JPWO2008096767A1 - 肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置 - Google Patents
肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置 Download PDFInfo
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Abstract
本発明の課題は肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べ存在量が異なるタンパク質群を用いて肝細胞がんを判定する方法、ならびに該タンパク質群からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを用いた肝細胞がんを検出する装置を提供することである。本発明の肝細胞がんを検出する方法は、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ、配列番号６で示されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシンからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを用いる、肝細胞がんを検出する方法である。
Description
本発明は、肝細胞がんの検出に用い得る新規なタンパク質マーカーおよびこのタンパク質マーカーを用いた肝細胞がんの検出方法及び装置に関する。
肝細胞がんは肝臓に原発する上皮性悪性腫瘍の一つで、肝細胞に似た腫瘍細胞からなる。
肝細胞がんは通常肝臓に多数の腫瘤を形成しており、肝血管内に増殖・進展する傾向が強く、しばしば門脈に腫瘍栓を形成する。
肝細胞がんは、日本を含むアジア、アフリカ地域に多発し、肝硬変が併存していることが多い。
肝細胞がん検出のためのマーカーとして、従来、Ｌｉｅｂｍａｎ ＨＡ，Ｆｕｒｉｅ ＢＣ，Ｔｏｎｇ ＭＪ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＲＡ，Ｌｏ ＫＪ，Ｌｅｅ ＳＤ，Ｃｏｌｅｍａｎ ＭＳ，Ｆｕｒｉｅ Ｂ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０，ｐｐ．１４２７−１４３１．（１９８４）記載のαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、また、Ｋｕｍａｇａｉ Ｙ，Ｃｈｉｂａ Ｊ，Ｓａｔａ Ｔ，Ｏｈｔａｋｉ Ｓ，Ｍｉｔａｍｕｒａ Ｋ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２，ｐｐ４９８７−４９９４．（１９９２）記載のＫＭ−２、Ｅｌｉａｓ Ｊ，Ｋｅｗ ＭＣ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４６，ｐｐ８０５−８０７．（１９９０）記載のＣＡ１２５等が用いられていた。
しかしながら、これらのマーカーは陽性判定率が十分でなかった。例えば、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩの肝細胞がん判定スクリーニング率は６０〜７０％である。
そのため、さらなる信頼性をもったマーカーが求められている。
肝細胞がんは肝臓に原発する上皮性悪性腫瘍の一つで、肝細胞に似た腫瘍細胞からなる。
肝細胞がんは通常肝臓に多数の腫瘤を形成しており、肝血管内に増殖・進展する傾向が強く、しばしば門脈に腫瘍栓を形成する。
肝細胞がんは、日本を含むアジア、アフリカ地域に多発し、肝硬変が併存していることが多い。
肝細胞がん検出のためのマーカーとして、従来、Ｌｉｅｂｍａｎ ＨＡ，Ｆｕｒｉｅ ＢＣ，Ｔｏｎｇ ＭＪ，Ｂｌａｎｃｈａｒｄ ＲＡ，Ｌｏ ＫＪ，Ｌｅｅ ＳＤ，Ｃｏｌｅｍａｎ ＭＳ，Ｆｕｒｉｅ Ｂ．Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１０，ｐｐ．１４２７−１４３１．（１９８４）記載のαフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＰＩＶＫＡ−ＩＩ、また、Ｋｕｍａｇａｉ Ｙ，Ｃｈｉｂａ Ｊ，Ｓａｔａ Ｔ，Ｏｈｔａｋｉ Ｓ，Ｍｉｔａｍｕｒａ Ｋ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２，ｐｐ４９８７−４９９４．（１９９２）記載のＫＭ−２、Ｅｌｉａｓ Ｊ，Ｋｅｗ ＭＣ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．４６，ｐｐ８０５−８０７．（１９９０）記載のＣＡ１２５等が用いられていた。
しかしながら、これらのマーカーは陽性判定率が十分でなかった。例えば、ＡＦＰとＰＩＶＫＡ−ＩＩの肝細胞がん判定スクリーニング率は６０〜７０％である。
そのため、さらなる信頼性をもったマーカーが求められている。
本発明は、肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べ存在量が異なるタンパク質群を用いて肝細胞がんを判定する方法を提供することを目的とする。
更に本発明は、該タンパク質群からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置の提供を目的とする。
本発明者は、肝細胞がん組織において、非がん細胞に比べて発現量が増加もしくは減少するタンパク質を探索した。
その結果、特定のタンパク質群の発現量を測定することで肝細胞がん細胞と非がん細胞を判別することが可能であることを見出した。
即ち、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。
また、本発明によれば、肝細胞がんタンパク質マーカーを用いる肝細胞がんを検出する方法であって、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がん検出方法において、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出することを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記いずれか一つの肝細胞がんの検出方法において、生体試料中における前記肝細胞がんタンパク質マーカーの前記少なくとも一つのタンパク質を測定し、健常人生体試料中と比較し増加または減少することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記少なくとも一つのタンパク質を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明の肝細胞がん検出装置は、前記肝細胞がんの検出方法を実施するための装置である。
