JP7144014B2 - 肺がんの検出方法 - Google Patents

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Description

本発明は、肺がんの検出方法に関する。
世界のがん年間死亡数において、最も多いものは肺がんである。２０１２年には、世界で１６０万人が肺がんにより死亡したと予測されている。我が国では、年間７万４０００人が肺がんにより死亡し、がん死亡原因において、肺がんが第１位の疾患である。肺がんは、小細胞肺がんと非小細胞肺がんに分類され、肺がん患者全体の１５％が小細胞肺がんであり、残りの８５％が非小細胞肺がんである。さらに、非小細胞肺がんは、病理組織学的に、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がんやがん肉腫などの肉腫様がんなどのタイプに分けることができる。
肺がんの生存率は臨床病期の進行と共に低下する。例えば手術が可能な臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期の非小細胞肺がんでは、５年生存率がそれぞれ８２．０％、６６．１％、５４．５％、４６．１％および４２．８％であり（非特許文献１）、手術適応のない臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期の非小細胞肺がんでは、生存期間中央値はそれぞれ２２．４か月（非特許文献２）および１０．３か月（非特許文献３）である。
肺がんに対する既存の腫瘍マーカーとして、肺腺がんに対する血清Ｃａｒｃｉｎｏ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ）、肺扁平上皮がんに対するｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ １９ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＣＹＦＲＡ ２１－１）、肺小細胞がんに対するＮｅｕｒｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｏｌａｓｅ（ＮＳＥ）などが臨床的な診断に用いられている。しかし、肺腺がん症例におけるＣＥＡの陽性率は３６．６～５６．５％に過ぎず（非特許文献４ 、５）、特にＩ期の早期肺腺がんでは陽性率が２７％と低いため（非特許文献５）、ＣＥＡでは根治可能な病期で肺腺がんを診断することは困難である。また、肺扁平上皮がん症例におけるＣＹＦＲＡ ２１－１の陽性率は５７％（非特許文献６）、小細胞肺がん症例におけるＮＳＥの陽性率は４５％であり（非特許文献７）、既存の腫瘍マーカーより高感度に肺がんを検出することが可能なマーカーの開発が求められている。
臨床応用に向けて開発が進められている腫瘍マーカーとして、血清ＣＹＢＰ（特許文献１）、ＵＢＥ２Ｌ３（特許文献２）等が上げられるが、患者の血液採取を必須条件とし、侵襲的である。このような検査ではより低侵襲であることが求められる。
特表２０１２－５２６９７６ 特開２０１４－１１５１８６
Sawabata N、et al.、J Thorac Oncol. 6:1229-35、2011. Atagi S、 et al.、 Lancet Oncol. 13:671-8、2012. Scagliotti GV、 et al.、 J Clin Oncol. 26:3543-51、2008. Molina R、 et al.、 Am J Respir Crit Care Med. 193:427-37、 2016 Matsuoka K、 et al.、 Eur J Cardiothorac Surg. 32:435-9、 2007. Rastel D、et al.、Eur J Cancer. 30A:601-6、1994. Stieber P、et al.、 Anticancer Res. 19(4A):2673-8、1999.
本発明は、肺がんの検出方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、肺がん患者に特異的に見られる、体液中のキニノーゲンＩの断片化の増加や正常な構造を有するタンパク質の減少、タンパク質の不正常な位置での切れ目や中間位置の欠損による露出部を見出し、簡易で低侵襲性または非侵襲性の肺がん検出方法を確立すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の[１]～[１２]を提供し得るものである。
[項１]
被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺がんの検出方法。
[項２]
前記キニノーゲンＩの不正常な切断が、該キニノーゲンＩ中のペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断および／または該キニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断である、項１記載の肺がんの検出方法。
[項３]
前記被検体由来試料中における、キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む、項１または２記載の肺がんの検出方法：
（１）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の量または存在を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の量または存在を検知すること。
[項４]
項１記載の肺がんの検出方法であって、
前記キニノーゲンＩの不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程が、以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくともいずれか１種の量または存在を検知することを含む、肺腺がんの検出方法：
(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｃ)ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。

［項５］
前記不正常な切断をインビトロで検知する工程が、
被検体試料中に存在するキニノーゲンＩ由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはキニノーゲンＩ由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む、項１～４のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
［項６］
前記被検体由来試料が、尿または血液から選択される、項１～５のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
［項７］
質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を用いる工程を含む、項１～６のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
[項８]
上記肺がんが、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんである、項１～７のいずれか１項記載のがんの検出方法。
［項９］
項１記載の肺がんの検出方法であって、前記キニノーゲンＩにおける不正常な切断の有無が、該キニノーゲンＩの断片化率によって決定され、該断片化率が、
キニノーゲンＩタンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来タンパク質全量
で得られる、肺がんの検出方法。
[項１０]
前記肺がんの検出方法が、早期肺がんの診断補助の為の検出、肺がんの診断の為の検出、肺がんの進行の検出、肺がんの再発の有無の予測の為の検出、及び肺がんの治療効果の有無の為の検出からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、項１～９のいずれか１項記載の肺がんの検出方法。
[項１１]
被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の発現レベルに基づくデータを正常な切断として検知されるキニノーゲンIの発現レベルデータと比較する比較工程を含み、比較により被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断に由来するペプチドの量が、正常値より高いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。
[項１２]
被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の１つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、
該ペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラム。
本発明により、肺がんを尿や血液などの体液を用いて低侵襲の方法で検出することができる。
