WO2020241801A1 - 浸潤性腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー糖タンパク質およびその断片 - Google Patents

浸潤性腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー糖タンパク質およびその断片 Download PDF

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hhl
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晶 栂谷内
敦 久野
裕之 梶
成松　久
雅之 野口
亮太 松岡
徳彦 池田
俊孝 長尾
純一 前田
康雄 櫻井
斉湖 吉村
省一 金山
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国立研究開発法人産業技術総合研究所
国立大学法人 筑波大学
学校法人東京医科大学
キヤノンメディカルシステムズ株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer

Definitions

  • Embodiments of the present invention relate to an invasive adenocarcinoma morbidity determination method, an analysis method, and a marker glycoprotein and a fragment thereof used therein.
  • the number of lung cancers in Japan is the second highest among cancers, affecting more than 100,000 people every year.
  • the number of deaths from lung cancer is the highest among cancers, which is 70,000 every year.
  • lung cancers the number of people suffering from lung adenocarcinoma accounts for about half, and the 5-year survival rate is less than 40%. Therefore, there is a need for a method for detecting and treating lung adenocarcinoma as soon as possible.
  • Lung adenocarcinoma is one of non-small cell lung cancers and is classified into a plurality of types such as preinvasive lesions, microinvasive adenocarcinomas, and invasive adenocarcinomas.
  • lung lesions are often found on X-ray CT images.
  • the abnormal shadow seen on the CT image is also small, and it is difficult to distinguish whether it is a lesion requiring treatment such as cancer or another benign disease.
  • even a tissue biopsy using a bronchoscope may not always be able to collect sufficient lesion cells / tissues to make a diagnosis.
  • There is also a diagnostic method that measures tumor markers by blood test but when the lesion is small, a significant difference from that of a healthy person is unlikely to appear.
  • LPA Lepidic predominant adenocarcinoma
  • the problem to be solved by the present invention is whether or not the classification of the lung adenocarcinoma in which the subject is affected is an invasive adenocarcinoma that requires immediate treatment, as defined as a pre-invasive lesion or a microinvasive cancer.
  • the marker glycoprotein according to the embodiment is a marker glycoprotein for distinguishing whether or not the classification of lung adenocarcinoma affecting the subject is invasive adenocarcinoma from pre-invasive lesions or microinvasive cancers. is there.
  • Marker glycoproteins include proteins and sugar chains attached to the proteins.
  • the protein is procollagen lysine-2-oxoglutaric acid-5-dioxygenase (PLOD3) or ceruloplasmin (CP), and the sugar chain is a sugar chain having a binding ability to Hippeastrum Hybrid Lectin (HHL). .. HHL is a lectin also called Amaryllis lectin (AL).
  • PLOD3 procollagen lysine-2-oxoglutaric acid-5-dioxygenase
  • CP ceruloplasmin
  • HHL Hippeastrum Hybrid Lectin
  • HHL Hippeastrum Hybrid Lectin
  • HHL is a lect
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of an invasive adenocarcinoma morbidity determination method of the embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of the analysis method of the embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the lectin array.
  • FIG. 4 is a photograph of electrophoresis (silver-stained image) showing the experimental results of the expression analysis of the marker glycoprotein.
  • FIG. 5 is a flowchart showing a method of catching lectins.
  • FIG. 6 is a photograph of electrophoresis (Western blotting analysis image) showing the experimental results of the expression analysis of the marker glycoprotein.
  • FIG. 1 is a flowchart showing an example of an invasive adenocarcinoma morbidity determination method of the embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing an example of the analysis method of the embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the lectin array.
  • FIG. 4
  • FIG. 7 is a photograph of electrophoresis (Western blotting analysis image) showing the experimental results of the expression analysis of the marker glycoprotein.
  • FIG. 8 is a photograph of electrophoresis (Western blotting analysis image) showing the results of a comparative experiment of candidate protein concentrations in lesions.
  • FIG. 9 is a photograph of electrophoresis (Western blotting analysis image) showing the results of a comparative experiment of candidate protein concentrations in lesions.
  • a marker glycoprotein or a fragment thereof for distinguishing whether or not the classification of the lung adenocarcinoma affecting the subject is invasive adenocarcinoma from pre-invasive lesions or microinvasive cancers.
  • Marker glycoproteins include proteins and sugar chains attached to the proteins.
  • the protein is procollagen lysine-2-oxoglutaric acid-5-dioxygenase (PLOD3) or ceruloplasmin (CP), and the sugar chain is a sugar chain having a binding ability to Hippeastrum Hybrid Lectin (HHL) (hereinafter referred to as “)”. , "HHL-binding sugar chain”).
  • HHL is a lectin also called Amaryllis lectin (AL).
  • A Amaryllis lectin
  • a method for determining morbidity of invasive adenocarcinoma and a method for analysis, which comprises detecting or quantifying the marker glycoprotein or a fragment thereof in a sample.
  • the marker glycoprotein of the embodiment the invasive adenocarcinoma morbidity determination method, and the analysis method will be described.
  • the marker glycoprotein according to the embodiment is used to distinguish whether or not the subject is affected by the classification of lung adenocarcinoma as invasive adenocarcinoma, distinguishing it from preinvasive lesions or microinvasive cancers. It is a marker glycoprotein.
  • the target is an animal to be analyzed, that is, an animal that provides a sample described later.
  • the subject may be an animal having some disease or a healthy animal.
  • the subject is an animal that may have lung cancer or an animal that has lung cancer.
  • Animals are, for example, mammals. Mammals belong to, for example, primates such as monkeys and humans, rodents such as mice, rats and guinea pigs, companion animals such as dogs, cats and rabbits, domestic animals such as horses, cows and pigs, or exhibited animals. It is an animal.
  • Lung adenocarcinoma is one of the non-small cell lung cancers that can be divided into invasive adenocarcinoma, preinvasive lesion, and microinvasive adenocarcinoma.
  • Invasive adenocarcinoma follows the IASLC / ATS / ERS classification and is, for example, Lepidic predominant adenocarcinoma (LPA), papillary predominant adenocarcinoma (PPA), acinar predominant adenocarcinoma (APA), or solid. production) adenocarcinoma (SPA), Micropapillary-predominant adenocarcinoma (MPA), etc.
  • LPA Lepidic predominant adenocarcinoma
  • PPA papillary predominant adenocarcinoma
  • APA acinar predominant adenocarcinoma
  • SPA adenocarcinoma
  • MPA Micropapillary-predominant adenocarcinoma
  • Pre-invasive lesions follow the IASLC / ATS / ERS classification and are, for example, atypical adenomatous hyperplasia (AHH) or adenocarcinoma in situ (AIS).
  • Pre-invasive lesions include Nonmucinous, Mucinous, Mixed mucinous / nonmucinous.
