ES2710974T3 - Método para predecir el riesgo de contraer cáncer de mama o diagnosticar cáncer en un sujeto femenino - Google Patents

Método para predecir el riesgo de contraer cáncer de mama o diagnosticar cáncer en un sujeto femenino Download PDF

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Abstract

Método para predecir el riesgo de contraer cáncer de mama en un sujeto femenino que no padece cáncer que comprende: - determinar el nivel de protaquicinina que es SEC ID nº 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID nº 2 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y - correlacionar dicho nivel de protaquicinina que es SEC ID nº 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID nº 2 con el riesgo de contraer cáncer, en el que un nivel reducido es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cáncer de mama, en el que un nivel reducido significa un nivel inferior a un determinado nivel umbral y en el que el fluido corporal es sangre o plasma o suero.

Description

DESCRIPCION
Método para predecir el riesgo de contraer cancer de mama o diagnosticar cancer en un sujeto femenino.
El objeto de la presente invencion es un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino que no padece cancer que comprende:
■ determinar el nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
■ correlacionar dicho nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 con un riesgo de contraer cancer, en el que un nivel reducido es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama, en el que un nivel reducido significa un nivel por debajo de un determinado nivel umbral y en el que el fluido corporal es sangre o plasma o suero.
La sustancia P (SP) es un neuropeptido: un undecapeptido que funciona como neurotransmisor y como neuromodulador. Pertenece a la familia de neuropeptidos de taquicinina. La sustancia P y su neuropeptido estrechamente relacionado neurocinina A (NKA) se producen a partir de un precursor de poliprotema tras el corte y empalme diferencial del gen de preprotaquicinina A. En el SNC, la sustancia P participa en el sistema de transmision del dolor.
La sustancia P desempena papeles en procesos inflamatorios (Ang et al., 2011) y presenta actividad antiapoptotica en celulas cancerosas (Munoz et al., 2005).
El receptor de sustancia P (receptor de neurocinina1) desempena un papel crucial en el desarrollo de cancer (Fries et al., 2003; Munoz et al., 2010; Rameshwar, 2007; Schulz et al., 2o06). El bloqueo de la ruta de sustancia P reducfa notablemente el crecimiento de celulas tumorales in vitro (para una revision vease Munoz y Rossow, 2009).
Se ha informado de la utilizacion de peptidos vasoactivos para la prediccion de los riesgos de cancer en varones por Belting et al., Cancer, Epidemiology, Biomarkes & Prevention. Se midieron MR-pro-ANP, MR-pro-ADM y copeptina en el plasma en ayunas de los participates del estudio Malmo Diet and Cancer que no teman cancer antes del examen inicial en de 1991 a 1994 (1768 varones y 2293 mujeres). Los autores establecieron que, entre las mujeres, no habfa relacion entre los biomarcadores y la incidencia de cancer.
El documento WO 2005/103712 da a conocer la utilizacion de precursores de taquicininas y/o los fragmentos en diagnostico medico. No existe ninguna divulgacion de un metodo para la prediccion del riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto debil.
Turner et al. (Gut 2006; 55:1586-1591) dan a conocer marcadores circulantes de pronostico y respuesta al tratamiento en pacientes con tumores carcinoides del intestino medio.
Ardill, J. y Erikkson, B. (Endocrine-Related Cancer (2003) 10 459-462) informan de la importancia de las mediciones de marcadores circulantes en pacientes con tumores neuroendocrinos del pancreas y el intestino. Reddy, B, et al., (Current Drug Discovery Technolgies, 2008, 5, 15-19) informan de los receptores de neurocinina como posibles dianas en el tratamiento de cancer de mama.
Khan, I. y Beck-Sickinger (Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry; 2008, 8, 186-199) informan del diagnostico y la terapia tumorales dirigidos con hormonas peptfdicas como productos radiofarmaceuticos.
Alumets, J. et al., (Ultrastructural Pathology, 5: 55-72, 1983 dan a conocer peptidos neurohormonales en tumores de punto final del pancreas, el estomago y el intestino delgado superior en un estudio inmunohistoqmmico de 27 casos.
Nesland, J. et al., (Anticancer Res. 11: 161-168 (1991)) dan a conocer un estudio de protema C-erbB-2 y expresion neuroendocrina y carcinomas de mama.
Un objetivo de la presente invencion es investigar la potencia de pronostico de protaquicinina para la prediccion del riesgo de contraer cancer de mama y la prediccion del riesgo de reaparicion de cancer en un sujeto femenino que no padece cancer. Para abordar esta cuestion, se midieron fragmentos estables de protaquicinina (Ernst et al., 2008) en plasma en ayunas en dicho estudio de cohorte prospectivo sueco (estudio Malmo Diet and Cancer) y el nivel inicial relacionado de este biomarcador para la incidencia de cancer de mama durante 15 anos de seguimiento.
Sorprendentemente, se ha mostrado que la protaquicinina es un biomarcador poderoso y altamente significativo para predecir el riesgo de contraer cancer en un sujeto que no padece cancer o alternativamente diagnosticar cancer en un sujeto.
Por tanto, el objeto de la presente invencion es un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino que no padece cancer que comprende:
• determinar el nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
• correlacionar dicho nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 con un riesgo de contraer cancer, en el que un nivel reducido es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama, en el que un nivel reducido significa un nivel por debajo de un determinado nivel umbral y en el que el fluido corporal es sangre o plasma o suero.
En otro objeto de la invencion dicho metodo comprende adicionalmente las siguientes etapas: determinar adicionalmente el nivel de proneurotensina que es s Ec ID n° 14 o proneurotensina 1-117 que es SEC ID n° 18 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
• correlacionar adicionalmente dicho nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 con un riesgo de contraer cancer, en el que un nivel incrementado de proneurotensina es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
Segun otra forma de realización de la invencion, los metodos anteriores pueden comprender adicionalmente las siguientes etapas:
• determinar adicionalmente el nivel de proencefalina que es SEC ID n° 23 o MRPENK que es SEC ID n° 28 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
• correlacionar adicionalmente la proencefalina o MRPENK con un riesgo de contraer cancer, en el que un nivel reducido de proencefalina o MRPENK es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
Segun otra forma de realización de la invencion, los metodos anteriores pueden comprender adicionalmente las siguientes etapas:
• determinar adicionalmente el nivel de insulina en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y • correlacionar adicionalmente dicho nivel de insulina con un riesgo de contraer cancer de mama, en el que un nivel reducido de insulina es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
Por tanto, los metodos segun la presente invencion comprenden la determinacion del nivel de protaquicinina, protaquicinina 1-37, en un fluido corporal y pueden comprender ademas opcionalmente al menos una determinacion adicional y correlacion adicional con el riesgo de cancer seleccionada de entre el grupo que comprende:
• determinacion del nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 y
• determinacion del nivel de proencefalina o acidos MRPENK y
• determinacion del nivel de insulina.
En una forma de realización de la invencion, por lo menos uno de los biomarcadores adicionales mencionados anteriormente se determina adicionalmente y correlaciona adicionalmente con dicho riesgo de cancer de mama ademas de protaquicinina o protaquicinina 1-37. En una forma de realización de la invencion, por lo menos dos de los biomarcadores adicionales mencionados anteriormente se determinan adicionalmente y correlacionan adicionalmente con dicho riesgo ademas de protaquicinina o protaquicinina 1-37. En una forma de realización, se determinan los cuatro biomarcadores anteriores.
En una forma de realización espedfica de los metodos anteriores en los que se determinan ademas protaquicinina o protaquicinina 1-37 se determinan unos biomarcadores adicionales y se correlacionan con dicho riesgo, “que se correlacionan adicionalmente” significa un analisis combinado de los niveles de biomarcador determinados teniendo en cuenta los factores de riesgo relativos para el desarrollo de cancer obtenidos mediante los biomarcadores individuales.