本発明をさらに、具体的に述べると、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量を、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より測定する方法を提供するものである。
本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ１）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量を測定することで、肝細胞がんの判別が可能となる。
更に本発明は、該タンパク質群からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置の提供を目的とする。
本発明者は、肝細胞がん組織において、非がん細胞に比べて発現量が増加もしくは減少するタンパク質を探索した。
その結果、特定のタンパク質群の発現量を測定することで肝細胞がん細胞と非がん細胞を判別することが可能であることを見出した。
即ち、本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。
また、本発明によれば、肝細胞がんタンパク質マーカーを用いる肝細胞がんを検出する方法であって、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がん検出方法において、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出することを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記いずれか一つの肝細胞がんの検出方法において、生体試料中における前記肝細胞がんタンパク質マーカーの前記少なくとも一つのタンパク質を測定し、健常人生体試料中と比較し増加または減少することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記少なくとも一つのタンパク質を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。
また、本発明の肝細胞がん検出装置は、前記肝細胞がんの検出方法を実施するための装置である。
本発明をさらに、具体的に述べると、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量を、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より測定する方法を提供するものである。
本発明によれば、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ１）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量を測定することで、肝細胞がんの判別が可能となる。
図１は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ＧＰ９６）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図２は、図１のＧＰ９６の全アミノ酸配列を示す図である。
図３は、バロシンコンティニングプロテイン（ＶＣＰ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図４は、図３のＶＣＰの全アミノ酸配列を示す図である。
図５は、ビメンチン（ＶＩＭ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図６は、図５のＶＩＭの全アミノ酸配列を示す図である。
図７は、カーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図８は、図７のＣＡ２の全アミノ酸配列を示す図である。
図９は、マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ＭｎＳＯＤ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１０は、図９のＭｎＳＯＤの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１１は、トリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ＴＰＩ１）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１２は、図１１のＴＰＩ１の全アミノ酸配列を示す図である。
図１３は、ペルオキシレドキシン５（ＰＲＸ５）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１４は、図１３のＰＲＸ５の全アミノ酸配列を示す図である。
図１５は、チオレドキシン（ＴＲＸ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である
図１６は、図１５のＴＲＸの全アミノ酸配列を示す図である。
図１７は、ビメンチン（ＶＩＭ）とカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。
図２は、図１のＧＰ９６の全アミノ酸配列を示す図である。
図３は、バロシンコンティニングプロテイン（ＶＣＰ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図４は、図３のＶＣＰの全アミノ酸配列を示す図である。
図５は、ビメンチン（ＶＩＭ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図６は、図５のＶＩＭの全アミノ酸配列を示す図である。
図７は、カーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図８は、図７のＣＡ２の全アミノ酸配列を示す図である。
図９は、マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ＭｎＳＯＤ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１０は、図９のＭｎＳＯＤの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１１は、トリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ＴＰＩ１）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１２は、図１１のＴＰＩ１の全アミノ酸配列を示す図である。