  • microinvasive cancer follows the IASLC / ATS / ERS classification, and is, for example, a minimally invasive adenocarcinoma (MIA).
  • MIA minimally invasive adenocarcinoma
  • Microinvasive adenocarcinomas include Nonmucinous, Mucinous, Mixed mucinous / nonmucinous.
  • the marker glycoprotein according to the embodiment includes a protein and a sugar chain bound to the protein.
  • the protein is Procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase (hereinafter referred to as "PLOD3”) from the National Center for Biotechnology Information (NCBI). It is a protein encoded by the gene of Gene ID: 8985. PLOD3 is also referred to as lysyl hydroxylase 3 (LH3).
  • the protein may be ceruloplasmin (hereinafter referred to as "CP").
  • CP is a protein encoded by the gene of Gene ID: 1356 of the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • CP is also referred to as CP2, ferroxydase, iron (II): oxygen-oxidoreductase (Fe (II): oxygen oxidoreductase).
  • a protein isoform having 45% or more amino acid sequence homology with the above protein may be regarded as the protein of the embodiment. It is more preferable to have a homology of 80% or more. It is more preferable to have a homology of 90% or more.
  • the sugar chain is a sugar chain having a binding ability to Hippeastrum Hybrid Lectin (HHL).
  • HHL is a lectin, also referred to as amaryllis lectin (AL).
  • AL amaryllis lectin
  • the sugar chain is, for example, a sugar chain whose binding to HHL has been confirmed in the Lectin Frontier Database.
  • the sugar chain is bound to asparagine contained in PLOD3 or CP.
  • the inventors of the present invention found that PLOD3 or CP in a clinical sample of invasive adenocarcinoma had the above-mentioned sugars in the asparagine at specific positions shown in Table 1 below, as compared with the case of pre-invasive lesions and micro-invasive adenocarcinoma. We found that the chains were bound. In the table, the underline of "peptide sequence around the glycosylated position" indicates N (asparagine) of the "glycosylated position".
  • the sugar chain is bound to N (asparagine) of NXT or NXS of the amino acid sequence corresponding to the "peptide sequence around the glycosylation position" shown in Table 1 contained in PLOD3 or CP, for example (NXT or NXS). Is a consensus sequence of asparagine-linked glycosylated positions).
  • X is an arbitrary amino acid.
  • the sugar chain may be bound to, for example, asparagine having a sequence corresponding to the “peptide sequence around the sugar chain addition position” in Table 1 of the isoform.
  • sugar chain is bound to asparagine at positions 63 and / or 548.
  • sugar chains are bound to asparagine at positions 138, 397, and 762.
  • the protein contained in the marker glycoprotein may be a fragment of the protein.
  • the marker glycoprotein in which the protein is a fragment is also referred to as a marker glycoprotein () fragment.
  • Fragments of marker glycoproteins contain at least one asparagine residue at the glycosylated position. An HHL-binding sugar chain is bound to the asparagine residue of such a fragment.
  • the protein fragment is an oligopeptide or polypeptide fragment consisting of a part of PLOD3 or CP.
  • the fragment is a PLOD3 fragment containing an asparagine residue at positions 63 and / or 548 in its amino acid sequence.
  • the fragment is a CP fragment containing asparagine residues at positions 138, 397, and 762 in its amino acid sequence.
  • the above-mentioned sugar chain is bound to the above-mentioned asparagine residue.
  • the fragment may be, for example, a fragment obtained when these proteins are trypsin-digested.
  • the length of the amino acids in the fragment is not limited, but is preferably 5-100 amino acids, 8-80 amino acids or 8-50 amino acids.
  • the fragment may be a fragment of the above-mentioned PLOD3 or CP isoform.
  • the isoform fragment may contain, for example, at least one asparagine having a sequence corresponding to the “peptide sequence around the sugar chain addition position” in Table 1, and a sugar chain may be bound thereto.
  • the protein of the embodiment may contain the above-mentioned fragment of PLOD3 or CP and a further peptide.
  • the inventors of the present invention express or express more of the marker glycoproteins of the embodiments described above from lesions of invasive adenocarcinoma, and do not express or express them in pre-invasive lesions or microinvasive cancers. Found less.
  • pre-invasive lesions of lung adenocarcinoma or AHH, AIS or MIA which are microinvasive cancers
  • the policy of surgery or follow-up is determined by imaging findings such as tumor diameter and major axis of solid part. ..
  • the prognosis is good and the 5-year survival rate is almost 100%.
  • the 5-year survival rate at stages 1 and 2 is 70 to 80%, and surgery is essential.
  • invasive adenocarcinoma can be accurately distinguished from preinvasive lesions or microinvasive cancers, thereby preventing the detection of false negatives and false positives of invasive adenocarcinomas. can do.
  • false-negative detection results can delay treatment and prevent the progression of lung adenocarcinoma of interest.
  • the false positive detection result can prevent the burden on the subject or the medical staff due to unnecessary treatment.
  • the invasive adenocarcinoma morbidity determination method of the embodiment detects or quantifies a marker glycoprotein, that is, PLOD3 or CP having an HHL-binding sugar chain and / or a fragment thereof from a sample derived from a subject. This involves determining whether a subject has an invasive adenocarcinoma to distinguish it from pre-invasive lesions or micro-invasive cancers.
  • the detection or quantification is performed using HHL.
  • FIG. 1 is a schematic flowchart showing an example of an invasive adenocarcinoma morbidity determination method using HHL.
  • An example of a method for determining the morbidity of invasive adenocarcinoma includes the following steps: (S1) Preparing a sample derived from a subject, (S2) Glycoprotein or a fragment thereof having an HHL-binding sugar chain in the sample, HHL. To obtain an HHL (+) fraction containing the glycoprotein or a fragment thereof, (S3) detect or quantify PLOD3 or CP and / or a fragment thereof from the (S3) HHL (+) fraction, and (S4). ) To determine whether a subject has invasive adenocarcinoma according to the results of the detection or quantification, distinguishing it from pre-invasive lesions or microinvasive cancers.
  • each step will be described in detail.
  • the sample is preferably, for example, a body fluid, cell, tissue or lung lavage fluid of interest.
  • Body fluids include, for example, blood, serum, blood cells, plasma, interstitial fluid, urine, stool, sweat, saliva, oral mucosa, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, tears, pleural effusion, sheep water, semen, cell extracts or For example, pleural effusion.
  • the body fluid is preferably blood, serum, plasma, interstitial fluid, lymph, cell extract, sputum or pleural effusion.
  • the cell may be a cell collected from a subject and cultured, or a supernatant thereof. Further, it may be a cell-lined cultured cell.
  • the sample also includes a cleaning solution during treatment such as surgery or examination by an endoscope or the like.
  • the sample may be one obtained by diluting or concentrating the sample collected from the subject, adding or extracting a blood coagulation inhibitor such as heparin, as necessary. Alternatively, it may be used as it is without performing such pretreatment.
