TWI487913B - A method for finding serum / plasma biomarker molecules of hepatocellular carcinoma and a method for detecting serum / plasma biomarker molecules - Google Patents

Description

找尋肝癌血清/血漿生物標記分子之方法及該肝癌血清/血漿生物標記分子

本發明係關於找尋偵測肝癌的新穎血清/血漿生物標記分子之方法及利用此方法發現血清/血漿中的特定蛋白可作為偵測肝癌的生物標記分子。詳而言之，本發明係以肝癌組織的組織間質液作為尋找偵測肝癌的血清/血漿生物標記分子之對象，並利用此方法找尋到的血清/血漿ERBB3及IGFBP2蛋白可精確偵測肝癌的存在。

按，肝癌是人類最常見的癌症之一，在全球排名與國內排名都是名列前矛；而在診斷方面，血清或血漿因取得方便是臨床上最佳的檢驗是否患有肝癌的檢體。因此，傳統上尋找新的血清/血漿生物標記分子也是直接從血清或血漿中找具疾病診斷價值的分子。但血清或血漿的蛋白中百分之九十是由最常見的六種血清蛋白組成，百分之九十九是由固定的蛋白組成，血清或血漿中蛋白組成也反應全身所有細胞或組織的代謝及生理狀態，而任何具診斷價值的肝癌特異的蛋白分子分泌或排入血液循環中，不僅極其微量，在複雜的血清/血漿蛋白群中更不易被發現，所以直接從血清/血漿中尋找新的肝癌生物標記分子如大海撈針，往往徒勞無獲。

又，有些研究以培養的肝癌細胞或組織的培養液作為尋找新穎肝癌生物標記分子的對象，也被廣及地運用。但培養的肝癌細胞已與原本肝癌組織中之癌細胞因長期適應培養環境而產生很大的改變，因此，所尋獲的分子，未必與個體內肝癌細胞所分泌者相同。

此外，血清甲型胎兒蛋白(α-fetoprotein，以下簡稱AFP)做為肝癌的血清生物標記分子已有四十年的歷史。然而在診斷方面有百分之二十到四十的肝癌患者其血清中的AFP並未上升，也有百分之六到二十的慢性肝炎患者其血清中AFP上升，而過去二十年來也不斷地有新的血清生物標記分子運用於診斷肝癌，如AFP-L3(lens culinaris reactive AFP)，DCP(Des-gamma carboxy prothrombin)，PIVK-II(Vtamink alioence or antagpnist II)，AFU(α-L-Fuosidase)，GPC3(Glypican3)等相繼被發表做為診斷肝癌之用，但也因各有其特殊的限制，而無法廣為臨床採用。因此尋找新的且兼具高敏感與高特異性偵測肝癌的血清生物標記分子，以提高診斷肝癌的精確度，使病患能及時治療，有其必要及迫切性。

是以，針對不易直接從血清/血漿中或培養的肝癌細胞或組織的培養液中尋找新的肝癌生物標記分子，本發明人開發一種利用新鮮肝癌組織之組織間質液，做為找尋偵測肝癌的新穎血清/血漿生物標記之來源，並利用此方法尋找到血清/血漿IGFBP2及ERBB3蛋白是具高敏感與高特異性偵測肝癌的血清/血漿生物標記分子。

習知技術不易從血清/血漿中或培養的肝癌組織培養液中尋找到新的肝癌生物標記分子，而習知的現有血清生物標記分子也無法十分精確的診斷肝癌，顯然有其有待改善的問題點。

一種找尋肝癌血清/血漿生物標記分子之方法及該肝癌血清/血漿生物標記分子，其步驟依序如下：

第一步驟：取出手術切除的新鮮肝癌組織與肝癌周圍的非癌肝組織，分別切碎各以磷酸緩衝液(phosphate buffer saline，以下簡稱PBS)清洗兩次，再以PBS於37℃、10%二氧化碳的條件在細胞培養箱中培養10分鐘，之後使用離心機以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，去除切碎組織表面之汙染物質；

第二步驟：再各用PBS於37℃、10%二氧化碳的條件在細胞培養箱中培養60分鐘，使用離心機以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，將組織與組織間質液分開，並避免因過度離心導致細胞破裂；

