WO2018225830A1 - 肺がんの検出方法 - Google Patents

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WO2018225830A1
WO2018225830A1 PCT/JP2018/021901 JP2018021901W WO2018225830A1 WO 2018225830 A1 WO2018225830 A1 WO 2018225830A1 JP 2018021901 W JP2018021901 W JP 2018021901W WO 2018225830 A1 WO2018225830 A1 WO 2018225830A1
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kininogen
lung cancer
protein
derived
detecting
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雅光 中里
信弘 松元
拡伸 坪内
保次 有村
重久 柳
敏文 高尾
宣明 奥村
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国立大学法人宮崎大学
国立大学法人大阪大学
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    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/745—Assays involving non-enzymic blood coagulation factors

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting lung cancer.
  • lung cancer The most common cancer death in the world is lung cancer. In 2012, 1.6 million people worldwide are estimated to have died from lung cancer. In Japan, 74,000 people die from lung cancer annually, and lung cancer is the leading disease in cancer death. Lung cancer is classified into small cell lung cancer and non-small cell lung cancer, with 15% of all lung cancer patients having small cell lung cancer and the remaining 85% having non-small cell lung cancer. In addition, non-small cell lung cancer is pathologically expressed as adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, sarcoma-like cancer such as pleomorphic cancer or carcinosarcoma. Can be divided into types.
  • Lung cancer survival rate declines with clinical stage progression.
  • the 5-year survival rates are 82.0%, 66.1%, 54.5%, and 46.1%, respectively.
  • the median survival was 22.4 months (non-patent document 2) and 42.8%, respectively. 10.3 months (Non-Patent Document 3).
  • CEA Carcino embryonic antigen
  • CYFRA 21-1 cytokeratin 19 fragment
  • NSE Neuron-specific cancer
  • the positive rate of CEA in lung adenocarcinoma cases is only 36.6-56.5% (Non-Patent Documents 4-5), especially in early stage I early stage lung adenocarcinoma with a low positive rate of 27% Therefore (non-patent document 5), it is difficult to diagnose lung adenocarcinoma at a stage that can be completely cured by CEA.
  • Non-patent document 6 the positive rate of CYFRA 21-1 in lung squamous cell carcinoma cases was 57% (Non-patent document 6), and the positive rate of NSE in small cell lung cancer cases was 45% (Non-patent document 7).
  • Development of a marker capable of detecting lung cancer with higher sensitivity than the marker is required.
  • Serum CYBP (Patent Document 1), UBE2L3 (Patent Document 2), and the like are raised as tumor markers that are being developed for clinical application. However, they are invasive with blood sampling of patients as an essential condition. Such examination is required to be less invasive.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting lung cancer.
  • the inventors of the present invention are specifically observed in lung cancer patients due to an increase in fragmentation of kininogen I in body fluid, a decrease in protein having a normal structure, a break at an abnormal position of protein, and a deletion at an intermediate position. As a result of finding the exposed portion and intensively studying to establish a simple, minimally invasive or non-invasive lung cancer detection method, the present invention has been completed.
  • [Section 1] A method for detecting lung cancer, comprising a step of detecting in vitro the presence or absence of abnormal cleavage of kininogen I in a sample derived from a subject.
  • [Section 2] Abnormal cleavage of kininogen I results in cleavage that results in one or more breaks in peptide bonds in the kininogen I and / or deletion of one or more amino acid residues at one or more locations in the kininogen I Item 2.
  • Step 3 Item 1 or wherein the step of detecting in vitro the presence or absence of abnormal cleavage of kininogen I in the sample derived from the subject comprises at least one selected from the group consisting of the following (1) to (4): Method for detecting lung cancer according to 2: (1) detecting a decrease in the amount of a protein having a normal structure of the kininogen I in the specimen-derived sample; (2) detecting the amount or presence of a protein having a deletion of an amino acid residue on the C-terminal side of the kininogen I in the sample derived from the subject; (3) detecting the amount or presence of a protein having an amino acid residue deletion on the N-terminal side of the kininogen I in the specimen-derived sample; and (4) the kininogen I in the specimen-derived sample.
  • the method for detecting lung cancer according to Item 1 comprises detecting the amount or presence of at least one selected from the group consisting of the following (a) to (f): How to detect lung adenocarcinoma: (a) a protein fragment having ESNEELTESCET as the C-terminal amino acid sequence; (b) a protein fragment having IYPTVNCQPLG as the C-terminal amino acid sequence; (c) a protein fragment having TEHLASSSSEDSTTPSA as the C-terminal amino acid sequence; A protein fragment as a sequence; (e) a protein fragment having IYPTVNCQPL as the C-terminal amino acid sequence; and (f) A protein fragment having IYPTVNCQP as the C-terminal amino acid sequence.
  • the method for detecting lung cancer according to any one of Items 1 to 6, comprising a step of using at least one method selected from the group consisting of a mass spectrometry measurement method, an immunochemical measurement method, and a chromatography method.
  • the lung cancer is one non-small cell cancer selected from the group consisting of adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, pleomorphic cancer, and carcinosarcoma; or Item 8.
  • lung cancer can be detected by a minimally invasive method using body fluids such as urine and blood.
  • FIG. 1 is a graph showing the amount ratio of protein fragments having ESNEELTESCET as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a subject-derived sample (urine) from a healthy person and a lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount ratio of protein fragments having IYPTVNCQPLG as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a sample (urine) from a subject of a healthy subject and a lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 1 is a graph showing the amount ratio of protein fragments having ESNEELTESCET as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a subject-derived sample (urine) from a healthy person and a lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 2 is a diagram showing the amount ratio of protein fragments having IYPTVNCQPLG as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a
  • FIG. 3 is a graph showing the amount ratio of protein fragments having ESNEELTESCET as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a subject-derived sample (urine) of a healthy subject and an early lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount ratio of protein fragments having IYPTVNCQPLG as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a subject-derived sample (urine) from a healthy person and an early lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount ratio of protein fragments having IYPTVNCQPLG as a C-terminal amino acid sequence after in vitro treatment of a subject-derived sample (urine) from a healthy person and an early lung adenocarcinoma patient.
  • FIG. 5 is a diagram showing a chest CT image in a lung adenocarcinoma case in which a protein fragment having EYCGVPGDGDDEEL as the C-terminal amino acid sequence was found at a high value by in vitro treatment of a subject-derived sample (urine).
  • a primary lesion of about 2 cm in size with pleural invagination, bronchial transparency and ground glass shadow is observed in the upper lobe S1 of the right lung.
  • FIG. 6 is a diagram showing a PET-CT chest image in the same patient as FIG. Abnormal accumulation of PET is observed in agreement with the primary lesion found in the chest CT examination.
  • FIG. 6 is a diagram showing a PET-CT chest image in the same patient as FIG. Abnormal accumulation of PET is observed in agreement with the primary lesion found in the chest CT examination.
  • FIG. 7 is a lung adenocarcinoma tissue image (immunohistochemiluminescence using HE staining and anti-TTF-1 antibody) collected by transbronchial biopsy in the same patient as FIG.
  • FIG. 8 is a graph (a) showing a change over time in the kininogen I fragmentation rate in a lung adenocarcinoma case, and a diagram (b) showing a chest CT image and a PET-CT image of the same case.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in the fragmentation rate before and after surgery in early lung adenocarcinoma cases.
  • FIG. 10 is a view showing a chest CT image in a case of stage IV lung adenocarcinoma positive for epidermal-growth-factor-receptor (EGFR) gene mutation.
  • EGFR epidermal-growth-factor-receptor
  • the lung cancer detection method of the present invention is based on a new discovery by the present inventors. That is, the present inventors have found that kininogen I is cleaved at a place where it is not cleaved by a healthy person in the body of a lung cancer patient, resulting in an increase in various types of deficient proteins or proteins with breaks. Found that there may be.
  • the abnormal cleavage of kininogen I may be due to the presence of a lung cancer specific protease. Therefore, the present invention can be evaluated in vitro by distinguishing healthy individuals from lung cancer patients using such kininogen I breaks and defects due to such abnormal cleavage as an index in vitro. On the other hand, it is possible to evaluate the enhancement of abnormal cleavage of kininogen I by distinguishing between healthy subjects and lung cancer patients using a decrease in the amount of normal protein (including a relative quantitative ratio) as an index.
  • the present invention is a method for detecting lung cancer comprising a step of detecting in vitro the presence or absence of abnormal cleavage of kininogen I in a sample derived from a subject.
  • abnormal cleavage of kininogen I results in a primary structure, secondary structure, or tertiary structure different from the normal structure of kininogen I, although not limited thereto. For example, cleavage that results in one or more breaks in peptide bonds in kininogen I, cleavage that results in the deletion of one or more amino acid residues at one or more sites in kininogen I, and the like.
  • a protein having a deletion of an amino acid residue on the C-terminal side of kininogen I or a protein having a deletion of an amino acid residue on the N-terminal side of kininogen I can be generated by “abnormal cleavage”.
  • “abnormal cleavage” results in the breaking of peptide bonds between amino acid residues in the protein or the loss of amino acids at any intermediate position.
  • abnormal cleavage of kininogen I
  • the peptide bond is broken to expose the amino acid residue at the new cleavage site, but the amino acid may not be lost from the original protein due to a disulfide bond or the like. is there.
  • the kininogen I deficiency or fragmentation may not occur in an untreated sample taken from the living body.
  • the abnormal cutting of the present invention includes such cutting. Or, in this way, for example, the original protein retains the binding state due to, for example, a disulfide bond, but the peptide bond is broken, and one or more amino acid residues are further lost therefrom. In some cases, amino acid residues in the protein are missing at any intermediate position.
  • the “subject” refers to a mammal that is a detection target of cancer, and is preferably, but not limited to, a dog, a cat, a mouse, or a human.
  • lung cancer refers to cancer that occurs in any tissue of the lung.
  • Lung cancer is one non-small cell cancer selected from the group consisting of adenocarcinoma, squamous cell carcinoma, large cell carcinoma, adenosquamous cell carcinoma, pleomorphic cancer, and carcinosarcoma; or small Can be cell lung cancer.
  • lung adenocarcinoma refers to cancer that occurs in the secretory gland tissue of the lung.
  • lung cancer may be in any stage of clinical stage IA, IB, IIA, IIB and IIIA, clinical stage IIIB and stage IV.
  • early lung cancer it refers to any of clinical stage IA, IB, IIA, and IIB.
  • the “detection of lung cancer” of the present invention may be detection for assisting diagnosis of the presence or absence of lung cancer.
  • “detection of lung cancer” refers to the detection of the presence or extent of lung cancer, the presence or absence of recurrence, or the presence or absence of therapeutic effects such as lung cancer surgery or anticancer drug treatment. Includes any detection.
  • recurrence includes recurrence after surgery or anticancer drug treatment.
  • the presence or absence of a therapeutic effect and the degree of therapeutic success are typically found by reducing cancer. According to the method of the present invention, these detections can be easily performed. That is, “abnormal cleavage” of kininogen I of the present invention can be found with lung cancer.
  • the rate of abnormal cleavage of kininogen I may increase as lung cancer progresses. Furthermore, abnormal cuts of kininogen I may be found or increased with the recurrence of lung cancer. Furthermore, abnormal cuts of kininogen I can be reduced with successful lung cancer surgery and anticancer drug treatment.
  • subject-derived sample refers to a body fluid derived from a subject, and refers to a body fluid itself, a concentrated fluid of a body fluid, a diluted solution, or other appropriately processed liquid.
  • the body fluid refers to, for example, urine, blood (whole blood, plasma, serum), sputum, sweat, cerebrospinal fluid, digestive fluid, and ascites, although not limited thereto.
  • the body fluid is urine or blood, particularly preferably urine.
  • the urine can be any of early morning intermediate urine, accumulated urine, and occasional urine.
  • the collection amount of body fluid such as urine and blood is 10 ⁇ l to 200 ml, preferably 100 ⁇ l to 100 ml, more preferably 1 ml to 100 ml.
  • the treatment of bodily fluid refers more specifically to pretreatment such as concentration, dilution, fractionation, desalting, preservatives such as glycerin, stabilizers such as protease inhibitors, addition of preservatives, and the like. . It includes returning to room temperature after refrigeration or freezing treatment, and performing appropriate treatment either before or after refrigeration or freezing treatment. Furthermore, for example, when the body fluid is blood, an anticoagulant treatment can be performed as an appropriate treatment. It is also possible to combine these processes.
  • concentration When the body fluid is urine, it is preferable to perform an operation including concentration as a pretreatment before the measurement.
  • concentration method is not particularly limited, and examples thereof include a method using an ultrafiltration membrane having a fractional molecular weight, freeze concentration, reduced pressure or vacuum concentration, and heating.
  • the molecular weight cut off is not limited, and any value such as 3 kD, 10 kD, 30 kD, 50 kD can be used.
  • the concentration of the total protein amount in the raw urine is about 0.001 g / dL to 0.6 g / dL, so concentration is a useful pretreatment.
