WO2008096767A1

WO2008096767A1 - 肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置

Info

Publication number: WO2008096767A1
Application number: PCT/JP2008/051893
Authority: WO
Inventors: Hirotaka Minagawa; Reiji Teramoto; Yo Tabuse; Kenichi Kamijo
Original assignee: Nec Corporation; National University Corporation Kanazawa University; Kaneko, Shuichi
Priority date: 2007-02-06
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2008-08-14
Also published as: JPWO2008096767A1

Abstract

　本発明の課題は肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べ存在量が異なるタンパク質群を用いて肝細胞がんを判定する方法、ならびに該タンパク質群からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを用いた肝細胞がんを検出する装置を提供することである。本発明の肝細胞がんを検出する方法は、配列番号１で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲンｇｐ９６、配列番号２で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプロテイン、配列番号３で表されるアミノ酸からなるビメンチン、配列番号４で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ２、配列番号５で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーオキシドディスミューターゼ、配列番号６で示されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ１、配列番号７で表されるアミノ酸からなるペルオキシレドキシン５、配列番号８で表されるアミノ酸からなるチオレドキシンからなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーを用いる、肝細胞がんを検出する方法である。

Description

肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置発明の背景：

本発明は、肝細胞がんの検出に用い得る新規なタンパク質マーカーおよびこのタンパク質マーカーを用いた肝細胞がんの検出方法及ぴ装置に関する。

明

肝細胞がんは肝臓に原発する上皮性悪性腫瘍の一つで、肝細胞に似た腫瘍細胞からなる。田肝細胞がんは通常肝臓に多数の腫瘤を形成しており、肝血管内に増殖 ·進展する傾向が強く、しばしば門脈に腫瘍栓を形成する。

肝細胞がんは、日本を含むアジア、アフリカ地域に多発し、肝硬変が併存していることが多い。

肝細胞がん検出のためのマーカーとして、従来、 L i e bm a n HA, F u r i e B C， T o n g M J , B l a n c h a r d RA， L o K J , L e e S D， C o l e ma n MS, F u r i e B. N e w E n g 1. J . Me d. 3 1 0, p p. 1 4 2 7— 1 4 3 1. (1 9 84) 記載の a フエトプロティン（AF P)、 P I VKA- I I、また、 Kuma g a i Y， C h i b a J , S a t a T， O h t a k i S, M i t a mu r a K. C a n c e r R e s . 5 2， p p 4 9 8 7 -4 9 9 4.

(1 9 9 2)記載の KM— 2、 E 1 i a s J， K e w MC. I n t . J . C a n c e r . 4 6, p p 8 0 5 - 8 0 7. ( 1 9 9 0 ) 記載の C A 1 2 5等が用いられていた。

しかしながら、これらのマーカ一は陽性判定率が十分でなかった。例えば、 A F Pと P I VK A— IIの肝細胞がん判定スクリーユング率は 6 0〜7 0%である。そのため、さらなる信頼"生をもったマーカーが求められている。発明の開示：本発明は、肝細胞がん細胞において非肝がん細胞に比べ存在量が異なるタンパク質群を用レ、て肝細胞がんを判定する方法を提供することを目的とする。

更に本発明は、該タンパク質群からなる肝細胞がん検出のための肝細胞がんタンパク質マーカーとそれを用いた肝細胞がん検出方法及び装置の提供を目的とする。

本発明者は、肝細胞がん組織において、非がん細胞に比べて発現量が増加もしくは減少するタンパク質を探索した。

その結果、特定のタンパク質群の発現量を測定することで肝細胞がん細胞と非がん細胞を判別することが可能であることを見出した。

即ち、本発明によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリンェクションアンテゲン g p 9 6 t umo r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 96)、配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティニングプ口ティン (v a 1 o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n)、酉己列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2)、配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンスーノ一ォキシドディスミユーターゼ (m. a n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s e )、配列番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメフ¹ ~" i 1 i,t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1 )、配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5

