患癌症(特别是女性受试者患乳腺癌)的风险，或者确定受试者(特别是女性受试者)具有患癌症(特别是乳腺癌)的风险增加的方法，其中可通过选自以下供选择的方法，将获自所述受试者的体液中速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段水平单独或组合其他预测性的实验或临床参数用于预测受试者患癌症的风险：
■在获自“健康的”或“表面上健康的”受试者群体中的预定样品总体中，比较所述受试者的体液中速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段水平的中值，
■在获自“健康的”或“表面上健康的”受试者群体中的预定样品总体中，比较所述受试者的体液中速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平的四分位数，
■基于Cox比例风险分析或通过使用风险指数计算如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
在本发明一实施方案中，为了监测受试者患癌症，特别是女性受试者患乳腺癌的风险，或者监测治疗进程，实施所述方法多于一次。在一具体实施方案中，进行所述监测是为了评估所述受试者对采用的预防性和/或治疗性措施的反应。
在本发明的一实施方案中，使用所述方法是为了将所述受试者分级为风险组。
在本发明的一实施方案中，所述癌症选自乳腺癌和肺癌。
图片说明
图1:示出了典型的PTA剂量/信号曲线。标准曲线PTA。
图2:Kaplan Meier图，示出了女性乳腺癌诊断累积四分位数(Q)1(45.6pmol/1以下)、四分位数2(45.6-55.3pmol/l)、四分位数3(55.4-65.9pmol/l)、四分位数4(65.9pmol/l以上)。PTA降低指示长期乳腺癌发展风险增加。因为排除了任何在基线(采血)当天具有癌症史的女性，PTA对于未来乳腺癌发展具有高度预测性。总之，来自Q1的女性相比来自Q4的女性具有2.1倍以上更高的发展乳腺癌的风险。
图3:示出了典型的PNT剂量/信号曲线。标准曲线PNT
图4:示出了典型的MR PENK剂量/信号曲线。标准曲线MR PENK
图5:示出了如表9中所定义的乳腺癌预测风险组的PTA与PNT的联组合分析的示例性实例。
实施例
实施例1PTA-免疫测定
抗PTA抗体的开发
用于免疫的肽/缀合物：
合成了用于免疫的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)，其具有另外的N端半胱氨酸残基，以将所述肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联。通过使用Sulfo-SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将所述肽与BSA共价连接。根据Perbio手册实施连接方案。
表1：
用于免疫的肽 PTA序列
(C)GANDDLNYWSDWYDSDQIK 3-22(SEQ ID NO.12)
(C)IKEELPEPFEHLLQRI 21-36(SEQ ID NO.13)
根据以下方法产生抗体：
在第0天和第14天以100μg肽-BSA偶联物(乳化于100μl完全弗氏佐剂中)及在第21和28天以50μg(于100μl不完全弗氏佐剂中)免疫BALB/c小鼠。在进行融合实验前3天，动物接受溶于100μl生理盐水中的50μg偶联物，其以一次腹膜内和一次静脉内注射给予。
37℃下，将来自免疫的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞用1ml 50％聚乙二醇融合30秒。洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养板。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT补充剂]中培养来选择杂交体克隆。两周后，用HT培养基更换HAT培养基传代3代，然后恢复至正常细胞培养基。
融合后3周，初步筛选细胞培养物上清液的抗原特异性IgG抗体。将检测阳性的微量培养物转移至24孔板用于增殖。重新检测后，克隆所选择的培养物，并使用限制稀释技术重新克隆，并确定同种型。
(Lane,R.D."A short-duration polyethylene glycol msiontechnique forincreasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas",J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al."Glutamatedecarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cellsexamined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibodies",Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。
单克隆抗体制备
经标准抗体制备方法(Marx et al,Monoclonal Antibody Production(1997),ATLA 25,121)来制备抗体，并通过蛋白A-色谱法进行纯化。基于SDS凝胶电泳分析的抗体纯度为>95％。
抗体标记和包被
所有抗体用吖啶酯根据以下方案进行标记：