第三步驟：再各使用離心機以每分鐘5000~15000轉離心15~30分鐘，去除不溶的雜質，將組織間質液的純度提昇，提升接下來的步驟偵測微量蛋白的敏感度；

第四步驟：利用蛋白質體學的方法比較取自肝癌組織及非癌肝組織之組織間質液的蛋白質組成，鑑別出肝癌組織間質液中含量高於非癌肝組織組織間質液的蛋白質，並將這些蛋白質列為候選的肝癌生物標記分子。

第五步驟：將這些候選的肝癌生物標記分子逐一以酶-免疫吸附法，偵測及測量這些候選的肝癌生物標記分子於肝癌及非肝癌病患血清中之濃度，利用學生T檢驗(以下稱student t-test)分析與接收器操作特徵(Receiver Operating Cheracteristic，以下簡稱ROC)分析其候選的肝癌生物標記分子濃度有顯著差異者，再以另外一群含取自肝癌及非肝癌患者的血清檢體，用酶-免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，以下簡稱ELISA)及ROC等方法，作進一步驗證，若ROC曲線下面積再大於90%者，則認定該候選的肝癌生物標記分子為肝癌的生物標記分子，可用於檢測肝癌之用途。

利用上述步驟，本發明提出血清/血漿中的胰島素樣生長因子結合蛋白2(IGFBP2，Insulin-like growth factor binding protein 2，以下簡稱IGFBP2)與人類上皮細胞生長因子接受體蛋白(ERBB3，v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3，以下簡稱ERBB3)蛋白可作為偵測肝癌的標記分子。

習知技術上不易從血清/血漿中或培養的肝癌組織培養液中尋找到偵測肝癌的新穎血清/血漿生物標記，本發明發展出利用新鮮肝癌組織萃取出的組織間質液作為找尋偵測肝癌的新穎的血清/血漿標記分子之對象的方法。利用肝癌生物標記分子濃度最高的肝癌組織間液找尋偵測肝癌的新穎血清/血漿標記，再以病患的血清/血漿加以驗證。並且現行使用的血清生物標記分子無法十分精確的診斷肝癌，本發明提出檢測血清/血漿中ERBB3及IGFBP2兩種蛋白可更精確診斷是否罹患肝癌。

有關本發明所採用之技術、手段及其功效，茲舉一較佳實施例並配合圖式詳細說明於后，相信本發明上述之目的、構造及特徵，當可由之得一深入而具體的瞭解。

尋找偵測肝癌的血清/血漿生物標記分子之方法步驟：

本發明主要揭示一種找尋肝癌血清/血漿生物標記分子之方法及該肝癌血清/血漿生物標記分子。找尋肝癌血清/血漿生物標記分子之方法如第一圖所示，其步驟依序如下：

(11)第一步驟、低速離心去除切碎之肝癌組織及非肝癌組織表面之汙染物質：取出手術切除的新鮮肝癌組織與肝癌周圍的非癌肝組織，將該肝癌組織與該非癌肝組織分別切碎為約1×1×3mm大小，各以PBS(phosphate buffer saline)清洗兩次，再以PBS於37℃、10%二氧化碳的條件在細胞培養箱中培養10分鐘，之後使用離心機以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，去除切碎組織表面之汙染物質。

(12)第二步驟、低速離心將組織與組織間質液分開：再各用PBS於37℃、10%二氧化碳的條件在細胞培養箱中培養60分鐘，使用離心機以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，將組織與組織間質液分開，並避免因過度離心導致細胞破裂。

(13)第三步驟、高速離心去除不溶之雜質：再各使用離心機以每分鐘5000~15000轉離心15~30分鐘，去除不溶的雜質，將組織間質液的純度提昇，提升接下來的步驟偵測微量蛋白的敏感度。

(14)第四步驟、建立候選的肝癌生物標記分子：利用蛋白質體學的方法，如二維凝膠電泳法(two-dimensional gel electrophoresis)與蛋白質抗體晶片(Antibody array)等，比較取自肝癌組織及非癌肝組織之組織間質液的蛋白質組成，並鑑別出肝癌組織間質液中含量高於非癌肝組織之組織間質液的蛋白質，並將這些蛋白質列為候選的肝癌生物標記分子(candidate biomarkers for hepatoma detection)。