  • the sample may be collected based on a method known in the art. The sample may be used immediately after collection, may be cultured, or may be stored for a certain period of time by freezing or refrigerating and then subjected to a treatment such as thawing.
  • a glycoprotein having an HHL-binding sugar chain or a fragment thereof is separated using HHL.
  • a method of separation for example, a complex is formed with a glycoprotein having a binding ability via HHL-immobilized-agarose or biotinylated HHL. This complex is centrifuged or recovered by an appropriate method such as magnetic beads such as streptavidin magnet beads or streptavidin sepharose beads.
  • Separation of the glycoprotein bound to HHL or a fragment thereof can be performed by a known method such as chromatography, washing with a buffer solution and / or centrifugation. Thereby, unnecessary substances that did not bind to HHL are removed. As a result, an HHL (+) fraction containing a glycoprotein having an HHL-binding sugar chain and / or a fragment thereof is obtained.
  • step (S3) PLOD3 or CP is detected or quantified from the HHL (+) fraction.
  • the step (S3) can be performed using any known method for detecting or quantifying a specific protein. For example, detection or quantification is performed using a probe selected from the group consisting of lectins, antibodies, peptides and aptamers that bind to marker glycoproteins. Further, for example, it is carried out by a method of directly detecting the protein to be analyzed such as mass spectrometry, or a method of detecting a complex obtained by binding the protein to be analyzed to a molecular probe such as an antibody.
  • Such methods include, for example, coagulation time method; diluted Russell serpentine method; Blotting method; flow cytometry method; protease method, immunoinhibition method, G3-CNP method, DGGR substrate method, TMP substrate method, color-developing synthetic substrate method.
  • Enzymatic methods such as (UV method); colorimetric methods such as biuret method, BCG method, BCP improvement method, Kasahara method, color rate method, synthetic substrate colorimetric method; RIA solid phase method, EIA method, ELISA method, CLIA method , Antibody labeling method such as CLEIA method; Immunization turbidimetric method (TIA method), Latex near infrared turbidity method (LPIA), Neferometry method (NIA method) and other deposition methods; Latex aggregation method (LA method), Aggregation methods such as fixed platelet aggregation; Electrophoresis methods such as SDS-PAGE, capillary electrophoresis, and two-dimensional electrophoresis; analytical systems such as HPLC, Western blotting, and dot blotting; test strip method; pyrogallol Red method; includes sulfosalicylic acid method and the like.
  • TIA method Immunization turbidimetric method
  • LPIA Latex near
  • the detection or quantification is preferably carried out by detecting a complex such as HHL-marker molecule-antibody using sandwich ELISA detection using an antibody.
  • step (S4) according to the result of the step (S3), whether or not the subject has invasive adenocarcinoma is determined separately from the preinvasive lesion or the microinvasive cancer.
  • the decision can be made as follows.
  • step (S3) for example, when PLOD3 or CP and / or fragments thereof are detected in the HHL (+) fraction, the subject suffers from invasive adenocarcinoma rather than pre-invasive lesions or microinvasive cancers. Decide that you are.
  • the subject is not a pre-invasive lesion or microinvasive cancer but an invasive adenocarcinoma. Determine to be affected.
  • the threshold is determined, for example, by quantifying PLOD3 or CP with HHL-binding sugar chains in a standard sample from a subject known to be invasive adenocarcinoma rather than pre-invasive lesion or microinvasive cancer. can do.
  • step (S4) when Western blotting is used in step (S3), the obtained band density is quantified and it is determined whether the band is darker or lighter than a predetermined threshold value. Be told.
  • FIG. 2 is a schematic flowchart showing an example of an analysis method performed using HHL.
  • An example of the analytical method includes the following steps: (S11) preparing a sample from the subject, (S12) separating a glycoprotein or a fragment thereof having an HHL-binding sugar chain in the sample using HHL. To obtain an HHL (+) fraction containing the glycoprotein or a fragment thereof, and to detect or quantify PLOD3 or CP and / or a fragment thereof from the (S13) HHL (+) fraction. (S11) to (S13) can be performed in the same manner as in the above steps (S1) to (S3), respectively.
  • the sample may be any of the above samples, established cells or commercially available cells, or a supernatant, extract, washing solution, or the like thereof.
  • the sample comprises cells or tissues, or contains supernatants, extracts or lavage fluids of cells or tissues.
  • the information is, for example, information on whether PLOD3 or CP having an HHL-binding sugar chain and / or a fragment thereof, which is obtained according to the result of detection or quantification in step (S13), is present in the sample, or in the sample. It is the information of the abundance. For example, from such information, it is possible to determine whether or not the subject from which the sample is derived has invasive adenocarcinoma, distinguishing it from preinvasive lesions or microinvasive cancers. Alternatively, from the above information, it can be determined whether or not the cells or tissues contained in the sample or from which the sample is derived are lesions of invasive adenocarcinoma, etc., in distinction from preinvasive lesions or microinvasive cancers.
  • Lectin array analysis was performed using the FFPE block of patients with lung adenocarcinoma.
  • the RecChip scan was performed under five conditions, and the conditions under which the maximum signal value did not exceed 50,000 were selected and used for data standardization.
  • the Mean melanize method (Tateno Het al Methods in Enzymol 478, 181-195 (2010)) was used.
  • HHL-binding glycoproteins HHL (+) carriers / glycoproteins
  • the peptide group obtained by digesting the glycoprotein group collected with a probe from the tumor tissue of the sample with a protease was recollected with the same probe. ..
  • the crude peptide group obtained by protease digestion without separating the crude protein mixture of the tumor tissue of the sample was collected directly with a probe.
  • the obtained glycopeptide group was treated with an enzyme such as glycopeptidase in water labeled with isotope oxygen to dissociate the sugar chain.
  • asparagine at the sugar chain binding site was converted to aspartic acid.
  • the isotope oxygen (18O) in water is incorporated into the peptide (this method is referred to as "IGOT").
  • Step 1 Glycoproteins are identified from the cultured cell lines (PL16T, HCC827, H1650, H1975 cells), the patient-derived tissues of the three cases shown in Table 3, and the stroma.
  • Step 2 From the glycoprotein identified in step 1, the glycoprotein identified in the patient-derived tissue stroma and the precancerous lesion model cultured cell line PL16T is excluded.
  • AM-01-05 are tissues from lesions of pre-invasive lesions (AIS) or micro-invasive cancer (MIA) specimens.
  • L-01-05 are tissues from lesions of invasive adenocarcinoma (LPA) specimens.
  • HHL (+) fraction obtained was separated by agarose gel electrophoresis (SDS-PAGE) and stained with HHL (FIGS. 6 and 7). A smear band was observed in the lane of "Bound 1" which means the HHL (+) fraction, and it was confirmed that the HHL (+) fraction was obtained by the procedure of FIG.