El analisis combinado de mas de un marcador es un ejemplo explicado en el ejemplo 5. El experto en la materia conoce los metodos estadfsticos que pueden realizar el analisis combinado de mas de un marcador o parametro. En una forma de realización de los metodos anteriores, un nivel reducido de protaquicinina taquicinina o protaquicinina 1-37 es un nivel por debajo de un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de o inferior a 100 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 80 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 60 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 50 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 45.6 pmol/l, preferentemente aproximadamente de 40 pmol/l
En una forma de realización de los metodos anteriores, un nivel incrementado de proneurotensina o proneurotensina 1-117 es un nivel por encima de un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de o superior a 78 pmol/l de PNT, preferido aproximadamente de o superior a 100 pmol/l, mas preferido aproximadamente de 150 pmol/l.
En una forma de realización de los metodos anteriores, un nivel reducido de proencefalina o MRPENK es un nivel por debajo de un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de o inferior a 100 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 75 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 50 pmol/l, preferentemente aproximadamente de 40.4 pmol/l.
En una forma de realización de los metodos anteriores, un nivel reducido de insulina es un nivel por debajo de un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de 70 pmol/l.
Los umbrales han de considerarse a partir del metodo de calibracion utilizado y los valores anteriores han de considerarse a partir de los ensayos y los metodos de calibracion utilizados en los presentes ejemplos 1, 3 y 4. En las formas de realización de la presente invencion, dicho sujeto es femenino y dicho cancer es cancer de mama.
A lo largo de toda la memoria descriptiva el termino protaquicinina y protaquicinina A (PTA) se utilizan de manera sinonima. El termino incluye protaquicinina 1-37.
Determinar el nivel de protaquicinina o protaquicinina 1-37 significa que se determina habitualmente la inmunorreactividad hacia una region dentro de las moleculas mencionadas anteriormente. Esto significa que no es necesario que se mida selectivamente un determinado fragmento. Se entiende que un agente de union que se utiliza para la determinacion del nivel de protaquicinina o protaquicinina 1-37 se une a cualquier fragmento que comprende la region de union de dicho agente de union. Dicho agente de union puede ser un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o un armazon distinto de IgG.
Por tanto, el objetivo de la presente invencion es en una forma de realización determinar la susceptibilidad de una mujer a desarrollar cancer de mama.
Los datos obtenidos en el estudio Malmo revelaron una correlacion entre el riesgo de contraer cancer en sujetos masculinos con el nivel de protaquicinina, sus variantes de corte y empalme o fragmentos de la misma de por lo menos 5 aminoacidos en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto masculino; sin embargo, esta correlacion no era estadfsticamente significativa para el presente conjunto de datos aunque existe una clara tendencia hacia un riesgo de cancer incrementado a niveles reducidos de protaquicinina, sus variantes de corte y empalme o fragmentos de la misma tambien en varones. Por tanto, el metodo segun la invencion presenta valor tambien para sujetos masculinos, pero en el presente estudio el efecto observado no fue tan fuerte para varones en comparacion con mujeres. Esto puede deberse principalmente al bajo numero de casos de cancer en la poblacion masculina.
El termino “sujeto” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sujeto humano femenino.
El termino “nivel reducido” significa un nivel por debajo de un determinado nivel umbral. El termino “nivel incrementado” significa un nivel por encima de un determinado umbral. Un fluido corporal puede seleccionarse de entre el grupo que comprende sangre, suero o plasma.
En una forma de realización de la invencion a dicho sujeto nunca se le ha diagnosticado cancer en el momento en que se toma la muestra de fluido corporal de dicho sujeto.
En otra forma de realización a dicho sujeto se le ha diagnosticado anteriormente que presenta cancer y se ha curado en el momento en el que se toma la muestra de fluido corporal de dicho sujeto y se determina el riesgo de volver a contraer cancer o alternativamente se predice la reaparicion del cancer.
La protaquicinina puede presentar la(s) siguiente(s) secuencia(s):
SEC ID n° 1 (protaquicinina A (1-107)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEFILLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIE KQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAMQNYERRR
Un fragmento de protaquicinina que puede determinarse en un fluido corporal es:
SEC ID n° 2 (protaquicinina 1-37, P37)
EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA
Tambien se dan a conocer en la presente memoria:
SEC ID n° 3 (sustancia P)
RPKPQQFFGLM(-NH2)
SEC ID n° 4 (neuropeptido K)
DADSSIEKQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLM (-NH2)
SEC ID n° 5 (neuropeptido gamma)
GHGQISHKRHKTDSFVGLM (-NH2)
SEC ID n° 6 (neurocinina 1)
HKTDSFVGLM(-NH2)
SEC ID n° 7 (peptido flanqueante C-terminal, PTA192-107)
ALNSVAYERSAMQNYE SEC ID n° 8 (isoforma de PTA alfa) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIE KQVALLKALYGHGQISHKMAYERSAMQNYERRR SEC ID n° 9 (isoforma de PTA beta) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDADSSIE KQVALLKALYGHGQISHKRHKTDSFVGLMGKRALNSVAYERSAiMQNYERRR
SEC ID n° 10 (isoforma de PTA delta) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRLARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQI SHKMAYERSAMQNYERRR SEC ID n° 11 (isoforma de PTA gamma) EEIGANDDLNYWSDWYDSDQ1KEELPEPFEHLLQRIARRPKPQQFFGLMGKRDAGHGQI SHKRHKTDSFV GLMGKRALNSV AYERS AMQNYERRRSEQ SEC ID n° 12 (PTA3-22)
GANDDLNYWSDWYDSDQIK SEC ID n° 13 (PTA 21-36)
IKEELPEPFEHLLQRI
Determinar el nivel de PTA o PTA 1-37 puede significar que se determina la inmunorreactividad hacia PTA o PTA 1-37. Un aglutinante utilizado para la determinacion de PTA o PTA 1-37 dependiendo de la region de union puede unirse a mas de una de las moleculas presentadas anteriormente. Esto resulta evidente para un experto en la materia.
En una forma de realización mas espedfica del metodo segun la presente invencion, se determina el nivel de P37 (PTA 1-37, SEC ID n° 2, EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA). En una forma de realización incluso mas espedfica segun la presente invencion, se utilizan por lo menos uno o dos agentes de union que se unen a PTA 1-37, SEC ID n° 2, EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA, en el caso de mas de un agente de union se unen preferentemente a dos regiones diferentes dentro de PTA 1-37, SEC ID n° 2, EEIGANDDLNYWSDWYDSDQIKEELPEPFEHLLQRIA. Dichos(s) agente(s) de union pueden ser preferentemente un anticuerpo o un fragmento de union del mismo.
En una forma de realización incluso mas espedfica se utiliza(n) agente(s) de union para la determinacion de PTA, sus variantes y fragmentos que se unen a una o ambas, respectivamente, de las siguientes regiones dentro de PTA 1-37:
Figure imgf000006_0001
En una forma de realización espedfica se mide el nivel de PTA o PTA 1-37 con un inmunoensayo utilizando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a PTA o PTA 1-37. Un inmunoensayo que puede ser util para determinar el nivel de PTA o PTA 1-37 puede comprender las etapas tal como se explican resumidamente en el ejemplo 1. Todos los umbrales y valores tienen que considerarse en correlacion con la prueba y la calibracion utilizadas segun el ejemplo 1. Un experto en la materia puede conocer que el valor absoluto de un umbral podna verse influido por la calibracion utilizada. Esto significa que todos los valores y umbrales proporcionados en la presente memoria han de entenderse en el contexto de la calibracion utilizada en la presente memoria (ejemplo 1).