  • Raw urine can be concentrated 200-250 times and used for analysis. This concentrated solution can be used for the measurement as it is, but the total protein amount can be further diluted and adjusted for the measurement.
  • the concentration can be adjusted to about 0.1 ⁇ g to 10 ⁇ g / ⁇ l for use in the measurement.
  • Vivaspin registered trademark, manufactured by Sartorius Japan Co., Ltd.
  • Amicon Ultra manufactured by Merck Millipore
  • Dilution can be performed using distilled water or a buffer solution, and can also be used to adjust concentrated urine.
  • the kininogen I deficiency is not particularly limited in size or length as long as the amino acid residues at the C-terminal part, N-terminal part, or intermediate position of the derived full-length protein are deleted when compared by primary structure.
  • a defect in the C-terminal part, N-terminal part or intermediate position means that the C-terminal side or N-terminal side is usually shorter than the protein of the unit in which the protein normally functions, or should be present in the intermediate position It means that the residue is missing.
  • each notation symbol means a normal letter used as a one-letter code of an amino acid residue.
  • the step of detecting in vitro the presence or absence of abnormal cleavage of kininogen I in a sample derived from a subject is not limited, but is preferably selected from the group consisting of the following (1) to (4)
  • the process may include at least one of the following.
  • a decrease in the amount of protein having a normal structure of one or more kininogen I in a sample derived from a subject is detected.
  • the amount of kininogen I having a normal structure is measured by the presence or absence of the amino acid sequence at the C-terminal part and / or the N-terminal part of the kininogen I. It can be detected whether or not the amount is relatively decreased compared to a healthy person.
  • another embodiment of the lung cancer detection method of the present invention includes detecting a protein fragment of kininogen I in vitro using a subject-derived sample.
  • detection of protein fragments can be detection of protein fragments present in a fragmented state in the sample derived from the analyte and / or protein fragments generated after, for example, subjecting the sample derived from the sample to reduction treatment or the like. .
  • the protein fragment of kininogen I is derived from a protein having a defect on the C-terminal side compared to the full length of the protein or an intermediate site. It is preferably a fragment derived from a protein having a cut and / or amino acid deficiency.
  • a protein fragment having ESNEELTESCET as a C-terminal amino acid sequence a protein fragment having IYPTVNCQPLG as a C-terminal amino acid sequence
  • a protein fragment having TEHLASSEDSTTPSA as the C-terminal amino acid sequence and the like.
  • the full-length protein has a missing (absent) amino acid residue that was originally present on the C-terminal side of T shown at the right end. It means that an amino acid residue may or may not exist from the first E to the N-terminal side.
  • the protein fragment of kininogen I is preferably at least one selected from the group consisting of: (a) a protein fragment having ESNEELTESCET as the C-terminal amino acid sequence (also referred to herein as P1); (b) a protein fragment having IYPTVNCQPLG as the C-terminal amino acid sequence (also referred to herein as P2); (c) a protein fragment having TEHLASSEDSTTPSA as the C-terminal amino acid sequence; (d) a protein fragment having IYPTVNCQPLGMIS as the C-terminal amino acid sequence; (e) a protein fragment having IYPTVNCQPL as the C-terminal amino acid sequence; and (f) A protein fragment having IYPTVNCQP as the C-terminal amino acid sequence.
  • early lung cancer such as early lung adenocarcinoma can be detected by measuring in vitro at least one selected from the group consisting of such kininogen I protein fragments.
  • the number of amino acid residues in the protein fragment of kininogen I is not particularly limited, but is preferably at least 10 residues, more preferably at least 50 residues.
  • the upper limit of the size of the protein fragment is not particularly limited, and is less than the size of the full-length protein from which each protein fragment is derived.
  • it is a protein fragment having a structure in which the C-terminal side is deleted as compared to the full-length protein from which each protein fragment is derived.
  • the protein fragment is not particularly limited as long as it is less than the full length, but in some cases, it may be present as a short fragment of 200 residues or less, preferably 100 residues or less.
  • detecting the presence of a protein having a deletion of amino acid residues on the N-terminal side of kininogen I in a sample derived from a subject or an increase in relative amount thereof; or an arbitrary amino acid sequence for kininogen I in a sample derived from a sample It is also possible to detect C-terminal free protein fragments lacking the N-terminal side in order to detect the presence of an intermediate site cleavage or deletion or an increase in the relative amount. By detecting such a fragment, the protein fragments (a) to (f) can be indirectly detected, or the presence of a protein fragment in which the N-terminus is deleted in vivo can be detected. .
  • the molecular weight of the kininogen I protein fragment of the present invention is not limited as long as it is less than the full-length protein. However, depending on the method of detecting lung cancer using a specimen such as urine, for example, it is 3 kDa or more and less than full length, preferably 10 kDa or more and less than full length.
  • these kininogen I protein fragments include those that have undergone post-translational modifications such as glycosylation and phosphorylation as long as they have the above sequences.
  • sequence of the protein fragment of kininogen I will be described with reference to a specific sequence (SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing) included in a specific database.
  • sequences and sequences may vary from individual to individual, and the listed sequences may vary from database to database.
  • sequences are for purposes of illustration and are not intended to limit the invention.
  • kininogen I is a protein that plays an important role in the kallikrein-kinin system.
  • This metabolic system is a series of in vivo reaction systems that generate kinins having various physiological activities.
  • the kallikrein-kinin system is involved in the regulation of biological functions in relation to various enzyme reaction systems in vivo, such as the renin-angiotensin-aldosterone system and the blood coagulation system.
  • the products kinins such as bradykinin exhibit various physiological activities such as hypotension associated with peripheral vasodilation, increased vascular permeability, contraction or relaxation of smooth muscle, pain, and leukocyte migration.
  • Kininogen I is a protein that is a precursor of this kinin and is one of endogenous blood coagulation factors. It exists in female genitals at very high concentrations, and by releasing bradykinin, it is said to play an important role in pregnancy and delivery through the kallikrein-kinin system. A relationship with infertility has also been suggested.
  • Kininogen I has, for example, the sequence of UniProtKB-P01042 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) or the sequence of UniProtKB-P01042-2 (SEQ ID NO: 2 in the sequence listing) as a precursor sequence.
  • Kininogen I has several typical isoforms (high molecular weight type and low molecular weight type).
  • the high molecular weight type (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) is synthesized as a precursor consisting of 644 amino acids and amino acid numbers 1 to 18 are signal peptides.
  • the mature form (amino acid numbers 19 to 644) is further processed into a heavy chain (amino acids 19 to 380) and a light chain (amino acids 390 to 644), and bradykinin (amino acids 381 to 389). )).
  • cleavage into T-kinin (amino acid numbers 376 to 389) or lysyl bradykinin (positions 380 to 389), cleavage into low molecular weight growth-promoting factor (GPF) (amino acid numbers 431 to 434)
  • GPF low molecular weight growth-promoting factor
  • SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is the same as the high molecular weight type in the heavy chain and bradykinin part sequences, but the light chain sequence.
  • the sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is a sequence in which positions 189 to 224 of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing are deleted.
  • SEQ ID NO: 4 The sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is In the sequence shown in SEQ ID NO: 2, positions 1 to 153 are substituted with 17 amino acids, and Met at position 177 is substituted with Thr. It is known that none of the low molecular weight types are related to the blood coagulation system. In the present specification, an example of a high molecular weight type is disclosed in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing, and an example of a low molecular type is disclosed in SEQ ID NOS: 2 to 4 of the sequence listing.
  • kininogen I As used herein, “a protein having a normal structure of kininogen I” and “kininogen I having a normal structure” are mature forms (amino acids at positions 19 to 644 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, SEQ ID NO: in the sequence listing).
  • amino acids 19 to 427 in SEQ ID NO: 2 amino acids 19 to 391 in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing, amino acids 1 to 291 in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing), heavy chain (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) Or, when 2 is used as a reference, amino acids 19 to 380 of amino acid numbers), light chain (amino acids 390 to 644 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing) or amino acid 390 positions of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Amino acid at position 427, or corresponding position of SEQ ID NO: 3 to 4 in the sequence listing), bradykinin (amino acid positions 381 to 3 in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing) 9 the amino acid at position, or release the corresponding portion) of SEQ ID NO: 3-4 of the Sequence Listing.
  • T-kinin amino acids from positions 376 to 389 in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing
  • lysyl bradykinin amino acids from positions 380 to 389 in SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing
  • GPF low molecular weight growth-promoting factor
  • cleavage at an abnormal position refers to cleavage into a signal peptide and mature form, heavy chain, light chain, bradykinin, T-kinin, lysyl bradykinin, and low molecular weight growth-promoting factor (GPF).
  • Cleavage other than the chain selected from the group consisting of: When it is cleaved by an enzyme that increases its activity in lung cancer, such as matrix metalloprotease group, it may cleave at a cleavage site that does not occur originally, and secondary fragmentation and amino acid deficiency may be enhanced. Conceivable.
  • the kininogen I protein fragment that can be detected as an example of the abnormal cleavage referred to in the present specification is the same as the amino acid residue at position 342 to the amino acid residue at position 342 when described in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2 in the sequence listing. It may be a protein fragment that has a C-terminal portion to be deleted and that lacks the C-terminal side from position 343 onwards. Furthermore, the kininogen I protein fragment that can be detected as another example of the abnormal cleavage referred to in the present specification is the amino acid residue at position 374 from the amino acid residue at position 364 as described in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the kininogen I protein fragment that can be detected as an example of abnormal cleavage referred to in the present specification is represented by the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It may be a protein fragment that has a C-terminal part that matches the residue and lacks the C-terminal side from position 537 onwards. In still another aspect, the kininogen I protein fragment that can be detected as another example of the abnormal cleavage referred to herein is 377 from the amino acid residue at position 364 as described in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the kininogen I protein fragment that can be detected as another example of the abnormal cleavage referred to in the present specification is 373 from the amino acid residue at position 364 described in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. It may be a protein fragment that has a C-terminal portion that coincides with the amino acid residue at the position and lacks the C-terminal side from position 374 onwards.
  • the kininogen I protein fragment that can be detected as another example of abnormal cleavage referred to in the present specification is the amino acid residue at position 364 as described in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2. Or a protein fragment having a C-terminal portion that matches the amino acid residue at position 372 and lacking the C-terminal side from position 373 onward.
  • the amount of kininogen I having a normal structure or the presence thereof, the amount of kininogen I protein fragment or the presence thereof is a mass of those contained in a body fluid as a sample derived from a subject. , Molecular weight, or concentration. Further, it can be expressed by fluorescence intensity, absorbance, MS / MS spectrum intensity, and the like.
  • the detection method in the present invention is not particularly limited as long as it is a method for detecting abnormal cleavage or a method for detecting a protein having a normal structure contained in a sample derived from a subject.
  • a method of detecting by mass spectrometry a method of detecting by an immunochemical measurement method using an antibody (radioimmunoassay, enzyme immunoassay, Western blotting, etc.) can be mentioned.
  • the method by mass spectrometry is not particularly limited as long as it is a method for detecting a kininogen I having a normal structure in a sample derived from a specimen or a protein fragment of kininogen I derived from abnormal cleavage.
  • a sample is collected, enzymatically digested after pretreatment and / or reduction treatment, labeled with an isotope, etc., and then the amount of only the peptide derived from the C terminus is measured by MS / MS. .
  • the sample derived from the subject is urine
  • urine is collected
  • a sample obtained by concentrating the urine sample is obtained as a pretreatment
  • the concentrated sample is subjected to reductive alkylation.
  • a peptide derived from a trypsin-digested fragment can be labeled with a stable isotope by digestion with trypsin in the presence of 2 18 O. Then, after desalting and purification by ion exchange chromatography, only the trypsin-digested peptide derived from the C terminus is measured by Nano-LC-MALDI-MS / MS.
  • a protein having a normal structure or a kininogen I protein fragment derived from an abnormal cleavage can be distinguished and detected.
  • the N-terminus of all digested peptides is subjected to phenyl isocyanate or TMPP reagent (N-Succinimidyloxycarbonyl-methyl) tris (2, 4, 6-
  • TMPP reagent N-Succinimidyloxycarbonyl-methyl
  • a high performance liquid chromatography / triple quadrupole mass spectrometer QTRAP® 5500 System
  • LCMS-8030 manufactured by Shimadzu Corporation
  • the amino acid exposure part derived from abnormal cleavage, the C-terminal part of the protein fragment of kininogen I, or a specific amino acid deletion part is specifically recognized and has a corresponding normal structure. It is desirable to use antibodies that can be distinguished from proteins.
  • the amount of kininogen I having a normal structure or the amount of kininogen I protein fragment in the sample derived from the subject can be compared with the abundance of all the proteins derived from kininogen I coexisting in the sample, and can also be expressed as a relative ratio. .
  • the abundance of protein fragments in the sample derived from the subject can be compared with the total amount of protein in the sample derived from the sample, and expressed as a relative ratio of the amount of fragments to the total amount of protein.