(15)第五步驟：篩選候選的肝癌生物標記分子：將這些候選的肝癌生物標記分子逐一以酶-免疫吸附法(ELISA)，偵測及測量其在數肝癌及數非肝癌病患血清中之濃度，先用student t-test分析該候選標記在肝癌患者及非肝癌患者的血中濃度是否有統計學上有意義之差異，偽陽性小於百分之一，期望值P<0.01，為初步選取的標準。有顯著差別的候選生物標記再以ROC(Receiver Operating Cheracteristic)分析。其中ROC曲線下面積(AUC，Area under curve，以下簡稱AUC)大於90%者才被視為具臨床價值。再以另外一群含取自肝癌及非肝癌之慢性B型肝炎患者的血清檢體，用ELISA及ROC等方法，作進一步驗證，若ROC曲線下面積再大於90%者，則認定該候選的肝癌生物標記分子為肝癌的生物標記分子，且該肝癌的生物標記分子可製成肝癌檢測套組而用於檢測肝癌之用途。其中，第五步驟所稱非肝癌病患可為肝硬化但無肝癌、慢性B型肝炎患者及健康的B型肝炎帶原者。

以下實例係進一步了解本發明之優點，並非進一步限制本發明之申請專利範圍：

試驗實例： (11)第一步驟、低速離心去除切碎之肝癌組織及非肝癌組織表面之汙染物質

將手術切除的肝癌組織及肝癌周圍的非癌肝組織各自切碎為約1×1×3mm大小，將切碎的組織先以PBS(phosphate buffer saline)於37℃在、10%二氧化碳的條件在細胞培養箱中培養10分鐘後，用離心機採用以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，去除切碎組織表面之汙染物質。

(12)第二步驟、低速離心將組織與組織間質液分開

收集切碎的組織之後用PBS於37℃在10%二氧化碳的細胞培養箱中培養60分鐘。先使用離心機以每分鐘1000~2000轉離心2~5分鐘，將組織中的細胞部份去除。

(13)第三步驟、高速離心去除不溶之雜質

再以離心機以每分鐘5000~15000轉離心15~30分鐘，將不溶的雜質從萃取液中去除，得到該肝癌組織及非肝癌組織的組織間質液。

(14)第四步驟、建立候選的肝癌生物標記分子

如圖二A與圖二B所示，利用蛋白質二維凝膠電泳法(two-dimensional gel electrophoresis)與蛋白質二維凝膠螢光電泳法(two-dimensional differential fluorescence gel electrophoresis)比較取自肝癌組織及非癌肝組織之組織間質液的蛋白質組成，在蛋白質二維凝膠電泳法中分離，分離的蛋白使用寶石紅蛋白(SYPRO Ruby)染色，照相並利用軟體分析凝膠上有濃度差異的地方(圖二A)，將濃度有差異的地方之蛋白質列為候選的肝癌生物標記分子。或肝癌組織及非癌肝組織之組織間質液的蛋白質先分別以Cy3與Cy5螢光化合物染色，再以蛋白質二維凝膠螢光電泳法分離。經比對後找出在肝癌組織間質液有較高濃度差異的蛋白，再使用質譜儀(mass spectrometry)鑑定出該蛋白的身分(圖二B)，並鑑別出ERBB3及IGFBP2兩種蛋白質在肝癌組織間質液中含量高於非癌肝組織之組織間質液。

同時也利用蛋白質抗體晶片(Antibody array)，比較取自肝癌組織及非癌肝組織之組織間質液的蛋白質組成，該蛋白質抗體晶片(Antibody array)詳細的使用步驟依序為：

A、將萃取出的組織間質液的蛋白質100毫克加入每個晶片上的反應槽，於室溫下作用二小時。

B、用沖洗液洗反應槽五次後。同時將遮飾液(blocking buffer)與Biotin結合的抗體混合。

C、將上述已與遮飾液混合的Biotin結合的抗體加入每一反應槽。在室溫下作用兩小時。

D、用沖洗液洗反應槽五次，然後加入稀釋過的Cy3-conjugated streptavidin。避光下於室溫作用兩小時。

E、用沖洗液洗反應槽五次。避光下於室溫讓晶片完全乾燥。

F、如第三圖所示，利用共焦掃描晶片閱讀器(Confocal scanner Chip Reader)獲得蛋白質點陣圖(第三圖)，並透過Gene Pix Pro 4.1軟體將蛋白質點陣圖做螢光強度分析，並鑑別出ERBB3及IGFBP2兩種蛋白質在肝癌組織間質液中含量高於非癌肝組織之組織間質液，並將ERBB3及IGFBP2兩種蛋白質列為候選的肝癌生物標記分子(candidate biomarkers for hepatoma detection)。