Segun la invencion el agente de union de diagnostico para PTA o los otros biomarcadores adicionales se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos por ejemplo IgG, una inmunoglobulina de longitud completa tfpica, o fragmentos de anticuerpo que contienen al menos el dominio variable F de la cadena pesada y/o ligera como por ejemplo anticuerpos acoplados qdmicamente (fragmento de union a antfgeno) incluyendo pero sin limitarse a fragmentos Fab incluyendo minicuerpos de Fab, anticuerpo de Fab de cadena sencilla, anticuerpo de Fab monovalente con etiquetas de epftopo, por ejemplo Fab-V5Sx2; Fab bivalente (minianticuerpo) dimerizado con el dominio CH3; Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo formado por medio de multimerizacion con la ayuda de un dominio heterologo, por ejemplo por medio de dimerizacion de dominios dHLX, por ejemplo Fab-dHLX-FSx2; fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multimerizados multivalentes o/y multiespedficos, diacuerpos bivalentes y/o biespedficos, BITE® ("bispecific T cell engager", acoplador de celulas T biespedfico), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo de una clase diferente de G; anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camelidos o peces.
En una forma de realización espedfica, el nivel de PTA o PTA 1-37 o los otros biomarcadores adicionales se mide con un ensayo utilizando agentes de union seleccionados de entre el grupo que comprende aptameros, armazones distintos de Ig tal como se describe con mayor detalle a continuacion que se unen a PTA o PTA 1-37 o alternativamente a los biomarcadores adicionales.
El agente de union que puede utilizarse para determinar el nivel de PTA o PTA 1-37 presenta una constante de afinidad para PTA o PTA 1-37 de por lo menos 107 M-1, preferido de 108 M-1, la constante de afinidad preferida es mayor de 109 M-1, mas preferentemente mayor de 1010 M-1. Un experto en la materia sabe que puede considerarse compensar la afinidad menor aplicando una dosis superior de compuestos y esta medida no conducina a apartarse del alcance de la invencion. La afinidad de union puede determinarse utilizando el metodo de Biacore, ofrecido como analisis de servicio por ejemplo en Biaffin, Kassel, Alemania (http://www.biaffin.com/de/).
Constantes de afinidad
Para determinar la afinidad de los anticuerpos, se determino la cinetica de union de PTAo PTA 1-37 a anticuerpo inmovilizado por medio de resonancia de plasmon superficial sin marcador utilizando un sistema Biacore 2000 (GE Healthcare Europe GmbH, Friburgo, Alemania). Se realizo la inmovilizacion reversible de los anticuerpos utilizando un anticuerpo anti-Fc de raton acoplado covalentemente en alta densidad a una superficie de sensor CM5 segun las instrucciones del fabricante (kit de captura de anticuerpos de raton; GE Healthcare). (Lorenz et al., "Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphilococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy”; Antimicrob Agents Chemother. Enero de 2011; 55(1): 165-173.) Una muestra de control de PTA humana esta disponible en ICI-Diagnostics, Berlin, Alemania http://www.icidiagnostics.com/. El ensayo puede calibrarse tambien mediante PTA o PTA 1-37 sintetica (para los experimented se utilizo P37 sintetica, s Ec ID n° 2) o recombinante.
El umbral de PTA o PTA 1-37 para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino segun los metodos de la presente invencion esta por debajo de 100 pmol/l, preferentemente por debajo de 80 pmol/l, preferentemente por debajo de 60 pmol/l, preferentemente por debajo de 50 pmol/l, preferentemente por debajo de 45,6 pmol/l, preferentemente por debajo de 40 pmol/l. Estos umbrales estan relacionados con el metodo de calibracion mencionado anteriormente. Un valor de PTA por debajo de dicho umbral significa que el sujeto corre un riesgo aumentado de contraer cancer o ya presenta cancer.
En una forma de realización de la invencion dicho metodo se realiza mas de una vez con el fin de monitorizar el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino o con el fin de monitorizar el transcurso del tratamiento. En una forma de realización espedfica dicha monitorizacion se realiza con el fin de evaluar la respuesta de dicho sujeto femenino a las medidas preventivas y/o terapeuticas tomadas.
En una forma de realización de la invencion el metodo se utiliza para estratificar a dichos sujetos en grupos de riesgo.
La materia de la invencion es ademas un ensayo para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra tal como se define anteriormente que comprende dos agentes de union que se unen a dos regiones diferentes dentro de la region de PTA que son los aminoacidos 3-22 (GANDDLNYw SdWYDSDQIK, SEC ID n° 12) y aminoacidos 21-36 (IKEELPEPFEHLLQRI, SEC ID n° 13) en la que cada una de dichas regiones comprende por lo menos 4 o 5 aminoacidos.
En una forma de realización de los ensayos para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra segun la presente invencion la sensibilidad de ensayo analftico de dicho ensayo puede cuantificar la PTA o PTA 1-37 de sujetos sanos y es < 20pmol/, preferentemente < 10 pmol/l y mas preferentemente < 5 pmol/l.
En una forma de realización de los ensayos para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra segun la presente invencion, tal ensayo es un ensayo de tipo sandwich, preferentemente un ensayo totalmente automatizado. Puede ser un ELISA, un ensayo totalmente automatizado o un ensayo manual. Puede ser una denominada prueba de POC ("point-of-care”, lugar de atencion). Los ejemplos de un ensayo automatizado o completamente automatizado comprenden ensayos que pueden utilizarse para uno de los siguientes sistemas: Elecsys® de Roche, Architect® de Abbott, Centauer® de Siemens, Kryptor® de Brahms, Vidas® de Biomerieux, Triage® de Alere. Se proporcionan anteriormente unos ejemplos de formatos de prueba.
En una forma de realización de los ensayos para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra segun la presente invencion, por lo menos uno de dichos dos agentes de union se marca con el fin de detectarse. Se proporcionan unos ejemplos de marcadores anteriormente.
En una forma de realización de los ensayos para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra segun la presente invencion, por lo menos uno de dichos agentes de union esta unido a una fase solida. Los ejemplos de fases solidas son perlas magneticas, tubos de poliestireno o placas de microtitulacion. En una forma de realización se utiliza un ensayo homogeneo, es decir utilizando tecnologfas de emision de criptato amplificada de resolucion temporal (TRACE).
En una forma de realización de los ensayos para determinar PTA o PTA 1-37 en una muestra segun la presente invencion, dicho marcador se selecciona de entre el grupo que comprende marcador quimioluminiscente, marcador enzimatico, marcador de fluorescencia, marcador de radioyodo.
Un objeto adicional de la presente invencion es un kit que comprende un ensayo segun la presente invencion en el que los componentes de dicho ensayo pueden estar comprendidos en uno o mas recipientes.
Un objeto de la presente invencion es tambien un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en una mujer, en el que se utiliza el nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto o bien solo o bien conjuntamente con otros parametros clmicos o de laboratorio predictivos para la prediccion del riesgo de un sujeto de contraer cancer de mama mediante un metodo que puede seleccionarse de las siguientes alternativas:
• la comparacion con la mediana del nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de sujetos “sanos” o "aparentemente sanos”,
• la comparacion con un cuantil del nivel de PTAo PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de sujetos "sanos” o "aparentemente sanos”,
• el calculo basado en analisis de peligros proporcionales de Cox o utilizando calculos de mdice de riesgo tales como el NRI (mdice de reclasificacion neta) o el IDI (mdice de discriminacion integrado).
En una forma de realización de la invencion, el objeto de la presente invencion es tambien un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en una mujer segun cualquiera de las formas de realización anteriores, en el que el nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto o bien solo o bien conjuntamente con otros biomarcadores predictivos.
Un biomarcador adicional util de este tipo puede ser proneurotensina o proneurotensina 1-117 o proencefalina o MRPENK o insulina.
En una forma de realización espedfica del metodo segun la presente invencion, se determina el nivel de proneurotensina 1-117 ademas de la determinacion de PTA o PTA 1-37.