図１は、健常者と肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図２は、健常者と肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図３は、健常者と早期肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図４は、健常者と早期肺腺がん患者の被検体由来試料（尿）をインビトロで処理した後の、ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片の量比を示す図である。 図５は、被検体由来試料（尿）のインビトロでの処理により、ＥＹＣＧＶＰＧＤＧＤＥＥＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片が高値に見出された肺腺がん症例における胸部ＣＴ画像を示す図である。右肺上葉Ｓ１に胸膜の陥入と気管支透亮および周囲にすりガラス影を伴う約２ｃｍ大の原発巣を認める。 図６は、図５と同じ患者におけるＰＥＴ－ＣＴ胸部画像を示す図である。胸部ＣＴ検査で認められた原発巣に一致して、ＰＥＴの異常集積を認める。 図７は、図５と同じ患者における経気管支生検で採取した肺腺がん組織像（Ｈ－Ｅ染色および抗ＴＴＦ－１抗体を用いた免疫組織化学発光）である。 図８は、肺腺がん症例における、キニノーゲンＩ断片化率の経時的変化を示すグラフ（ａ）と同症例の胸部ＣＴ画像およびＰＥＴ－ＣＴ画像を示す図（ｂ）である。 図９は、早期肺腺がん症例における手術前後の断片化率の変化を示すグラフである。 図１０は、ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子変異陽性のＩＶ期肺腺がん症例における、胸部ＣＴ画像を示す図である。
[肺がんの検出方法]
本発明の肺がんの検出方法は、本発明者らによる新たな発見に基づく。すなわち、本発明者らは、肺がん患者の体内では、キニノーゲン（Ｋｉｎｉｎｏｇｅｎ）Ｉが、健常者では切断されないような箇所で切断され、様々なタイプの欠損タンパク質または切れ目が生じた当該タンパク質が増加している場合があることを見出した。
すなわち、特定のタンパク質において、Ｃ末端部またはＮ末端部の欠損、不正常な位置でのペプチド結合の切れ目あるいはそれに伴う切れ目からのアミノ酸の欠損などのような不正常な切断という現象が見られることを見出した。
キニノーゲンＩの不正常な切断は、肺がん特異的なプロテアーゼの存在による可能性もある。従って、本発明は、インビトロにおいて、そのような不正常な切断によるキニノーゲンＩの切れ目や欠損を指標として健常者と肺がん患者を区別して評価することができる。一方、キニノーゲンＩの不正常な切断の亢進を、正常タンパク質の量（相対的な量比を含む）の減少を指標として健常者と肺がん患者を区別して評価することも可能となる。
本発明は、被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩについて、不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程を含む肺がんの検出方法である。
本明細書において、キニノーゲンＩの「不正常な切断」は、限定はされないが、キニノーゲンＩの正常な構造とは異なる一次構造、二次構造、あるいは三次構造をもたらす。例えば、キニノーゲンＩにおけるペプチド結合に１以上の切れ目をもたらす切断、キニノーゲンＩの１以上の箇所に、１または２以上のアミノ酸残基の欠損をもたらす切断などが含まれる。
限定はされないが、「不正常な切断」によって、キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質、あるいは、キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質が生じ得る。あるいは、「不正常な切断」によって、タンパク質中のアミノ酸残基同士のペプチド結合の切れまたは任意の中間位置でのアミノ酸の欠損が生じる。
キニノーゲンＩの「不正常な切断」の一態様では、ペプチド結合が切れて新たな切断部位のアミノ酸残基を露出するが、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質からアミノ酸を失うことのない場合がある。このような場合では、生体から取り出した未処理の試料中では当該キニノーゲンＩの欠損あるいは断片化が生じていない場合がある。本発明の不正常な切断は、このような切断も含む。あるいは、このように、例えば、ジスルフィド結合などにより、もとのタンパク質が結合状態を保持してはいるが、ペプチド結合が切れて、そこからさらに、１または２以上のアミノ酸残基が欠如することで、タンパク質中のアミノ酸残基が任意の中間位置で欠損している場合が生じる。
キニノーゲンＩに関連して、本来の正常な翻訳後プロセシングは、ここでの不正常な切断ではない。
本明細書において、「被検体」とは、がんの検出対象となる哺乳動物を指し、限定はされないが、好ましくは、イヌ、ネコ、マウス、あるいはヒトである。
本明細書において、肺がんとは、肺のいずれかの組織に発生するがんをいう。肺がんは、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんであり得る。このうち、肺腺がんとは、肺の分泌腺組織に発生するがんをいう。
本願発明において、肺がんは、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期、臨床病期ＩＩＩＢおよびＩＶ期のいずれの段階のものであってもよい。早期肺がんというときには、臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、およびＩＩＢのいずれかを指す。
本発明の「肺がんの検出」とは、肺がんの罹患の有無の診断補助の為の検出であり得る。さらには、「肺がんの検出」は、肺がんの進行の有無や程度の検出、再発の有無や程度の検出、又は肺がんの手術や抗がん剤治療などの治療効果の有無や効果奏功の程度の検出のいずれも含む。ここで、再発は、手術や抗がん剤治療後の再発を含む。また、治療効果の有無や治療奏功の程度は、典型的には、がんの縮小などで見出されるものである。本発明の方法によれば、簡易にこれらの検出を行うことができる。すなわち、本発明のキニノーゲンＩの「不正常な切断」は、肺がんの罹患に伴い見出され得る。さらには、肺がんの進行に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断の割合が増加し得る。さらには、肺がんの再発に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断が見出されたり、増加したりし得る。さらには、肺がんの手術や抗がん剤治療の効果奏功に伴って、キニノーゲンＩの不正常な切断は減少し得る。
本明細書において、「被検体由来試料」とは、被検体に由来する体液を指し、体液そのものの他、体液の濃縮液、希釈液、あるいはその他の適宜の処理済みの液体を指す。ここで、体液は、限定はされないが、例えば、尿、血液（全血、血漿、血清）、痰、汗、髄液、消化液、腹水、を指す。好ましくは、体液は、尿または血液であり、特に好ましくは尿である。ここで、尿は、早朝中間尿、蓄尿、随時尿のいずれでもあり得る。尿や血液などの体液の採取量は、１０μｌ～２００ｍｌ、好ましくは、１００μｌ～１００ｍｌ、さらに好ましくは、１ｍｌ～１００ｍｌである。
ここで、体液の処理は、より詳細には、濃縮、希釈、分画、脱塩等の前処理、グリセリン等の保存剤、プロテアーゼ阻害剤等の安定化剤、防腐剤を加えることなどを指す。冷蔵または冷凍処理した後に常温に戻すこと、冷蔵または冷凍処理前後のいずれかで適宜の処理を行うことなども含まれる。さらに、例えば体液が血液の場合には、適宜の処理として抗凝血剤処理を行うこともできる。これらの処理を組み合わせることも可能である。
体液が尿の場合には、測定前に前処理として濃縮を含む操作を行うことが好ましい。この濃縮方法は特に限定されないが、分画分子量の限外ろ過膜を用いた方法、凍結濃縮、減圧または真空濃縮、加熱などが挙げられる。分画分子量としては、限定はされず、例えば、３ｋＤ、１０ｋＤ、３０ｋＤ、５０ｋＤなど任意の値を用いることができる。
例えば、体液が尿の場合、原尿の総タンパク質量の濃度は、０．００１ｇ／ｄＬ～０．６ｇ／ｄＬ程度であるため、濃縮は有用な前処理である。原尿を２００～２５０倍に濃縮して分析に用いることができる。この濃縮液をそのまま測定に供することも可能であるが、さらに総タンパク質量を希釈して調整して測定に供することもできる。例えば、ウエスタンブロットなどの測定手法によっては、０．１μｇ～１０μｇ／μｌ程度に調整して測定に供することもできる。
濃縮は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標、サルトリウス・ジャパン株式会社製）、アミコンウルトラ（メルクミリポア社製）などを使用して、製造者の指示に従って使用することもできる。
希釈は、蒸留水や緩衝液を用いて行うことができ、濃縮尿の調整にも利用することができる。
キニノーゲンＩの欠損は、一次構造で比較した場合に、由来する全長タンパク質のＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置のアミノ酸残基の欠損があれば特にその大きさや長さに限定はない。ここでＣ末端部、Ｎ末端部、あるいは中間位置に欠損があるとは、通常そのタンパク質が正常に機能する単位のタンパク質よりもＣ末端側、Ｎ末端側が短いか、中間位置に存在すべきアミノ酸残基が欠如していることを意味する。
本明細書において、タンパク質断片の配列が特定されている場合には、それぞれの表記記号は、アミノ酸残基の一文字表記として使用されている通常の文字を意味する。
具体的には、
Ａ Ａｌａ Ａｌａｎｉｎｅ アラニン
Ｃ Ｃｙｓ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ システイン
Ｄ Ａｓｐ Ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ アスパラギン酸
Ｅ Ｇｌｕ Ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ グルタミン酸
Ｆ Ｐｈｅ Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ フェニルアラニン
Ｇ Ｇｌｙ Ｇｌｙｃｉｎｅ グリシン
Ｈ Ｈｉｓ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ヒスチジン