其中，該蛋白質抗體晶片(Antibody array)的來源為RayBiotech公司所生產之Human Cytokine Antibody Array G Series 2000。

其中，該ERBB3蛋白之完整序列為如SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列，而存在於人體血清/血漿中之ERBB3蛋白片段為SEQ ID NO:2所示之氨基酸序列，其為SEQ ID NO:1所示之氨基酸序列第20到第643的氨基酸序列；該IGFBP2蛋白之完整序列為如SEQ ID NO:3所示之氨基酸序列，而存在於人體血清/血漿中之IGFBP2蛋白片段為SEQ ID NO:4所示之氨基酸序列，其為SEQ ID NO:3所示之氨基酸序列第40到第328的氨基酸序列

(15)第五步驟：篩選候選的肝癌生物標記分子 A、偵測血清中ERBB3及IGFBP2蛋白的濃度：

為正確地測量血清中ERBB3及IGFBP2的濃度，我們選擇使用由R ＆ D Systems Europe，Ltd.生產的human ErbB3(DY348)及human IGFBP2(DY674)的ELISA組套。並使用基因工程生產的human ErbB3及human IGFBP2做定量標準品。

ERBB3之ELISA所使用的抗體為：

1.捕捉抗體(Capture antibody)：相對應於SEQ ID NO:2所示之氨基酸序列的單株抗體(購自R&D Systems，MAB3481)。

2.偵測抗體(Detection antibody)：相對應於SEQ ID NO:2所示之氨基酸序列的biotinylated單株抗體(購自R&D Systems，BAM348)。

IGFBP2之ELISA所使用的抗體為：

1.捕捉抗體(Capture antibody)：相對應於SEQ ID NO:4所示之氨基酸序列的單株抗體(購自R&D Systems，MAB6741)。

2.偵測抗體(Detection antibody)：相對應於SEQ ID NO:4所示之氨基酸序列，山羊，IgG，biotinylated的抗體(購自R&D Systems，BAF674)。

操作步驟如下：

(a)、將捕捉抗體(Capture antibody)稀釋為每毫升4毫克，每小槽加入100微升，於室溫下作用過夜。

(b)、將適量倍數稀釋過的血清(平均約稀釋10~100倍)100微升加入每個小槽，於室溫下作用兩小時。

(c)、移去血清並適量地沖洗後，每小槽加入100微升每毫升含2毫克的biotinylated偵測抗體(Detection antibody)，室溫下作用兩小時。

(d)、沖洗過後，加入streptavidin-HRP，避光下，室溫作用二十分鐘。

(e)、沖洗過後加入反應的受質，室溫下反應二十分鐘。

(f)、用microplate reader，以450nm及540nm測吸光值，並以540nm的吸光質為microplate背景值做修正。經對照組做校正後，得到正確吸光值。最後與標準定量值(由一系列稀釋濃度的合成的human ErbB3或合成的IGFBP2作為定量之標準值)比對後，換算出ERBB3或IGFBP2的血清濃度。

利用上述(a)~(f)之步驟，本發明人分別量測出113位肝癌病人及111位無肝癌之病人(含47位肝硬化無肝癌及64位慢性B型肝炎病人)血清中ERBB3或IGFBP2蛋白之濃度。請參閱第四圖及第六圖，113位肝癌病人及111位無肝癌之病人血清中ERBB3或IGFBP2蛋白之濃度先用student t-test分析該候選標記在肝癌患者及非肝癌患者的血中濃度是否有統計學上有意義之差異，偽陽性小於百分之一,P<0.01,為初步選取的標準。ERBB3或IGFBP2蛋白之濃度都有顯著差別，接著再以ROC(Receiver Operating Cheracteristic)分析。