Cuando se hace referencia a fragmentos a lo largo de la presente solicitud, dichos fragmentos comprenden por lo menos cuatro o cinco aminoacidos.
Por tanto, el objeto de la presente invencion es tambien un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino que no padece cancer:
■ determinar el nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto tal como se define anteriormente; y
■ determinar el nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto tal como se define anteriormente; y
■ correlacionar dicho nivel de PTAo PTA 1-37 y proneurotensina o proneurotensina 1-117 con un riesgo de contraer cancer de mama, en el que un nivel reducido de PTA o PTA 1-37 es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama y en el que un nivel incrementado de proneurotensina o proneurotensina 1-117 es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
La proneurotensina presenta la siguiente secuencia:
SEC ID n° 14 (proneurotensina 1-147)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVIKRK TPYILKRQLY ENKPRRPYIL KRDSYYY
Tambien se da a conocer SEC ID n° 15 (proneurotensina 1-125 (neuromedina N grande))
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVI KR KIPYIL SEC ID n° 16 (neuromedina N)
KIPYIL SEC ID n° 17 (neurotensina)
piroQLYENKPRRP YIL
Segun las reivindicaciones, SEC ID n° 18 (proneurotensina 1-117) es:
SDSEEEM KAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS W KMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DG FSLEA M LT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVI
Se dan a conocer ademas:
SEC ID n° 19 (proneurotensina 1-132)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY EN SEC ID n° 20 (proneurotensina 120-140)
KIPYILKRQL YENKPRRPYI L SEC ID n° 21 (proneurotensina 120-147)
KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY SEC ID n° 22 (proneurotensina 128-147)
QLYENKPRRP YILKRDSYYY
En una forma de realización espedfica el nivel de proneurotensina se mide con un inmunoensayo. Mas espedficamente se utiliza un inmunoensayo tal como se describe en Ernst et al. (Peptides (2006), (27) 1787­ 1793). Un inmunoensayo que puede ser util para determinar el nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 puede comprender las etapas tal como se explican resumidamente en el ejemplo 3. Todos los umbrales y valores tienen que considerarse en correlacion con la prueba y la calibracion utilizadas segun el ejemplo 3. Un experto en la materia puede saber que el valor absoluto de un umbral podna verse influido por la calibracion utilizada. Esto significa que todos los valores y umbrales facilitados en la presente memoria han de entenderse en el contexto de la calibracion utilizada en la presente memoria (ejemplo 3). Esta disponible un calibrador de proneurotensina humana de ICI-Diagnostics, Berlin, Alemania. Alternativamente, el ensayo tambien puede calibrarse mediante P-NT 1-117 sintetica o recombinante o fragmentos de la misma (vease tambien Ernst et al, 2006).
El agente de union que puede utilizarse para determinar el nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 presenta una constante de afinidad para proneurotensina o proneurotensina 1-117 de por lo menos 107 M-1, preferida de 108 M-1, la constante de afinidad preferida es mayor de 109 M-1, mas preferentemente mayor de 1010 M-1. Un experto en la materia sabe que puede considerarse compensar una afinidad inferior aplicando una dosis superior de compuestos y esta medida no conducina a apartarse del alcance de la invencion. La afinidad de union puede determinarse utilizando el metodo de Biacore, ofrecido como analisis de servicio por ejemplo en Biaffin, Kassel, Alemania (http://www.biaffin.com/de/), vease tambien anteriormente.
El umbral para determinar el riesgo de contraer cancer en un sujeto o diagnosticar cancer en un sujeto, en particular cancer de mama en un sujeto femenino, segun los metodos de la presente invencion es aproximadamente de o superior a PNT 78 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o superior a 100 pmol/l, mas preferentemente aproximadamente de o superior a 150 pmol/l. En una forma de realización espedfica dicho umbral es aproximadamente de o superior a 100 pmol/l. Estos umbrales estan relacionados con el metodo de calibracion mencionado anteriormente. Un valor de PNT por encima de dicho umbral significa que el sujeto presenta un riesgo aumentado de contraer cancer o ya presenta cancer
Ademas de la determinacion del nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y/o la determinacion del nivel de proneurotensina (PNT) o proneurotensina 1-117 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; puede medirse la proencefalina (PENK) o MRPENK en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino. Debe apreciarse que ademas de la determinacion del nivel de PTA o pTa 1­ 37, puede medirse la proencefalina (PENK) o MRPENK en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino. Esto significa que se mide el nivel de o bien PTA sola o bien en combinacion con o bien PENK o bien PNT o se combina una determinacion de PTA y PNT y PENK y se correlaciona con dicho riesgo.
En una forma de realización mas espedfica del metodo segun la presente invencion, se determina el nivel de proencefalina (PENK) o MRPENK ademas de la determinacion del nivel de proneurotensina 1-117 y ademas de la determinacion de PTA o PTA 1-37 de la misma.
Por tanto, el objeto de la presente invencion es tambien un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino que no padece cancer que comprende:
■ determinar el nivel de PTA o PTA 1-37 en un fluido corporal seleccionado de entre sangre, plasma o suero obtenido de dicho sujeto; y
■ determinar el nivel de proneurotensina o proneurotensina 1-117 en dicho fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y/o
■ determinar el nivel de proencefalina o MRPENK en dicho fluido corporal obtenido de dicho sujeto; y correlacionar dicho nivel de PTA o PTA 1-37 y proneurotensina o proneurotensina 1-117 y/o el nivel de proencefalina o MRPENK con un riesgo de contraer cancer de mama,
en el que un nivel reducido de PTA o PTA 1-37 es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama y en el que un nivel incrementado de proneurotensina o proneurotensina 1-117 es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama y en el que un nivel reducido de proencefalina o MRPENK es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
La correlacion entre el biomarcador y las combinaciones de biomarcadores anteriores y los casos de cancer de mama en mujeres es en particular notable segun la presente invencion.
La proencefalina y asimismo los fragmentos dados a conocer pueden presentar la siguiente secuencia:
SEC ID n° 23 (proencefalina (1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTL
RENSKPEESHTJAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSETLAKRYGGFMK KDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQL
EDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPE
MEKRYGGF MRF
Se dan a conocer fragmentos de proencefalina en:
SEC ID n° 24 (Syn-encefalina, proencefalina 1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTL
RENSKPEESHLLA SEC ID n° 25 (Met-encefalina)
YGGFM SEC ID n° 26 (Leu-encefalina)
YGGFL SEC ID n° 27 (proencefalina 90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
Segun la presente invencion, SEC ID n° 28 (proencefalina 119-159, fragmento de proencefalina regional medio, MRPENK) corresponde a:
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
Se dan a conocer ademas:
SEC ID n° 29 (Met-encefalina-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL SEC ID n° 30 (proencefalina 172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEC ID n° 9 (proencefalina 193-203)
VGRPEWWMDYQ SEC ID n° 31 (proencefalina 213-234)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME SEC ID n° 32 (proencefalina 213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M SEC ID n° 33 (Met-encefalina-Arg-Phe)
YGGFMRF
Determinar el nivel de proencefalina incluyendo, en general pero no en el contexto de la presente invencion, Leuencefalina y Met-encefalina o fragmentos de la misma puede significar que se determina la inmunorreactividad hacia proencefalina o fragmented de la misma incluyendo Leu-Encefalina y Met-encefalina. Un agente de union utilizado para la determinacion de proencefalina incluyendo Leu-Encefalina y Met-encefalina o fragmented de la misma dependiendo de la region de union puede unirse a mas de una de las moleculas presentadas anteriormente. Esto resulta evidente para un experto en la materia.
En una forma de realización mas espedfica del metodo segun la presente invencion, se determina el nivel de MRPENK (SEC ID n° 28: (proencefalina 119-159, fragmento de proencefalina regional medio, MRPENK) que es DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS.