  • the presence or absence of abnormal cleavage in kininogen I is determined by calculating the fragmentation rate of kininogen I in the sample and determining whether the value exceeds a threshold value. be able to. That is, when the protein fragmentation rate of kininogen I exceeds the threshold, it can be grasped that the derived subject is a lung gland cancer.
  • the fragmentation rate (F n ) of kininogen I is obtained by the following calculation formula, and the fragmentation rate of the patient sample is 1. A thing 5 times or more high can be made positive.
  • Protein fragmentation factor (F n) C n / I n C n : amount of each kininogen I protein fragment I n : total amount of protein derived from kininogen I protein
  • the amount of fragmentation of the kininogen I in C n refers to an amount of one kininogen I protein fragments (e.g., (a) the amount of any one protein fragment of ⁇ (f)).
  • the amount of the original protein in the I n refers to (a) any one of the protein fragments ⁇ (f), including full length proteins with normal structure, the total amount of kininogen I derived protein in a sample.
  • the amount of C n or I n are both can be detected for example by measurement of the amount of tryptic peptides.
  • I n can be indicated by the amount of tryptic peptides contained in common to kininogen I having a normal structure in kininogen I protein fragments. The measurement method conforms to the conditions described in Example 5.
  • sequences included in common are not limited, but the following sequences can be used.
  • YFIDFVAR positions 317 to 324 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the subject is determined to be a lung cancer patient.
  • the significant decrease is, for example, 0.9 times or less, preferably 0.8 times or less, more preferably, as a relative ratio of the protein having the normal structure as compared with a healthy subject sample. , 0.6 or less.
  • the reduction in the amount that can be recognized from the intensity of the label or the like is 0.8 times or less, preferably about 0.6 times or less, compared to a healthy subject sample.
  • the subject is determined to be a lung cancer patient.
  • the significant increase is, for example, 1.25 times or more, preferably 1.5 times or more, more preferably 2.0 times or more, as an MS / MS spectrum area, compared with a healthy subject sample. It means that it becomes the strength of.
  • the increase in the amount of protein fragment that can be recognized from the label intensity or the like is a value exceeding 1, preferably 1.2 or more, more preferably 1.5 It means that it becomes about the above.
  • the amount of kininogen I having a normal structure or the amount of kininogen I protein fragment in a sample derived from a healthy subject can be determined according to the preparation of the sample derived from the subject and the measurement method.
  • the step of detecting abnormal cleavage in vitro comprises reducing the amount of protein having a normal structure derived from kininogen I and / or a protein derived from kininogen I present in a sample. Including detecting the amount or presence of fragments.
  • the present invention can also provide an antibody composition for detecting lung cancer comprising an antibody capable of measuring a kininogen I protein fragment in a sample derived from a subject.
  • the antibody for measuring the kininogen I protein fragment is not limited as long as it is an antibody that can recognize the kininogen I protein fragment, but preferably, it can specifically recognize the C-terminal cleavage of the kininogen I protein fragment, and It is an antibody that does not recognize other proteins such as full-length proteins.
  • the antibody may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody as long as it can specifically recognize the kininogen I protein fragment. These antibodies may be immobilized on a solid phase.
  • the present invention also relates to a lung cancer detection program.
  • the lung cancer detection program compares the data based on the expression level of the protein fragment derived from abnormal cleavage derived from kininogen I in the sample derived from the subject with the expression level data of kininogen I detected as normal cleavage. By comparison, lung cancer can be detected on the basis that the amount of peptide derived from the abnormal cleavage of the kininogen I protein in the sample derived from the subject is higher than the normal value.
  • the present invention also relates to another aspect of a lung cancer detection program.
  • the lung cancer detection program includes a comparison step of comparing expression level data of one or more proteolytic enzyme-digested peptides derived from kininogen I in a sample derived from a subject with a normal value.
  • the program may be a lung cancer detection program that detects lung cancer on the basis of being lower than a normal value.
  • the proteolytic enzyme is not limited, and may be trypsin, for example.
  • the expression level data of the digested peptide is compared with a normal value, and abnormal cleavage of the kininogen I protein in the sample derived from the subject occurs in the proteolytic enzyme digested peptide. If so, lung cancer can be detected on the basis that the amount of the peptide is lower than the normal value.
  • the expression level data of a digested peptide by a proteolytic enzyme such as trypsin can be expressed by a ratio with the expression level data of a trypsin digested peptide used as an internal standard.
  • the method comprises the step of comparing the expression level data of two or more proteolytic enzyme-digested peptides derived from kininogen I with each other, the abnormal cleavage of the kininogen I protein in the sample from the subject
  • lung cancer can be detected on the basis that the amount of the peptide is lower than the amount of other peptides.
  • the expression level data of a digested peptide by a proteolytic enzyme such as trypsin can be expressed by a ratio with the expression level data of a trypsin digested peptide used as an internal standard.
  • at least one of the digested peptides may be a peptide used for an internal standard.
  • each element including the definition of a protein fragment derived from abnormal cleavage derived from kininogen I conforms to the content described in the above [Lung cancer detection method].
  • Example 1 Collection of body fluid Among patients with intrapulmonary nodule shadow or tumor shadow suspected of primary lung cancer in chest imaging examination, lung gland is detected by surgery, transbronchial biopsy, lymph node biopsy or cytology Patients who were diagnosed with cancer were selected. Early morning intermediate urine was collected from selected lung adenocarcinoma patients and healthy individuals using a sterile cup. The collected urine samples were stored at ⁇ 80 ° C. until analysis.
  • the C-terminal protein fragments of urine from 124 cases of lung adenocarcinoma and 66 healthy subjects were comprehensively analyzed.
  • the clinical stage breakdown of lung adenocarcinoma cases was 46 cases of stage IA, 15 cases of stage IB, 1 case of stage IIA, 1 case of stage IIB, 8 cases of stage IIIA, 8 cases of stage IIIb and 45 cases of stage IV.
  • the clinical stage was determined according to the criteria described in the Japanese Lung Association edited by “Lung Cancer Handling Rules 7th Edition” (Kanehara Publishing Co., Ltd.).
  • Stage IA and stage IB lung adenocarcinoma cases were defined as early lung adenocarcinoma cases.
  • Example 2 Detection by mass spectrometry A urine sample ( ⁇ 50 mL) was collected, and marker search was performed by the procedures of pretreatment, analysis data acquisition, and statistical analysis. Two types (Table 1 and Table 2) were identified as lung adenocarcinoma diagnostic markers and early lung adenocarcinoma diagnostic markers.
  • Example 3 Evaluation method of lung adenocarcinoma Surgery, lung biopsy, lymph node biopsy, bone biopsy, etc. among patients with intrapulmonary nodule or tumor shadow suspected of primary lung cancer in chest imaging Lung adenocarcinoma was diagnosed by histological diagnosis and cytology of sputum and pleural effusion.
  • evaluation method of lung adenocarcinoma Surgery, lung biopsy, lymph node biopsy, bone biopsy, etc. among patients with intrapulmonary nodule or tumor shadow suspected of primary lung cancer in chest imaging Lung adenocarcinoma was diagnosed by histological diagnosis and cytology of sputum and pleural effusion.
  • imaging examination by head MRI examination and chest CT examination, bone biopsy, lymph node aspiration cytology or pleural effusion cytology examination was used.
  • Example 2 In a pulmonary adenocarcinoma case in which the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I in urine having a high value in Example 2 showed a high value in Example 2, a chest CT examination showed a 2 cm-sized nodule shadow in the upper right lobe (FIG. 5). ), An abnormal accumulation was observed in the PET-CT examination (FIG. 6). Lung adenocarcinoma that was positive for thyroid transcription factor-1 (TTF-1) was detected from the tissue obtained by transbronchial biopsy (FIG. 7). In this case, the spectrum area of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQPLG was 11.46 times the average value of healthy subjects.
  • TTF-1 thyroid transcription factor-1
  • Example 4 Comparison of usefulness with CEA in diagnosis of lung adenocarcinoma Of 124 cases diagnosed as lung adenocarcinoma (Example 1), 116 cases of lung adenocarcinoma with confirmed blood CEA levels Compared the usefulness of CEA with urine protein fragments. For example, when a protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQPLG showing positive 1.5 times the average value of healthy subjects is positive in Example 2, It was possible to judge that 61 cases were positive. On the other hand, when the blood CEA reference value was 8.0 ng / ml, only 45 cases out of 116 cases of lung adenocarcinoma were positive.
  • Example 5 Screening A specimen was prepared and subjected to the MRM method to screen lung adenocarcinoma patients.
  • Urine samples ( ⁇ 50 mL) were collected and pre-processing and analytical data acquisition and analysis were performed. Specifically, the urine sample is concentrated 200 to 250 times using Amicon Ultra-15 (10 kDa molecular weight cut) and Amicon Ultra-4 (10 kDa molecular weight cut) (Merck Millipore) by pretreatment, and low molecular weight Was removed by washing to obtain a concentrated specimen. Protein quantification of this concentrated specimen was performed, and for all specimens, the total protein amount was adjusted to a concentration of 10 mg / mL using a buffer and used in the subsequent analysis step.
  • Each sample thus obtained is separately subjected to high performance liquid chromatography / triple quadrupole mass spectrometer (QTRAP (R) 5500 System (ABC)) or Agilent 6470 LC / MS / MS System)
  • the peptide was quantified by MRM (Multiple Reaction Monitoring) simultaneously with separation of the mixture.
  • the fragmentation rate (F n ) of each protein was determined by the following calculation formula, and a patient sample with a fragmentation rate higher by 1.5 times or more than the average value of the healthy subject group was regarded as positive.
  • Protein fragmentation factor (F n) C n / I n C n : amount of each protein fragment (amount of peptide in the protein fragment sequence of (a) to (f)) I n: amount of the original protein from each protein fragment
  • the amount of C-terminal fragments of the protein in C n refers to the amount of kininogen I protein fragments.
  • the amount of the original protein in the I n refers to the amount of tryptic peptides contained in common in the protein fragment or the full length protein. (The commonly used trypsin-digested peptide is YFIDFVAR).
  • Urine samples from 124 cases of lung adenocarcinoma and 66 healthy subjects were subjected to the MRM method, and the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as ESNEELTESCET was measured.
  • a patient sample having a fragmentation rate higher by 1.25 times or more than the average value of the healthy group was positive, 8 healthy persons were positive and 61 cases of lung adenocarcinoma were positive.
  • the fragmentation rate is 1.5 times the average value of the healthy group, 8 healthy individuals are positive and 53 lung adenocarcinoma are positive, and the sensitivity at the reference value is 42.74. %, Specificity was 87.88%, and ROC-AUC value was 0.766.
  • urine samples of 124 cases of lung adenocarcinoma and 66 healthy subjects were subjected to the MRM method, and the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQPLG was measured.
  • a patient sample with a fragmentation rate higher by 1.25 times or more than the average value of the healthy group was positive, 7 healthy persons were positive and 78 cases of lung adenocarcinoma were positive.
  • the fragmentation rate is 1.5 times the average value of the group of healthy subjects, 5 healthy subjects are positive and 68 cases of lung adenocarcinoma are positive.
  • the sensitivity at the reference value is the reference value. The sensitivity was 54.84%, the specificity was 92.42%, and the ROC-AUC value was 0.814.
  • the urine samples of 61 cases of early stage IA and IB early stage lung adenocarcinoma and 66 healthy subjects were subjected to the MRM method, and the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as ESNEELTESCET was measured.
  • a patient sample having a fragmentation rate higher by 1.25 times or more than the average value of the healthy group was positive, 8 healthy persons were positive and 21 early-stage lung adenocarcinoma were positive.
  • the fragmentation rate is 1.5 times the average value of the group of healthy subjects, 8 healthy subjects are positive and 18 early stage lung adenocarcinoma are positive.
  • the sensitivity at the reference value is 29. 51%, specificity was 87.88%, and ROC-AUC value was 0.676.
  • Example 6 Detection by mass spectrometry A urine sample ( ⁇ 50 mL) was collected, and a marker for kininogen 1 was searched for by pretreatment, analysis data acquisition, and statistical analysis.
  • the urine sample was concentrated 200 to 250 times using Amicon Ultra-15 (10 kDa molecular weight cut) and Amicon Ultra-4 (10 kDa molecular weight cut) (Merck Millipore), and triethyl hydrogen carbonate containing 100 mM NaCl was used. After washing with 3 mL of an aqueous ammonium solution three times to remove low molecules, a concentrated specimen was obtained.
  • Protein quantification of this concentrated sample was performed, and all samples were adjusted to a total protein amount of 10 mg / mL using a buffer solution and used in the subsequent analysis process. Subsequently, after reductive alkylation, the sample was trypsin-digested in a buffer prepared using a constant concentration of H 2 18 O (stable isotope labeling method for peptide C-terminal). After desalting and purification, labeling with iTRAQ (8-plex, ABC SEX) was performed, and 8 samples were mixed, desalted and purified, and then only C-terminal trypsin-digested peptides derived from protein fragments were subjected to ion exchange chromatography.