标记的化合物(示踪物，抗PTA 3-22)：将100μg(100μl)抗体(1mg/ml,于PBS中,pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml,于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP 0353971)相混合，并在室温下孵育20分钟。通过凝胶过滤HPLC，在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化标记的抗体。将所纯化的标记抗体稀释于(300mmol/l磷酸钾,100mmol/1NaCl,10mmol/l Na-EDTA,5g/l牛血清白蛋白,pH 7.0)。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记的抗体)。通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。
固相抗体(包被的抗体)：
固相：用抗PTA 22-36抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙稀管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18小时，室温下)。管用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS(pH 7.4)洗涤并真空干燥。
PTA免疫测定：
将50μl的样品(或校准物)吸至包被的管中，在加入标记的抗体(200μl)后，将管在18-25℃下孵育2小时。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用Luminumeter LB 953(Berthold,Germany)测量管结合的标记抗体。
校准：
使用稀释于20mM K2PO4、6mM EDTA、0,5％BSA、50μΜ氨肽酶抑制剂、100μΜ亮抑酶肽,pH 8.0中的合成P37稀释剂来校准测定。PTA对照血浆可获自ICI-diagnostics(Berlin,Germany)。
图1示出了典型的PTA剂量/信号曲线。
分析测定灵敏度为(通过20次测定0-校准物(未加入PTA)产生的中值信号+2SD2标准差(SD)，从标准曲线计算相应的PTA浓度)4.4pmol/L。
实施例2群体研究/PTA
方法
我们测量了来自1991-1994年基于马尔摩膳食和癌症研究基线检查群体的2559名女性参与者(年龄58±6岁)的空腹血浆中的PTA。我们使用了多变量校准的(所有常规心血管风险因素、糖尿病风险因素，并且在癌症分析中还包括癌症遗传性)Cox比例风险模型，以将基线PTA(风险比/对数转换PTA的每个标准差增加)与超过12年的中值随访时间期间所研究终点的每一个的首次事件的时间相关联。通过瑞典国立医院出院登记、瑞典心肌梗死登记、马尔摩登记中的中风和瑞典癌症登记获取终点。验证了通过这些登记获取的终点，并发现其为准确的(同样参见Belting etal.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev；1-10.2012AACR)。通过标准实验室方法测量胰岛素。
表2
本研究中女性的临床特征：
女性群体(N＝2559)中PTA的分布：
女性群体中PTA的均值为54.3pmol/L，标准差为+/-1.4pmol/L。所有结果均落入测定的测量范围中，最低PTA浓度为9.1pmol/L。这些结果表明了所使用测定的适合性(测定灵敏度4.4pmol/L)。
乳腺癌的PTA和预测
我们评估了PTA与乳腺癌之间的关系(表3)。从评估中排除了所有先前患癌症的女性(N＝459)。女性PTA与乳腺癌之间存在强烈的关联性。在完全校准的模型中，PTA每个SD增加(我们使用了逆四分位数revPTA，参见表3/4)与未来乳腺癌风险增加28.2％相关(表3)，并且PTA的最高对最低四分位数鉴定了乳腺癌风险超过2.1倍的差异(参见表5和图2)。等式中无PTA的胰岛素与未来乳腺癌发展无显著相关性，但是令人吃惊地，如果PTA为等式的一部分，则胰岛素成为显著的(p＝0.035)。胰岛素增加与未来乳腺癌每SD降低风险34.6％相关。PTA的预测能力不受胰岛素影响。
表3
等式中的变量
表4
PTA四分位数分析：
表5:基线PTA对乳腺癌发生的多变量Cox比例风险模型
实施例3
神经降压素原测定
按上文所述产生抗体。针对P-NT 1-19(H-C SDS EEEMKALEADFLTNMH(SEQ ID NO.33))生成了用于标记(LA)的抗体，并针对肽P-NT 44-62(CNLNSPAEETGEVHEEELVA(SEQ ID NO.34)生成了固相抗体(SPA)。按上文所述进行抗体开发和制备。
用于定量人神经降压素原的免疫测定
使用的技术为基于吖啶酯标记的三明治包被的管发光免疫测定。
标记的化合物(示踪物)：将100μg(100μl)LA(1mg/ml于PBS中,pH7.4，与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml于乙腈中,InVent GmbH,Germany)(EP0353971)相混合，并在室温下孵育20分钟。通过凝胶纯化HPLC在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化标记的LA。将所纯化的LA稀释于(300mmol/l磷酸钾,100mmol/l NaCl,10mmol/lNa-EDTA,5g/l牛血清白蛋白,pH 7.0)中。终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记化合物(约20ng标记的抗体)。通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。