図１３は、ペルオキシレドキシン５（ＰＲＸ５）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。
図１４は、図１３のＰＲＸ５の全アミノ酸配列を示す図である。
図１５は、チオレドキシン（ＴＲＸ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である
図１６は、図１５のＴＲＸの全アミノ酸配列を示す図である。
図１７は、ビメンチン（ＶＩＭ）とカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。
本発明についてさらに、詳細にのべる。
本発明は被験者から得られた生体試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ１）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量の変動を測定することで肝細胞がんの判定を行う方法である。
本発明において、生体試料としては、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、尿などが例示できる。
これらの生体試料中から上記タンパク質発現量を測定する方法としては、生体試料を等電点電気泳動およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法と分離されたタンパク質を発現量に応じて定量できる染色法を組み合わせて用いる方法がある。
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせた多次元クロマトグラフィー法と分離されたタンパク質を紫外／可視吸光度や質量分析を用いて定量する方法、特定の抗体を用いる方法などがある。
ここで、特定の抗体とは、検出したいタンパク質の完全長を認識するもの、検出したいタンパク質の部分ペプチドを認識するものなどを指す。これらの抗体を単独もしくは複数用い、公知の方法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング法、放射免疫測定法、免疫沈降法などにより試料中のタンパク質を定量することができる。
本発明は被験者から得られた生体試料中の、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ２）、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ１）、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ５）、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質発現量の変動を測定することで肝細胞がんの判定を行う方法である。
本発明において、生体試料としては、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、尿などが例示できる。
これらの生体試料中から上記タンパク質発現量を測定する方法としては、生体試料を等電点電気泳動およびＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法と分離されたタンパク質を発現量に応じて定量できる染色法を組み合わせて用いる方法がある。
さらに、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わせた多次元クロマトグラフィー法と分離されたタンパク質を紫外／可視吸光度や質量分析を用いて定量する方法、特定の抗体を用いる方法などがある。
ここで、特定の抗体とは、検出したいタンパク質の完全長を認識するもの、検出したいタンパク質の部分ペプチドを認識するものなどを指す。これらの抗体を単独もしくは複数用い、公知の方法である酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング法、放射免疫測定法、免疫沈降法などにより試料中のタンパク質を定量することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではないことは勿論である。
（実施例１）
実施例１では、肝細胞がん患者由来のがん細胞抽出タンパク質および非がん細胞抽出タンパク質の二次元電気泳動解析について説明する。
１８人の肝細胞がん患者から外科的に切除された組織より、病理学的に診断された、がん部位組織および非がん部位組織を、それぞれ細胞溶解液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）中でガラスホモジェナイザーを用いて破砕後、３７℃で１時間インキュベートした。
サンプルを遠心（１３，０００ｒｐｍ、２０分）した後、上清を採取した。上清中のタンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用い、ブラッドフォード法により測定した。５０μｇのがん部位抽出タンパク質と５０μｇの非がん部位抽出タンパク質をそれぞれＣｙ３（ＧＥヘルスケア社）、Ｃｙ５（ＧＥヘルスケア社）の蛍光色素で標識した。蛍光標識した抽出タンパク質サンプルを混合し、固定化ｐＨグラジェントゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ ｐＨ ３−１０、２４ｃｍ：ＧＥヘルスケア社）を用いて７１，５００Ｖｏｌｔ・時間の等電点電気泳動を行った（一次元電気泳動）。一次元電気泳動後のゲルに対し還元アルキル化を行った後、二次元目のＳＤＳ電気泳動を、１２．５％のポリアクリルアミドゲル（２４ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて行った。以上のように分離したゲル上のタンパク質スポットを、スキャナーを用いて蛍光イメージとして取得した。二次元電気泳動は、一人の患者から得られたサンプルで３回ずつ行い、合計５４枚のゲルイメージを取得した。得られた蛍光イメージ上のタンパク質スポットを各ゲルにおいてマッチングさせ、各タンパク質スポットの蛍光強度を計算した。タンパク質スポットの蛍光強度はスポット中に含まれるタンパク質の量に比例するため、非がん部位に比べがん部位でスポットの蛍光強度が統計的に有意に変動しているスポット、スポットナンバー４３６、スポットナンバー４６４、スポットナンバー１０４６、スポットナンバー１９７７、スポットナンバー２１８７、スポットナンバー２０２７、スポットナンバー２３０１、スポットナンバー２３９９、の８スポットを、非がん部位に比べがん部位で発現量が変動しているものとして特定した。特定した８スポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、ペプチド化した。ゲル内消化したペプチドを飛行時間測定型の質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ，Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＳＴＲ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはイオンスプレー型質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ，ＬＣＱ−Ｄｅｃａ：Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で測定し、ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）により、スポットのタンパク質同定を行った。