  • the marker glycoprotein of the embodiment can distinguish whether or not the target lung adenocarcinoma is classified as invasive adenocarcinoma by distinguishing it from preinvasive lesions or microinvasive cancers. became.

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Abstract

実施形態に従うマーカー糖タンパク質は、対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質である。マーカー糖タンパク質は、タンパク質及び当該タンパク質に結合している糖鎖を含む。タンパク質はＰＬＯＤ３又はＣＰであり、糖鎖はＨＨＬに対して結合能を有する。

Description

浸潤性腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー糖タンパク質およびその断片
　本発明の実施形態は、浸潤性腺癌罹患判定方法、分析方法、並びにそれに使用するマーカー糖タンパク質およびその断片に関する。
　日本国内における肺癌の罹患数は癌の中で２番目に多く、毎年１０万人以上が罹患している。また、肺癌による死亡者数は癌の中で最も多く、毎年７万人である。
　肺癌の中で、肺腺癌の罹患者数は約半分の割合を占め、５年生存率は４０％に満たない。したがって、肺腺癌をできるだけ早期に発見し、治療する方法が求められている。
　肺腺癌は、非小細胞肺癌の１つであり、前浸潤性病変、微小浸潤性腺癌、浸潤性腺癌等の複数のタイプに分けられる。
　今日、肺の病変は、Ｘ線ＣＴ画像により発見されることが多い。しかしながら、早期の病変の場合、ＣＴ画像上に見られる異常陰影も小さく、それが癌など治療を必要とする病変であるのか、又はその他の良性疾患であるのかを見分けるのが難しい。また、気管支鏡を用いた組織生検でも、診断を下すのに必要十分な病変細胞・組織が採取できるとは限らない。血液検査で腫瘍マーカーを測定する診断法もあるが、病変が小さい場合、健常人と有意な差が現れにくい。このように、治療を必要とする早期の肺腺癌を、他の良性疾患と識別して検出することは、今日極めて困難である。早期の肺腺癌を検出することができずに放置した場合、それがLepidic predominant adenocarcinoma（ＬＰＡ）などの浸潤性の高い癌であれば、患者が死に至る可能性もある。
　本発明が解決しようとする課題は、対象が罹患している肺腺癌の分類が、すぐに治療が必要な浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して正確に識別するための浸潤性腺癌罹患判定方法、当該識別のための情報を得るための分析方法、並びにそれに使用するマーカー糖タンパク質およびその断片を提供することである。
　実施形態に従うマーカー糖タンパク質は、対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質である。マーカー糖タンパク質は、タンパク質及び当該タンパク質に結合している糖鎖を含む。タンパク質はプロコラーゲン・リジン－２－オキソグルタール酸－５－ジオキシゲナーゼ（ＰＬＯＤ３）又はセルロプラスミン（ＣＰ）であり、糖鎖はHippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖である。ＨＨＬは、アマリリスレクチン（Amaryllis lectin：ＡＬ）とも称されるレクチンである。このような糖鎖は、例えば、Lectin Frontier DatabaseでＨＨＬとの結合性が確認されている糖鎖構造を有する。
図１は、実施形態の浸潤性腺癌罹患判定方法の一例を示すフローチャートである。 図２は、実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図３は、レクチンアレイの結果を示すグラフである。 図４は、マーカー糖タンパク質の発現解析の実験結果を示す電気泳動（銀染色像）の写真である。 図５は、レクチンキャッチの方法を示すフローチャートである。 図６は、マーカー糖タンパク質の発現解析の実験結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。 図７は、マーカー糖タンパク質の発現解析の実験結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。 図８は、病変における候補タンパク質濃度の比較実験の結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。 図９は、病変における候補タンパク質濃度の比較実験の結果を示す電気泳動(ウェスタンブロッティング解析像)の写真である。
　実施形態によれば、対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質又はその断片が提供される。マーカー糖タンパク質は、タンパク質及び当該タンパク質に結合している糖鎖を含む。タンパク質はプロコラーゲン・リジン－２－オキソグルタール酸－５－ジオキシゲナーゼ（ＰＬＯＤ３）又はセルロプラスミン（ＣＰ）であり、糖鎖はHippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖（以下、「ＨＨＬ結合性糖鎖」と称する）である。ＨＨＬは、アマリリスレクチン（Amaryllis lectin：ＡＬ）とも称されるレクチンである。このような糖鎖は、例えば、Lectin Frontier Database（https://acgg.asia/lfdb2/index.action?request_locale=en）でＨＨＬとの結合性が確認されている糖鎖構造を有する。また、他の実施形態によれば、試料中の前記マーカー糖タンパク質又はその断片を検出又は定量することを含む浸潤性腺癌罹患判定方法及び分析方法が提供される。
　以下、実施形態のマーカー糖タンパク質、浸潤性腺癌罹患判定方法及び分析方法について説明する。
　・マーカー糖タンパク質
　実施形態に従うマーカー糖タンパク質は、対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質である。
　対象は、分析に供される動物、即ち、後述する試料を提供する動物である。対象は、何らかの疾患を有する動物であってもよいし、健常な動物であってもよい。例えば、対象は、肺癌に罹患している可能性がある動物又は肺癌に罹患した動物である。動物は、例えば、哺乳類である。哺乳類は、例えば、サル及びヒト等の霊長類、マウス、ラット及びモルモット等の齧歯類、イヌ、ネコ及びウサギ等の伴侶動物、ウマ、ウシ及びブタ等の家畜動物、或いは展示動物などに属する動物である。
　肺腺癌は、非小細胞肺癌のうち、浸潤性腺癌、前浸潤性病変、微小浸潤性腺癌に分けられる肺癌の１つである。
　浸潤性腺癌（Invasive adenocarcinoma）とは、ＩＡＳＬＣ／ＡＴＳ／ＥＲＳ分類に従うものであり、例えば、Lepidic predominant adenocarcinoma（ＬＰＡ）、papillary predominant adenocarcinoma（ＰＰＡ）、acinar predominant adenocarcinoma（ＡＰＡ）、又はsolid predominant（with mucin production）adenocarcinoma（ＳＰＡ）、Micropapillary-predominant adenocarcinoma（ＭＰＡ）などである。
　前浸潤性病変とは、ＩＡＳＬＣ／ＡＴＳ／ＥＲＳ分類に従うものであり、例えば、異型腺腫様過形成（atypical adenomatous hyperplasia：ＡＨＨ）又は上皮内腺癌（adenocarcinoma in situ：ＡＩＳ）などである。前浸潤性病変は、Nonmucinous、Mucinous、Mixed mucinous/nonmucinousを含む。