固相：用SPA(1.5μg SPA/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18小时，室温下)。管用5％牛血清白蛋白封闭后，用PBS(pH 7.4)洗涤并真空干燥。
校准：
使用包含神经降压素原的人血清稀释液来校准测定。用马血清(Biochrom AG,Deutschland)稀释具有高神经降压素原免疫反应性的人血清库(InVent Diagostika,Hennigsdorf,Germany)(测定标准)。
通过使用人神经降压素原-校准物(ICI-Diagnostics,Berlin,Germany)来校准标准。可选地，可通过合成或重组P-NT 1-117或其片段来校准测定(同样参见Ernst et al.,2006)。
ProNT免疫测定：
将50μl样品(或校准物)吸取至SPA包被的管中，在加入标记的LA(200μl)后，将管子18-25℃下孵育16-22小时。通过用洗涤溶液(20mmol/lPBS,pH 7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)去除未结合的示踪物。通过使用Luminometer LB 953测量管结合的LA。结果从校准曲线计算而来。图3中示出了典型的校准曲线。
实施例4:
脑啡肽原免疫测定
抗体的开发
用于免疫的肽/偶联物：
用另外的N端半胱氨酸残基合成用于免疫的肽(JPT Technologies,Berlin,Germany)，以将所述肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联。通过使用Sulfo-SMCC(Perbio-science,Bonn,Germany)将肽与BSA共价连接。根据Perbio手册实施连接方案。
表6:
用于免疫的肽 脑啡肽原-序列
(C)LKELLETG(SEQ ID NO.35) 133-140
(C)SDNEEEVS(SEQ ID NO.36) 152-159
根据以下方法产生抗体：
BALB/c小鼠在第0天和第14天以100μg肽-BSA偶联物(乳化于100μl完全弗氏佐剂中)，并在第21天和第28天以50μg(于100μl不完全弗氏佐剂)免疫。在进行融合实验前3天，动物接受溶于100μl生理盐水中的50μg偶联物，其以一次腹内和一次静脉内注射给予。
37℃下，将来自免疫的小鼠的皮细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞用1ml 50％聚乙二醇融合30秒。洗涤后，将细胞接种于96孔细胞培养板。通过在HAT培养基[RPMI 1640培养基，补充有20％胎牛血清和HAT-补充剂]中培养来选择杂合体克隆。两周后，将HAT培养基更换成HT培养基传代3代，然后恢复至正常细胞培养基。
融合后3周，初步筛选细胞培养物上清液的抗原特异性IgG抗体。将检测阳性的微量培养物转移至24孔板增殖。重新测试后，克隆所选择的培养物，并使用限制稀释技术重新克隆，并确定同种型。
(Lane,R.D."A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique forincreasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas",J.Immunol.Meth.81:223-228；(1985),Ziegler,B.et al"Glutamatedecarboxylase(GAD)is not detectable on the surface of rat islet cellsexamined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediatedcytotoxicity of monoclonal GAD antibodies",Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。
表7
单克隆抗体制备
通过标准抗体制备方法(Marx et al,Monoclonal Antibody Production(1997),ATLA 25,121)来制备抗体，并通过蛋白A-色谱法纯化。基于SDS凝胶电泳分析的抗体纯度为>95％。
抗体的标记和包被。
标记化合物(示踪物,CT-MRPENK抗体)：将100μg(100μl)抗体(1mg/ml于PBS中,pH 7.4)与10μl吖啶NHS-酯(1mg/ml于乙腈中,InVentGmbH,Germany)(EP 0353971)相混合，并在室温下孵育20分钟。通过凝胶过滤HPLC，在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化标记抗体。将所纯化的标记抗体稀释于(300mmol/l磷酸钾,100mmol/lNaCl,10mmol/l Na-EDTA,5g/l牛血清白蛋白,pH 7.0)中。终浓度为约每200μl 800.000相对光单位的(RLU)标记化合物(约20ng标记抗体)。通过使用AutoLumat LB 953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量吖啶酯化学发光。
固相抗体(包被管的抗体,MR-MRPENK抗体)：
固相：用抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl,50mmol/l Tris/HCl,pH 7.8)包被聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)(18小时，室温下)。管用5％牛血清白蛋白孵育后，用PBS(pH 7.4)洗涤并真空干燥。
脑啡肽原免疫测定：