その結果、スポットナンバー４３６は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（以下ＧＰ９６と略す）、スポットナンバー４６４は、バロシンコンティニングプロテイン（以下ＶＣＰと略す）、スポットナンバー１０４６は、ビメンチン（以下ＶＩＭと略す）、スポットナンバー１９７７は、カーボニックアンヒドラーゼ２（以下ＣＡ２と略す）、スポットナンバー２１８７は、マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（以下ＭｎＳＯＤと略す）、スポットナンバー２０２７は、トリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（以下ＴＰＩ１と略す）、スポットナンバー２３０１は、ペルオキシレドキシン５（以下ＰＲＸ５と略す）、スポットナンバー２３９９は、チオレドキシン（以下ＴＲＸと略す）であることがわかり、これらのタンパク質スポットの蛍光強度が、非がん部位に比べがん部位で変動していることが明らかとなった。
図１はチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ＧＰ９６）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＧＰ９６の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度である。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。即ち、図１は同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動におけるスポットナンバー４３６の蛍光強度を示している。図１において、図中の数字は各患者番号に対応している。同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動は独立に３回行っているため、図中の蛍光強度は３回の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示した。ここで、「白丸」は患者１から得られたデータ、「黒丸」は患者２から得られたデータ、「白三角」は患者３から得られたデータ、「黒三角」は患者４から得られたデータ、「白四角」は患者５から得られたデータ、「黒四角」は患者６から得られたデータ、「白逆三角」は患者７から得られたデータ、「黒逆三角」は患者８から得られたデータ、「白菱形」は患者９から得られたデータ、「黒菱形」は患者１０から得られたデータ、「＋」は患者１１から得られたデータ、「×」は患者１２から得られたデータ、「二重丸」は患者１３から得られたデータ、「二重三角」は患者１４から得られたデータ、「二重四角」は患者１５から得られたデータ、「二重逆三角」は患者１６から得られたデータ、「二重菱形」は患者１７から得られたデータ、及び「半黒丸」は患者１８から得られたデータを夫々示している。なお、図３、図５、図７、図９、図１１、図１３、図１５、及び図１７においても同様に示されている。
図２は、ＧＰ９６の全アミノ酸配列を示す図である。図２において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
つまり、図２はスポットナンバー４３６のＰＭＦ法によるタンパク質同定結果を表しており、ＧＰ９６の全アミノ酸配列のうち、下線のペプチドが質量分析で測定されたことを示している。
図３は、バロシンコンティニングプロテイン（ＶＣＰ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＶＣＰの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図４は、ＶＣＰの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図５はビメンチン（ＶＩＭ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＶＩＭの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図６はＶＩＭの全アミノ酸配列を示す図で、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図７はカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＣＡ２の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図８はＣＡ２の全アミノ酸配列を示す図である。図６において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図９はマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ＭｎＳＯＤ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＭｎＳＯＤの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１０はＭｎＳＯＤの全アミノ酸配列を示す図である。図１０を参照すると、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１１はトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ＴＰＩ１）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、前述した１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＰＩ１の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１２はＴＰＩ１の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１３はペルオキシレドキシン５（ＰＲＸ５）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＰＲＸ５の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１４はＰＲＸ５の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１５は、チオレドキシン（ＴＲＸ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。図中の記号は図１と同じである。