  • iTRAQ 8-plex, ABC SEX
  • Nano-LC LC column: inner diameter 75 ⁇ m, length 100 mm, filler Inertsil C18 (particle diameter 3 ⁇ m); flow rate: 250 nL / min; solvent: 0.1% trifluoroacetic acid in water (By separation with an acetonitrile concentration gradient (3-80%)) / MALDI-MS / MS (Abbexix) to select and extract only C-terminal trypsin-digested peptides (originally developed program “iSpec”; literature : Fernandez-de-Cossio J., Takao T. et al. Rapid Commun. Mass Spectrom.18, 2465-2472 (2004)).
  • Example 7 Statistical analysis 58 cases of lung adenocarcinoma (stage IA 5 cases, stage IB 1 case, stage IIIA 3 cases, stage IIIb 8 cases and stage IV 41 cases), benign respiratory disease 30 cases (bronchial asthma, Empyema, pulmonary fluke, nontuberculous mycobacterial disease, interstitial pneumonia, chronic obstructive pulmonary disease, sarcoidosis, inflammatory pseudotumor, bacterial pneumonia, allergic bronchopulmonary aspergillosis) and 25 healthy subjects
  • bronchial asthma, Empyema, pulmonary fluke, nontuberculous mycobacterial disease, interstitial pneumonia, chronic obstructive pulmonary disease, sarcoidosis, inflammatory pseudotumor, bacterial pneumonia, allergic bronchopulmonary aspergillosis For the peak intensity of each C-terminal trypsin digested peptide of the MS / MS spectrum obtained from the urine sample (Example 6), the relative ratio to the peak intensity of the control sample was calculated,
  • the sensitivity, specificity, and ROC-AUC values at the relevant reference values were 37.93%, 96.36%, and 0.708. It was.
  • Example 8 Peaks of each C-terminal tryptic peptide in MS / MS spectra obtained from urine samples of 25 early lung adenocarcinoma cases (18 stage IA, 5 cases IB, and 1 stage IIA) and 25 healthy subjects With respect to the intensity (Example 6), the relative ratio of the control specimen to the peak intensity was calculated and compared between the early lung adenocarcinoma group and the healthy subject.
  • a protein fragment in which the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen 1 is IYPTVNCQPLGMIS is positive in 10 cases out of 24 cases of early lung adenocarcinoma when the reference value is 1.25 times the peak intensity detected in healthy subjects. Met.
  • the sensitivity at the reference value was 41.7%, the specificity was 72%, and the ROC-AUC value was 0.644.
  • Example 9 Apart from Example 8, 37 cases of lung adenocarcinoma (15 cases of stage IA, 3 cases of stage IB, 4 cases of stage IIA, 2 cases of stage IIIA, 3 cases of stage IIIB, 10 cases of stage IV) and 55 healthy subjects A urine sample was subjected to the MRM method, and the fragmentation rate of a protein fragment having a C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQPL was measured.
  • the average value (0.005) of the healthy subjects group is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 12 healthy subjects are positive and 23 cases of lung adenocarcinoma are positive Met.
  • the sensitivity at the reference value was 63.2%, the specificity was 78.2%, and the ROC-AUC value was 0.757.
  • Example 10 Separately, 22 cases of early lung adenocarcinoma (15 cases of stage IA, 3 cases of stage IB, 4 cases of stage IIA) and 55 healthy subjects were subjected to MRM, and the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I was expressed as IYPTVNCQPL. The fragmentation rate of protein fragments was measured. When the average value (0.005) of the group of healthy subjects is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 12 healthy subjects are positive and 16 cases of lung adenocarcinoma are positive Met. The sensitivity at the reference value was 72.7%, the specificity was 78.2%, and the ROC-AUC value was 0.842.
  • Example 11 Separately, 37 cases of lung adenocarcinoma (15 cases of IA, 3 cases of IB, 4 cases of stage IIA, 2 cases of stage IIIA, 3 cases of stage IIIB, 10 cases of stage IV) and urine samples of 55 healthy subjects were subjected to the MRM method.
  • the fragmentation rate of a protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP was measured.
  • the average value (0.044) of the healthy subjects group is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 11 healthy subjects are positive and 29 lung adenocarcinoma are positive Met.
  • the sensitivity at the reference value was 73.7% at the reference value, the specificity was 80%, and the ROC-AUC value was 0.865.
  • Example 12 Separately, 22 cases of early lung adenocarcinoma (15 cases in stage IA, 3 cases in stage IB, 4 cases in stage IIA) and 55 healthy subjects were subjected to the MRM method, and the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I was expressed as IYPTVNCQP. The fragmentation rate of protein fragments was measured. When the average value (0.044) of the healthy subjects group is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 11 healthy subjects are positive and 16 lung adenocarcinoma are positive Met. The sensitivity at the reference value was 72.3%, the specificity was 80%, and the ROC-AUC value was 0.842.
  • Each urine sample was subjected to MRM, and the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP was measured.
  • the fragmentation rate in each lung cancer case is 0.125 for polymorphic cancer, 0.162 for carcinosarcoma, and 0.135 for large cell cancer, and the fragmentation rate in each lung cancer case is the average of the healthy group It was higher than the reference value of 1.25 times (0.055) of the value (0.044).
  • Example 14 Urinary specimens from 4 cases of squamous cell carcinoma (2 cases of stage IB, 1 case of stage IIIA, 1 case of stage IIIB) and 55 healthy subjects who obtained histopathological diagnosis by transbronchial biopsy or surgical lung biopsy Were subjected to MRM, and the fragmentation rate of a protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP was measured.
  • the fragmentation rates of protein fragments in which C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I is IYPTVNCQP in squamous cell carcinoma cases are 0.098 and 0.090 in stage IB, 0.19 in stage IIIA, and 0.44 in stage IIIB All of the 4 cases of squamous cell carcinoma were higher than the standard value of 1.25 times (0.055) the average value (0.044) of the healthy subject group.
  • Example 15 Urine specimens of 4 cases of small cell lung cancer and 55 healthy subjects obtained by histopathological diagnosis by transbronchial biopsy or surgical lung biopsy were each subjected to MRM, and the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I was expressed as IYPTVNCQP The fragmentation rate of protein fragments was measured.
  • the fragmentation rates of the protein fragments with the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP in cases of squamous cell carcinoma are 0.069, 0.131, 0.747, and 0.754, respectively, and 4 cases of small cell lung cancer All were higher than the reference value of 1.25 times (0.055) the average value (0.044) of the healthy subject group.
  • Example 16 Detection by ELISA and comparison of usefulness with serum CEA Serum specimens (10 ⁇ L) of 25 early stage IA and IB early stage lung adenocarcinoma and 35 healthy subjects were subjected to the ELISA method.
  • the protein fragment concentration was measured with IYPTVNCQPLG as the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I.
  • the kininogen I-derived fragment whose C-terminal amino acid sequence recovered from chicken serum is CQPLG is obtained by administering the prepared immunogen solution to chickens and immunizing them. An antibody that specifically recognizes was used.
  • Example 17 Fluctuation of urinary markers with progression of lung adenocarcinoma A case in which a 1.4-cm ground glass nodule shadow with suspected lung adenocarcinoma was observed in the periphery of the right lower lobe on chest CT examination The urine was collected over time, and the fragmentation rate and size of nodule shadow of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP were obtained at the time of diagnosis of lung adenocarcinoma by surgical lung biopsy. Compared. The postoperative stage in this case was T1bN0M0, pStageIA.
  • the size of the nodule shadow increased to 1.9 cm at the time of surgery.
  • the nodule of the same part showed high accumulation of FDG in the PET-CT examination (FIG. 8).
  • the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP is 0.468, It was 0.565, 0.58, 0.956, 1.08, and increased with an increase in adenocarcinoma.
  • Example 18 Changes in urinary markers after resection of lung adenocarcinoma Recovered before and after lung cancer resection in 11 cases of early lung adenocarcinoma (5 cases IA, 2 cases IB, 4 cases IIA)
  • the urine sample was subjected to the MRM method, and the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP was measured.
  • urine collected after 14 days after surgery was used for analysis of urine specimens after surgery.
  • the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP was decreased.
  • the fragmentation rate of the protein fragment having the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I as IYPTVNCQP decreased from 0.378 to 0.205 by 45.77% (FIG. 9).
  • Example 19 Fluctuation of urinary marker due to treatment of lung adenocarcinoma
  • a urine sample collected in one case of stage IV lung adenocarcinoma positive for epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutation was subjected to MRM method and derived from kininogen I
  • the fragmentation rate of the protein fragment having IYPTVNCQP as its C-terminal amino acid sequence was compared before and 2 months after the treatment with the EGFR tyrosine kinase inhibitor.
  • the therapeutic effect of the EGFR tyrosine kinase inhibitor confirmed a tumor shrinkage rate of 37.1% (FIG. 10), and satisfied the criteria for Partial Response in Response Evaluation Criteria In Solid Tumors (RECIST).
  • the fragmentation rate of the protein fragment having IYPTVNCQP as the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I after 2 months of treatment decreased from 0.0783 to 0.0648, a 17.2% decrease compared to before treatment. It was.
  • Example 20 In order to efficiently detect the cleavage of kininogen I protein, the abundance (Cx) of a trypsin-digested peptide having the amino acid sequence IYPTVNCQP or the amino acid sequence IYPTVNCQPL as the C terminus and the abundance of the protein fragment having the C terminus as IYPTVNCQPLGLSLM (Ix)
  • Example 21 Urine samples from 27 lung adenocarcinoma cases (13 stage IA, 2 cases in stage IB, 4 cases in stage IIA, 2 cases in stage IIIA, 6 cases in stage IV) and 49 healthy subjects were subjected to the MRM method.
  • the average value of the healthy group (4.82) is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 14 healthy individuals are positive and 14 lung adenocarcinoma are positive
  • the sensitivity at the reference value was 71.4%, the specificity was 71.4%, and the ROC-AUC value was 0.829.
  • Example 22 A protein in which 19 cases of early lung adenocarcinoma (13 cases in IA, 2 cases in IB, 4 cases in IIA) and 49 healthy subjects are subjected to the MRM method, and the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I is IYPTVNCQP The fragmentation index (Fx) of the fragments was measured.
  • Fx fragmentation index
  • Example 23 Urine samples from 27 lung adenocarcinoma cases (13 stage IA, 2 cases in stage IB, 4 cases in stage IIA, 2 cases in stage IIIA, 6 cases in stage IV) and 49 healthy subjects were subjected to the MRM method.
  • Fx fragmentation index
  • Example 24 A protein in which 19 cases of early lung adenocarcinoma (stage 13 IA, 2 cases IB, 4 cases IIA) and 49 healthy subjects are subjected to the MRM method, and the C-terminal amino acid sequence derived from kininogen I is IYPTVNCQPL
  • the fragmentation index (Fx) of the fragments was measured.
  • the average value (0.437) of the healthy subject group is positive when the fragmentation rate of the patient sample is 1.25 times or higher, 11 healthy subjects are positive and 13 lung adenocarcinoma cases are positive.
  • the sensitivity at the reference value was 68.4%, the specificity was 75.5%, and the ROC-AUC value was 0.860.
  • Example 25 Protein fragments of 15 patients with advanced lung adenocarcinoma (stage IIIA 2 cases, stage IIIB 3 cases, stage IV 10 cases) and 55 healthy subjects subjected to MRM, with kininogen I-derived C-terminus as IYPTVNCQPLGMMISLM And the abundance of a trypsin-digested peptide whose C-terminal is YFIDFVAR, and the abundance ratio of IYPTVNCQPLGMMISLM is compared with the C-terminal protein fragment derived from normal kininogen I.
  • the average value (0.0075) of the group of healthy subjects is positive when the abundance ratio of the patient sample is 40% or lower, 15 healthy subjects are positive and 11 cases of lung adenocarcinoma are positive. there were.
  • the sensitivity at the reference value was 73.3%, and the specificity was 72.73%.
  • Example 26 Urine samples from 34 lung adenocarcinoma cases (14 cases in stage IA, 3 cases in stage IB, 3 cases in stage IIA, 2 cases in stage IIIA, 3 cases in stage IIIB, 9 cases in stage IV) and 53 healthy subjects were subjected to the MRM method.
  • Peak intensity ratio of trypsin digested peptide (ESNEELTESCETK) from amino acid 331 to 343 to trypsin digested peptide (LGQSLDCNAEVYVVPWEK) from amino acids 345 to 362 derived from kininogen I (reflects the abundance of the latter peptide relative to the former peptide) ) was calculated to be as low as 0.150 for the lung cancer patient sample compared to the average value (0.353) for the healthy group.
  • the peak intensity ratio of the trypsin digested peptide LGQSLDCNAEVYVVPWEK to the trypsin digested peptide ESNEELTESCETK is 40% or more lower than the average of healthy subjects, 6 healthy subjects are positive, 24 lung adenocarcinoma are positive there were.
  • the sensitivity at the reference value was 70.6%, the specificity was 88.68%, and the ROC-AUC value was 0.9.