( e r o x i r e d o x i n 5 )、配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。

また、本発明によれば、前記肝細胞がんタンパク質マーカ一において、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも 1つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカーが得られる。また、本発明によれば、肝細胞がんタンパク質マーカーを用いる肝細胞がんを検出する方法であって、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲン g p 96 (t urn o r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 6)、酉己歹 tj番号 2で表さ;^るアミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロティン（v a l o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n)、配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボ-ックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2)、配列番号 5 で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーォキシドディスミユーターゼ (m a n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s eノ、酉己歹 U番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1)、酉己歹 lj番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o x i r e d o x i n 5)、配歹 (1 番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。

また、本発明によれば、前記肝細胞がん検出方法において、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも 1つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出することを特徴とする肝細胞がん検出方法が得られる。

また、本発明によれば、前記いずれか一つの肝細胞がんの検出方法において、生体試料中における前記肝細胞がんタンパク質マーカーの前記少なくとも一つのタンパク質を測定し、健常人生体試料中と比較し増加または減少することをもつて陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。

また、本発明によれば、前記肝細胞がんの検出方法において、前記少なくとも一つのタンパク質を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ゥェスタンプロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィ一法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法が得られる。

また、本発明の肝細胞がん検出装置は、前記肝細胞がんの検出方法を実施するための装置である。

本発明をさらに、具体的に述べると、配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲン g p 9 6 ( t umo r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 6 )、配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロティン (v a l o s i 11— c o n t a i n i n g p r o t e i n)、配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2 )、配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンスーノーォキシドデイスミューターゼ (ma n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s e)、配列番号 6で表されるァミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1 )、配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o x i r e d o x i n 5)、配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質発現量を、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ゥェスタンプロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィ一法または質量分析法より測定する方法を提供するものである。

本発明によれば、配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジヱクションァンチゲン g p 96 (, t u m o r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 6)、配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロアイン (v a l o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n)、酉己歹 U番号 3 で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2 )、配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーォキシトアイスミューターゼ (ma n g a n e s e s u p e r o x i d e d i smu t a s e)、配列番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフエィトイソメラーゼ l (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e l)、配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o X i r e d o x i n 5),配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（ t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質発現量を測定することで、肝細胞がんの判別が可能となる。図面の簡単な説明：

図 1は、チュモーノレリジェクションアンチゲン g p 96 (GP 96) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。

図 2は、図 1の GP 96の全アミノ酸配列を示す図である。

図 3は、バロシンコンテイニングプロテイン (VC P) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。

図 4は、図 3の VCPの全アミノ酸配列を示す図である。

図 5は、ビメンチン（V IM) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および PMF法に用いた検出されたペプチドを示す図である。

図 6は、図 5の V IMの全アミノ酸配列を示す図である。

図 7は、力一ボニックアンヒドラーゼ 2 (CA2) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。

図 8は、図 7の C A 2の全アミノ酸配列を示す図である。

図 9は、マンガンスーパ一ォキシドデイスミユーターゼ (Mn SOD) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F 法に用いた検出されたペプチドを示す図である。

図 10は、図 9の Mn SODの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。図 1 1は、トリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (TP I 1) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。

図 12は、図 1 1の TP I 1の全アミノ酸配列を示す図である。

図 13は、ペルォキシレドキシン 5 (PRX 5) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。

図 14は、図 13の PRX 5の全アミノ酸配列を示す図である。

図 15は、チォレドキシン（TRX) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である

図 16は、図 15の TRXの全アミノ酸配列を示す図である。

図 17は、ビメンチン (V I M) とカーボニックアンヒドラーゼ 2 (CA2) の、 18人の患者から得られた非がん部、がん部における TRXの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。発明を実施するための最良の形態：