図１６はＴＲＸの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
（実施例２）
実施例２では、マーカータンパク質を用いたがん部と非がん部の判別について説明する。
図１７はビメンチン（ＶＩＭ）とカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図で、Ｘ軸にＶＩＭの蛍光強度を、Ｙ軸にＣＡ２の蛍光強度をプロットしたものを示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。蛍光強度のデータは実施例１で述べた通り、３回の二次元電気泳動の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示してある。なお、曲線１「白丸」は、非がん部から得られたＶＩＭとＣＡ２の蛍光強度を示す。また、曲線２「黒丸」はがん部から得られたＶＩＭとＣＡ２の蛍光強度を示している。
図１７を参照すると、ＶＩＭとＣＡ２の発現量を比較することにより、がん部と非がん部を判別できることは明らかであり、ＶＩＭとＣＡ２の発現量の測定は肝細胞がんの診断に有用である。ＶＩＭとＣＡ２の発現量測定をキット化することにより、新規な肝細胞がん診断キットとすることが可能になる。
また図１から図１６に記載の他のタンパク質を用いても同様の結果を得ることができる。
以上の説明の通り、本発明の肝細胞がんタンパク質マーカーと、肝細胞がん検出方法と、肝細胞がん検出装置は、肝細胞がんの判定に適用されるものであり、従来と比べて、さらなるスクリーニング率の向上が図れる可能性がある。
なお、本出願は、２００７年２月６日に出願された、日本国特許出願第２００７−０２６９４２号からの優先権を基礎として、その利益を主張するものであり、その開示はここに全体として参考文献として取り込む。
［配列表］
（実施例１）
実施例１では、肝細胞がん患者由来のがん細胞抽出タンパク質および非がん細胞抽出タンパク質の二次元電気泳動解析について説明する。
１８人の肝細胞がん患者から外科的に切除された組織より、病理学的に診断された、がん部位組織および非がん部位組織を、それぞれ細胞溶解液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．５）、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）中でガラスホモジェナイザーを用いて破砕後、３７℃で１時間インキュベートした。
サンプルを遠心（１３，０００ｒｐｍ、２０分）した後、上清を採取した。上清中のタンパク質濃度はプロテインアッセイキット（バイオラッド社）を用い、ブラッドフォード法により測定した。５０μｇのがん部位抽出タンパク質と５０μｇの非がん部位抽出タンパク質をそれぞれＣｙ３（ＧＥヘルスケア社）、Ｃｙ５（ＧＥヘルスケア社）の蛍光色素で標識した。蛍光標識した抽出タンパク質サンプルを混合し、固定化ｐＨグラジェントゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ＤｒｙＳｔｒｉｐ ｐＨ ３−１０、２４ｃｍ：ＧＥヘルスケア社）を用いて７１，５００Ｖｏｌｔ・時間の等電点電気泳動を行った（一次元電気泳動）。一次元電気泳動後のゲルに対し還元アルキル化を行った後、二次元目のＳＤＳ電気泳動を、１２．５％のポリアクリルアミドゲル（２４ｃｍ×２０ｃｍ）を用いて行った。以上のように分離したゲル上のタンパク質スポットを、スキャナーを用いて蛍光イメージとして取得した。二次元電気泳動は、一人の患者から得られたサンプルで３回ずつ行い、合計５４枚のゲルイメージを取得した。得られた蛍光イメージ上のタンパク質スポットを各ゲルにおいてマッチングさせ、各タンパク質スポットの蛍光強度を計算した。タンパク質スポットの蛍光強度はスポット中に含まれるタンパク質の量に比例するため、非がん部位に比べがん部位でスポットの蛍光強度が統計的に有意に変動しているスポット、スポットナンバー４３６、スポットナンバー４６４、スポットナンバー１０４６、スポットナンバー１９７７、スポットナンバー２１８７、スポットナンバー２０２７、スポットナンバー２３０１、スポットナンバー２３９９、の８スポットを、非がん部位に比べがん部位で発現量が変動しているものとして特定した。特定した８スポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、ペプチド化した。ゲル内消化したペプチドを飛行時間測定型の質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ，Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＳＴＲ：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）またはイオンスプレー型質量分析装置（ＥＳＩ−ＭＳ，ＬＣＱ−Ｄｅｃａ：Ｔｈｅｒｍｏｅｌｅｃｔｒｏｎ社）で測定し、ペプチドマスフィンガープリント法（ＰＭＦ法）により、スポットのタンパク質同定を行った。
その結果、スポットナンバー４３６は、チュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（以下ＧＰ９６と略す）、スポットナンバー４６４は、バロシンコンティニングプロテイン（以下ＶＣＰと略す）、スポットナンバー１０４６は、ビメンチン（以下ＶＩＭと略す）、スポットナンバー１９７７は、カーボニックアンヒドラーゼ２（以下ＣＡ２と略す）、スポットナンバー２１８７は、マンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（以下ＭｎＳＯＤと略す）、スポットナンバー２０２７は、トリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（以下ＴＰＩ１と略す）、スポットナンバー２３０１は、ペルオキシレドキシン５（以下ＰＲＸ５と略す）、スポットナンバー２３９９は、チオレドキシン（以下ＴＲＸと略す）であることがわかり、これらのタンパク質スポットの蛍光強度が、非がん部位に比べがん部位で変動していることが明らかとなった。