Ｉ Ｉｌｅ Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ イソロイシン
Ｋ Ｌｙｓ Ｌｙｓｉｎｅ リシン
Ｌ Ｌｅｕ Ｌｅｕｃｉｎｅ ロイシン
Ｍ Ｍｅｔ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ メチオニン
Ｎ Ａｓｎ Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ アスパラギン
Ｐ Ｐｒｏ Ｐｒｏｌｉｎｅ プロリン
Ｑ Ｇｌｎ Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ グルタミン
Ｒ Ａｒｇ Ａｒｇｉｎｉｎｅ アルギニン
Ｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒｉｎｅ セリン
Ｔ Ｔｈｒ Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ トレオニン
Ｖ Ｖａｌ Ｖａｌｉｎｅ バリン
Ｗ Ｔｒｐ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ トリプトファン
Ｙ Ｔｙｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ チロシン
本発明において、被検体由来試料中のキニノーゲンＩについて、不正常な切断の有無をインビトロで検知する工程は、限定はされないが、好ましくは、以下の（１）～（４）からなる群より選択される少なくとも１つを含む工程であり得る。
（１）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知すること；
（２）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＣ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；
（３）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質断片の量または存在を検知すること；および
（４）該被検体由来試料中における該キニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切れ目又は欠損を有するタンパク質の量または存在を検知すること。
限定はされないが、本発明の肺がんの検出方法の１つの態様では、被検体由来試料における１または２以上のキニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質の量の減少を検知する。具体的には、例えば、正常な構造を有するキニノーゲンＩの量を、当該キニノーゲンＩのＣ末端部のアミノ酸配列および／またはＮ末端部のアミノ酸配列の有無によって測定し、正常な構造を有するタンパク質の量が健常者と比較して相対的に減少しているか否かを検出することができる。
限定はされないが、本発明の肺がんの検出方法の別の態様では、被検体由来試料を用いて、インビトロにおいて、キニノーゲンIのタンパク質断片を検知することを含む。このようなタンパク質断片の検知は、被検体由来試料中に断片化した状態で存在するタンパク質断片および／または例えば被検体由来試料を還元処理等に供した後に生じるタンパク質断片を検知することであり得る。
具体的には、キニノーゲンＩのタンパク質断片の量をインビトロで測定する工程では、キニノーゲンＩのタンパク質断片が、該タンパク質の全長と比較してＣ末端側に欠損があるタンパク質に由来する断片または中間部位に切れ目および／またはアミノ酸の欠損があるタンパク質に由来する断片であることが好ましい。
本明細書で、キニノーゲンＩのタンパク質断片のＣ末端配列が記載されている場合には、例えば、「ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」、「ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」、「ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」などと表現される。例えば、「ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片」の場合、全長タンパク質では右端に示されるＴよりもＣ末端部側に本来存在していたアミノ酸残基は欠損（欠如）していることを示しており、１番目のＥよりＮ末端側へはアミノ酸残基は存在していても存在していなくてもよいことを意味する。
キニノーゲンＩのタンパク質断片は、以下からなる群より選択される少なくとも１つ以上であることが好ましい。
(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片（本明細書においてＰ１ともいう）；
(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片（本明細書において、Ｐ２ともいう）；
(ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
さらに、このようなキニノーゲンＩのタンパク質断片からなる群より選択される少なくとも１つ以上をインビトロで測定することによって、例えば早期肺腺がんなどの早期肺がんの検出が可能である。
ここで、キニノーゲンＩのタンパク質断片におけるアミノ酸残基の数は特に限定はされないが、好ましくは少なくとも１０残基以上、より好ましくは少なくとも５０残基以上である。タンパク質断片のサイズの上限は特に限定はされず、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質のサイズ未満である。例えば、限定はされないが、それぞれのタンパク質断片の由来である全長タンパク質と比較して、Ｃ末端側が欠損している構造のタンパク質断片である。タンパク質断片は、全長未満であれば特に上限はないが、場合によっては、２００残基以下、好ましくは１００残基以下のような短い断片で存在することも可能である。
さらに、被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩのＮ末端側にアミノ酸残基の欠損があるタンパク質の存在または相対量の増加を検知すること；または被検体由来試料中におけるキニノーゲンＩについて、アミノ酸配列の任意の中間部位の切断又は欠損の存在または相対量の増加を検知するために、Ｎ末端側が欠如したＣ末端側の遊離したタンパク質断片を検出することも可能である。このような断片を検出することで、（ａ）～（ｆ）のタンパク質断片を間接的に検出したり、Ｎ末端が生体内で欠損しているタンパク質断片の存在を検知したりすることもできる。
本発明のキニノーゲンＩタンパク質断片の分子量は、全長タンパク質未満であれば限定はされない。但し、例えば尿などの検体を用いて肺がんを検出する方法によっては、例えば３ｋＤａ以上全長未満、好ましくは１０ｋＤａ以上全長未満である。
さらには、これらのキニノーゲンＩタンパク質断片は、それぞれ、上記配列を有してさえいれば、糖鎖付加やリン酸化等の翻訳後修飾を受けたものも含まれる。
以下、キニノーゲンＩのタンパク質断片の配列を特定のデータベースに含まれる特定の配列（配列表の配列番号１又は２）で例示しながら説明する。当業者には明らかな通り、これらの配列や配列中におけるアミノ酸残基の位置およびアミノ酸残基数は、個人により変わる場合もあり、またデータベースによって掲載配列が異なる場合もある。配列は本発明の説明の為のものであり、本発明を限定するものではない。
ここで、キニノーゲンＩは、カリクレイン-キニン系で重要な役割を果たすタンパク質である。この代謝系は、種々の生理活性を有するキニン類を生成させる一連の生体内反応系である。
カリクレイン-キニン系は、生体内において様々な酵素反応系、例えばレニン－アンジオテンシン‐アルドステロン系、血液凝固系等と関連をもって生体の機能調節に関わっている。生成物であるブラジキニン等のキニン類は、末梢血管拡張に伴う降圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発痛、白血球の遊走など種々の生理活性を示す。キニノーゲンＩは、このキニンの前駆体となるタンパク質であり、内因系血液凝固因子の一つである。女性生殖器に非常に高濃度で存在し、ブラジキニンを放出することにより、カリクレイン-キニン系を介して妊娠分娩にも重要な役割を持つとされている。また、不育症との関係も示唆されている。
キニノーゲンＩは、前駆体配列として、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１０４２の配列（配列表の配列番号１）又はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１０４２－２の配列（配列表の配列番号２）がある。
キニノーゲンＩには、いくつかの代表的なアイソフォーム（高分子量型および低分子量型）がある。高分子量型は（配列表の配列番号１）、６４４アミノ酸からなる前駆体として合成されアミノ酸番号１位～１８位がシグナルペプチドである。成熟体（アミノ酸番号１９位～６４４位）はさらに、プロセッシングにより重鎖（アミノ酸番号１９位～３８０位）と軽鎖（アミノ酸番号３９０位～６４４位）になり、ブラジキニン（アミノ酸番号３８１位～３８９位）を放出する。さらに、Ｔ－キニン（アミノ酸番号３７６位～３８９位）あるいはリジルブラジキニン（３８０位～３８９位）などへの切断、低分子量growth-promoting factor（ＧＰＦ）（アミノ酸番号４３１位～４３４位）への切断があり得る。低分子量型は、主に３種類の配列が報告されており、配列表の配列番号２に示す配列は、重鎖とブラジキニン部分の配列は、高分子量型と同一であるが、軽鎖の配列が異なっており、配列表の配列番号３に示す配列は、配列表の配列番号２に示す配列の１８９位～２２４位の部位が欠損したもので、配列表の配列番号４に示す配列は、配列番号２に示す配列の１位～１５３位が１７個のアミノ酸に置換し、さらに、１７７位のMetがThrに置換したものである。いずれの低分子量型も血液凝固系には関係していないことが知られている。本明細書では、配列表の配列番号１に高分子量型の例を開示し、配列表の配列番号２～４に低分子型の例を開示する。