本発明についてさらに、詳細にのべる。

本発明は被験者から得られた生体試料中の、配列番号 1で表されるァミノ酸からなるチュモールリジェクシヨンアンチゲン g p 96 (t umo r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 96 )、配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンティユングプロティン (v a 1 o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n),配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（v i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a nhy d r a s e 2)、配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンス一パーォキシドディスミユーターゼ (ma n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s e )、酉己歹 tj番号 6で表されるアミノ酸力、らなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1 )、配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o x i r e d o x i n 5)、配列番号 8で表されるァミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質発現量の変動を測定することで肝細胞がんの判定を行う方法である。

本発明において、生体試料としては、生検（バイオプシー）試料、血液、血漿、血清、尿などが例示できる。

これらの生体試料中から上記タンパク質発現量を測定する方法としては、生体試料を等電点電気泳動および S D Sポリアクリルアミド電気泳動を組み合わせた二次元電気泳動法と分離されたタンパク質を発現量に応じて定量できる染色法を組み合わせて用いる方法がある。

さらに、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ一、ゲルろ過クロマトグラフィ一等のクロマトグラフィーを組み合わせた多次元クロマトグラフィ一法と分離されたタンパク質を紫外/可視吸光度や質量分析を用いて定量する方法、特定の抗体を用いる方法などがある。

ここで、特定の抗体とは、検出したいタンパク質の完全長を認識するもの、検出したいタンパク質の部分ぺプチドを認識するものなどを指す。これらの抗体を単独もしくは複数用い、公知の方法である酵素免疫測定法（EL I SA)、ウェスタンプロッティング法、放射免疫測定法、免疫沈降法などにより試料中のタンパク質を定量することができる。

(実施例）

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではないことは勿論である。

(実施例 1 )

実施例 1では、肝細胞がん患者由来のがん細胞抽出タンパク質および非がん細胞抽出タンパク質の二次元電気泳動解析について説明する。

18人の肝細胞がん患者から外科的に切除された組織より、病理学的に診断された、がん部位組織おょぴ非がん部位組織を、それぞれ細胞溶解液（ 30 mM T r i s— C I ( p H 8. 5)、 7 M尿素、 2 Mチ才尿素、 4% (w/v) CHAP S、 0. 5mMEDTA、 PMS F、 Ap r o t i n i n、 P e p s t a t i n) 中でガラスホモジェナイザーを用いて破砕後、 37 °Cで 1時間インキュベートした。

サンプルを遠心（1 3, 000 r pm、 20分）した後、上清を採取した。上清中のタンパク質濃度はプロテインアツセィキットレくィォラッド社）を用い、ブラッドフォード法により測定した。 50 gのがん部位抽出タンパク質と 50 11 gの非がん部位抽出タンパク質をそれぞれ Cy 3 (GEヘルスケア社）、 C y 5

(GEヘルスケア社）の蛍光色素で標識した。蛍光標識した抽出タンパク質サンプルを混合し、固定化 p Hグラジェントゲル ( I mm o b i l i n e D r y S t r i p p H 3— 10、 24 cm : GEヘルスケア社) を用いて 71 , 50 OVo 1 t ·時間の等電点電気泳動を行った（一次元電気泳動）。一次元電気泳動後のゲルに対し還元アルキルィ匕を行った後、二次元目の SDS電気泳動を、 12. 5 %のポリアクリルァミドゲル (24 c mX 20 c m) を用いて行った。以上のように分離したゲル上のタンパク質スポットを、スキャナーを用いて蛍光ィメージとして取得した。二次元電気泳動は、一人の患者から得られたサンプルで 3回ずつ行い、合計 54枚のゲルイメージを取得した。得られた蛍光イメージ上のタンパク質スポットを各ゲルにおいてマッチングさせ、各タンパク質スポットの蛍光強度を計算した。タンパク質スポットの蛍光強度はスポット中に含まれるタンパク質の量に比例するため、非がん部位に比べがん部位でスポットの蛍光強度が統計的に有意に変動しているスポット、スポットナンバー 436、スポットナンパー 464、スポットナンパ、一 1046、スポットナンノくー 1 977、スポットナンバー 2187、スポットナンバー 2027、スボットナンノくー 2301、スポットナンバー 2399、の 8スポットを、非がん部位に比べがん部位で発現量が変動しているものとして特定した。特定した 8スポットをゲルから切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行い、ぺプチド化した。ゲル内消化したぺプチドを飛行時間測定型の質量分析装置（M A LD I -TOF /M S， Vo y a g e r DE STR ： Ap 1 i e d B i o s v s t ems社）またはィオンスプレー型質量分析装置（E S I -MS, LCQ-D e c a : Th e rmo e l e c t r o n社）で測定し、ペプチドマスフィンガープリント法（PMF法）により、スポットのタンパク質同定を行った。