　微小浸潤性癌とは、ＩＡＳＬＣ／ＡＴＳ／ＥＲＳ分類に従うものであり、例えば、微少浸潤性腺癌（minimally invasive adenocarcinoma：ＭＩＡ）である。微少浸潤性腺癌は、Nonmucinous、Mucinous、Mixed mucinous/nonmucinousを含む。
　実施形態に従うマーカー糖タンパク質は、タンパク質及び当該タンパク質に結合している糖鎖を含む。
　タンパク質はプロコラーゲン・リジン－２－オキソグルタール酸－５－ジオキシゲナーゼ（Procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase：以下、「ＰＬＯＤ３」と称する）であり、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ：８９８５の遺伝子にコードされるタンパク質である。ＰＬＯＤ３は、リシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）とも称される。
　或いは、タンパク質は、セルロプラスミン（ceruloplasmin、cearuloplasmin：以下、「ＣＰ」と称する）であってもよい。ＣＰは、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎｅ ＩＤ：１３５６の遺伝子にコードされるタンパク質である。ＣＰは、ＣＰ２、フェロキシダーゼ（ferroxydase）、鉄（ＩＩ）：酸素－オキシドリダクターゼ（Fe(II):oxygen oxidoreductase）とも称される。
　なお、上記のタンパク質と４５％以上のアミノ酸配列相同性を持つタンパク質アイソフォームを実施形態のタンパク質とみなしてもよい。８０％以上の相同性を持てばより好ましい。９０％以上の相同性を持てば更に好ましい。
　糖鎖は、Hippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖である。例えば、ＨＨＬは、アマリリスレクチン（ＡＬ）とも称されるレクチンである。糖鎖は、例えば、Lectin Frontier DatabaseでＨＨＬとの結合性が確認されている糖鎖である。
　糖鎖は、ＰＬＯＤ３又はＣＰに含まれるアスパラギンに結合している。本発明の発明者らは、浸潤性腺癌の臨床試料におけるＰＬＯＤ３又はＣＰは、前浸潤性病変及び微小浸潤性腺癌の場合と比較して、以下の表１に示す特定の位置のアスパラギンに上記糖鎖が結合していることを見出した。表中、「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」の下線は、「糖鎖付加位置」のＮ（アスパラギン）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　糖鎖は、例えば、ＰＬＯＤ３又はＣＰに含まれる表１に記載の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に相当するアミノ酸配列のＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合している（ＮＸＴ又はＮＸＳはアスパラギン結合型糖鎖付加位置のコンセンサス配列である）。ここで、Ｘは任意のアミノ酸である。上述したＰＬＯＤ３又はＣＰのアイソフォームにおいては、糖鎖は、例えば、該アイソフォームの、表１の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に相当する配列のアスパラギンに結合していてもよい。
　例えば、ＰＬＯＤ３の主要なトランスクリプト（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８９８５の遺伝子にコードされるタンパク質）では、糖鎖は、６３位及び／又は５４８位のアスパラギンに結合している。例えば、ＣＰの主要なトランスクリプト（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１３５６の遺伝子にコードされるタンパク質）では、糖鎖は、１３８位、３９７位、及び７６２位のアスパラギンに結合している。
　・マーカー糖タンパク質の断片
　マーカー糖タンパク質に含まれるタンパク質は、タンパク質の断片であってもよい。以下、タンパク質が断片であるマーカー糖タンパク質をマーカー糖タンパク質（の）断片とも称する。マーカー糖タンパク質の断片は、糖鎖付加位置のアスパラギン残基を少なくとも１つ含む。このような断片の前記アスパラギン残基には、ＨＨＬ結合性糖鎖が結合している。
　タンパク質の断片は、ＰＬＯＤ３又はＣＰの一部からなるオリゴペプチド又はポリペプチドの断片である。例えば、断片は、そのアミノ酸配列中に６３位及び／又は５４８位のアスパラギン残基を含むＰＬＯＤ３断片である。或いは、断片は、そのアミノ酸配列中に１３８位、３９７位、及び７６２位のアスパラギン残基を含むＣＰ断片である。上記アスパラギン残基には、上述した糖鎖が結合している。
　断片は、例えば、これらのタンパク質をトリプシン消化した際に得られる断片であってもよい。断片のアミノ酸の長さは、限定されるものではないが、好ましくは、５～１００アミノ酸、８～８０アミノ酸又は８～５０アミノ酸である。
　断片は、上述したＰＬＯＤ３又はＣＰのアイソフォームの断片であってもよい。アイソフォーム断片は、例えば、表１の「糖鎖付加位置周辺のペプチド配列」に対応する配列のアスパラギンを少なくとも１つ含み、そこに糖鎖が結合したものであってもよい。
　実施形態のタンパク質は、上記ＰＬＯＤ３又はＣＰの断片と、更なるペプチドとを含むものであってもよい。
　本発明の発明者らは、以上に説明した実施形態のマーカー糖タンパク質が浸潤性腺癌の病変からは発現、又はより多く発現し、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌では発現しない、又は発現量がより少ないことを見出した。
　例えば、肺腺癌の前浸潤性病変又は微小浸潤性癌であるＡＨＨ、ＡＩＳ又はＭＩＡは、直ちに手術は必要なく、腫瘍径や充実部分の長径など画像所見で手術または経過観察の方針を判断する。手術を行った場合は予後良好で５年生存率はほぼ１００％とされる。しかしながら、浸潤性腺癌である場合には、ステージ１及び２で５年生存率は７０～８０％であり、手術が必須である。実施形態のマーカー糖タンパク質又はその断片を用いることによって、浸潤性腺癌を前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と正確に区別することができるため、浸潤性腺癌の偽陰性及び偽陽性の検出を防止することができる。その結果、偽陰性の検出結果によって治療が遅れ、対象の肺腺癌が進行することを防止できる。また、偽陽性の検出結果によって不要な治療を行うことによる対象又は医療従事者の負担を防止できる。
　・浸潤性腺癌罹患判定方法
　実施形態の浸潤性腺癌罹患判定方法は、対象由来の試料から、マーカー糖タンパク質、即ち、ＨＨＬ結合性糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定することを含む。
　例えば、前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる。
　図１は、ＨＨＬを用いる浸潤性腺癌罹患判定方法の一例を示す概略フローチャートである。浸潤性腺癌罹患判定方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ１）対象由来の試料を用意すること、（Ｓ２）試料中のＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を、ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、（Ｓ３）ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び（Ｓ４）前記検出又は定量の結果に従って、対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定すること。以下、各工程について詳細に説明する。