本明細書でいう「キニノーゲンＩの正常な構造を有するタンパク質」、「正常な構造のキニノーゲンＩ」は、成熟体（配列表の配列番号１における１９位～６４４位のアミノ酸、配列表の配列番号２における１９位から４２７位のアミノ酸、配列表の配列番号３における１９位から３９１位のアミノ酸、配列表の配列番号４における１位から２９１位のアミノ酸）、重鎖（配列表の配列番号１又は２を基準とした場合、アミノ酸番号１９位～３８０位のアミノ酸）、軽鎖（配列表の配列番号１のアミノ酸番号３９０位～６４４位のアミノ酸又は配列表の配列番号２のアミノ酸番号３９０位～４２７位のアミノ酸、あるいは配列表の配列番号３～４の対応箇所）、ブラジキニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３８１位～３８９位のアミノ酸、あるいは配列表の配列番号３～４の対応箇所）を放出する。さらに、Ｔ－キニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３７６位～３８９位のアミノ酸）あるいはリジルブラジキニン（配列表の配列番号１又は２におけるアミノ酸番号３８０位～３８９位のアミノ酸）などへの切断、低分子量growth-promoting factor（ＧＰＦ）（配列表の配列番号１におけるアミノ酸番号アミノ酸番号４３１位～４３４位のアミノ酸）への切断があり得る。これらはいずれも正常な構造である。
本明細書でいう「不正常な位置での切断」とは、シグナルペプチドと成熟体への切断、重鎖、軽鎖、ブラジキニン、Ｔ－キニン、リジルブラジキニン、および低分子量ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＰＦ）からなる群より選択される鎖以外への切断である。肺がんにおいて活性が亢進する酵素、例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ群などにより切断を受けることで、本来は起らない切断部位での切断が生じ、副次的に断片化やアミノ酸の欠損が亢進し得ると考えられる。
本明細書でいう不正常な切断の一例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると、３３１位のアミノ酸残基から３４２位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３４３位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７４位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７５位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。また、別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１の配列で説明すると５２１位のアミノ酸残基から５３６位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、５３７位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７７位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７８位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７３位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７４位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。また、さらに別の態様では、本明細書でいう不正常な切断の別の例として検出され得るキニノーゲンＩタンパク質断片は、配列表の配列番号１又は２の配列で説明すると３６４位のアミノ酸残基から３７２位のアミノ酸残基と一致するＣ末端部分を有し、３７３位以降からのＣ末端側が欠損しているタンパク質断片であってもよい。
本発明の不正常な切断を検知する方法において、正常な構造を有するキニノーゲンＩ量またはその存在、キニノーゲンＩタンパク質断片の量またはその存在は、被検体由来試料である体液中に含まれるそれらの質量、分子量、または濃度などで検出することができる。さらには、蛍光強度、吸光度、ＭＳ／ＭＳスペクトルの強度等で表わすことも可能である。
さらに、本発明における検出方法は、被検体由来試料中に含まれる、不正常な切断を検知する方法または正常な構造を有するタンパク質を検出する方法であれば特に制限されるものではない。例えば、質量分析により検出する方法の他、抗体を用いた免疫化学的測定法（ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、ウエスタンブロット法など）で検出する方法を挙げることができる。
質量分析による方法としては、被検体由来試料中の正常な構造を有するキニノーゲンＩまたは不正常な切断に由来するキニノーゲンＩのタンパク質断片を検出する方法であれば特に制限されるものではない。具体的には、例えば、試料を採取し、前処理および／または還元処理後に酵素消化し、同位体等で標識した後、ＭＳ／ＭＳによってＣ末端由来のペプチドのみの量を測定する方法がある。より具体的には、限定はされないが、被検体由来試料が尿である場合、尿を採取し、前処理として尿検体を濃縮した検体を得て、この濃縮検体を還元アルキル化した後に、Ｈ２ １８Ｏ存在下でトリプシン消化することで、トリプシン消化断片由来のペプチドを安定同位体標識することができる。その後、脱塩、イオン交換クロマトグラフィーによる精製後、Ｎａｎｏ－ＬＣ－ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳにより、Ｃ末端由来のトリプシン消化ペプチドのみを測定する。このペプチド情報を解析することで、正常な構造を有するタンパク質または不正常な切断に由来するキニノーゲンＩタンパク質断片を区別して検出することができる。この他に、例えば、濃縮試料中のタンパク質をＬｙｓ－Ｃで酵素消化した後、すべての消化ペプチドのＮ末端をイソシアン酸フェニルやＴＭＰＰ試薬（Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ－ｍｅｔｈｙｌ）ｔｒｉｓ（２、４、６－ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）といった試薬でブロックし、リジン以外のＣ末端を有するペプチドを得て、質量分析器によるＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、キニノーゲンＩタンパク質断片を測定する方法なども採用できる。
ＭＲＭ（Multiple Reaction Monitoring；多重反応モニタリング）によりキニノーゲンＩのタンパク質断片量を測定する場合には、例えば、高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（QTRAP(R) 5500 System（エービーサイエックス社））やLCMS-8030（島津製作所株式会社製）を用いることもできる。
ラジオイムノアッセイおよびエンザイムイムノアッセイによる方法としては、不正常な切断由来のアミノ酸露出部、キニノーゲンＩのタンパク質断片のＣ末端部、または特定のアミノ酸欠損部を特異的に認識し、対応する正常な構造を有するタンパク質と区別することができる抗体を用いることが望ましい。
被検体由来試料中の正常な構造を有するキニノーゲンＩの量またはキニノーゲンＩタンパク質断片の量を、試料中に共存するキニノーゲンＩ由来のすべてのタンパク質の存在量と比較し、相対比で表すこともできる。あるいは、被検体由来試料中のタンパク質断片の存在量を、被検体由来試料中の総蛋白量と比較し、断片の量と総蛋白量の相対比で表すこともできる。
いずれの測定方法を用いた場合でも、キニノーゲンＩにおける不正常な切断の有無は、被検体試料中におけるキニノーゲンＩの断片化率を算出して、その値が閾値を超えているか否かで判断することができる。すなわち、キニノーゲンＩのタンパク質断片化率が閾値を超えている場合には、由来する被検体が肺腺がんであることが把握できる。
より具体的には、限定はされないが、例えば、キニノーゲンＩの断片化率（Ｆｎ）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とすることができる。
［式１］タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来のタンパク質全量
ここで、Ｃｎにおける各キニノーゲンＩの断片の量とは、１つのキニノーゲンＩタンパク質断片の量（例えば（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのタンパク質断片の量）を指す。
Ｉｎにおける元のタンパク質の量とは、（ａ）～（ｆ）のいずれか１つのタンパク質断片、正常な構造を有する全長タンパク質を含む、試料中のキニノーゲンＩ由来タンパク質の全量を指す。ここで、ＣｎまたはＩｎにおける量は、いずれも、例えばトリプシン消化ペプチドの量の測定によって検知することができる。Ｉｎは、キニノーゲンＩタンパク質断片にも正常な構造を有するキニノーゲンＩにも共通に含まれるトリプシン消化ペプチドの量によって示すことができる。測定方法は、実施例５記載の条件に準ずる。
ここで、共通に含まれる配列は限定はされないが、以下の配列を使用することができる。
ＹＦＩＤＦＶＡＲ（配列表の配列番号１の３１７～３２４位）