En una forma de realización espedfica se mide el nivel de proencefalina o MRPENK con un inmunoensayo utilizando anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen a proencefalina o fragmentos de la misma. Un inmunoensayo que puede ser util para determinar el nivel de proencefalina o MRPENK puede comprender las etapas tal como se explican resumidamente en el ejemplo 4. Todos los umbrales y valores tienen que considerarse en correlacion con la prueba y la calibracion utilizadas segun el ejemplo 4. Un experto en la materia puede saber que el valor absoluto de un umbral podna verse influido por la calibracion utilizada. Esto significa que todos los valores y umbrales proporcionados en la presente memoria han de entenderse en el contexto de la calibracion utilizada en la presente memoria (ejemplo 4).
Segun la invencion el agente de union de diagnostico para proencefalina (y/o proneurotensina/proneurotensina 1­ 117) se selecciona de entre el grupo que consiste en anticuerpos por ejemplo IgG, una inmnoglobulina de longitud completa tfpica o fragmentos de anticuerpo que contienen por lo menos el dominio variable F de cadena pesada y/o ligera como por ejemplo anticuerpos acoplados qmmicamente (fragmento de union a antfgeno) incluyendo pero sin limitarse a fragmentos Fab incluyendo minicuerpos de Fab, anticuerpo de Fab de cadena sencilla, anticuerpo de Fab monovalente con etiquetas de epftopo, por ejemplo Fab-V5Sx2; Fab bivalente (minianticuerpo) dimerizado con el dominio CH3; Fab bivalente o Fab multivalente, por ejemplo formado por medio de multimerizacion con la ayuda de un dominio heterologo, por ejemplo por medio de dimerizacion de dominios dHLX, por ejemplo Fab-dHLX-FSx2; fragmentos F(ab')2, fragmentos scFv, fragmentos scFv multimerizados multivalentes o/y multiespedficos, diacuerpos bivalentes y/o biespedficos, BITE® ("bispecific T cell engager", acoplador de celulas T biespedfico), anticuerpos trifuncionales, anticuerpos polivalentes, por ejemplo de una clase diferente de G; anticuerpos de un solo dominio, por ejemplo nanocuerpos derivados de inmunoglobulinas de camelidos o peces.
En una forma de realización espedfica el nivel de proencefalina o MRPENK (y/o proneurotensina y proneurotensina 1-117) se mide con un ensayo que utiliza agentes de union seleccionados de entre el grupo que comprende aptameros, armazones distintos de Ig tal como se describe con mayor detalle a continuacion que se unen a proencefalina o MRPENK de la misma.
Los agentes de union que pueden utilizarse para determinar el nivel de proencefalina o MRPENK (y/o proneurotensina y proneurotensina 1-117) de la misma presentan una constante de afinidad para proencefalina (y/o proneurotensina y proneurotensina 1-117) de por lo menos 107 M-1, preferida de 108 M-1, la constante de afinidad preferida es mayor de 10 M‘ , mas preferentemente de mas de 10 M‘ . Un experto en la materia sabe que puede considerarse compensar la afinidad inferior aplicando una dosis superior de compuestos y esta medida no conducina a apartarse del alcance de la invencion. La afinidad de union puede determinarse utilizando el metodo de Biacore, ofrecido como analisis de servicio por ejemplo en Biaffin, Kassel, Alemania (http://www.biaffin.com/de/), ver tambien anteriormente.
Esta disponible una muestra humana de control de proencefalina humana de ICI-Diagnostics, Berlin, Alemania http://www.icidiagnostics.com/. El ensayo puede calibrarse tambien mediante proencefalina sintetica (para los experimentos se utilizo MRPENK sintetica, SEC ID n° 28) o recombinante o fragmentos de la misma.
El umbral de proencefalina (PENK) para determinar el riesgo de contraer cancer de mama, en un sujeto femenino segun los metodos de la presente invencion es aproximadamente de o inferior a 100 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 75 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 50 pmol/l, preferentemente aproximadamente de 40.4 pmol/l. En una forma de realización espedfica dicho umbral es aproximadamente de 40.4 pmol/l. Estos umbrales estan relacionados con el metodo de calibracion mencionado anteriormente. Un valor de PENK por debajo de dicho umbral significa que el sujeto corre un riesgo aumentado de contraer cancer o ya presenta cancer.
En una forma de realización de la invencion dicho metodo se realiza mas de una vez con el fin de monitorizar el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino, o con el fin de monitorizar el transcurso del tratamiento. En una forma de realización espedfica dicha monitorizacion se realiza con el fin de evaluar la respuesta de dicho sujeto a las medidas preventivas y/o terapeuticas tomadas.
En una forma de realización de la invencion el metodo se utiliza con el fin de estratificar a dichos sujetos femeninos en grupos de riesgo.
El objeto de la presente invencion es tambien un metodo para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino segun cualquiera de las formas de realización anteriores, en el que se utiliza el nivel de protaquicinina o protaquicinina 1-37 en un fluido corporal tal como se definio anteriormente obtenido de dicho sujeto o bien solo o bien conjuntamente con otros parametros clmicos o de laboratorio predictivos para la prediccion del riesgo de un sujeto de contraer cancer de mama mediante un metodo que puede seleccionarse de entre las siguientes alternativas:
■ la comparacion con la mediana del nivel de protaquicinina o protaquicinina 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de sujetos “sanos” o “aparentemente sanos”,
■ la comparacion con un cuantil del nivel de protaquicinina o protaquicinina 1-37 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto en un conjunto de muestras predeterminadas en una poblacion de sujetos “sanos” o “aparentemente sanos”,
■ el calculo basado en analisis de peligros proporcionales de Cox o utilizando calculos de mdice de riesgo tales como el NRI (mdice de reclasificacion neta) o el IDI (mdice de discriminacion integrado).
En una forma de realización de la invencion dicho metodo se realiza mas de una vez con el fin de monitorizar el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino, o con el fin de monitorizar el transcurso del tratamiento. En una forma de realización espedfica dicha monitorizacion se realiza con el fin de evaluar la respuesta de dicho sujeto a las medidas preventivas y/o terapeuticas tomadas.
En una forma de realización de la invencion el metodo se utiliza para estratificar a dichos sujetos en grupos de riesgo.
Descripcion de las figuras
Figura 1: representa una curva de dosis de PTA/senal tfpica. Curva patron de PTA.
Figura 2: Graficas de Kaplan Meier, que ilustran el diagnostico de cancer de mama acumulado en cuartil (Q) 1 (por debajo de 45.6 pmol/l), cuartil 2 (45.6-55.3 pmol/l), cuartil 3 (55.4-65.9 pmol/l), cuartil 4 (por encima de 65.9 pmol/l) de mujeres. La disminucion de PTA indica un riesgo a largo plazo incrementado de desarrollo de cancer de mama. Puesto que se excluyo cualquier mujer con antecedentes de cancer el primer dfa (toma de muestras de sangre), PTA es altamente predictiva del desarrollo futuro de cancer de mama. Sobre todo, las mujeres del Q 1 presentan mas de 2.1 veces mas riesgo de desarrollar cancer de mama que las mujeres del Q 4.
Figura 3: representa una curva de dosis de PNT/senal tfpica. Curva patron de PNT.
Figura 4: representa una curva de dosis de MR PENK/senal tfpica. Curva patron de MR PENK.
Figura 5: Ejemplo de ilustracion del analisis combinado de PTA y PNT para la prediccion de cancer de mama, los grupos de riesgo se presentan tal como se define en la tabla 9.
Ejemplos
Ejemplo 1 Inmunoensayo de PTA
Desarrollo de anticuerpos anti-PTA
Peptidos/coniuaados para inmunizacion:
Se sintetizaron peptidos para inmunizacion (JPT Technologies, Berlin, Alemania) con un residuo de cistema N-terminal adicional para la conjugacion de los peptidos con albumina serica bovina (BSA). Los peptidos se unieron covalentemente a BSA utilizando Sulfo-SMCC (Perbio-science, Bonn, Alemania). El procedimiento de acoplamiento se realizo segun el manual de Perbio.