B、ROC曲線分析：

為進一步驗證血清中ERBB3或IGFBP2蛋白可作為肝癌的血清/血漿生物標記分子，再以另外獨立的兩組檢體做驗證，在IGFBP2蛋白篩選及驗證方面，第一組含五十七位肝癌病人及三十五位無肝癌之B型肝炎病人，第二組五十六肝癌病人及三十六位無肝癌之B型肝炎病人。在ERBB3蛋白篩選及驗證方面，第一組含五十六位肝癌病人及三十二位無肝癌之B型肝炎病人，第二組含五十七肝癌病人及三十二位無肝癌之B型肝炎病人作為驗證組。

詳細濃度資料如表1與表2：

將表1及表2中血清ERBB3及IGFBP2濃度作為偵測肝癌的新穎血清生物標記的實驗結果分述如下：

(1)、血清ERBB3作為偵測肝癌的生物標記的實驗結果

甲、請參閱第四圖，ERBB3血清中之濃度在113位肝癌病人高於47位肝硬化無肝癌(P<0.0001，student’s t-test)及64位慢性B型肝炎病人(P<0.0001，student’s t-test)。

乙、運用第一組篩選組血清(五十六位肝癌病人及三十二位無肝癌之B型肝炎病人)分析則其ROC曲線下面積(AUC)為97.9%(圖五A)。

丙、用驗證第二組的血清(五十七肝癌病人及三十二位無肝癌之B型肝炎病人)分析，則其ROC曲線下面積(AUC)為96.1%(圖五B)。

丁、利用Youden index取曲線切點值(cut-off value)，則兩組檢體合併後，偵測肝癌的敏感度為93.8%，特異度(specificity)為95.3%。同樣兩組病人合併後，利用 AFP區隔肝癌及非肝癌病人的ROC曲線分析，其曲線下面積(AUC)為84.3%，而利用血清ERBB3分析的ROC曲線下面積(AUC)為97%(圖五C)。

以上的結果證實，測量血清ERBB3較測量血清AFP，對偵測肝癌有較高的敏感度及特異度。因此，血清ERBB3可做為偵測肝癌的生物標記分子，可用於檢測肝癌之用途。

(2)、血清IGFBP2作為偵測肝癌的生物標記的實驗結果

甲、請參閱第六圖，IGFBP2血清中之濃度在113位肝癌病人高於47位肝硬化無肝癌(P<0.0001，student’s t-test)及64位慢性B型肝炎病人(P<0.0001，student’s t-test)。

乙、運用第一組篩選組血清(五十七位肝癌病人及三十五位無肝癌之B型肝炎病人)分析則其ROC曲線下面積(AUC)為96.4%(圖七A)。

丙、驗證第二組的血清(五十六肝癌病人及三十六位無肝癌之B型肝炎病人)分析，則其ROC曲線下面積(AUC)為96.2%(圖七B)。

丁、兩組檢體合併後，其ROC曲線下面積(AUC)為96.2%(圖七C)。相同的病人，以血清AFP區分肝癌病人及非肝癌病人，則其ROC曲線下面積(AUC)為71.5%。因此，用血清IGFBP2來區別肝癌病人及非肝癌B型肝炎病人，較血清 AFP有較高的敏感度及特異度。

以上的結果證實，測量血清IGFBP2較測量血清AFP，對偵測肝癌有較高的敏感度及特異度。因此，血清IGFBP2可做為偵測肝癌的生物標記分子，可用於檢測肝癌之用途。

(3)、合併血清AFP、ERBB3及IGFBP2提高偵測肝癌的敏感度及特異度

甲、單獨分別用血清AFP、ERBB3或IGFBP2區別肝癌及非肝癌B型肝炎病患，其ROC曲線下面積(AUC)分別為84.3%，97%，96.2%。

乙、合併AFP+ERBB3或AFP+IGFBP2則ROC曲線下面積(AUC)分別為96.9%及94.5%(圖八A及圖八B)。合併血清中ERBB3及IGFBP2，則ROC曲線下面積(AUC)為98.5%(圖八C)。若合併血清中AFP+ERBB3+IGFBP2則ROC曲線下面積(AUC)為99.1%(圖八D)。換言之，合併血清中AFP、ERBB3及IGFBP2則可提高偵測肝癌之敏感度及特異度幾近100%。