将50μl样品(或校准物)吸至包被的管中，在加入标记抗体(200μl)后，将管在18-25℃下孵育2小时。通过用洗涤溶液(20mmol/l PBS,pH 7.4,0.1％Triton X-100)洗涤5次(每次1ml)来去除未结合的示踪物。通过使用Lummometer 953测量管结合的标记抗体。
校准：
使用稀释于20mM K2PO4、6mM EDTA、0.5％BSA、50μΜ氨肽酶抑制剂、100μΜ亮抑酶肽,pH 8.0中的稀释液的合成MRPENK来校准测定。脑啡肽原对照血浆可获自ICI-diagnostics(Berlin,Germany)。
图4示出了典型的脑啡肽原剂量/信号曲线。
测定灵敏度(20次测定0-校准物(未添加MRPENK)+2SD)为5.5pmol/L。
实施例5
用于乳腺癌预测的PTA、神经降压素原和HRT以及PTA、神经降压素原、脑啡肽原和胰岛素的组合分析
因为最近表明神经降压素原和脑啡肽原增加对乳腺癌具有高度预测性，我们将这些生物标志物组合用于乳腺癌预测。我们添加了乳腺癌已知的风险因素HRT(激素替代疗法)，以显示PTA的增加值。
首先，我们组合了PTA/神经降压素原/HRT/胰岛素：
PTA与神经降压素原之间无显著相关性(p＝0.71)。在使用PTA和PNT的包含胰岛素和激素替代疗法(HRT)的组合模型中(表8)，我们发现它们在乳腺癌预测中都是独立的。两种标志物均高度显著(PTA为p＝0.005，PNT为p<0.001)。
在完全校准的模型中，PNT每个SD增加与未来乳腺癌风险增加45.5％相关。PTA每个SD增加与未来乳腺癌风险(每SD)降低18.9％相关。
如同所预期的，HRT在同一模型中为显著的，但令人吃惊地，胰岛素在预测乳腺癌中处于优势(p＝0.027)。胰岛素每个SD增加与未来乳腺癌降低35.7％相关。
这些数据表明，PTA、PNT、胰岛素和HRT中的每一个对乳腺癌预测增加有意义的信息。表8:用于乳腺癌预测的PNT和PTA组合分析。
等式中的变量
在Kaplan Meier分析中，我们示出了PTA和PNT的组合信息，表9和图5：
我们组合了PTA和PNT的四分位数：
因为低PTA值指示乳腺癌发展的风险增加，我们逆转了PTA四分位数(revPTA)：第1四分位数PTA＝第4四分位数revPTA；第2四分位数PTA＝第3四分位数revPTA；第3四分位数PTA＝第2四分位数revPTA；第4四分位数PTA＝第1四分位数revPTA。(表9)
表9:
将PNT的最高四分位数和最低PTA四分位数(第6组)相组合，相比最低PNT四分位数和最高PTA四分位数(第1组)，显示4.9的未来乳腺癌的组合风险(参见图5)。
女性群体中PTA、脑啡肽原、HRT、胰岛素和PNT的组合分析：
PTA与脑啡肽原之间存在显著的相关性(p＝<0.001,r＝0.35)。在包含胰岛素、PTA、PNT和脑啡肽原的组合模型中，我们发现所有标志物都独立地增加乳腺癌预测信息(表10)。所有标志物均高度显著(PTA为p＝0.028，PNT为p<0.001，胰岛素为p＝0.009，且脑啡肽原为p<0.001)。PTA保持独立，尽管其与脑啡肽原高度相关。
在完全校准的模型中，PNT每个SD增加与未来乳腺癌风险增加47.8％相关。PTA增加与未来乳腺癌风险降低15.8％(每SD)相关。脑啡肽原增加与未来乳腺癌风险降低26.4％(每SD)相关，并且胰岛素增加与未来乳腺癌风险降低40.4％(每SD)相关。
这些数据显示了通过PTA、PNT、脑啡肽原和胰岛素对未来乳腺癌发展的强烈的独立和附加信息。
表10:PTA、脑啡肽原、胰岛素和PNT的组合分析。
等式中的变量
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.预测未患癌症的受试者患癌症的风险的方法，其包括：
■确定获自所述受试者体液的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■将所述速激肽原、其剪接变体或其片段的水平与患癌症的风险相关联，其中水平降低预示患癌症的风险增加。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■另外将神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段与患癌症的风险相关联，其中神经降压素原或其片段的水平增加预示患癌症的风险增加。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■另外将脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段与患癌症的风险相关联，并且其中脑啡肽原或其片段水平降低预示患癌症的风险增加。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的胰岛素的水平；以及
■另外将胰岛素与患癌症的风险相关联，其中胰岛素水平降低预示患癌症的风险增加。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中另外相关联是指通过考虑由个别生物标志物获得的癌症发展的相对风险因素而确定的生物标志物水平的组合分析。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述速激肽原、其剪接变体或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约80pmol/L或80pmol/L以下，优选约60pmol/L或60pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约45.6pmol/L或45.6pmol/L以下，优选约40pmol/L。