  • Example 27 Urine samples from 34 lung adenocarcinoma cases (14 cases in stage IA, 3 cases in stage IB, 3 cases in stage IIA, 2 cases in stage IIIA, 3 cases in stage IIIB, 9 cases in stage IV) and 53 healthy subjects were subjected to the MRM method.
  • Peak intensity ratio of trypsin digested peptide (ENFLFLTPDCK) from amino acid 209 to 219 to trypsin digested peptide (LGQSLDCNAEVYVPVPWEK) derived from kininogen I from amino acid 345 to 362 (reflects the abundance of the latter peptide relative to the former peptide) ) was calculated to be as low as 2.0 in the lung cancer patient sample with respect to the average value (5.423) of the healthy group.

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Abstract

簡易で侵襲性が低い肺腺がんの検出方法を提供する。本発明の肺腺がんの検出方法は、被検体由来試料におけるキニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む。このようなキニノーゲンＩの不正常な切断は、例えば、キニノーゲンＩにおけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／またはキニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である。本発明の肺腺がんの検出方法は、このような不正常な切断のあるタンパク質の存在または量、あるいは、正常なタンパク質の量の減少を検知する工程などを含む。

Description

肺がんの検出方法
　本発明は、肺がんの検出方法に関する。
　世界のがん年間死亡数において、最も多いものは肺がんである。２０１２年には、世界で１６０万人が肺がんにより死亡したと予測されている。我が国では、年間７万４０００人が肺がんにより死亡し、がん死亡原因において、肺がんが第１位の疾患である。肺がんは、小細胞肺がんと非小細胞肺がんに分類され、肺がん患者全体の１５％が小細胞肺がんであり、残りの８５％が非小細胞肺がんである。さらに、非小細胞肺がんは、病理組織学的に、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がんやがん肉腫などの肉腫様がんなどのタイプに分けることができる。
　肺がんの生存率は臨床病期の進行と共に低下する。例えば手術が可能な臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期の非小細胞肺がんでは、５年生存率がそれぞれ８２．０％、６６．１％、５４．５％、４６．１％および４２．８％であり（非特許文献１）、手術適応のない臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期の非小細胞肺がんでは、生存期間中央値はそれぞれ２２．４か月（非特許文献２）および１０．３か月（非特許文献３）である。
　肺がんに対する既存の腫瘍マーカーとして、肺腺がんに対する血清Ｃａｒｃｉｎｏ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、肺扁平上皮がんに対するｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ　１９　ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＣＹＦＲＡ　２１－１）、肺小細胞がんに対するＮｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）などが臨床的な診断に用いられている。しかし、肺腺がん症例におけるＣＥＡの陽性率は３６．６～５６．５％に過ぎず（非特許文献４ 、５）、特にＩ期の早期肺腺がんでは陽性率が２７％と低いため（非特許文献５）、ＣＥＡでは根治可能な病期で肺腺がんを診断することは困難である。また、肺扁平上皮がん症例におけるＣＹＦＲＡ　２１－１の陽性率は５７％（非特許文献６）、小細胞肺がん症例におけるＮＳＥの陽性率は４５％であり（非特許文献７）、既存の腫瘍マーカーより高感度に肺がんを検出することが可能なマーカーの開発が求められている。
　臨床応用に向けて開発が進められている腫瘍マーカーとして、血清ＣＹＢＰ（特許文献１）、ＵＢＥ２Ｌ３（特許文献２）等が上げられるが、患者の血液採取を必須条件とし、侵襲的である。このような検査ではより低侵襲であることが求められる。
特表２０１２－５２６９７６ 特開２０１４－１１５１８６
Sawabata N、et al.、J Thorac Oncol. 6:1229-35、2011. Atagi S、 et al.、 Lancet Oncol. 13:671-8、2012. Scagliotti GV、 et al.、 J Clin Oncol. 26:3543-51、2008. Molina R、 et al.、 Am J Respir Crit Care Med. 193:427-37、 2016 Matsuoka K、 et al.、 Eur J Cardiothorac Surg. 32:435-9、 2007. Rastel D、et al.、Eur J Cancer. 30A:601-6、1994. Stieber P、et al.、 Anticancer Res. 19(4A):2673-8、1999.
　本発明は、肺がんの検出方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、肺がん患者に特異的に見られる、体液中のキニノーゲンＩの断片化の増加や正常な構造を有するタンパク質の減少、タンパク質の不正常な位置での切れ目や中間位置の欠損による露出部を見出し、簡易で低侵襲性または非侵襲性の肺がん検出方法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の[１]～[１２]を提供し得るものである。
[項１]
　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺がんの検出方法。
[項２]
　前記キニノーゲンＩの不正常な切断が、該キニノーゲンＩ中のペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該キニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、項１記載の肺がんの検出方法。
[項３]
　前記被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１または２記載の肺がんの検出方法：
（１）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の量または存在を検知すること。
[項４]
　項１記載の肺がんの検出方法であって、
　前記キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、肺腺がんの検出方法：
(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｃ)ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。

［項５］
　前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
　被検体試料中に存在するキニノーゲンＩ由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはキニノーゲンＩ由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、項１～４のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
［項６］
　前記被検体由来試料が、尿または血液から選択される、項１～５のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
［項７］
　質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を用いる工程を含む、項１～６のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
[項８]
　上記肺がんが、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんである、項１～７のいずれか１項記載のがんの検出方法。
［項９］
　項１記載の肺がんの検出方法であって、前記キニノーゲンＩにおける不正常な切断の有無が、該キニノーゲンＩの断片化率によって決定され、該断片化率が、
　キニノーゲンＩタンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
　Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
　Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来タンパク質全量
　で得られる、肺がんの検出方法。
[項１０]
　前記肺がんの検出方法が、早期肺がんの診断補助の為の検出、肺がんの診断の為の検出、肺がんの進行の検出、肺がんの再発の有無の予測の為の検出、及び肺がんの治療効果の有無の為の検出からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、項１～９のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
[項１１]
　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の発現レベルに基づくデータを正常な切断として検知されるキニノーゲンIの発現レベルデータと比較する比較工程を含み、比較により被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断に由来するペプチドの量が、正常値より高いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。
[項１２]
　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の１つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、
　該ペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。
　本発明により、肺がんを尿や血液などの体液を用いて低侵襲の方法で検出することができる。
図１は、健常者と肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図２は、健常者と肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図３は、健常者と早期肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図４は、健常者と早期肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図５は、被検体由来試料（尿）のインビトロでの処理により、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片が高値に見出された肺腺がん症例における胸部ＣＴ画像を示す図である。右肺上葉Ｓ１に胸膜の陥入と気管支透亮および周囲にすりガラス影を伴う約２ｃｍ大の原発巣を認める。 図６は、図５と同じ患者におけるＰＥＴ－ＣＴ胸部画像を示す図である。胸部ＣＴ検査で認められた原発巣に一致して、ＰＥＴの異常集積を認める。 図７は、図５と同じ患者における経気管支生検で採取した肺腺がん組織像（Ｈ－Ｅ染色および抗ＴＴＦ－１抗体を用いた免疫組織化学発光）である。 図８は、肺腺がん症例における、キニノーゲンＩ断片化率の経時的変化を示すグラフ（ａ）と同症例の胸部ＣＴ画像およびＰＥＴ－ＣＴ画像を示す図（ｂ）である。 図９は、早期肺腺がん症例における手術前後の断片化率の変化を示すグラフである。 図１０は、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子変異陽性のＩＶ期肺腺がん症例における、胸部ＣＴ画像を示す図である。
[肺がんの検出方法]
　本発明の肺がんの検出方法は、本発明者らによる新たな発見に基づく。すなわち、本発明者らは、肺がん患者の体内では、キニノーゲン（Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ）Ｉが、健常者では切断されないような箇所で切断され、様々なタイプの欠損タンパク質または切れ目が生じた当該タンパク質が増加している場合があることを見出した。
　すなわち、特定のタンパク質において、Ｃ末端部またはＮ末端部の欠損、不正常な位置でのペプチド結合の切れ目あるいはそれに伴う切れ目からのアミノ酸の欠損などのような不正常な切断という現象が見られることを見出した。
　キニノーゲンＩの不正常な切断は、肺がん特異的なプロテアーゼの存在による可能性もある。従って、本発明は、インビトロにおいて、そのような不正常な切断によるキニノーゲンＩの切れ目や欠損を指標として健常者と肺がん患者を区別して評価することができる。一方、キニノーゲンＩの不正常な切断の亢進を、正常タンパク質の量（相対的な量比を含む）の減少を指標として健常者と肺がん患者を区別して評価することも可能となる。
　本発明は、被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩについて、不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺がんの検出方法である。
　本明細書において、キニノーゲンＩの「不正常な切断」は、限定はされないが、キニノーゲンＩの正常な構造とは異なる一次構造、二次構造、あるいは三次構造をもたらす。例えば、キニノーゲンＩにおけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断、キニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断などが含まれる。
　限定はされないが、「不正常な切断」によって、キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質、あるいは、キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質が生じ得る。あるいは、「不正常な切断」によって、タンパク質中のアミノ酸残基同士のペプチド結合の切れまたは任意の中間位置でのアミノ酸の欠損が生じる。
　キニノーゲンＩの「不正常な切断」の一態様では、ペプチド結合が切れて新たな切断部位のアミノ酸残基を露出するが、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質からアミノ酸を失うことのない場合がある。このような場合では、生体から取り出した未処理の試料中では当該キニノーゲンＩの欠損あるいは断片化が生じていない場合がある。本発明の不正常な切断は、このような切断も含む。あるいは、このように、例えば、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質が結合状態を保持してはいるが、ペプチド結合が切れて、そこからさらに、１または２以上のアミノ酸残基が欠如することで、タンパク質中のアミノ酸残基が任意の中間位置で欠損している場合が生じる。
　キニノーゲンＩに関連して、本来の正常な翻訳後プロセシングは、ここでの不正常な切断ではない。
　本明細書において、「被検体」とは、がんの検出対象となる哺乳動物を指し、限定はされないが、好ましくは、イヌ、ネコ、マウス、あるいはヒトである。
　本明細書において、肺がんとは、肺のいずれかの組織に発生するがんをいう。肺がんは、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんであり得る。このうち、肺腺がんとは、肺の分泌腺組織に発生するがんをいう。
　本願発明において、肺がんは、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期、臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期のいずれの段階のものであってもよい。早期肺がんというときには、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、およびＩＩＢのいずれかを指す。
　本発明の「肺がんの検出」とは、肺がんの罹患の有無の診断補助の為の検出であり得る。さらには、「肺がんの検出」は、肺がんの進行の有無や程度の検出、再発の有無や程度の検出、又は肺がんの手術や抗がん剤治療などの治療効果の有無や効果奏功の程度の検出のいずれも含む。ここで、再発は、手術や抗がん剤治療後の再発を含む。また、治療効果の有無や治療奏功の程度は、典型的には、がんの縮小などで見出されるものである。本発明の方法によれば、簡易にこれらの検出を行うことができる。すなわち、本発明のキニノーゲンＩの「不正常な切断」は、肺がんの罹患に伴い見出され得る。さらには、肺がんの進行に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断の割合が増加し得る。さらには、肺がんの再発に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断が見出されたり、増加したりし得る。さらには、肺がんの手術や抗がん剤治療の効果奏功に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断は減少し得る。
　本明細書において、「被検体由来試料」とは、被検体に由来する体液を指し、体液そのものの他、体液の濃縮液、希釈液、あるいはその他の適宜の処理済みの液体を指す。ここで、体液は、限定はされないが、例えば、尿、血液（全血、血漿、血清）、痰、汗、髄液、消化液、腹水、を指す。好ましくは、体液は、尿または血液であり、特に好ましくは尿である。ここで、尿は、早朝中間尿、蓄尿、随時尿のいずれでもあり得る。尿や血液などの体液の採取量は、１０μｌ～２００ｍｌ、好ましくは、１００μｌ～１００ｍｌ、さらに好ましくは、１ｍｌ～１００ｍｌである。
　ここで、体液の処理は、より詳細には、濃縮、希釈、分画、脱塩等の前処理、グリセリン等の保存剤、プロテアーゼ阻害剤等の安定化剤、防腐剤を加えることなどを指す。冷蔵または冷凍処理した後に常温に戻すこと、冷蔵または冷凍処理前後のいずれかで適宜の処理を行うことなども含まれる。さらに、例えば体液が血液の場合には、適宜の処理として抗凝血剤処理を行うこともできる。これらの処理を組み合わせることも可能である。
　体液が尿の場合には、測定前に前処理として濃縮を含む操作を行うことが好ましい。この濃縮方法は特に限定されないが、分画分子量の限外ろ過膜を用いた方法、凍結濃縮、減圧または真空濃縮、加熱などが挙げられる。分画分子量としては、限定はされず、例えば、３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、５０ｋＤなど任意の値を用いることができる。
　例えば、体液が尿の場合、原尿の総タンパク質量の濃度は、０．００１ｇ／ｄＬ～０．６ｇ／ｄＬ程度であるため、濃縮は有用な前処理である。原尿を２００～２５０倍に濃縮して分析に用いることができる。この濃縮液をそのまま測定に供することも可能であるが、さらに総タンパク質量を希釈して調整して測定に供することもできる。例えば、ウエスタンブロットなどの測定手法によっては、０．１μｇ～１０μｇ／μｌ程度に調整して測定に供することもできる。
　濃縮は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標、サルトリウス・ジャパン株式会社製）、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）などを使用して、製造者の指示に従って使用することもできる。
　希釈は、蒸留水や緩衝液を用いて行うことができ、濃縮尿の調整にも利用することができる。
　キニノーゲンＩの欠損は、一次構造で比較した場合に、由来する全長タンパク質のＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置のアミノ酸残基の欠損があれば特にその大きさや長さに限定はない。ここでＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置に欠損があるとは、通常そのタンパク質が正常に機能する単位のタンパク質よりもＣ末端側、Ｎ末端側が短いか、中間位置に存在すべきアミノ酸残基が欠如していることを意味する。