図１はチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ＧＰ９６）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＧＰ９６の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度である。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。即ち、図１は同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動におけるスポットナンバー４３６の蛍光強度を示している。図１において、図中の数字は各患者番号に対応している。同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動は独立に３回行っているため、図中の蛍光強度は３回の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示した。ここで、「白丸」は患者１から得られたデータ、「黒丸」は患者２から得られたデータ、「白三角」は患者３から得られたデータ、「黒三角」は患者４から得られたデータ、「白四角」は患者５から得られたデータ、「黒四角」は患者６から得られたデータ、「白逆三角」は患者７から得られたデータ、「黒逆三角」は患者８から得られたデータ、「白菱形」は患者９から得られたデータ、「黒菱形」は患者１０から得られたデータ、「＋」は患者１１から得られたデータ、「×」は患者１２から得られたデータ、「二重丸」は患者１３から得られたデータ、「二重三角」は患者１４から得られたデータ、「二重四角」は患者１５から得られたデータ、「二重逆三角」は患者１６から得られたデータ、「二重菱形」は患者１７から得られたデータ、及び「半黒丸」は患者１８から得られたデータを夫々示している。なお、図３、図５、図７、図９、図１１、図１３、図１５、及び図１７においても同様に示されている。
図２は、ＧＰ９６の全アミノ酸配列を示す図である。図２において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
つまり、図２はスポットナンバー４３６のＰＭＦ法によるタンパク質同定結果を表しており、ＧＰ９６の全アミノ酸配列のうち、下線のペプチドが質量分析で測定されたことを示している。
図３は、バロシンコンティニングプロテイン（ＶＣＰ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＶＣＰの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図４は、ＶＣＰの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図５はビメンチン（ＶＩＭ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＶＩＭの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図６はＶＩＭの全アミノ酸配列を示す図で、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図７はカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＣＡ２の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図８はＣＡ２の全アミノ酸配列を示す図である。図６において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図９はマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ＭｎＳＯＤ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＭｎＳＯＤの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１０はＭｎＳＯＤの全アミノ酸配列を示す図である。図１０を参照すると、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１１はトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ＴＰＩ１）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図で、前述した１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＰＩ１の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１２はＴＰＩ１の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１３はペルオキシレドキシン５（ＰＲＸ５）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＰＲＸ５の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図１と同様の患者には、同様の記号を用いている。
図１４はＰＲＸ５の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
図１５は、チオレドキシン（ＴＲＸ）の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量およびＰＭＦ法に用いた検出されたペプチドを示す図である。１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。図中の記号は図１と同じである。
図１６はＴＲＸの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。
（実施例２）
実施例２では、マーカータンパク質を用いたがん部と非がん部の判別について説明する。