7.如权利要求2至6所述的方法，其中所述神经降压素原或其片段水平增加为阈值以上的水平，其中所述阈值为约78pmol/l或78pmol/l以上，优选约100pmol/l或100pmol/l以上，更优选约150pmol/l。
8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述脑啡肽原或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约75pmol/L或75pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约40.4pmol/L。
9.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述胰岛素水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约70pmol/l。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为女性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述癌症为肺癌。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者从未有过癌症诊断史。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者有过癌症诊断史且已治愈，并且确定了患癌症复发的风险或者确定了乳腺癌症复发。
15.如权利要求1至14所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者已被诊断为患有心血管疾病或糖尿病。
16.如权利要求1至15所述的方法，其中另外确定了选自包含以下组的至少一项临床参数：年龄、糖尿病存在、当前吸烟。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中使用免疫测定法测量了速激肽原、其剪接变体或其片段，以及神经降压素原或其片段，和/或脑啡肽原或其片段，和/或胰岛素的水平。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中为了监测受试者患癌症的风险或者为了监测治疗进程，实施所述方法多于一次。
19.如权利要求18所述的方法，其中为了评估所述受试者对所采用的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其是为了将所述受试者分级为风险组。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述体液为血液或血浆或血清。
22.确定样品中速激肽原、其剪接变体的或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其包含与速激肽原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，所述速激肽原区域为速激肽原1-37(SEQ ID NO.2)。
23.如权利要求22所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段，其还包含与神经降压素原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，所述神经降压素原区域为神经降压素原1-117(SEQ ID No.18)。
24.如权利要求22或23所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的脑啡肽原及脑啡肽原片段，其包含与脑啡肽原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，其中所述脑啡肽原区域为氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.23)，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
25.如权利要求22至24中任一项所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的胰岛素，其包含与胰岛素的两个不同区域相结合的两种结合剂。

Claims (25)

1.预测未患癌症的受试者患癌症的风险或者诊断受试者癌症的方法，其包括：
■确定获自所述受试者体液的速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■将所述速激肽原、其剪接变体或其片段的水平与患癌症的风险相关联，其中水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中水平降低与癌症诊断相关。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■另外将神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段与患癌症的风险相关联，其中神经降压素原或其片段的水平增加预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中神经降压素原或其片段水平增加与癌症的诊断相关。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段的水平；以及