その結果、スポットナンバー 436は、チュモールリジェクションアンチゲン g p 96 (以下 GP 96と略す）、スポットナンバー 46 は、バロシンコンティエングプロテイン（以下 VCPと略す）、スポットナンパ一 1046は、ビメンチン（以下 V IMと略す）、スポットナンバー 1 977は、カーボニックアンヒドラーゼ 2 (以下 C A 2と略す）、スポットナンバー 2187は、マンガンスーパーォキシドディスミユーターゼ（以下 Mn S〇Dと略す）、スポットナンバー 2027 は、 1、リオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (以下 T P I 1と略す）、スボットナンバー 2301は、ペルォキシレドキシン 5 (以下 PRX 5と略す）、スポットナンバー 2399は、チォレドキシン（以下 TRXと略す）であることがわかり、これらのタンパク質スポットの蛍光強度が、非がん部位に比べがん部位で変動していることが明らかとなった。

図 1はチュモールリジェクションアンチゲン g p 96 (GP 96) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたペプチドを示す図で、 18人の患者から得られた非がん部、がん部における GP 96の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度である。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。即ち、図 1は同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動におけるスポットナンバー 436の蛍光強度を示している。図 1において、図中の数字は各患者番号に対応している。同一患者から得られた非がん部とがん部サンプルの二次元電気泳動は独立に 3回行っているため、図中の蛍光強度は 3回の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示した。ここで、「白丸」は患者 1から得られたデータ、「黒丸」は患者 2から得られたデータ、「白三角」は患者 3から得られたデータ、「黒三角」は患者 4から得られたデータ、「白四角」は患者 5から得られたデータ、「黒四角」は患者 6から得られたデータ、「白逆三角」は患者 7 から得られたデータ、「黒逆三角」は患者 8から得られたデータ、「白菱形」は患者 9から得られたデータ、「黒菱形」は患者 1 0から得られたデータ、「 +」は患者 1 1から得られたデータ、「X」は患者 1 2から得られたデータ、「二重丸」は患者 1 3から得られたデータ、「二重三角」は患者 1 4から得られたデータ、「二重四角」は患者 1 5から得られたデータ、「二重逆三角」は患者 1 6から得られたデータ、「二重菱形」は患者 1 7から得られたデータ、及び「半黒丸」は患者 1 8 から得られたデータを夫々示している。なお、図 3、図 5、図 7、図 9、図 1 1、図 1 3、図 1 5、及び図 1 7においても同様に示されている。

図 2は、 G P 9 6の全アミノ酸配列を示す図である。図 2において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。つまり、図 2はスポットナンバー 4 3 6の P MF法によるタンパク質同定結果を表しており、 G P 9 6の全ァミノ酸配列のうち、下線のぺプチドが質量分析で測定されたことを示している。

図 3は、バロシンコンテイニングプロティン (V C P ) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたペプチドを示す図で、 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における V C Pの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。

図 4は、 V C Pの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。

図 5はビメンチン（V I M) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図で、 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における V I Mの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は 3回行レ、、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。

図 6は V I Mの全アミノ酸配列を示す図で、タンパク質スポットカゝらトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。図 7はカーボニックアンヒドラーゼ 2 ( C A 2 ) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたペプチドを示す図で、 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における C A 2の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。