　工程（Ｓ１）において、対象由来の試料を用意する。試料は、例えば、対象の体液、細胞、組織又は肺洗浄液であることが好ましい。体液は、例えば、血液、血清、血球、血漿、間質液、尿、便、汗、唾液、口腔内粘膜、喀痰、リンパ液、髄液、涙液、母乳、羊水、精液、細胞の抽出液又は胸水などである。体液は、血液、血清、血漿、間質液、リンパ液、細胞の抽出液、痰又は胸水であることが好ましい。細胞は、対象から採取され、培養された細胞又はその上清であってもよい。また、細胞株化した培養細胞でもよい。試料は、手術などの治療時や内視鏡などによる検査時の洗浄液も含む。
　試料は、対象から採取したものを必要に応じて希釈若しくは濃縮、ヘパリンのような血液凝固阻止剤の添加又は抽出等の処理したものであってもよい。或いは、そのような前処理を行なうことなく、そのまま使用してもよい。試料の採取は、当該分野の公知の方法に基づいて行なえばよい。試料は、採取後直ちに利用してもよいし、培養したものであってもよいし、冷凍又は冷蔵により一定期間保存した後、解凍等の処理を行なったものであってもよい。
　工程（Ｓ２）において、ＨＨＬを用いてＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を分離する。分離する方法としては、例えばＨＨＬ固定化－アガロースやビオチン化したＨＨＬを介して、結合能を有する糖タンパク質と複合体を形成する。この複合体を遠心分離やストレプトアビジンマグネットビーズなどの磁気ビーズやストレプトアビジンセファロースビーズなど適切な手法による回収を行う。
　ＨＨＬに結合した糖タンパク質又はその断片の分離は、例えば、クロマトグラフィー、緩衝液による洗浄及び／又は遠心等の公知の方法により行うことができる。それよって、ＨＨＬに結合しなかった不要物質が除去される。その結果、ＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質及び／又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分が得られる。
　工程（Ｓ３）において、ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰを検出又は定量する。工程（Ｓ３）は、特定のタンパク質を検出又は定量する公知の何れかの方法を用いて行うことができる。例えば、検出又は定量は、マーカー糖タンパク質と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる。また例えば、質量分析等の分析対象タンパク質を直接検出する方法、或いは分析対象タンパク質を抗体などの分子プローブに結合させて得られた複合体を検出する方法により行われる。そのような方法は、例えば、凝固時間法；希釈ラッセル蛇毒法；Ｂｅｔｈｅｓｄａ法；フローサイトメトリー法；プロテアーゼ法、免疫阻害法、Ｇ３－ＣＮＰ法、ＤＧＧＲ基質法、ＴＭＰ基質法、発色性合成基質法などの酵素法（ＵＶ法）；ビウレット法、ＢＣＧ法、ＢＣＰ改良法、笠原法、カラーレート法、合成基質比色法などの比色法；ＲＩＡ固相法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＣＬＩＡ法、ＣＬＥＩＡ法などの抗体標識法；免疫比濁法（ＴＩＡ法）、Ｌａｔｅｘ近赤外比濁法（ＬＰＩＡ）、ネフェロメトリー法（ＮＩＡ法）などの沈着法；ラテックス凝集法（ＬＡ法）、固定血小板凝集法などの凝集法；SDS-PAGE法、キャピラリー電気泳動法、二次元電気泳動法などの電気泳動法；ＨＰＬＣ法、ウエスタンブロット法、ドットブロット法などの分析系；試験紙法；ピロガロールレッド法；スルホサリチル酸法などを含む。
　検出又は定量は、抗体を使用したサンドイッチＥＬＩＳＡ検出を用いて、ＨＨＬ－マーカー分子－抗体などの複合体の検出により行うことが好ましい。
　工程（Ｓ４）において、工程（Ｓ３）の結果に従って、対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定する。例えば、決定は次のように行うことができる。工程（Ｓ３）において、例えば、ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片が検出された場合に、対象が前浸潤性病変又は微小浸潤性癌ではなく、浸潤性腺癌に罹患していると決定する。或いは、ＨＨＬ（＋）画分からのＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片の検出量が予め設定された閾値よりも多い場合に、対象が前浸潤性病変又は微小浸潤性癌ではなく、浸潤性腺癌に罹患していると決定する。閾値は、例えば、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌ではなく浸潤性腺癌であることが知られている対象からの標準試料において、ＨＨＬ結合性糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰを定量することによって決定することができる。
　例えば、工程（Ｓ４）は、工程（Ｓ３）でウエスタンブロット法を用いる場合、得られたバンドの濃さを数値化し、予め定められた閾値よりもバンドが濃いか薄いかを決定することにより行われる。
　以上の浸潤性腺癌罹患判定方法により、対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と正確に区別して識別することができる。そのため、浸潤性腺癌の偽陰性及び偽陽性の検出を防止することができる。
　・分析方法
　実施形態の分析方法は、対象に由来する試料から、ＨＨＬ結合性糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定するための情報を得る方法である。例えば、前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる。「対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定するための情報」を以下単に「情報」とも記す。
　図２は、ＨＨＬを用いて行われる分析方法の一例を示す概略フローチャートである。分析方法の一例は、以下の工程を含む：（Ｓ１１）対象由来の試料を用意すること、（Ｓ１２）試料中のＨＨＬ結合性糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を、ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、（Ｓ１３）ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量すること。（Ｓ１１）～（Ｓ１３）は、それぞれ上記工程（Ｓ１）～（Ｓ３）と同様の方法で行うことができる。
　この例の場合、試料は、上記の何れかの試料であってもよいし、株化された細胞又は市販の細胞、或いはその上清、抽出物若しくは洗浄液等であってもよい。例えば、試料は、細胞又は組織を含むか、或いは細胞又は組織の上清、抽出物若しくは洗浄液を含む。
　情報とは、例えば、工程（Ｓ１３）の検出又は定量の結果に従って得られる、ＨＨＬ結合性糖鎖を有するＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片が試料に存在するか否かの情報、或いは試料中におけるその存在量の情報である。例えば、このような情報から、試料の由来となる対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定することができる。或いは、上記情報から、試料に含まれる又は試料の由来となる細胞又は組織が浸潤性腺癌の病変であるかどうかなどを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定することができる。
　［例］
　以下に、実施形態のマーカー糖タンパク質を同定した実験について説明する。
　１．レクチンアレイ
　肺腺癌患者のＦＦＰＥブロックを用いてレクチンアレイ解析を実施した。