■另外将脑啡肽原或其至少5个氨基酸的片段与患癌症的风险相关联，并且其中脑啡肽原或其片段水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中脑啡肽原或其片段水平降低与癌症的诊断相关。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
■确定获自所述受试者体液的胰岛素的水平；以及
■另外将胰岛素与患癌症的风险相关联，其中胰岛素水平降低预示患癌症的风险增加，或者诊断癌症，其中胰岛素水平降低与癌症诊断相关。
5.如权利要求2至4中任一项所述的方法，其中另外相关联是指通过考虑由个别生物标志物获得的癌症发展的相对风险因素而确定的生物标志物水平的组合分析。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述速激肽原、其剪接变体或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约80pmol/L或80pmol/L以下，优选约60pmol/L或60pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约45.6pmol/L或45.6pmol/L以下，优选约40pmol/L。
7.如权利要求2至6所述的方法，其中所述神经降压素原或其片段水平增加为阈值以上的水平，其中所述阈值为约78pmol/l或78pmol/l以上，优选约100pmol/l或100pmol/l以上，更优选约150pmol/l。
8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述脑啡肽原或其片段水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约100pmol/l或100pmol/l以下，优选约75pmol/L或75pmol/L以下，优选约50pmol/L或50pmol/L以下，优选约40.4pmol/L。
9.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中所述胰岛素水平降低为阈值以下的水平，其中所述阈值为约70pmol/l。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述受试者为女性。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌症为乳腺癌。
12.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述癌症为肺癌。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者从未有过癌症诊断史。
14.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者有过癌症诊断史且已治愈，并且确定了患癌症复发的风险或者确定了乳腺癌症复发。
15.如权利要求1至14所述的方法，其中在从所述受试者采取体液样品时，所述受试者已被诊断为患有心血管疾病或糖尿病。
16.如权利要求1至15所述的方法，其中另外确定了选自包含以下组的至少一项临床参数：年龄、糖尿病存在、当前吸烟。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中使用免疫测定法测量了速激肽原、其剪接变体或其片段，以及神经降压素原或其片段，和/或脑啡肽原或其片段，和/或胰岛素的水平。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中为了监测受试者患癌症的风险或者为了监测治疗进程，实施所述方法多于一次。
19.如权利要求18所述的方法，其中为了评估所述受试者对所采用的预防性和/或治疗性措施的反应而进行所述监测。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其是为了将所述受试者分级为风险组。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述体液为血液或血浆或血清。
22.确定样品中速激肽原、其剪接变体的或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其包含与速激肽原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，所述速激肽原区域为速激肽原1-37(SEQ ID NO.2)。
23.如权利要求22所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的神经降压素原或其至少5个氨基酸的片段，其还包含与神经降压素原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，所述神经降压素原区域为神经降压素原1-117(SEQ ID No.18)。
24.如权利要求22或23所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的脑啡肽原及脑啡肽原片段，其包含与脑啡肽原区域内的两个不同区域相结合的两种结合剂，其中所述脑啡肽原区域为氨基酸133-140(LKELLETG,SEQ ID NO.22)和氨基酸152-159(SDNEEEVS,SEQ ID NO.23)，其中所述区域中的每一个包含至少4或5个氨基酸。
25.如权利要求22至24中任一项所述的确定速激肽原、其剪接变体或其至少5个氨基酸的片段的测定法，其中所述测定法另外确定样品中的胰岛素，其包含与胰岛素的两个不同区域相结合的两种结合剂。
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