図 8は C A 2の全アミノ酸配列を示す図である。図 6において、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。

図 9はマンガンスーパーォキシドディスミユーターゼ (M n S O D) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P MF法に用いた検出されたペプチドを示す図で、 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における M n S O Dの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。

図 1 0は M n S O Dの全アミノ酸配列を示す図である。図 1 0を参照すると、タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたペプチドを下線で示してある。

図 1 1はトリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (T P I 1 ) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量および P M F法に用いた検出されたペプチドを示す図で、前述した 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における T P I 1の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示している。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。図 1 2は T P I 1の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。

図 1 3はペルォキシレドキシン 5 ( P R X 5 ) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。 1 8人の患者から得られた非がん部、がん部における P RX 5の二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。なお、記号は図 1と同様の患者には、同様の記号を用いている。

図 14は PRX5の全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。

図 15は、チォレドキシン（TRX) の非がん部におけるタンパク質発現量とがん部におけるタンパク質発現量おょぴ P M F法に用いた検出されたぺプチドを示す図である。 18人の患者から得られた非がん部、がん部における TRXの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図である。二次元電気泳動は 3回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。図中の記号は図 1 と同じである。

図 16は TRXの全アミノ酸配列を示す図である。タンパク質スポットからトリプシン消化により得られたぺプチドを下線で示してある。

(実施例 2)

実施例 2では、マーカータンパク質を用いたがん部と非がん部の判別について説明する。

図 17はビメンチン (V I M) とカーボニックアンヒドラーゼ 2 (C A 2)の、 18人の患者から得られた非がん部、がん部における TRXの二次元電気泳動ゲル中のタンパク質スポットの蛍光強度を示す図で、 X軸に V IMの蛍光強度を、 Y軸に C A 2の蛍光強度をプロットしたものを示している。二次元電気泳動は 3 回行い、平均の蛍光強度と標準偏差を示してある。蛍光強度のデータは実施例 1 で述べた通り、 3回の二次元電気泳動の平均値を示し、標準偏差をエラーバーで示してある。なお、曲線 1 「白丸」は、非がん部から得られた V IMと CA2の蛍光強度を示す。また、曲線 2 「黒丸」はがん部から得られた V IMと CA2の蛍光強度を示している。

図 1 7を参照すると、 V IMと CA 2の発現量を比較することにより、がん部と非がん部を判別できることは明らかであり、 V I Mと C A 2の発現量の測定は肝細胞がんの診断に有用である。 V IMと CA2の発現量測定をキット化することにより、新規な肝細胞がん診断キットとすることが可能になる。

また図 1から図 1 6に記載の他のタンパク質を用いても同様の結果を得ることができる。

以上の説明の通り、本発明の肝細胞がんタンパク質マーカーと、肝細胞がん検出方法と、肝細胞がん検出装置は、肝細胞がんの判定に適用されるものであり、従来と比べて、さらなるスクリ一二ング率の向上が図れる可能性がある。

なお、本出願は、 2 0 0 7年 2月 6日に出願された、日本国特許出願第 2 0 0 7 - 0 2 6 9 4 2号からの優先権を基礎として、その利益を主張するものであり、その開示はここに全体として参考文献として取り込む。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンテン g p 9 6 ( t umo r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 6 ) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

2. 配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロテイン v a 1 o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i nリを含？ _Pことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

3. 配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i η) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

4. 配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2) を含むことを特徴とする月干細胞がんタンパク質マーカー。

5. 配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーォキシドディスユーター (m a n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s e) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

6. 配列番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメフ'— 1 、t r i o s e p h o s p h a t e i s om e r a s e 1 ) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

7. 配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o x i r e d o x i n 5) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マ一力一。

8. 配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（ t h i o r e d o X i n) を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