被検体由来試料において、正常な構造を有するタンパク質の量が、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、有意に減少した場合、対象者は肺がん患者と判定される。ここで、有意な減少とは、健常者検体と比較して、例えば、上記正常な構造を有する上記蛋白質の相対比として、０．９倍以下、好ましくは、０．８倍以下、より好ましくは、０．６倍以下になることをいう。あるいは、抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できる量の減少が健常者検体と比較して、０．８倍以下、好ましくは、０．６倍以下程度になることをいう。
被検体由来試料におけるキニノーゲンＩタンパク質断片の量を、健常者の検体試料（健常試料）と比較し、タンパク質断片の有意な増加を検出した場合、対象者は肺がん患者と判定される。ここで、有意な増加とは、健常者検体と比較して、例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトル面積として、１．２５倍以上、好ましくは、１．５倍以上、より好ましくは、２．０倍以上の強度になることをいう。あるいは、抗体を用いる場合、標識の強度等から認識できるタンパク質断片の量の増加が健常者検体と比較して、１を超える値、好ましくは１．２倍以上、より好ましくは、１．５倍以上程度になることをいう。
なお、ここでの比較の数値は、内部標準等を用いた補正後の値を指すものとする。
健常者被検体由来試料における正常な構造を有するキニノーゲンＩの量またはキニノーゲンＩタンパク質断片の量などは、被検体由来試料の調製と測定方法に準じて決定することができる。
本発明における特に好ましい態様では、不正常な切断をインビトロで検知する工程が、被検体試料中に存在するキニノーゲンＩ由来の正常な構造を有するタンパク質の量の減少、および／またはキニノーゲンＩ由来のタンパク質断片の量または存在を検知することを含む。ここで、例えば、(ａ)ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端部アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部；(ｂ)ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端部アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、（ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、(ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、(ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部、および(ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片のＣ末端部を認識する抗体を好適に使用することができる。
[抗体]
本発明ではまた、被検体由来試料中のキニノーゲンＩタンパク質断片を測定することができる抗体を含む、肺がん検出用抗体組成物が提供され得る。キニノーゲンＩタンパク質断片を測定する抗体は、キニノーゲンＩタンパク質断片を認識できる抗体であれば限定はされないが、好ましくは、キニノーゲンＩタンパク質断片のＣ末端側の切断を特異的に認識することができ、かつ全長タンパク質などのその他のタンパク質を認識しない抗体である。抗体は、キニノーゲンＩタンパク質断片を特異的に認識することができる抗体であれば、ポリクロ－ナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。これらの抗体は固相に固定化していてもよい。
[プログラム]
本発明はまた、肺がん検出プログラムに関する。肺がん検出プログラムは、被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の発現レベルに基づくデータを正常な切断として検知されるキニノーゲンＩの発現レベルデータと比較する比較工程を含み、比較により被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断に由来するペプチドの量が、正常値より高いことを基準として、肺がんを検出することができる。
本発明はまた、別の態様の肺がん検出プログラムに関する。１つの態様の肺がん検出プログラムでは、被検体由来試料中における、キニノーゲンＩ由来の１つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、該ペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出する、肺がん検出プログラムであり得る。ここで、タンパク質分解酵素は、限定はされず、例えばトリプシンであり得る。詳細には、該消化ペプチドの発現レベルデータを、正常値と比較する比較工程を含み、被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断が、上記のタンパク質分解酵素消化ペプチド内で起きている場合、そのペプチドの量が正常値と比較して低いことを基準として、肺がんを検出することができる。ここで、限定はされないが、例えばトリプシンなどのタンパク質分解酵素による消化ペプチドの発現レベルデータは、内部標準に用いるトリプシン消化ペプチドの発現レベルデータとの比で表すこともできる。
さらに別の態様では、キニノーゲンＩ由来の２つ又は３つ以上のタンパク質分解酵素消化ペプチドの発現レベルデータを相互に比較する比較工程を含み、被検体由来試料のキニノーゲンＩのタンパク質の不正常な切断が、上記のいずれかのタンパク質分解酵素消化ペプチド内で起きている場合、そのペプチドの量が他のペプチドの量と比較して低いことを基準として、肺がんを検出することができる。ここで、限定はされないが、例えばトリプシンなどのタンパク質分解酵素による消化ペプチドの発現レベルデータは、内部標準に用いるトリプシン消化ペプチドの発現レベルデータとの比で表すこともできる。あるいは、消化ペプチドのうちの少なくとも１つは、内部標準に用いるペプチドであってもよい。
本プログラムにおける、キニノーゲンＩ由来の不正常な切断に由来するタンパク質断片の定義を始めとする各要素は、上記[肺がんの検出方法]で述べた内容に準じる。
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕体液の採取
胸部画像検査にて原発性肺がんを疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、経気管支生検、リンパ節生検または細胞診により、肺腺がんと診断した患者を選定した。選定した肺腺がん患者および健常者から早朝中間尿を、滅菌コップを用いて採取した。採取した尿試料は解析までの間‐８０℃で保存した。
肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿のＣ末端タンパク質断片を網羅的に解析した。肺腺がん症例の臨床病期の内訳はＩＡ期４６例、ＩＢ期１５例、ＩＩＡ期１例、ＩＩＢ期１例、ＩＩＩＡ期８例、ＩＩＩｂ期８例およびＩＶ期４５例であった。臨床病期は、日本肺学会編「肺がん取扱い規約 第７版」（金原出版株式会社）に記載された基準に従って判定した。ＩＡ期およびＩＢ期の肺腺がん症例を早期肺腺がん症例と定義した。
〔実施例２〕質量分析による検出
尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理、分析データの取得、統計解析の手順でマーカー探索を行った。肺腺がん診断マーカーおよび早期肺腺がん診断マーカーとして計２種（表１および表２）を同定した。
Figure 0007144014000001
Figure 0007144014000002
〔実施例３〕肺腺がんの評価方法
胸部画像検査にて原発性肺がんを疑う肺内結節影または腫瘤影が存在する患者のうち、手術、肺生検、リンパ節生検または骨生検などの組織診断や、喀痰や胸水などの細胞診により、肺腺がんの診断を行った。肺腺がんの臨床病期の決定については、ＰＥＴ－ＣＴ検査による集積強度、頭部ＭＲＩ検査および胸部ＣＴ検査による画像検査の他、骨生検、リンパ節穿刺吸引細胞診または胸水細胞診検査を用いた。尿中におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片が実施例２で高値を示した肺腺がん症例において、胸部ＣＴ検査では右上葉に２ｃｍ大の結節影を認め（図５）、同部はＰＥＴ－ＣＴ検査で異常な集積を認めた（図６）。経気管支生検で得た組織からＴｈｙｒｏｉｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ （ＴＴＦ－１）が陽性である肺腺がんを検出した（図７）。この症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片のスペクトル面積は健常者の平均値の１１．４６倍であった。
〔実施例４〕肺腺がんの診断におけるCEAとの有用性の比較
肺腺がんと診断した１２４例（実施例１）のうち、血中CEA値が確認できた肺腺がん１１６例において、CEAと尿中タンパク質断片での有用性を比較した。例えば、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片が、実施例2で、健常者の平均値の１．５倍を示すものを陽性とするとした場合、肺腺がん１１６例中６１例が陽性であると判断できた。一方、血中ＣＥＡ値の基準値を８．０ ng/mlとした場合、肺腺がん１１６例中４５例のみが陽性の結果であった。