以上所述，僅為本發明最佳具體實施例，惟本發明之構造特徵並不侷限於此，任何熟悉該項技藝者在本發明領域內，可輕易思及之變化或修飾，皆可涵蓋在以下本案之專利範圍。

(11)．．．第一步驟、低速離心去除切碎之肝癌組織及非肝癌組織表面之汙染物質

(12)．．．第二步驟、低速離心將組織與組織間質液分開

(13)．．．第三步驟、高速離心去除不溶之雜質

(14)．．．第四步驟、建立候選的肝癌生物標記分子

(15)．．．第五步驟、篩選候選的肝癌生物標記分子

第一圖：本發明步驟流程圖。

第二A圖：本發明其一實施例二維凝膠電泳法實驗照片。

第二B圖：本發明其一實施例二維凝膠螢光電泳法實驗照片。

第三圖：本發明其一實施例之生物晶片實驗照片。

第四圖：本發明其一實施例之ERBB3濃度比較表。

第五A圖：本發明其一實施例ERBB3篩選組ROC曲線圖。

第五B圖：本發明其一實施例ERBB3驗證組ROC曲線圖。

第五C圖：本發明其一實施例ERBB3合併篩選組及驗證組的ROC曲線圖。

第六圖：本發明其一實施例之IGFBP2濃度比較表。

第七A圖：本發明其一實施例IGFBP2篩選組ROC曲線圖。

第七B圖：本發明其一實施例IGFBP2驗證組ROC曲線圖。

第七C圖：本發明其一實施例ERBB3合併篩選組及驗證組的ROC曲線圖。

第八A圖：本發明其一實施例合併ERBB3與AFP的ROC曲線圖。

第八B圖：本發明其一實施例合併IGFBP2與AFP的ROC曲線圖。

第八C圖：本發明其一實施例合併ERBB3及IGFBP2的ROC曲線圖。

第八D圖：本發明其一實施例合併ERBB3、IGFBP2與AFP的ROC曲線圖。

(11)．．．第一步驟、低速離心去除切碎之肝癌組織及非肝癌組織表面之汙染物質

(12)．．．第二步驟、低速離心將組織與組織間質液分開

(13)．．．第三步驟、高速離心去除不溶之雜質

(14)．．．第四步驟、建立候選的肝癌生物標記分子

(15)．．．第五步驟、篩選候選的肝癌生物標記分子

Claims (9)

1. 一種用於檢測血清及/或血漿中肝癌生物標記分子之套組，包含一用於結合人類上皮細胞生長因子接受體蛋白(ERBB3)片段之抗體；以及一用於結合胰島素樣生長因子結合蛋白2(IGFBP2)片段之抗體；其中，該ERBB3片段係實質上由SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列所組成，該IGFBP2片段係實質上由SEQ ID NO：4所示之氨基酸序列所組成。
2. 如請求項1之套組，其中該ERBB3片段係具SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列。
3. 如請求項1之套組，其中該IGFBP2片段係具SEQ ID NO：4所示之氨基酸序列。
4. 如請求項1至3中任一項之套組，更包含一用於結合血清甲型胎兒蛋白(AFP)之抗體。
5. 一種檢測肝癌的方法，包含：(a)偵測一血清及/或血漿檢體中人類上皮細胞生長因子接受體蛋白(ERBB3)片段的含量，其中，該ERBB3片段係實質上由SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列所組成；以及(b)偵測該檢體中胰島素樣生長因子結合蛋白2(IGFBP2)片段的含量，其中，該IGFBP2片段係實質上由SEQ ID NO：4所示之氨基酸序列所組成。
6. 如請求項5之方法，其中該ERBB3片段係具SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列。
7. 如請求項5之方法，其中該IGFBP2片段係具SEQ ID NO：4所示之氨基酸序列。
8. 如請求項5之方法，更包含偵測該檢體中血清甲型胎兒蛋白(AFP)的含量。
9. 一種使用生物標記分子於透過血清及/或血漿樣本以檢測肝癌之用途，其中該生物標記分子係實質上由SEQ ID NO：2所示之氨基酸序列的人類上皮細胞生長因子接受體蛋白(ERBB3)片段所組成。