Tabla 1:
Figure imgf000013_0001
Se generaron los anticuerpos segun el siguiente metodo:
Se inmunizo un raton BALB/c con 100 |ig de conjugado de peptido-BSA el d^ a 0 y 14 (emulsionado en 100 |il de adyuvante completo de Freund) y 50 |ig el dfa 21 y 28 (en 100 |il de adyuvante incompleto de Freund). Tres dfas antes de que se realizara el experimento de fusion, el animal recibio 50 |ig del conjugado disuelto en 100 |il de solucion salina, administrada como una inyeccion intraperitoneal y una intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos del raton inmunizado y celulas de la estirpe celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras lavar, se sembraron las celulas en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron clones tubridos mediante crecimiento en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 20% y suplemento de HAT]. Tras dos semanas se reemplaza el medio HAT por medio HT durante tres pases seguido por retorno al medio de cultivo celular normal.
Se examinaron principalmente los sobrenadantes de cultivo celular para detectar anticuerpos IgG espedficos de antfgeno tres semanas tras la fusion. Los microcultivos que dieron positivo se transfirieron a placas de 24 pocillos para su propagacion. Tras volverlos a someter a prueba, se clonaron los cultivos seleccionados y volvieron a clonarse utilizando la tecnica de dilucion limitante y se determinaron los isotipos.
(Lane, R.D. “A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”, J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. “Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies”, Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).
Produccion de anticuerpos monoclonales
Se produjeron anticuerpos por medio de metodos de produccion de anticuerpos convencionales (Marx et al., Monoclonal Antibody Production (1997), ATLA 25, 121) y se purificaron por medio de cromatograffa de protema A. Las purezas de los anticuerpos fueron > 95% basandose en el analisis de electroforesis en gel de SDS.
Marcaie y recubrimiento de anticuerpos.
Se marcaron todos los anticuerpos con ester de acridinio segun el siguiente procedimiento:
Compuesto marcado (trazador, anti-PTA 3-22): se mezclaron 100 |ig (100 |il) de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7.4), con 10 |il de NHS-ester de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (documento EP 0353 971) y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Se purifico el anticuerpo marcado mediante HPLC de filtracion en gel en Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.). Se diluyo el anticuerpo marcado purificado en (fosfato de potasio 300 mmol/l, NaCl 100 mmol/l, Na-EDTA 10 mmol/l, albumina serica bovina 5 g/l, pH 7.0). La concentracion final era aproximadamente de 800.000 unidades relativas de luz (URL) de compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 |il. Se midio la quimioluminiscencia del ester de acridinio utilizando un instrumento AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Anticuerpo en fase solida (anticuerpo recubierto):
Fase solida: Se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con anticuerpo anti-PTA 22-36 (1.5 |ig de anticuerpo/0.3 ml de NaCl 100 mmol/l, Tris/HCl 50 mmol/l, pH 7.8). Tras bloquear con albumina serica bovina al 5%, se lavaron los tubos con PBS, pH 7.4 y se secaron a vado.
Inmunoensayo de PTA:
Se pipetearon 50 |il de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, tras anadir anticuerpo marcado (200 ul), se incubaron los tubos durante 2 h a 18-25°C. Se elimino el trazador no unido lavando 5 veces (cada una 1 ml) con disolucion de lavado (PBS 20 mmol/l, pH 7.4, Triton X-100 al 0.1%). Se midio el anticuerpo marcado unido al tubo utilizando un luminometro LB 953, Berthold, Alemania.
Calibracion:
Se calibro el ensayo utilizando diluciones de P37 sintetica, diluida en K2PO420 mM, EDTA6 mM, BSA al 0,5%, amastatina 50 |iM, leupeptina 100 |iM, pH 8.0. Esta disponible plasma de control de PTA de ICI-diagnostics, Berlin, Alemania.
La figura 1 representa una curva de dosis de PTA/senal tipica.
La sensibilidad de ensayo analftico fue (la mediana de la senal generada por 20 determinaciones de 0-calibrador (sin adicion de PTA) 2DE2 desviaciones estandar (DE), la concentracion de PTA correspondiente se calcula a partir de una curva patron) de 4,4 pmol/l.
Ejemplo 2 Estudio de poblacion/PTA
Metodos
Se midio PTA en plasma en ayunas de 2559 participates femeninos de la poblacion basada en el examen inicial del estudio Malmo Diet and Cancer en 1991-1994 (edad de 58 6 anos). Se utilizaron modelos de peligros proporcionales de Cox ajustados a multiples variables (todos los factores de riesgo cardiovasculares tradicionales, factores de riesgo de diabetes y en analisis de cancer tambien herencia de cancer) para relacionar PTA inicial (razon de peligro por cada aumento de desviacion estandar de PTA transformada logantmicamente) con el tiempo hasta el primer acontecimiento de cada uno de los criterios de valoracion estudiados durante una mediana de seguimiento de mas de 12 anos. Se recuperaron los criterios de valoracion del Swedish National Hospital Discharge Registry, el Swedish Myocardial Infarction Registry, el Stroke in Malmo Registry y el Swedish Cancer Registry. La recuperacion de los criterios de valoracion a traves de estos registros se ha validado y se ha encontrado que es precisa (ver tambien Belting et al. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev; 1-10. 2012 AACR). Se midio la insulina mediante metodos de laboratorio convencionales.
Tabla 2
Figure imgf000014_0001
Distribucion de PTA en la poblacion de mujeres (N=2559):
El valor medio de PTA en la poblacion femenina fue de 54.3 pmol/l, desviacion estandar /-1.4 pmol/l. Todos los resultados estaban dentro del intervalo de medicion del ensayo, la concentracion de PTA mas baja fue de 9.1 pmol/l. Estos resultados indican la idoneidad del ensayo utilizado (sensibilidad del ensayo 4.4 pmol/l).
PTA y prediccion de cancer de mama
Se evaluo la relacion entre PTA y cancer de mama (tabla 3). Todas las mujeres con cancer previo (N=459) se excluyeron de la evaluacion. Habfa una fuerte relacion entre PTA y cancer de mama en mujeres. En un modelo completamente ajustado, cada DE de disminucion de PTA (se utilizaron cuartiles invertidos, revPTA, ver la tabla 3/4) estaba asociado con un riesgo incrementado del 28,2% de futuro cancer de mama (tabla 3) y el cuartil superior frente al inferior de PTA identifico una diferencia de mas de 2,1 veces en el riesgo de cancer de mama (ver la tabla 5 y la figura 2). Insulina sin PTA en la ecuacion no estaba asociada significativamente con desarrollo futuro cancer de mama, pero, sorprendentemente, si PTA es parte de la ecuacion la insulina resulto significativa (p=0.035). El aumento de insulina estaba asociado con riesgo disminuido del 34.6% por DE de futuro cancer de mama. La potencia predictiva de PTA no se vio influida por la insulina.
Tabla 3:
Figure imgf000015_0002
Tabla 4:
Figure imgf000015_0003
Tabla 5: Modelos de peligros proporcionales de Cox multivariantes para PTA inicial frente a la incidencia de cancer de mama.
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 3
Ensayo de proneurotensina
Se generaron anticuerpos tal como se describe anteriormente. Se genero el anticuerpo para el marcaje (LA) contra P-NT 1-19 (H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH (SEC ID n° 33)) y se genero el anticuerpo en fase solida (SPA) contra el peptido P-NT 44-62 (CNLNSPAEETGEVHEEELVA (SEC ID n° 34). Se realizo el desarrollo y la produccion de anticuerpos tal como se describe anteriormente.
Inmunoensayo para la cuantificacion de proneurotensina humana
La tecnologfa utilizada fue un inmunoensayo de luminiscencia de tubo recubierto de tipo sandwich, basado en marcaje con ester de acridinio.