図１７はビメンチン（ＶＩＭ）とカーボニックアンヒドラーゼ２（ＣＡ２）の、１８人の患者から得られた非がん部、がん部におけるＴＲＸの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図で、Ｘ軸にＶＩＭの蛍光強度を、Ｙ軸にＣＡ２の蛍光強度をプロットしたものを示している。二次元電気泳動は３回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。蛍光強度のデータは実施例１で述べた通り、３回の二次元電気泳動の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示してある。なお、曲線１「白丸」は、非がん部から得られたＶＩＭとＣＡ２の蛍光強度を示す。また、曲線２「黒丸」はがん部から得られたＶＩＭとＣＡ２の蛍光強度を示している。
図１７を参照すると、ＶＩＭとＣＡ２の発現量を比較することにより、がん部と非がん部を判別できることは明らかであり、ＶＩＭとＣＡ２の発現量の測定は肝細胞がんの診断に有用である。ＶＩＭとＣＡ２の発現量測定をキット化することにより、新規な肝細胞がん診断キットとすることが可能になる。
また図１から図１６に記載の他のタンパク質を用いても同様の結果を得ることができる。
以上の説明の通り、本発明の肝細胞がんタンパク質マーカーと、肝細胞がん検出方法と、肝細胞がん検出装置は、肝細胞がんの判定に適用されるものであり、従来と比べて、さらなるスクリーニング率の向上が図れる可能性がある。
なお、本出願は、２００７年２月６日に出願された、日本国特許出願第２００７−０２６９４２号からの優先権を基礎として、その利益を主張するものであり、その開示はここに全体として参考文献として取り込む。
［配列表］
Claims (19)
- 配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 請求項１乃至８の内のいずれか一つに記載の肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。
- 請求項１乃至９の内のいずれか一つに記載の肝細胞がんタンパク質マーカーを用いることを特徴とする肝細胞検出方法。
- 配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、
配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、
配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、
配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、
配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、
配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、及び
配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。 - 請求項１１に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、
前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。 - 請求項１１に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーを用いることを特徴とする肝細胞がん検出方法。
- 請求項１３に記載の肝細胞がん検出方法において、
前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出することを特徴とする肝細胞がん検出方法。 - 請求項１４に記載の肝細胞がんの検出方法において、生体試料中における前記肝細胞がんタンパク質マーカーの前記少なくとも一つのタンパク質を測定し、健常人生体試料中と比較し増加または減少することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
- 請求項１５に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記少なくとも一つのタンパク質を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。
- 細胞がんタンパク質マーカーを用いて肝細胞がんを検出する装置であって、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、
配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６（ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６）、
配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）、
配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ）、
配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ２）、
配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）、
配列番号６で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１（ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ １）、
配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５（ｐｅｒｏｘｉｒｅｄｏｘｉｎ ５）、及び
配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質を含むものを用い、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも１つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出する特定タンパク質検出手段を備えていることを特徴とする肝細胞がん検出装置。 - 請求項１７に記載の肝細胞がんの検出装置において、前記特定タンパク質検出手段の結果が、増加または減少を示す場合に、陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出装置。
- 請求項１７又は１８に記載の肝細胞がんの検出装置において、前記特定タンパク質検出手段は、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンブロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いたものであることを特徴とする肝細胞がんの検出装置。
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