　下記２種類のサンプル（１）及び（２）について、４５種のレクチンのうち、シグナルが検出された２５種のレクチン（PSA, LCA, AOL, AAL, SNA, SSA, TJAI, RCA120, PHAE, DSA, NPA, ConA, GNA, HHL, ACG, TJAII, ABA, LEL, STL, UDA, Jacalin, ACA, HPA, Calsepa, WGA）との結合反応シグナルの違いを分析した。
（１）サンプル採取時点で野口分類Ａ型と診断され、かつ、５年後も生存していた症例（Ｎ＝１０）（前浸潤性病変）
（２）サンプル採取時点で野口分類Ｃ型と診断され、かつ、５年後死亡していた症例（Ｎ＝２８）（浸潤性腺癌）
　解析プロトコルは、Matsuda Aら（BBRC 370, 259-263(2008)）の方法を参考に、レーザーマイクロダイセクションで得た組織サンプル用に最適化した（表２フローチャート）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＬｅｃＣｈｉｐのスキャンは５つの条件で実施し、シグナルの最大値が５万を超えない条件を選択し、データの規格化に用いた。規格化には、Ｍｅａｎ ｎｏｒｍａｌｉｚｅ法（Tateno H et al Methods in Enzymol 478, 181-195 (2010)）を用いた。
　結果を図３に示す。２５種のレクチンのうち、ＨＨＬとの結合シグナルが、サンプル（２）では、サンプル（１）より有意に高いことが分かった。
　浸潤性腺癌の患者のサンプルでは、前浸潤性病変のサンプル（１）と比較して、ＨＨＬ結合性糖鎖を有するタンパク質が多いことを示している。
　２．ＨＨＬ結合性糖タンパク質の同定
　次に、ＨＨＬ結合性糖タンパク質（ＨＨＬ（＋）キャリア・糖タンパク質）を同定するために、培養細胞株及び表３に記載の３症例の患者由来腫瘍部組織、及び間質部においてグライコプロテオミクス解析（ＩＧＯＴ－ＬＣ／ＭＳ解析）を行った。この解析は以下のように行った。
　（１）糖鎖切除と糖鎖付加位置安定同位体標識
　試料の腫瘍部組織からプローブで捕集された糖タンパク質群をプロテアーゼで消化して得られたペプチド群を、同じプローブで再捕集した。あるいは、試料の腫瘍部組織の粗タンパク質混合物を分離することなくプロテアーゼ消化して得られた粗ペプチド群より、直接プローブで捕集した。得られた糖ペプチド群を、同位体酸素でラベルされた水の中でグリコペプチダーゼ等の酵素で処理して糖鎖を解離した。それにより、糖鎖結合部位のアスパラギンをアスパラギン酸に変換した。このときに水中の同位体酸素（１８Ｏ）がペプチドに取り込まれる（この方法は「ＩＧＯＴ」と称される）。
　（２）標識ペプチドのＬＣ／ＭＳショットガン分析
　ＩＧＯＴで標識されたペプチドをＬＣで分離し、ＭＳに導入し、タンデム質量分析法により、ペプチドの配列を網羅的に同定した。
　（３）ペプチドの同定
　例えば、標準技術集(特許庁編)、質量分析の３－６－２－２ アミノ酸配列解析に示されるＭＳ／ＭＳイオンサーチ法により、得られたペプチド混合物のＭＳ／ＭＳ ペプチド測定結果を、データベースに登録されたＭＳ／ＭＳスペクトルと比較してすることによりペプチドの配列を検索することができる。検索においては、以下のアミノ酸の修飾を勘案した：メチオニン残基側鎖の酸化、アミノ末端グルタミンのピロ化（脱アミド化、環化）、アミノ末端の脱アミノ化（カルバミドメチルシステイン）、アスパラギン残基側鎖の脱アミド化（ただし、安定同位体酸素の取り込みが生じたもの）。
　（４）糖鎖結合位置の同定
　ＭＳ／ＭＳイオンサーチ法によって同定されたペプチドのうち、アスパラギン残基側鎖に脱アミド化（安定同位体取り込み）が生じ、かつＮ結合型糖鎖付加のコンセンサス配列（Asn-Xaa-[Ser/Thr]、ただしXaaはProでない）を含むペプチドを候補糖ペプチドとした。但し、XaaがLys/Argであり、同定されたペプチド配列がこの位置で切断されている場合、タンパク質全体のアミノ酸配列を参照し、Xaaの次の残基が[Ser/Thr]であることが確認できた場合はこのペプチドも含めた。また、該糖ペプチドのコンセンサス配列アスパラギン残基を糖鎖結合部位とした。
　（５）候補タンパク質の更なる絞込み
　その後、以下のステップにより、候補タンパク質を更に絞込んだ。
　ステップ１：培養細胞株(ＰＬ１６Ｔ、ＨＣＣ８２７、Ｈ１６５０、Ｈ１９７５細胞)及び表３に記載の３症例の患者由来組織、及び間質部から糖タンパク質を同定する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ステップ２：ステップ１で同定された糖タンパク質から、患者由来組織間質部、及び前癌病変モデル培養細胞株ＰＬ１６Ｔで同定された糖タンパク質を排除する。
　上記の手順でリストアップされた候補タンパク質について、生化学的実験結果から、ＰＬＯＤ３、ＣＰが見出された。
　３．組織におけるマーカー糖タンパク質の発現解析
　次に、表４に示す癌組織を用いたウエスタンブロットで、ＰＬＯＤ３、ＣＰの発現量を評価した。ＡＭ－０１～０５は、前浸潤性病変（ＡＩＳ）又は微小浸潤性癌（ＭＩＡ）の検体の病変からの組織である。Ｌ－０１～０５は、浸潤性腺癌（ＬＰＡ）の検体の病変からの組織である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　解析の手順を以下に示す。ウエスタンブロット解析に供するタンパク質溶液を調製するために、ＣｅｌＬｙｔｉｃ ＭＥＭ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＳＩＧＭＡ）を用いて上記組織それぞれからタンパク質抽出を行った。疎水性画分（膜タンパク質：細胞ライセートに相当）及び親水性画分（細胞質・分泌タンパク質：培養上清に相当）の２つの画分が得られた。各画分の分離抽出されたタンパク質の濃度を定量した。６検体由来のサンプル（ＡＭ－０１～０３、Ｌ－０１～０３）又は１０検体から得られたサンプル（ＡＭ－０１～０５、Ｌ－０１～０５）の各々の一部を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、銀染色法により染色した。その結果、両画分がほぼ同程度タンパク質が含まれていることが確認された（図４（ａ）、（ｂ））。
　次に、ＨＨＬ結合性糖鎖を持つタンパク質を分離するために、各サンプルでＨＨＬ－アガロースビーズを用いてレクチンキャッチを行い、ＨＨＬ（＋）画分を調製した。レクチンキャッチの工程を図５に示す。
　得られた各ＨＨＬ（＋）画分をアガロースゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）にて分離し、ＨＨＬにより染色した（図６、図７）。ＨＨＬ(＋)画分を意味する「Ｂｏｕｎｄ１」のレーンにスメアなバンドが認められ、図５の手順により、ＨＨＬ（＋）画分が得られたことを確認できた。
　４．浸潤性腺癌及び前浸潤性病変又は微小浸潤性癌の候補タンパク質の濃度の比較
　次に、ＨＨＬ（＋）画分の全ての組織サンプルを用いて、上記候補のタンパク質に特異的な抗体（抗ＣＰ抗体：Bethyl社 カタログ番号A80-124、抗ＰＬＯＤ３抗体：Protein tech社 カタログ番号11027-1-AP）を用いたウエスタンブロット解析により、ＣＰ、ＰＬＯＤ３の検出を行った。ＣＰの疎水性画分（図８）、ＰＬＯＤ３の疎水性画分（図９）においては、ＡＭとＬとの間でタンパク質量に差があった。
　特に、図９に示すＰＬＯＤ３の疎水性画分においては、ＡＭ－０１～０５におけるバンドは極めて薄く、Ｌ－０１～０５では明確な濃いバンドが観察された。図８に示すＣＰにおいては、得られた結果画像から、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ製）によってバンド強度を数値化したところ、表５に示すように、ＡＭとＬとで、有意な差が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果から、実施形態のマーカー糖タンパク質によれば、対象の肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別できることが明らかとなった。

Claims (17)