Compuesto marcado (trazador): se mezclaron 100 |ig (100 |il) de LA (1 mg/ml en PBS, pH 7.4), con 10 |il de NHS-ester de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (documento EP 0 353 971) y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Se purifico LA marcado mediante HPLC de filtracion en gel en Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.). Se diluyo el LA purificado en (fosfato de potasio 300 mmol/l, NaCl 100 mmol/l, Na-EDTA 10 mmol/l, albumina serica bovina 5 g/l, pH 7.0). La concentracion final era aproximadamente de 800.000 unidades relativas de luz (URL) de compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 |il. Se midio la quimioluminiscencia de ester de acridinio utilizando un instrumento AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Fase solida: Se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con SPA (1.5 |ig de SPA/0.3 ml de NaCl 100 mmol/l, Tris/HCl 50 mmol/l, pH 7.8). Tras bloquear con albumina serica bovina al 5%, se lavaron los tubos con PBS, pH 7.4 y se secaron a vado.
Calibracion:
Se calibro el ensayo utilizando diluciones de proneurotensina que conteman suero humano. Se diluyo un conjunto de sueros humanos con alta inmunorreactividad con proneurotensina (InVent Diagostika, Hennigsdorf, Alemania) con suero de caballo (Biochrom AG, Alemania) (patrones de ensayo).
Se calibraron los patrones mediante la utilizacion del calibrador de proneurotensina humana (ICI-Diagnostics, Berlm, Alemania). Alternativamente, el ensayo puede calibrarse mediante P-NT 1-117 sintetica o recombinante o fragmentos de la misma (ver tambien Ernst et al., 2006).
Inmunoensayo de ProNT:
Se pipetearon 50 |il de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos con SPA, tras anadir LA marcado (200 ul), se incubaron los tubos durante 16-22 h a 18-25°C. Se elimino el trazador no unido lavando 5 veces (cada una 1 ml) con disolucion de lavado (PBS 20 mmol/l, pH 7.4, Triton X-100 al 0.1%). Se midio LA unido al tubo utilizando un luminometro LB 953. Se calcularon los resultados a partir de la curva de calibracion. Se muestra una curva de calibracion tipica en la figura 3.
Ejemplo 4:
Inmunoensayo de proencefalina
Desarrollo de anticuerpos
Peptidos/conjugados para la inmunizacion:
Se sintetizaron peptidos para la inmunizacion (JPT Technologies, Berlin, Alemania) con un residuo de cistema N-terminal adicional para la conjugacion de los peptidos con albumina serica bovina (BSA). Los peptidos se unieron covalentemente a BSA utilizando Sulfo-SMCc (Perbio-science, Bonn, Alemania). El procedimiento se realizo segun el manual de Perbio.
Tabla 6
Figure imgf000016_0002
Se generaron los anticuerpos segun el siguiente metodo:
Se inmunizo un raton BALB/c con 100 |ig de conjugado de peptido-BSA el d^ a 0 y 14 (emulsionado en 100 |il de adyuvante completo de Freund) y 50 |ig el dfa 21 y 28 (en 100 |il de adyuvante incompleto de Freund). Tres dfas antes de que se realizara el experimento de fusion, el animal recibio 50 |ig del conjugado disuelto en 100 |il de solucion salina, administrada como una inyeccion intraperitoneal y una intravenosa.
Se fusionaron esplenocitos del raton inmunizado y celulas de la estirpe celular de mieloma SP2/0 con 1 ml de polietilenglicol al 50% durante 30 s a 37°C. Tras lavar, se sembraron las celulas en placas de cultivo celular de 96 pocillos. Se seleccionaron clones tnbridos mediante crecimiento en medio HAT [medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 20% y suplemento de HAT]. Tras dos semanas se reemplaza el medio HAT con medio HT durante tres pases seguido por retorno al medio de cultivo celular normal.
Se examinaron principalmente los sobrenadantes de cultivo celular para detectar anticuerpos IgG espedficos de antfgeno tres semanas tras la fusion. Los microcultivos que dieron positivo se transfirieron a placas de 24 pocillos para su propagacion. Tras volverlos a someter a prueba se clonaron los cultivos seleccionados y volvieron a clonarse utilizando la tecnica de dilucion limitante y se determinaron los isotipos.
(Lane, R.D. “A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas”, J. Immunol. Met. 81: 223-228; (1985), Ziegler, B. et al. “Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies”, Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).
Tabla 7
Figure imgf000016_0001
Produccion de anticuerpos monoclonales
Se produjeron anticuerpos por medio de metodos de produccion de anticuerpos convencionales (Marx et al., Monoclonal Antibody Production (1997), ATLA 25, 121) y se purificaron por medio de cromatograffa de protema A. Las purezas de los anticuerpos fueron > 95% basandose en analisis de electroforesis en gel de SDS.
Marcaje y recubrimiento de anticuerpos.
Compuesto marcado (trazador, anticuerpo CT-MRPENK): se mezclaron 100 |ig (100 |il) de anticuerpo (1 mg/ml en PBS, pH 7.4) con 10 |il de NHS-ester de acridinio (1 mg/ml en acetonitrilo, InVent GmbH, Alemania) (documento EP 0 353 971) y se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente. Se purifico el anticuerpo marcado mediante HPLC de filtracion en gel en Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.). Se diluyo el anticuerpo marcado purificado en (fosfato de potasio 300 mmol/l, NaCl 100 mmol/l, Na-EDTA 10 mmol/l, albumina serica bovina 5 g/l, pH 7.0). La concentracion final era aproximadamente de 800.000 unidades relativas de luz (URL) de compuesto marcado (aproximadamente 20 ng de anticuerpo marcado) por 200 |il. Se midio la quimioluminiscencia del ester de acridinio utilizando un instrumento AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Anticuerpo en fase solida (anticuerpo en tubo recubierto, anticuerpo MR-MRPENK):
Fase solida: Se recubrieron tubos de poliestireno (Greiner Bio-One International AG, Austria) (18 h a temperatura ambiente) con anticuerpo (1.5 |ig de anticuerpo/0.3 ml de NaCl 100 mmol/l, Tris/HCl 50 mmol/l, pH 7.8). Tras bloquear con albumina serica bovina al 5%, se lavaron los tubos con PBS, pH 7.4 y se secaron a vado.
Inmunoensayo de proencefalina:
Se pipetearon 50 |il de muestra (o calibrador) en tubos recubiertos, tras anadir anticuerpo marcado (200 ul), se incubaron los tubos durante 2 h a 18-25°C. Se elimino el trazador no unido lavando 5 veces (cada una 1 ml) con disolucion de lavado (PBS 20 mmol/l, pH 7.4, Triton X-100 al 0.1%). Se midio el anticuerpo marcado unido al tubo utilizando el luminometro 953.
Calibracion:
Se calibro el ensayo utilizando diluciones de MRPENK sintetica, diluida en K2PO420 mM, EDTA 6 mM, BSA al 0.5%, amastatina 50 |iM, leupeptina 100 |iM, pH 8.0. Esta disponible plasma de control de proencefalina de ICI-diagnostics, Berlin, Alemania.
La figura 4 representa una curva de dosis de proencefalina/senal tfpica.
La sensibilidad del ensayo (20 determinaciones de 0-calibrador (sin adicion de MRPENK) 2DE) fue de 5.5 pmol/l.
Ejemplo 5
Analisis de combinacion de PTA, proneurotensina y HRT. y PTA, proneurotensina, proencefalina e insulina para la prediccion de cancer de mama.
Puesto que se mostro recientemente que el aumento de proneurotensina y proencefalina era altamente predictivo de cancer de mama, se combinaron estos biomarcadores para la prediccion de cancer de mama. Se anadio HRT (terapia de sustitucion de hormonas) como factor de riesgo conocido para cancer de mama para mostrar el valor incremental de PTA.