〔実施例５〕スクリーニング 検体を調製し、ＭＲＭ法に供することで、肺腺がん患者のスクリーニングを行った。尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理および分析データの取得と解析を実行した。具体的には、前処理により、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００～２５０倍に濃縮し、低分子を洗浄により除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析工程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、緩衝液中でトリプシン消化した。脱塩、精製後、タンパク質断片由来のトリプシン消化ペプチドをイオン交換クロマトグラフィーにより分画し（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ ＡＴＭ（ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ． ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０－１００％）させて分離）、タンパク質断片のＣ末端ペプチドを含むトリプシン消化ペプチド混合物を得た。このようにして得られる各試料を別々に高速液体クロマトグラフィー／３連四重極質量分析装置（ＱＴＲＡＰ（Ｒ）５５００ Ｓｙｓｔｅｍ（エービーサイエックス社）、或いは、Agilent社 6470 LC/MS/MS System ）に供し、混合物の分離と同時にペプチドの定量をＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）により行った。各タンパク質の断片化率（Ｆｎ）を以下の計算式により求め、健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．５倍以上高いものを陽性とした。
［式１］タンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
Ｃｎ：各タンパク質断片の量（（ａ）～（ｆ）のタンパク断片配列にあるペプチドの量）

Ｉｎ：各タンパク質断片由来の元のタンパク質の量
ここで、Ｃｎにおける各タンパク質のＣ末端断片の量とは、キニノーゲンＩタンパク質断片の量を指す。Ｉｎにおける元のタンパク質の量とは、タンパク質断片あるいは全長タンパク質に共通に含まれるトリプシン消化ペプチドの量を指す。（共通に含まれるトリプシン消化ペプチドとしては、ＹＦＩＤＦＶＡＲ）。
肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者８例が陽性、肺腺がん６１例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者８例が陽性、肺腺がん５３例が陽性であり、当該基準値における感度は４２．７４％、特異度は８７．８８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７６６であった。
別途、肺腺がん１２４例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者７例が陽性、肺腺がん７８例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者５例が陽性、肺腺がん６８例が陽性であり、当該基準値における感度は当該基準値における感度は５４．８４％、特異度は９２．４２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８１４であった。
ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん６１例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者８例が陽性、早期肺腺がん２１例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者８例が陽性、早期肺腺がん１８例が陽性であり、当該基準値における感度は２９．５１％、特異度は８７．８８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．６７６であった。
別途、ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん６１例と健常者６６名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者７例が陽性、早期肺腺がん３２例が陽性であった。断片化率が健常者群の平均値に対して１．５倍を基準とした場合、健常者５例が陽性、早期肺腺がん２６例が陽性であり、当該基準値における感度は当該基準値における感度は４２．６２％、特異度は９２．４２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７６６であった。
〔実施例６〕質量分析による検出
尿試料（～５０ｍＬ）を採取し、前処理、分析データの取得、統計解析の手順でキニノーゲン１由来のマーカー探索を行った。前処理は、尿試料をアミコンウルトラ‐１５（１０ｋＤａ分子量カット）、及びアミコンウルトラ‐４（１０ｋＤａ分子量カット）（メルクミリポア社）を用いて２００～２５０倍に濃縮し、１００ｍＭ ＮａＣｌを含む炭酸水素トリエチルアンモニウム水溶液３ｍＬを用いて３回洗浄して、低分子を除去後、濃縮検体を得た。この濃縮検体のタンパク質定量を行い、全ての検体について、全タンパク質量１０ｍｇ／ｍＬの濃度に緩衝液を用いて調整して、その後の分析行程に用いた。続いて、試料を還元アルキル化の後に、一定濃度のＨ２ １８Ｏを用いて調製した緩衝液中でトリプシン消化した（ペプチドＣ末端の安定同位体標識法）。脱塩、精製後、ｉＴＲＡＱ（８－ｐｌｅｘ、エービーサイエックス社）によるラベル化を行い、８検体を混合、脱塩、精製した後、タンパク質断片由来のＣ末端トリプシン消化ペプチドのみをイオン交換クロマトグラフィーにより分画した（ＬＣカラム：ＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ ＡTM（ＰｏｌｙＬＣ Ｉｎｃ． ＵＳＡ）、内径４．６ｍｍ、長さ５０ｍｍ；流速：０．４ｍＬ／分；溶媒：２０％アセトニトリル／リン酸水溶液（ｐＨ２．５５）に対して２０％アセトニトリル／５ｍＭリン酸第１カリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ２．５５）の濃度を段階的に上昇（０－１００％）させて分離）。その画分を脱塩、精製後、Ｎａｎｏ－ＬＣ（ＬＣカラム：内径７５μｍ、長さ１００ｍｍ、充填剤Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｃ１８（粒子径３μｍ）；流速：２５０ｎＬ／分；溶媒：０．１％トリフルオロ酢酸水中でアセトニトリル濃度勾配（３－８０％）により分離）／ＭＡＬＤＩ－ＭＳ／ＭＳ（エービーサイエックス社）により測定を行い、Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのみを選別、抽出した（独自開発プログラム“ｉＳｐｅｃ“；文献：Ｆｅｒｎaｎｄｅｚ－ｄｅ－Ｃｏｓｓｉｏ Ｊ．、Ｔａｋａｏ Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１８、２４６５－２４７２（２００４））。アッセイ間の比較は、ＭＳ／ＭＳスペクトル中に含まれる比較定量に関わるレポーターピーク（ｍ／ｚ １１３～１１９、１２１）の内のコントロールピーク（ｍ／ｚ １１３、各アッセイに等量スパイクした）の強度で他のレポーターピークを規格化した後に行った。具体的な評価基準として、定性については、一定強度以上のピークの本数が５個以上のＭＳ／ＭＳスペクトルを選択し、かつ、それらのＭＳ／ＭＳスペクトルを基に同定されたタンパク質の数が５０個以上のアッセイを採用した。定量については、基準のレポーターピーク（ｍ／ｚ１１３）のピーク強度が１０より大きく、かつ、ＭＳ／ＭＳスペクトル数が３００個以上のアッセイのみの定量値を用いた。
〔実施例７〕統計解析
肺腺がん５８例（ＩＡ期５例、ＩＢ期１例、ＩＩＩＡ期３例、ＩＩＩｂ期８例およびＩＶ期４１例）、良性呼吸器疾患３０例（気管支喘息、膿胸、肺吸虫症、非結核性抗酸菌症、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、サルコイドーシス症、炎症性偽腫瘍、細菌性肺炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症）および健常者２５例の尿試料 から得られた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの各Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのピーク強度（実施例６）について、コントロール検体のピーク強度に対する相対比をそれぞれ算出し、肺腺がん群と非肺腺がん群（良性呼吸器疾患および健常者）の間で比較検討した。肺腺がん５８例と非肺腺がん群５５例におけるキニノーゲン１由来の尿中タンパク質断片のピーク検出率をＦｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔで検定し、ｐ値が０．０１未満であるものを抽出した。統計解析はＪＭＰ１２（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用した。キニノーゲン１由来のＣ末端アミノ酸配列をＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡとするタンパク質断片は、肺腺がん５８例中２６例と非肺腺がん群５５例中２例で検出され、上記の基準を満たした（ｐ値＜０．０００１）。非肺腺がん群の健常者で検出されたピーク強度を基準とした場合、該当基準値における感度、特異度およびＲＯＣ－ＡＵＣ値は３７．９３％、９６．３６％および０．７０８であった。
〔実施例８〕