　本明細書において、タンパク質断片の配列が特定されている場合には、それぞれの表記記号は、アミノ酸残基の一文字表記として使用されている通常の文字を意味する。
　具体的には、
　Ａ　　Ａｌａ　　Ａｌａｎｉｎｅ　アラニン　　
　Ｃ　　Ｃｙｓ　　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　システイン　　
　Ｄ　　Ａｓｐ　　Ａｓｐａｒｔｉｃ　ａｃｉｄ　アスパラギン酸
　Ｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ　グルタミン酸
　Ｆ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　フェニルアラニン
　Ｇ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙｃｉｎｅ　グリシン
　Ｈ　　Ｈｉｓ　　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　ヒスチジン
　Ｉ　　Ｉｌｅ　　Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　イソロイシン
　Ｋ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓｉｎｅ　リシン
　Ｌ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕｃｉｎｅ　ロイシン
　Ｍ　　Ｍｅｔ　　Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ　メチオニン
　Ｎ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　アスパラギン
　Ｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏｌｉｎｅ　プロリン
　Ｑ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ　グルタミン
　Ｒ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇｉｎｉｎｅ　アルギニン　
　Ｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒｉｎｅ　セリン
　Ｔ　　Ｔｈｒ　　Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ　トレオニン
　Ｖ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌｉｎｅ　バリン
　Ｗ　　Ｔｒｐ　　Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　トリプトファン
　Ｙ　　Ｔｙｒ　　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　チロシン
　本発明において、被検体由来試料中のキニノーゲンＩについて、不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程は、限定はされないが、好ましくは、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む工程であり得る。
（１）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切れ目又は欠損を有するタンパク質の量または存在を検知すること。
　限定はされないが、本発明の肺がんの検出方法の１つの態様では、被検体由来試料における１または２以上のキニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知する。具体的には、例えば、正常な構造を有するキニノーゲンＩの量を、当該キニノーゲンＩのＣ末端部のアミノ酸配列および／またはＮ末端部のアミノ酸配列の有無によって測定し、正常な構造を有するタンパク質の量が健常者と比較して相対的に減少しているか否かを検出することができる。
　限定はされないが、本発明の肺がんの検出方法の別の態様では、被検体由来試料を用いて、インビトロにおいて、キニノーゲンIのタンパク質断片を検知することを含む。このようなタンパク質断片の検知は、被検体由来試料中に断片化した状態で存在するタンパク質断片および／または例えば被検体由来試料を還元処理等に供した後に生じるタンパク質断片を検知することであり得る。
　具体的には、キニノーゲンＩのタンパク質断片の量をインビトロで測定する工程では、キニノーゲンＩのタンパク質断片が、該タンパク質の全長と比較してＣ末端側に欠損があるタンパク質に由来する断片または中間部位に切れ目および／またはアミノ酸の欠損があるタンパク質に由来する断片であることが好ましい。
　本明細書で、キニノーゲンＩのタンパク質断片のＣ末端配列が記載されている場合には、例えば、「ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」、「ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」、「ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」などと表現される。例えば、「ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」の場合、全長タンパク質では右端に示されるＴよりもＣ末端部側に本来存在していたアミノ酸残基は欠損（欠如）していることを示しており、１番目のＥよりＮ末端側へはアミノ酸残基は存在していても存在していなくてもよいことを意味する。
　キニノーゲンＩのタンパク質断片は、以下からなる群より選択される少なくとも１つ以上であることが好ましい。
(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片（本明細書においてＰ１ともいう）；
(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片（本明細書において、Ｐ２ともいう）；
(ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
　さらに、このようなキニノーゲンＩのタンパク質断片からなる群より選択される少なくとも１つ以上をインビトロで測定することによって、例えば早期肺腺がんなどの早期肺がんの検出が可能である。
　ここで、キニノーゲンＩのタンパク質断片におけるアミノ酸残基の数は特に限定はされないが、好ましくは少なくとも１０残基以上、より好ましくは少なくとも５０残基以上である。タンパク質断片のサイズの上限は特に限定はされず、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質のサイズ未満である。例えば、限定はされないが、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質と比較して、Ｃ末端側が欠損している構造のタンパク質断片である。タンパク質断片は、全長未満であれば特に上限はないが、場合によっては、２００残基以下、好ましくは１００残基以下のような短い断片で存在することも可能である。
　さらに、被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；または被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知するために、Ｎ末端側が欠如したＣ末端側の遊離したタンパク質断片を検出することも可能である。このような断片を検出することで、（ａ）～（ｆ）のタンパク質断片を間接的に検出したり、Ｎ末端が生体内で欠損しているタンパク質断片の存在を検知したりすることもできる。
　本発明のキニノーゲンＩタンパク質断片の分子量は、全長タンパク質未満であれば限定はされない。但し、例えば尿などの検体を用いて肺がんを検出する方法によっては、例えば３ｋＤａ以上全長未満、好ましくは１０ｋＤａ以上全長未満である。
　さらには、これらのキニノーゲンＩタンパク質断片は、それぞれ、上記配列を有してさえいれば、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾を受けたものも含まれる。
　以下、キニノーゲンＩのタンパク質断片の配列を特定のデータベースに含まれる特定の配列（配列表の配列番号１又は２）で例示しながら説明する。当業者には明らかな通り、これらの配列や配列中におけるアミノ酸残基の位置およびアミノ酸残基数は、個人により変わる場合もあり、またデータベースによって掲載配列が異なる場合もある。配列は本発明の説明の為のものであり、本発明を限定するものではない。
　ここで、キニノーゲンＩは、カリクレイン-キニン系で重要な役割を果たすタンパク質である。この代謝系は、種々の生理活性を有するキニン類を生成させる一連の生体内反応系である。
　カリクレイン-キニン系は、生体内において様々な酵素反応系、例えばレニン－アンジオテンシン‐アルドステロン系、血液凝固系等と関連をもって生体の機能調節に関わっている。生成物であるブラジキニン等のキニン類は、末梢血管拡張に伴う降圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発痛、白血球の遊走など種々の生理活性を示す。キニノーゲンＩは、このキニンの前駆体となるタンパク質であり、内因系血液凝固因子の一つである。女性生殖器に非常に高濃度で存在し、ブラジキニンを放出することにより、カリクレイン-キニン系を介して妊娠分娩にも重要な役割を持つとされている。また、不育症との関係も示唆されている。
　キニノーゲンＩは、前駆体配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１０４２の配列（配列表の配列番号１）又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１０４２－２の配列（配列表の配列番号２）がある。
　キニノーゲンＩには、いくつかの代表的なアイソフォーム（高分子量型および低分子量型）がある。高分子量型は（配列表の配列番号１）、６４４アミノ酸からなる前駆体として合成されアミノ酸番号１位～１８位がシグナルペプチドである。成熟体（アミノ酸番号１９位～６４４位）はさらに、プロセッシングにより重鎖（アミノ酸番号１９位～３８０位）と軽鎖（アミノ酸番号３９０位～６４４位）になり、ブラジキニン（アミノ酸番号３８１位～３８９位）を放出する。さらに、Ｔ－キニン（アミノ酸番号３７６位～３８９位）あるいはリジルブラジキニン（３８０位～３８９位）などへの切断、低分子量growth-promoting factor（ＧＰＦ）（アミノ酸番号４３１位～４３４位）への切断があり得る。低分子量型は、主に３種類の配列が報告されており、配列表の配列番号２に示す配列は、重鎖とブラジキニン部分の配列は、高分子量型と同一であるが、軽鎖の配列が異なっており、配列表の配列番号３に示す配列は、配列表の配列番号２に示す配列の１８９位～２２４位の部位が欠損したもので、配列表の配列番号４に示す配列は、配列番号２に示す配列の１位～１５３位が１７個のアミノ酸に置換し、さらに、１７７位のMetがThrに置換したものである。いずれの低分子量型も血液凝固系には関係していないことが知られている。本明細書では、配列表の配列番号１に高分子量型の例を開示し、配列表の配列番号２～４に低分子型の例を開示する。
　本明細書でいう「キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質」、「正常な構造のキニノーゲンＩ」は、成熟体（配列表の配列番号１における１９位～６４４位のアミノ酸、配列表の配列番号２における１９位から４２７位のアミノ酸、配列表の配列番号３における１９位から３９１位のアミノ酸、配列表の配列番号４における１位から２９１位のアミノ酸）、重鎖（配列表の配列番号１又は２を基準とした場合、アミノ酸番号１９位～３８０位のアミノ酸）、軽鎖（配列表の配列番号１のアミノ酸番号３９０位～６４４位のアミノ酸又は配列表の配列番号２のアミノ酸番号３９０位～４２７位のアミノ酸、あるいは配列表の配列番号３～４の対応箇所）、ブラジキニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３８１位～３８９位のアミノ酸、あるいは配列表の配列番号３～４の対応箇所）を放出する。さらに、Ｔ－キニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３７６位～３８９位のアミノ酸）あるいはリジルブラジキニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３８０位～３８９位のアミノ酸）などへの切断、低分子量growth-promoting factor（ＧＰＦ）（配列表の配列番号１におけるアミノ酸番号アミノ酸番号４３１位～４３４位のアミノ酸）への切断があり得る。これらはいずれも正常な構造である。
　本明細書でいう「不正常な位置での切断」とは、シグナルペプチドと成熟体への切断、重鎖、軽鎖、ブラジキニン、Ｔ－キニン、リジルブラジキニン、および低分子量ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ（ＧＰＦ）からなる群より選択される鎖以外への切断である。肺がんにおいて活性が亢進する酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ群などにより切断を受けることで、本来は起らない切断部位での切断が生じ、副次的に断片化やアミノ酸の欠損が亢進し得ると考えられる。
　本明細書でいう不正常な切断の一例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると、３３１位のアミノ酸残基から３４２位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３４３位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７４位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７５位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。また、別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１の配列で説明すると５２１位のアミノ酸残基から５３６位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、５３７位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７７位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７８位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７３位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７４位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。また、さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７２位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７３位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。
　本発明の不正常な切断を検知する方法において、正常な構造を有するキニノーゲンＩ量またはその存在、キニノーゲンＩタンパク質断片の量またはその存在は、被検体由来試料である体液中に含まれるそれらの質量、分子量、または濃度などで検出することができる。さらには、蛍光強度、吸光度、ＭＳ／ＭＳスペクトルの強度等で表わすことも可能である。
　さらに、本発明における検出方法は、被検体由来試料中に含まれる、不正常な切断を検知する方法または正常な構造を有するタンパク質を検出する方法であれば特に制限されるものではない。例えば、質量分析により検出する方法の他、抗体を用いた免疫化学的測定法（ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ウエスタンブロット法など）で検出する方法を挙げることができる。
　質量分析による方法としては、被検体由来試料中の正常な構造を有するキニノーゲンＩまたは不正常な切断に由来するキニノーゲンＩのタンパク質断片を検出する方法であれば特に制限されるものではない。具体的には、例えば、試料を採取し、前処理および／または還元処理後に酵素消化し、同位体等で標識した後、ＭＳ／ＭＳによってＣ末端由来のペプチドのみの量を測定する方法がある。より具体的には、限定はされないが、被検体由来試料が尿である場合、尿を採取し、前処理として尿検体を濃縮した検体を得て、この濃縮検体を還元アルキル化した後に、Ｈ２ １８Ｏ存在下でトリプシン消化することで、トリプシン消化断片由来のペプチドを安定同位体標識することができる。その後、脱塩、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後、Ｎａｎｏ－ＬＣ－ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ末端由来のトリプシン消化ペプチドのみを測定する。このペプチド情報を解析することで、正常な構造を有するタンパク質または不正常な切断に由来するキニノーゲンＩタンパク質断片を区別して検出することができる。この他に、例えば、濃縮試料中のタンパク質をＬｙｓ－Ｃで酵素消化した後、すべての消化ペプチドのＮ末端をイソシアン酸フェニルやＴＭＰＰ試薬（Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ｍｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｓ（２、４、６－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）といった試薬でブロックし、リジン以外のＣ末端を有するペプチドを得て、質量分析器によるＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、キニノーゲンＩタンパク質断片を測定する方法なども採用できる。
　ＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring；多重反応モニタリング）によりキニノーゲンＩのタンパク質断片量を測定する場合には、例えば、高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（QTRAP(R) 5500 System（エービーサイエックス社））やLCMS-8030（島津製作所株式会社製）を用いることもできる。
　ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイによる方法としては、不正常な切断由来のアミノ酸露出部、キニノーゲンＩのタンパク質断片のＣ末端部、または特定のアミノ酸欠損部を特異的に認識し、対応する正常な構造を有するタンパク質と区別することができる抗体を用いることが望ましい。
　被検体由来試料中の正常な構造を有するキニノーゲンＩの量またはキニノーゲンＩタンパク質断片の量を、試料中に共存するキニノーゲンＩ由来のすべてのタンパク質の存在量と比較し、相対比で表すこともできる。あるいは、被検体由来試料中のタンパク質断片の存在量を、被検体由来試料中の総蛋白量と比較し、断片の量と総蛋白量の相対比で表すこともできる。
　いずれの測定方法を用いた場合でも、キニノーゲンＩにおける不正常な切断の有無は、被検体試料中におけるキニノーゲンＩの断片化率を算出して、その値が閾値を超えているか否かで判断することができる。すなわち、キニノーゲンＩのタンパク質断片化率が閾値を超えている場合には、由来する被検体が肺腺がんであることが把握できる。
　より具体的には、限定はされないが、例えば、キニノーゲンＩの断片化率（Ｆｎ）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とすることができる。
［式１］タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
　Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
　Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来のタンパク質全量
　ここで、Ｃｎにおける各キニノーゲンＩの断片の量とは、１つのキニノーゲンＩタンパク質断片の量（例えば（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのタンパク質断片の量）を指す。
　Ｉｎにおける元のタンパク質の量とは、（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのタンパク質断片、正常な構造を有する全長タンパク質を含む、試料中のキニノーゲンＩ由来タンパク質の全量を指す。ここで、ＣｎまたはＩｎにおける量は、いずれも、例えばトリプシン消化ペプチドの量の測定によって検知することができる。Ｉｎは、キニノーゲンＩタンパク質断片にも正常な構造を有するキニノーゲンＩにも共通に含まれるトリプシン消化ペプチドの量によって示すことができる。測定方法は、実施例５記載の条件に準ずる。