  1. 　対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質であって、タンパク質及び当該タンパク質に結合している糖鎖を含み、前記タンパク質はプロコラーゲン・リジン－２－オキソグルタール酸－５－ジオキシゲナーゼ（ＰＬＯＤ３）又はセルロプラスミン（ＣＰ）であり、前記糖鎖はHippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖であるマーカー糖タンパク質。
  2. 　前記タンパク質がＰＬＯＤ３であり、前記糖鎖は前記ＰＬＯＤ３中のＳＡＥＦＦＮＹＴＶＲ（配列番号１）及び／又はＱＹＩＨＥＮＹＳＲ（配列番号２）に含まれるＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合しており、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である請求項１に記載のマーカー糖タンパク質。
  3. 　前記タンパク質がＣＰであり、前記糖鎖は前記ＣＰ中のＥＮＬＴＡＰＧＳＤＳＡＶＦＦＥＱＧＴＴＲ（配列番号３）、ＥＬＨＨＬＱＥＱＮＶＳＮＡＦＬＤＫ（配列番号４）及び／又はＥＨＥＧＡＩＹＰＤＮＴＴＤＦＱＲ（配列番号５）に含まれるＮＸＴ又はＮＸＳのＮ（アスパラギン）に結合しており、ここで、Ｘは任意のアミノ酸である請求項１に記載のマーカー糖タンパク質。
  4. 　前記タンパク質がＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：８９８５の遺伝子にコードされるタンパク質であるＰＬＯＤ３であり、前記糖鎖は、当該ＰＬＯＤ３の６３位及び／又は５４８位のアスパラギンに結合している請求項１又は２に記載のマーカー糖タンパク質。
  5. 　前記タンパク質がＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１３５６の遺伝子にコードされるタンパク質であるＣＰであり、前記糖鎖は、当該ＣＰの１３８位、３９７位及び／又は７６２位のアスパラギンに結合している請求項１又は３に記載のマーカー糖タンパク質。
  6. 　前記浸潤性腺癌は、Lepidic predominant adenocarcinoma（ＬＰＡ）、papillary predominant adenocarcinoma（ＰＰＡ）、acinar predominant adenocarcinoma（ＡＰＡ）、solid predominant（with mucin production）adenocarcinoma（ＳＰＡ）又はMicropapillary-predominant adenocarcinoma（ＭＰＡ）であり、前記前浸潤性病変はatypical adenomatous hyperplasia（ＡＨＨ）又はadenocarcinoma in situ（ＡＩＳ）であり、前記微小浸潤性癌はminimally invasive adenocarcinoma（ＭＩＡ）である請求項１～５の何れか１項に記載のマーカー糖タンパク質。
  7. 　対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して識別するためのマーカー糖タンパク質断片であって、
    　アスパラギン残基を少なくとも１つ含むＰＬＯＤ３又はＣＰの断片と、前記アスパラギン残基に結合している、Hippeastrum Hybrid Lectin（ＨＨＬ）に対して結合能を有する糖鎖とを含むマーカー糖タンパク質断片。
  8. 　対象由来の試料から、ＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰであるマーカー糖タンパク質及び／又はその断片を検出又は定量することによって、対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定することを含む浸潤性腺癌罹患判定方法。
  9. 　前記検出又は定量は、前記マーカー糖タンパク質と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項８に記載の方法。
  10. 　前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる請求項９に記載の方法。
  11. 　（Ｓ１）対象由来の試料を用意すること、
    　（Ｓ２）前記試料中のＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰであるマーカー糖タンパク質又はその断片を、前記ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、
    　（Ｓ３）前記ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量すること、及び
    　（Ｓ４）前記検出又は定量の結果に従って、前記対象が浸潤性腺癌に罹患しているか否かを前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定すること
    を含む請求項１０に記載の方法。
  12. 　前記浸潤性腺癌は、Lepidic predominant adenocarcinoma（ＬＰＡ）、papillary predominant adenocarcinoma（ＰＰＡ）、acinar predominant adenocarcinoma（ＡＰＡ）、solid predominant（with mucin production）adenocarcinoma（ＳＰＡ）又はMicropapillary-predominant adenocarcinoma（ＭＰＡ）であり、前記前浸潤性病変はatypical adenomatous hyperplasia（ＡＨＨ）又はadenocarcinoma in situ（ＡＩＳ）であり、前記微小浸潤性癌はminimally invasive adenocarcinoma（ＭＩＡ）である請求項８～１１の何れか１項に記載の方法。
  13. 　対象由来の試料から、ＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備えるＰＬＯＤ３若しくはＣＰであるマーカー糖タンパク質及び／又はその断片を検出又は定量することによって、前記対象が罹患している肺腺癌の分類が浸潤性腺癌であるか否かを、前浸潤性病変又は微小浸潤性癌と区別して決定するための情報を得ることを含む分析方法。
  14. 　前記検出又は定量は、前記マーカー糖タンパク質と結合するレクチン、抗体、ペプチド及びアプタマーからなる群から選択されるプローブを用いて行われる請求項１３に記載の方法。
  15. 　前記検出又は定量は、ＨＨＬを用いて行われる請求項１３に記載の方法。
  16. 　（Ｓ１１）前記試料を用意すること、
    　（Ｓ１２）前記試料中のＨＨＬに対して結合能を有する糖鎖を備える糖タンパク質又はその断片を、前記ＨＨＬを用いて分離し、前記糖タンパク質又はその断片を含むＨＨＬ（＋）画分を得ること、
    　（Ｓ１３）ＨＨＬ（＋）画分からＰＬＯＤ３若しくはＣＰ及び／又はその断片を検出又は定量すること
    を含む請求項１５に記載の方法。
  17. 　前記浸潤性腺癌は、Lepidic predominant adenocarcinoma（ＬＰＡ）、papillary predominant adenocarcinoma（ＰＰＡ）、acinar predominant adenocarcinoma（ＡＰＡ）又はsolid predominant（with mucin production）adenocarcinoma（ＳＰＡ）であり、前記前浸潤性病変はatypical adenomatous hyperplasia（ＡＨＨ）又はadenocarcinoma in situ（ＡＩＳ）であり、微小浸潤性癌はminimally invasive adenocarcinoma（ＭＩＡ）である請求項１３～１６の何れか１項に記載の方法。
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