早期肺腺がん２５例（ＩＡ期１８例、ＩＢ期５例、およびＩＩＡ期１例）および健常者２５例の尿試料から得られた、ＭＳ／ＭＳスペクトルの各Ｃ末端トリプシン消化ペプチドのピーク強度（実施例６）について、コントロール検体のピーク強度に対する相対比をそれぞれ算出し、早期肺腺がん群と健常者の間で比較検討した。キニノーゲン１由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳとするタンパク質断片は、健常者で検出されたピーク強度の１．２５倍を基準値とした場合、早期肺腺がん２４例中１０例が陽性の結果であった。当該基準値における感度は４１．７％、特異度は７２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．６４４であった。
〔実施例９〕
実施例８とは別に、肺腺がん３７例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．００５）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん２３例が陽性であった。当該基準値における感度は当該基準値における感度は６３．２％、特異度は７８．２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７５７であった。
〔実施例１０〕
別途、早期肺腺がん２２例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．００５）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん１６例が陽性であった。当該基準値における感度は７２．７％、特異度は７８．２％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４２であった。
〔実施例１１〕
別途、肺腺がん３７例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．０４４）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん２９例が陽性であった。当該基準値における感度は当該基準値における感度は７３．７％、特異度は８０％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８６５であった。
〔実施例１２〕
別途、早期肺腺がん２２例（ＩＡ期１５例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期４例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。健常者群の平均値（０．０４４）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん１６例が陽性であった。当該基準値における感度は７２．３％、特異度は８０％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４２であった。
〔実施例１３〕
経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、肉腫様がん２例（多形がん１例、癌肉腫１例）、大細胞がん１例および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。各肺がん症例における断片化率は、多形がんが０．１２５、癌肉腫が０．１６２、大細胞がんが０．１３５であり、各肺がん症例における断片化率は、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
〔実施例１４〕
経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、扁平上皮がん４例（ＩＢ期２例、ＩＩＩＡ期１例、ＩＩＩＢ期１例）および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。扁平上皮がん症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、ＩＢ期が０．０９８と０．０９０、ＩＩＩＡ期が０．１９、ＩＩＩＢ期が０．４４であり、扁平上皮がん４例すべてが、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
〔実施例１５〕
経気管支生検または外科的肺生検により病理組織学的診断を得た、小細胞肺がん４例および健常者５５名の尿検体をそれぞれＭＲＭに供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。扁平上皮がん症例におけるキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、それぞれ０．０６９、０．１３１、０．７４７、０．７５４であり、小細胞肺がん４例すべてが、健常者群の平均値（０．０４４）の１．２５倍（０．０５５）の基準値より高値であった。
〔実施例１６〕ＥＬＩＳＡによる検出および血清ＣＥＡとの有用性の比較
ＩＡ期およびＩＢ期の早期肺腺がん２５例と健常者３５名の血清検体（１０μＬ）をＥＬＩＳＡ法に供し、血清中のキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧとするタンパク質断片濃度を測定した。血清中のキニノーゲンＩ由来の断片の濃度測定には、調製した免疫原溶液をニワトリに投与して免疫することにより、ニワトリ血清中から回収したＣ末端アミノ酸配列をＣＱＰＬＧとするキニノーゲンＩ由来の断片を特異的に認識する抗体を用いた。健常者平均の１．２倍を陽性とした場合、早期肺腺がん２５例中１３例が陽性であると判断できた。当該基準値における感度は５２％、特異度は８２．９％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．７０６であった。一方、血清ＣＥＡ値の基準値を５．０ ｎｇ／ｍｌとした場合、早期肺腺がん２５例中７例のみが陽性の結果であった。当該基準値における感度は２８％、特異度は７４．２９％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．５３４であった。
〔実施例１７〕肺腺がんの進行に伴う尿中マーカーの変動
胸部ＣＴ検査にて、右下葉末梢に肺腺がんが疑われる１．４ｃｍ大のすりガラス状結節影を認めた症例の尿を経時的に採取し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率と結節影のサイズを、外科的肺生検により肺腺がんの診断を得た時点と比較した。本症例における術後病期はＴ１ｂＮ０Ｍ０、ｐＳｔａｇｅＩＡであった。手術２４か月前と手術時点の胸部ＣＴ検査を比較した結果、手術時点では結節影のサイズが１．９ｃｍへ増大していた。また、同部の結節はＰＥＴ－ＣＴ検査において、ＦＤＧの高度な集積を認めた（図８）。手術２４か月前、１８か月前、１２か月前、６か月前、手術時において、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率はそれぞれ、０．４６８、０．５６５、０．５８、０．９５６、１．０８であり、腺がんの増大に伴い増加していた。
〔実施例１８〕肺腺がん切除後の尿中マーカーの変動
早期肺腺がん１１例（ＩＡ期５例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）において、肺がん切除術の前後で回収した尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を測定した。手術後の尿検体の解析には、手術後１４日以降に回収した尿を用いた。早期肺腺がん１１例中８例の尿検体において、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率が低下していた。１１例全体の平均値では、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率が、０．３７８から０．２０５へ、４５．７７％低下した（図９）。
〔実施例１９〕肺腺がんの治療による尿中マーカーの変動
ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）遺伝子変異陽性のＩＶ期肺腺がん１例において回収した尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率を、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療前と治療開始２か月後で比較した。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤による治療効果は、３７．１％の腫瘍縮小率を認め（図１０）、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ Ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）におけるＰａｒｔｉａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅの基準を満たした。治療２か月後のキニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化率は、治療前と比較して、０．０７８３から０．０６４８へ、１７．２％の低下を認めた。
〔実施例２０〕
キニノーゲンＩタンパク質の切断を効率的に検知するため、アミノ酸配列ＩＹＰＴＶＮＣＱＰまたはアミノ酸配列ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端とするトリプシン消化ペプチドの存在量（Ｃｘ）と、Ｃ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭとするタンパク質断片の存在量（Ｉｘ）の２種を用いて、キニノーゲンＩタンパク質の断片化指数（Ｆｘ）を以下の計算式により求めた。健常者の平均値に対して、患者試料で断片化指数が１．２５倍以上高いものを陽性とした。