9. 請求項 1乃至 8の内のいずれか一つに記載の肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

1 0. 請求項 1乃至 9の内のいずれか一つに記載の肝細胞がんタンパク質マ一力一を用いることを特徴とする肝細胞検出方法。

1 1. 配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクシヨンァンテグン g p 96 st umo r ' r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 6)、

配列番号 2で表されるアミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロティン、v a l o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n)、

配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（v i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n 1 c a nhy d r a s e 2)、

配列番号 5で表されるアミノ酸からなるマンガンスーパーォキシドディスミュ' ~タ ' ~ゼ (m a n g a n e s e s u p e r o x i d e d i smu t a s e)、配列番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ丄 (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1)、

配列番号 7で表されるアミノ酸からなるペルォキシレドキシン 5 (p e r o X i r e d o x i n 5)、及ひ

配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n) からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質を含むことを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

12. 請求項 1 1に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーにおいて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも 1つのタンパク質力肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少するものであることを特徴とする肝細胞がんタンパク質マーカー。

1 3. 請求項 1 1に記載の肝細胞がんタンパク質マーカーを用いることを特徴とする肝細胞がん検出方法。

14. 請求項 13に記載の肝細胞がん検出方法において、

前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも 1つのタンパク質が、肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出することを特徴とする肝細胞がん検出方法。

1 5. 請求項 14に記載の肝細胞がんの検出方法において、生体試料中における前記肝細胞がんタンパク質マーカーの前記少なくとも一つのタンパク質を測定し、健常人生体試料中と比較し増加または減少することをもって陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出方法。

1 6. 請求項 1 5に記載の肝細胞がんの検出方法において、前記少なくとも一つのタンパク質を測定するにあたり、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ゥスタンプロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィ一法または質量分析法より選択される方法を用いることを特徴とする肝細胞がんの検出方法。

1 7. 細胞がんタンパク質マーカーを用いて肝細胞がんを検出する装置であつて、前記肝細胞がんタンパク質マーカーは、

配列番号 1で表されるアミノ酸からなるチュモールリジェクションアンチゲン g p 9 6 ( t umo r r e j e c t i o n a n t i g e n g p 9 oノ、配列番号 2で表されるァミノ酸からなるバロシンコンテイニングプロテイン、v a l o s i n— c o n t a i n i n g p r o t e i n)^

配列番号 3で表されるアミノ酸からなるビメンチン（V i me n t i n)、配列番号 4で表されるアミノ酸からなるカーボニックアンヒドラーゼ 2 (c a r b o n i c a n h y d r a s e 2)、

配列番号 5で表されるァミノ酸からなるマンガンスーパーォキシドディスミュ¹ ~タ' ~セ (m a n g a n e s e s u p e r o x i d e d i s mu t a s e)、配列番号 6で表されるアミノ酸からなるトリオースフォスフェイトイソメラーゼ 1 (t r i o s e p h o s p h a t e i s ome r a s e 1)、

配列番号 8で表されるアミノ酸からなるチォレドキシン（t h i o r e d o x i n)からなる群から選択される少なくとも 1つのタンパク質を含むものを用い、前記肝細胞がんタンパク質マーカーとしての前記少なくとも 1つのタンパク質力肝細胞がん患者生体試料中において、健常人生体試料中と比較し増加または減少することを検出する特定タンパク質検出手段を備えていることを特徴とする肝細胞がん検出装置。

1 8 . 請求項 1 7に記載の肝細胞がんの検出装置において、前記特定タンパク質検出手段の結果が、増加または減少を示す場合に、陽性と判断することを特徴とする肝細胞がんの検出装置。

1 9 . 請求項 1 7又は 1 8に記載の肝細胞がんの検出装置において、前記特定タンパク質検出手段は、酵素免疫測定法、蛍光標識抗体法、ウェスタンプロット法、放射免疫測定法、免疫沈降法、電気泳動法、液体クロマトグラフィー法または質量分析法より選択される方法を用いたものであることを特徴とする肝細胞がんの検出装置。