　ここで、共通に含まれる配列は限定はされないが、以下の配列を使用することができる。
　ＹＦＩＤＦＶＡＲ（配列表の配列番号１の３１７～３２４位）
　被検体由来試料において、正常な構造を有するタンパク質の量が、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、有意に減少した場合、対象者は肺がん患者と判定される。ここで、有意な減少とは、健常者検体と比較して、例えば、上記正常な構造を有する上記蛋白質の相対比として、０．９倍以下、好ましくは、０．８倍以下、より好ましくは、０．６倍以下になることをいう。あるいは、抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できる量の減少が健常者検体と比較して、０．８倍以下、好ましくは、０．６倍以下程度になることをいう。
　被検体由来試料におけるキニノーゲンＩタンパク質断片の量を、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、タンパク質断片の有意な増加を検出した場合、対象者は肺がん患者と判定される。ここで、有意な増加とは、健常者検体と比較して、例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトル面積として、１．２５倍以上、好ましくは、１．５倍以上、より好ましくは、２．０倍以上の強度になることをいう。あるいは、抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できるタンパク質断片の量の増加が健常者検体と比較して、１を超える値、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは、１．５倍以上程度になることをいう。
　なお、ここでの比較の数値は、内部標準等を用いた補正後の値を指すものとする。
　健常者被検体由来試料における正常な構造を有するキニノーゲンＩの量またはキニノーゲンＩタンパク質断片の量などは、被検体由来試料の調製と測定方法に準じて決定することができる。
　本発明における特に好ましい態様では、不正常な切断をインビトロで検知する工程が、被検体試料中に存在するキニノーゲンＩ由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはキニノーゲンＩ由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む。ここで、例えば、(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端部アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部；(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端部アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、（ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、および(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部を認識する抗体を好適に使用することができる。
[抗体]
　本発明ではまた、被検体由来試料中のキニノーゲンＩタンパク質断片を測定することができる抗体を含む、肺がん検出用抗体組成物が提供され得る。キニノーゲンＩタンパク質断片を測定する抗体は、キニノーゲンＩタンパク質断片を認識できる抗体であれば限定はされないが、好ましくは、キニノーゲンＩタンパク質断片のＣ末端側の切断を特異的に認識することができ、かつ全長タンパク質などのその他のタンパク質を認識しない抗体である。抗体は、キニノーゲンＩタンパク質断片を特異的に認識することができる抗体であれば、ポリクロ－ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。これらの抗体は固相に固定化していてもよい。
[プログラム]
　本発明はまた、肺がん検出プログラムに関する。肺がん検出プログラムは、被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の発現レベルに基づくデータを正常な切断として検知されるキニノーゲンＩの発現レベルデータと比較する比較工程を含み、比較により被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断に由来するペプチドの量が、正常値より高いことを基準として、肺がんを検出することができる。
　本発明はまた、別の態様の肺がん検出プログラムに関する。１つの態様の肺がん検出プログラムでは、被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の１つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、該ペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラムであり得る。ここで、タンパク質分解酵素は、限定はされず、例えばトリプシンであり得る。詳細には、該消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断が、上記のタンパク質分解酵素消化ペプチド内で起きている場合、そのペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出することができる。ここで、限定はされないが、例えばトリプシンなどのタンパク質分解酵素による消化ペプチドの発現レベルデータは、内部標準に用いるトリプシン消化ペプチドの発現レベルデータとの比で表すこともできる。
　さらに別の態様では、キニノーゲンＩ由来の２つ又は３つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを相互に比較する比較工程を含み、被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断が、上記のいずれかのタンパク質分解酵素消化ペプチド内で起きている場合、そのペプチドの量が他のペプチドの量と比較して低いことを基準として、肺がんを検出することができる。ここで、限定はされないが、例えばトリプシンなどのタンパク質分解酵素による消化ペプチドの発現レベルデータは、内部標準に用いるトリプシン消化ペプチドの発現レベルデータとの比で表すこともできる。あるいは、消化ペプチドのうちの少なくとも１つは、内部標準に用いるペプチドであってもよい。
　本プログラムにおける、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の定義を始めとする各要素は、上記[肺がんの検出方法]で述べた内容に準じる。
　次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　〔実施例１〕体液の採取
　胸部画像検査にて原発性肺がんを疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、経気管支生検、リンパ節生検または細胞診により、肺腺がんと診断した患者を選定した。選定した肺腺がん患者および健常者から早朝中間尿を、滅菌コップを用いて採取した。採取した尿試料は解析までの間‐８０℃で保存した。
　肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿のＣ末端タンパク質断片を網羅的に解析した。肺腺がん症例の臨床病期の内訳はＩＡ期４６例、ＩＢ期１５例、ＩＩＡ期１例、ＩＩＢ期１例、ＩＩＩＡ期８例、ＩＩＩｂ期８例およびＩＶ期４５例であった。臨床病期は、日本肺学会編「肺がん取扱い規約　第７版」（金原出版株式会社）に記載された基準に従って判定した。ＩＡ期およびＩＢ期の肺腺がん症例を早期肺腺がん症例と定義した。
　〔実施例２〕質量分析による検出
　尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理、分析データの取得、統計解析の手順でマーカー探索を行った。肺腺がん診断マーカーおよび早期肺腺がん診断マーカーとして計２種（表１および表２）を同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  〔実施例３〕肺腺がんの評価方法
　胸部画像検査にて原発性肺がんを疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、肺生検、リンパ節生検または骨生検などの組織診断や、喀痰や胸水などの細胞診により、肺腺がんの診断を行った。肺腺がんの臨床病期の決定については、ＰＥＴ－ＣＴ検査による集積強度、頭部ＭＲＩ検査および胸部ＣＴ検査による画像検査の他、骨生検、リンパ節穿刺吸引細胞診または胸水細胞診検査を用いた。尿中におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片が実施例２で高値を示した肺腺がん症例において、胸部ＣＴ検査では右上葉に２ｃｍ大の結節影を認め（図５）、同部はＰＥＴ－ＣＴ検査で異常な集積を認めた（図６）。経気管支生検で得た組織からＴｈｙｒｏｉｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ－１　（ＴＴＦ－１）が陽性である肺腺がんを検出した（図７）。この症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片のスペクトル面積は健常者の平均値の１１．４６倍であった。
  〔実施例４〕肺腺がんの診断におけるCEAとの有用性の比較
　肺腺がんと診断した１２４例（実施例１）のうち、血中CEA値が確認できた肺腺がん１１６例において、CEAと尿中タンパク質断片での有用性を比較した。例えば、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片が、実施例2で、健常者の平均値の１．５倍を示すものを陽性とするとした場合、肺腺がん１１６例中６１例が陽性であると判断できた。一方、血中ＣＥＡ値の基準値を８．０ ng/mlとした場合、肺腺がん１１６例中４５例のみが陽性の結果であった。
  〔実施例５〕スクリーニング　検体を調製し、ＭＲＭ法に供することで、肺腺がん患者のスクリーニングを行った。尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理および分析データの取得と解析を実行した。具体的には、前処理により、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００～２５０倍に濃縮し、低分子を洗浄により除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析工程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、緩衝液中でトリプシン消化した。脱塩、精製後、タンパク質断片由来のトリプシン消化ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにより分画し（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ　ＡＴＭ（ＰｏｌｙＬＣ　Ｉｎｃ．　ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０－１００％）させて分離）、タンパク質断片のＣ末端ペプチドを含むトリプシン消化ペプチド混合物を得た。このようにして得られる各試料を別々に高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（ＱＴＲＡＰ（Ｒ）５５００　Ｓｙｓｔｅｍ（エービーサイエックス社）、或いは、Agilent社　6470 LC/MS/MS System ）に供し、混合物の分離と同時にペプチドの定量をＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）により行った。各タンパク質の断片化率（Ｆｎ）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とした。
　［式１］タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
　Ｃｎ：各タンパク質断片の量（（ａ）～（ｆ）のタンパク断片配列にあるペプチドの量）

　Ｉｎ：各タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
　ここで、Ｃｎにおける各タンパク質のＣ末端断片の量とは、キニノーゲンＩタンパク質断片の量を指す。Ｉｎにおける元のタンパク質の量とは、タンパク質断片あるいは全長タンパク質に共通に含まれるトリプシン消化ペプチドの量を指す。（共通に含まれるトリプシン消化ペプチドとしては、ＹＦＩＤＦＶＡＲ）。
　肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者８例が陽性、肺腺がん６１例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者８例が陽性、肺腺がん５３例が陽性であり、当該基準値における感度は４２．７４％、特異度は８７．８８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７６６であった。
　別途、肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者７例が陽性、肺腺がん７８例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者５例が陽性、肺腺がん６８例が陽性であり、当該基準値における感度は当該基準値における感度は５４．８４％、特異度は９２．４２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８１４であった。
　ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん６１例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者８例が陽性、早期肺腺がん２１例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者８例が陽性、早期肺腺がん１８例が陽性であり、当該基準値における感度は２９．５１％、特異度は８７．８８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．６７６であった。
　別途、ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん６１例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者７例が陽性、早期肺腺がん３２例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者５例が陽性、早期肺腺がん２６例が陽性であり、当該基準値における感度は当該基準値における感度は４２．６２％、特異度は９２．４２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７６６であった。
　〔実施例６〕質量分析による検出
　尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理、分析データの取得、統計解析の手順でキニノーゲン１由来のマーカー探索を行った。前処理は、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００～２５０倍に濃縮し、１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液３ｍＬを用いて３回洗浄して、低分子を除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析行程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、一定濃度のＨ２ １８Ｏを用いて調製した緩衝液中でトリプシン消化した（ペプチドＣ末端の安定同位体標識法）。脱塩、精製後、ｉＴＲＡＱ（８－ｐｌｅｘ、エービーサイエックス社）によるラベル化を行い、８検体を混合、脱塩、精製した後、タンパク質断片由来のＣ末端トリプシン消化ペプチドのみをイオン交換クロマトグラフィーにより分画した（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ　ＡTM（ＰｏｌｙＬＣ　Ｉｎｃ．　ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ　ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０－１００％）させて分離）。その画分を脱塩、精製後、Ｎａｎｏ－ＬＣ（ＬＣカラム：内径７５μｍ、長さ１００ｍｍ、充填剤Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　Ｃ１８（粒子径３μｍ）；流速：２５０ｎＬ／分；溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸水中でアセトニトリル濃度勾配（３－８０％）により分離）／ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳ（エービーサイエックス社）により測定を行い、Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのみを選別、抽出した（独自開発プログラム“ｉＳｐｅｃ“；文献：Ｆｅｒｎaｎｄｅｚ－ｄｅ－Ｃｏｓｓｉｏ　Ｊ．、Ｔａｋａｏ　Ｔ．ｅｔ　ａｌ．Ｒａｐｉｄ　Ｃｏｍｍｕｎ．　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８、２４６５－２４７２（２００４））。アッセイ間の比較は、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に含まれる比較定量に関わるレポーターピーク（ｍ／ｚ　１１３～１１９、１２１）の内のコントロールピーク（ｍ／ｚ　１１３、各アッセイに等量スパイクした）の強度で他のレポーターピークを規格化した後に行った。具体的な評価基準として、定性については、一定強度以上のピークの本数が５個以上のＭＳ／ＭＳスペクトルを選択し、かつ、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルを基に同定されたタンパク質の数が５０個以上のアッセイを採用した。定量については、基準のレポーターピーク（ｍ／ｚ１１３）のピーク強度が１０より大きく、かつ、ＭＳ／ＭＳスペクトル数が３００個以上のアッセイのみの定量値を用いた。
　〔実施例７〕統計解析
　肺腺がん５８例（ＩＡ期５例、ＩＢ期１例、ＩＩＩＡ期３例、ＩＩＩｂ期８例およびＩＶ期４１例）、良性呼吸器疾患３０例（気管支喘息、膿胸、肺吸虫症、非結核性抗酸菌症、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、サルコイドーシス症、炎症性偽腫瘍、細菌性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症）および健常者２５例の尿試料　から得られた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの各Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのピーク強度（実施例６）について、コントロール検体のピーク強度に対する相対比をそれぞれ算出し、肺腺がん群と非肺腺がん群（良性呼吸器疾患および健常者）の間で比較検討した。肺腺がん５８例と非肺腺がん群５５例におけるキニノーゲン１由来の尿中タンパク質断片のピーク検出率をＦｉｓｈｅｒ’ｓ　ｅｘａｃｔ　ｔｅｓｔで検定し、ｐ値が０．０１未満であるものを抽出した。統計解析はＪＭＰ１２（ＳＡＳ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用した。キニノーゲン１由来のＣ末端アミノ酸配列をＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡとするタンパク質断片は、肺腺がん５８例中２６例と非肺腺がん群５５例中２例で検出され、上記の基準を満たした（ｐ値＜０．０００１）。非肺腺がん群の健常者で検出されたピーク強度を基準とした場合、該当基準値における感度、特異度およびＲＯＣ－ＡＵＣ値は３７．９３％、９６．３６％および０．７０８であった。
　〔実施例８〕
　早期肺腺がん２５例（ＩＡ期１８例、ＩＢ期５例、およびＩＩＡ期１例）および健常者２５例の尿試料から得られた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの各Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのピーク強度（実施例６）について、コントロール検体のピーク強度に対する相対比をそれぞれ算出し、早期肺腺がん群と健常者の間で比較検討した。キニノーゲン１由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳとするタンパク質断片は、健常者で検出されたピーク強度の１．２５倍を基準値とした場合、早期肺腺がん２４例中１０例が陽性の結果であった。当該基準値における感度は４１．７％、特異度は７２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．６４４であった。