［式２］タンパク質断片化指数（Ｆｘ）＝Ｃｘ／Ｉｘ
〔実施例２１〕
肺腺がん２７例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＶ期６例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（４．８２）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１４例が陽性、肺腺がん１４例が陽性であり、当該基準値における感度は７１．４％、特異度は７１．４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８２９であった。
〔実施例２２〕
早期肺腺がん１９例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（４．８２）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１４例が陽性、肺腺がん１４例が陽性であり、当該基準値における感度は７３．７％、特異度は７１．４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８１５であった。
〔実施例２３〕
肺腺がん２７例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＶ期６例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１２例が陽性、肺腺がん２１例が陽性であり、当該基準値における感度は７５％、特異度は７５．５％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８４８であった。
〔実施例２４〕
早期肺腺がん１９例（ＩＡ期１３例、ＩＢ期２例、ＩＩＡ期４例）と健常者４９名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端アミノ酸配列をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬとするタンパク質断片の断片化指数（Ｆｘ）を測定した。健常者群の平均値（０．４３７）に対して、患者試料で断片化率が１．２５倍以上高いものを陽性とした場合、健常者１１例が陽性、肺腺がん１３例が陽性であり、当該基準値における感度は６８．４％、特異度は７５．５％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．８６０であった。
〔実施例２５〕
進行期肺腺がん１５例（ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩＢ期３例、ＩＶ期１０例）と健常者５５名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のＣ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭとするタンパク質断片とＣ末端をＹＦＩＤＦＶＡＲとするトリプシン消化ペプチドの存在量を測定し、正常なキニノーゲンＩ由来の蛋白質断片であるＣ末端をＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳＬＭの存在比を比較した。健常者群の平均値（０．００７５）に対して、患者試料で断片の存在比が４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者１５例が陽性、肺腺がん１１例が陽性であった。当該基準値における感度は７３．３％、特異度は７２．７３％であった。
〔実施例２６〕
肺腺がん３４例（ＩＡ期１４例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期３例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩB期３例、ＩＶ期９例）と健常者５３名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のアミノ酸３４５位から３６２位までのトリプシン消化ペプチド（ＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫ）に対するアミノ酸３３１位から３４３位までのトリプシン消化ペプチド（ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫ）のピーク強度比（前者ペプチドに対する後者ペプチドの存在度を反映する）を算出したところ、健常者群の平均値（０．３５３）に対して、肺がん患者試料では０．１５０と低値であった。患者試料において、トリプシン消化ペプチドＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫに対するトリプシン消化ペプチドＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫのピーク強度比が、健常者平均より４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者６例が陽性、肺腺がん２４例が陽性であった。当該基準値における感度は７０．６％、特異度は８８．６８％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．９であった。
〔実施例２７〕
肺腺がん３４例（ＩＡ期１４例、ＩＢ期３例、ＩＩＡ期３例、ＩＩＩＡ期２例、ＩＩＩB期３例、ＩＶ期９例）と健常者５３名の尿検体をＭＲＭ法に供し、キニノーゲンＩ由来のアミノ酸３４５位から３６２位までのトリプシン消化ペプチド（ＬＧＱＳＬＤＣＮＡＥＶＹＶＶＰＷＥＫ）に対するアミノ酸２０９位から２１９位までのトリプシン消化ペプチド（ＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫ）のピーク強度比（前者ペプチドに対する後者ペプチドの存在度を反映する）を算出したところ、健常者群の平均値（５．４２３）に対して、肺がん患者試料では２．０と低値であった。患者試料において、トリプシン消化ペプチドＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴＫに対するトリプシン消化ペプチドＥＮＦＬＦＬＴＰＤＣＫのピーク強度比が、健常者平均より４０％以上低いものを陽性とした場合、健常者３例が陽性、肺腺がん３１例が陽性であった。当該基準値における感度は９１．２％、特異度は９４．３４％、ＲＯＣ－ＡＵＣ値は０．９７２であった。

Claims (5)

  1. 被検体由来試料中における、肺がんの検出補助方法であって、
    以下のキニノーゲンＩ由来の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくともいずれか１種の断片の量または存在を検知することを含み、該被検体由来試料が尿又は血液である、肺腺がんの検出補助方法：
    （ａ）ＥＳＮＥＥＬＴＥＳＣＥＴをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｂ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｃ）ＴＥＨＬＡＳＳＳＥＤＳＴＴＰＳＡをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｄ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬＧＭＩＳをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；
    （ｅ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰＬをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片；および
    （ｆ）ＩＹＰＴＶＮＣＱＰをＣ末端アミノ酸配列とするタンパク質断片。
  2. 質量分析測定法、免疫化学的測定法、およびクロマトグラフィー法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を用いる工程を含む、請求項１に記載の肺がんの検出補助方法。
  3. 前記肺がんが、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がん、多形がん、およびがん肉腫からなる群より選択される１種の非小細胞がん；又は小細胞肺がんである、請求項１又は２に記載の肺がんの検出補助方法。
  4. 請求項１記載の肺がんの検出補助方法であって、前記キニノーゲンＩ由来の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される少なくともいずれか１種の断片の量または存在を検知することが、該キニノーゲンＩの断片化率によって決定され、該断片化率が、
    キニノーゲンＩタンパク質断片化率（Ｆｎ）＝Ｃｎ／Ｉｎ
    Ｃｎ：各キニノーゲンＩタンパク質断片の量
    Ｉｎ：キニノーゲンＩタンパク質由来タンパク質全量
    で得られる、肺がんの検出補助方法。
  5. 前記肺がんの検出補助方法が、早期肺がんの診断補助の為の検出補助、肺がんの診断の為の検出補助、肺がんの進行の検出補助、肺がんの再発の有無の予測の為の検出補助、及び肺がんの治療効果の有無の為の検出補助からなる群より選択されるいずれか１つ以上である、請求項１～４のいずれか１項記載の肺がんの検出補助方法。
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