En primer lugar, se combinaron PTA/proneuroensina/HRT/insulina:
No existe una correlacion significativa entre PTA y proneurotensina (p= 0.71). En un modelo combinado que incluye insulina y terapia de sustitucion de hormonas (HRT) utilizando PTA y PNT (tabla 8), se descubre que ambas son independientes en la prediccion de cancer de mama. Ambos marcadores son altamente significativos (p=0.005 para PTAy p<0.001 para PNT).
En un modelo completamente ajustado, cada aumento de DE de PNT estaba asociado con un aumento del riesgo del 45.5% de futuro cancer de mama. Cada aumento de DE de PTA estaba asociado con un riesgo disminuido del 18.9% (por DE) de futuro cancer de mama.
La HRT, tal como se esperaba, era significativa en el mismo modelo, pero la insulina, sorprendentemente, estaba en la parte superior de la prediccion de cancer de mama (p=0,027). Cada aumento de DE de insulina estaba asociado con una disminucion del 35.7% de futuro cancer de mama.
Estos datos muestran que PTA, PNT, insulina y HRT anaden cada una informacion significativa para la prediccion de cancer de mama.
Tabla 8: analisis combinado de PNT y PTA para la prediccion de cancer de mama.
Figure imgf000018_0002
En un analisis de Kaplan Meier, se ilustra la informacion combinatoria de PTA y PNT, tabla 9 y figura 5:
Se combinaron los cuartiles de PTA y PNT
Puesto que valores de PTA bajos indican un riesgo incrementado de desarrollo de cancer de mama, se invirtieron los cuartiles de PTA (revPTA): 1° cuartil PTA = 4° cuartil revPTA; 2° cuartil PTA = 3° cuartil revPTA; 3° cuartil PTA = 2° cuartil revPTA; 4° cuartil PTA = 1° cuartil revPTA. (Tabla 9)
Tabla 9
Figure imgf000018_0001
La combinacion del cuartil mas alto de PNT y el cuartil mas bajo de PTA (grupo 6) frente al cuartil mas bajo de PNT y el mas alto de PTA (grupo 1) mostro un riesgo combinado de 4.9 para futuro cancer de mama (ver la figura 5).
Analisis combinado de PTA, proencefalina, HRT insulina y PNT en la poblacion femenina:
Existe una correlacion significativa entre PTA y proencefalina (p= <0.001, r= 0.35). En un modelo combinado que inclrna insulina, PTA, PNT y proencefalina, se encontro que todos los marcadores anadfan independientemente informacion para la prediccion de cancer de mama (tabla 10). Todos los marcadores eran altamente significativos (p=0.028 para PTA, p<0.001 para PNT, p= 0.009 para insulina y p< 0.001 para proencefalina). PTAsigue siendo independiente aunque este altamente correlacionada con proencefalina. En un modelo completamente ajustado, cada aumento de DE de PNT estaba asociado con un aumento del riesgo del 47.8% de futuro cancer de mama. El aumento de PTA estaba asociado con un riesgo disminuido del 15.8% (por DE) de futuro cancer de mama. El aumento de proencefalina estaba asociado con un riesgo disminuido del 26.4% (por DE) y el aumento de insulina estaba asociado con un riesgo disminuido del 40.4% (por DE) de futuro cancer de mama.
Estos datos muestran una fuerte informacion independiente y aditiva sobre el desarrollo futuro de cancer de mama mediante PTA, PNT, proencefalina e insulina.
Tabla 10: Analisis combinado de PTA, proencefalina, insulina y PNT
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001

Claims (19)

REIVINDICACIONES
1. Método para predecir el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino que no padece cancer que comprende:
■ determinar el nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
■ correlacionar dicho nivel de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 con el riesgo de contraer cancer, en el que un nivel reducido es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama,
en el que un nivel reducido significa un nivel inferior a un determinado nivel umbral y en el que el fluido corporal es sangre o plasma o suero.
2. Método segun la reivindicación 1, en el que dicho nivel umbral de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 que es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama es aproximadamente de o inferior a 80 pmol/l.
3. Método segun la reivindicación 1, en el que dicho nivel umbral de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 que es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama es aproximadamente de o inferior a 60 pmol/l.
4. Método segun la reivindicación 1, en el que dicho nivel umbral de protaquicinina que es SEC ID n° 1, o protaquicinina 1-37 que es SEC ID n° 2 que es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama es un nivel aproximadamente de o inferior a 45.6 pmol/l.
5. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1a 4, en el que estan comprendidas ademas las etapas siguientes:
■ determinar el nivel de proneurotensina que es SEC ID n° 14 o proneurotensina 1-117 que es SEC ID n° 18 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
■ correlacionar adicionalmente proneurotensina o proneurotensina 1-117 con un riesgo de contraer cancer, en el que un nivel incrementado de proneurotensina o proneurotensina 1-117 es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
6. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1a 5, en el que estan comprendidas ademas las etapas siguientes:
■ determinar el nivel de proencefalina que es SEC ID n° 23 o MRPENK que es SEC ID n° 28 en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
■ correlacionar adicionalmente proencefalina o MRPENK con un riesgo de contraer cancer de mama, y en el que un nivel reducido de proencefalina o MRPENK es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
7. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, en el que estan comprendidas ademas las etapas siguientes:
■ determinar el nivel de insulina en un fluido corporal obtenido de dicho sujeto femenino; y
■ correlacionar adicionalmente insulina con un riesgo de contraer cancer de mama, en el que un nivel reducido de insulina es predictivo de un riesgo aumentado de contraer cancer de mama.
8. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que correlacionar adicionalmente significa un analisis combinado de los niveles de biomarcador determinados considerando los factores de riesgo relativos para el desarrollo del cancer obtenidos mediante los biomarcadores individuales.
9. Método segun las reivindicaciones 5 a 8, en el que un nivel incrementado de proneurotensina es un nivel superior a un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de o superior a 78 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o superior a 100 pmol/l, mas preferentemente aproximadamente de 150 pmol/l.
10. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que un nivel reducido de proencefalina es un nivel inferior a un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de o inferior a 100 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 75 pmol/l, preferentemente aproximadamente de o inferior a 50 pmol/l, preferentemente aproximadamente de 40.4 pmol/l.
11. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que un nivel reducido de insulina es un nivel inferior a un umbral en el que dicho umbral es aproximadamente de 70 pmol/l.
12. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho sujeto femenino nunca ha presentado antecedentes de diagnostico de cancer en el momento en el que la muestra de fluido corporal se toma de dicho sujeto femenino.
13. Método segun las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho sujeto femenino ha presentado antecedentes de diagnostico de cancer y se ha curado en el momento en el que la muestra de fluido corporal se toma de dicho sujeto femenino y se determina el riesgo de reaparicion del cancer de mama.
14. Método segun las reivindicaciones 1 a 13, en el que en el momento en el que la muestra de fluido corporal se toma de dicho sujeto femenino, a dicho sujeto femenino se le ha diagnosticado que presenta una enfermedad cardiovascular o diabetes.
15. Método segun las reivindicaciones 1 a 14, en el que adicionalmente se determina por lo menos un parametro clmico seleccionado de entre el grupo que comprende: edad, presencia de diabetes mellitus, tabaquismo actual.
16. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que el nivel de protaquicinina y proneurotensina y/o proencefalina y/o insulina se mide con un inmunoensayo.
17. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho metodo se realiza mas de una vez para monitorizar el riesgo de contraer cancer de mama en un sujeto femenino.
18. Método segun la reivindicación 17, en el que dicha monitorizacion se realiza para evaluar la respuesta de dicho sujeto femenino a las medidas preventivas y/o terapeuticas tomadas.
19. Método segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, para estratificar dichos sujetos femeninos en grupos de riesgo.
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