　〔実施例９〕
　実施例８とは別に、肺腺がん３７例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．００５）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん２３例が陽性であった。当該基準値における感度は当該基準値における感度は６３．２％、特異度は７８．２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７５７であった。
　〔実施例１０〕
　別途、早期肺腺がん２２例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．００５）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん１６例が陽性であった。当該基準値における感度は７２．７％、特異度は７８．２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４２であった。
　〔実施例１１〕
　別途、肺腺がん３７例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．０４４）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん２９例が陽性であった。当該基準値における感度は当該基準値における感度は７３．７％、特異度は８０％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８６５であった。
　〔実施例１２〕
　別途、早期肺腺がん２２例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．０４４）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん１６例が陽性であった。当該基準値における感度は７２．３％、特異度は８０％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４２であった。
　〔実施例１３〕
　経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、肉腫様がん２例（多形がん１例、癌肉腫１例）、大細胞がん１例および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。各肺がん症例における断片化率は、多形がんが０．１２５、癌肉腫が０．１６２、大細胞がんが０．１３５であり、各肺がん症例における断片化率は、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
　〔実施例１４〕
　経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、扁平上皮がん４例（ＩＢ期２例、ＩＩＩＡ期１例、ＩＩＩＢ期１例）および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。扁平上皮がん症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、ＩＢ期が０．０９８と０．０９０、ＩＩＩＡ期が０．１９、ＩＩＩＢ期が０．４４であり、扁平上皮がん４例すべてが、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
　〔実施例１５〕
　経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、小細胞肺がん４例および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。扁平上皮がん症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、それぞれ０．０６９、０．１３１、０．７４７、０．７５４であり、小細胞肺がん４例すべてが、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
　〔実施例１６〕ＥＬＩＳＡによる検出および血清ＣＥＡとの有用性の比較
　ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん２５例と健常者３５名の血清検体（１０μＬ）をＥＬＩＳＡ法に供し、血清中のキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片濃度を測定した。血清中のキニノーゲンＩ由来の断片の濃度測定には、調製した免疫原溶液をニワトリに投与して免疫することにより、ニワトリ血清中から回収したＣ末端アミノ酸配列をＣＱＰＬＧとするキニノーゲンＩ由来の断片を特異的に認識する抗体を用いた。健常者平均の１．２倍を陽性とした場合、早期肺腺がん２５例中１３例が陽性であると判断できた。当該基準値における感度は５２％、特異度は８２．９％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７０６であった。一方、血清ＣＥＡ値の基準値を５．０ ｎｇ／ｍｌとした場合、早期肺腺がん２５例中７例のみが陽性の結果であった。当該基準値における感度は２８％、特異度は７４．２９％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．５３４であった。
　〔実施例１７〕肺腺がんの進行に伴う尿中マーカーの変動
　胸部ＣＴ検査にて、右下葉末梢に肺腺がんが疑われる１．４ｃｍ大のすりガラス状結節影を認めた症例の尿を経時的に採取し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率と結節影のサイズを、外科的肺生検により肺腺がんの診断を得た時点と比較した。本症例における術後病期はＴ１ｂＮ０Ｍ０、ｐＳｔａｇｅＩＡであった。手術２４か月前と手術時点の胸部ＣＴ検査を比較した結果、手術時点では結節影のサイズが１．９ｃｍへ増大していた。また、同部の結節はＰＥＴ－ＣＴ検査において、ＦＤＧの高度な集積を認めた（図８）。手術２４か月前、１８か月前、１２か月前、６か月前、手術時において、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率はそれぞれ、０．４６８、０．５６５、０．５８、０．９５６、１．０８であり、腺がんの増大に伴い増加していた。
　〔実施例１８〕肺腺がん切除後の尿中マーカーの変動
　早期肺腺がん１１例（ＩＡ期５例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）において、肺がん切除術の前後で回収した尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。手術後の尿検体の解析には、手術後１４日以降に回収した尿を用いた。早期肺腺がん１１例中８例の尿検体において、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率が低下していた。１１例全体の平均値では、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率が、０．３７８から０．２０５へ、４５．７７％低下した（図９）。
　〔実施例１９〕肺腺がんの治療による尿中マーカーの変動
　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子変異陽性のＩＶ期肺腺がん１例において回収した尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療前と治療開始２か月後で比較した。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療効果は、３７．１％の腫瘍縮小率を認め（図１０）、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ｃｒｉｔｅｒｉａ　Ｉｎ　Ｓｏｌｉｄ　Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）におけるＰａｒｔｉａｌ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅの基準を満たした。治療２か月後のキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、治療前と比較して、０．０７８３から０．０６４８へ、１７．２％の低下を認めた。
　〔実施例２０〕
　キニノーゲンＩタンパク質の切断を効率的に検知するため、アミノ酸配列ＩＹＰＴＶＮＣＱＰまたはアミノ酸配列ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端とするトリプシン消化ペプチドの存在量（Ｃｘ）と、Ｃ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭとするタンパク質断片の存在量（Ｉｘ）の２種を用いて、キニノーゲンＩタンパク質の断片化指数（Ｆｘ）を以下の計算式により求めた。健常者の平均値に対して、患者試料で断片化指数が１．２５倍以上高いものを陽性とした。
［式２］タンパク質断片化指数（Ｆｘ）＝Ｃｘ／Ｉｘ
　〔実施例２１〕
　肺腺がん２７例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＶ期６例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（４．８２）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１４例が陽性、肺腺がん１４例が陽性であり、当該基準値における感度は７１．４％、特異度は７１．４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８２９であった。
　〔実施例２２〕
　早期肺腺がん１９例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（４．８２）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１４例が陽性、肺腺がん１４例が陽性であり、当該基準値における感度は７３．７％、特異度は７１．４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８１５であった。
　〔実施例２３〕
　肺腺がん２７例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＶ期６例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん２１例が陽性であり、当該基準値における感度は７５％、特異度は７５．５％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４８であった。
　〔実施例２４〕
　早期肺腺がん１９例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（０．４３７）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん１３例が陽性であり、当該基準値における感度は６８．４％、特異度は７５．５％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８６０であった。
　〔実施例２５〕
　進行期肺腺がん１５例（ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭとするタンパク質断片とＣ末端をＹＦＩＤＦＶＡＲとするトリプシン消化ペプチドの存在量を測定し、正常なキニノーゲンＩ由来の蛋白質断片であるＣ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭの存在比を比較した。健常者群の平均値（０．００７５）に対して、患者試料で断片の存在比が４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者１５例が陽性、肺腺がん１１例が陽性であった。当該基準値における感度は７３．３％、特異度は７２．７３％であった。
　〔実施例２６〕
　肺腺がん３４例（ＩＡ期１４例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期３例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩB期３例、ＩＶ期９例）と健常者５３名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のアミノ酸３４５位から３６２位までのトリプシン消化ペプチド（ＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫ）に対するアミノ酸３３１位から３４３位までのトリプシン消化ペプチド（ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫ）のピーク強度比（前者ペプチドに対する後者ペプチドの存在度を反映する）を算出したところ、健常者群の平均値（０．３５３）に対して、肺がん患者試料では０．１５０と低値であった。患者試料において、トリプシン消化ペプチドＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫに対するトリプシン消化ペプチドＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫのピーク強度比が、健常者平均より４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者６例が陽性、肺腺がん２４例が陽性であった。当該基準値における感度は７０．６％、特異度は８８．６８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．９であった。
　〔実施例２７〕
　肺腺がん３４例（ＩＡ期１４例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期３例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩB期３例、ＩＶ期９例）と健常者５３名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のアミノ酸３４５位から３６２位までのトリプシン消化ペプチド（ＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫ）に対するアミノ酸２０９位から２１９位までのトリプシン消化ペプチド（ＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫ）のピーク強度比（前者ペプチドに対する後者ペプチドの存在度を反映する）を算出したところ、健常者群の平均値（５．４２３）に対して、肺がん患者試料では２．０と低値であった。患者試料において、トリプシン消化ペプチドＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫに対するトリプシン消化ペプチドＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫのピーク強度比が、健常者平均より４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者３例が陽性、肺腺がん３１例が陽性であった。当該基準値における感度は９１．２％、特異度は９４．３４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．９７２であった。

Claims (12)

  1. 　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺がんの検出方法。
  2. 　前記キニノーゲンＩの不正常な切断が、該キニノーゲンＩ中のペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該キニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、請求項１記載の肺がんの検出方法。
  3. 　前記被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、請求項１または２記載の肺がんの検出方法：
    （１）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
    （２）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；
    （３）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；および
    （４）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の量または存在を検知すること。
  4. 　請求項１記載の肺がんの検出方法であって、
    　前記キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、肺腺がんの検出方法：
    （ａ）ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｂ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片;
    （ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
    （ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
  5. 　前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
    　被検体試料中に存在するキニノーゲンＩ由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはキニノーゲンＩ由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、請求項１～４のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
  6. 　前記被検体由来試料が、尿または血液から選択される、請求項１～５のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
  7. 　質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも1種の方法を用いる工程を含む、請求項１～６のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
  8. 　前記肺がんが、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんである、請求項１～７のいずれか１項記載のがんの検出方法。
  9. 　請求項１記載の肺がんの検出方法であって、前記キニノーゲンＩにおける不正常な切断の有無が、該キニノーゲンＩの断片化率によって決定され、該断片化率が、
    　キニノーゲンＩタンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
    　Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
    　Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来タンパク質全量
    　で得られる、肺がんの検出方法。
  10. 　前記肺がんの検出方法が、早期肺がんの診断補助の為の検出、肺がんの診断の為の検出、肺がんの進行の検出、肺がんの再発の有無の予測の為の検出、及び肺がんの治療効果の有無の為の検出からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項１～９のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
  11. 　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の発現レベルに基づくデータを正常な切断として検知されるキニノーゲンIの発現レベルデータと比較する比較工程を含み、比較により被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断に由来するペプチドの量が、正常値より高いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。
  12. 　被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の１つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、
    　該ペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。 
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