CN107515304B - 肾癌标志物pdzk1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学和肿瘤医学领域，涉及一种新型特异的肾癌标志物PDZK1在肾癌诊断、预后以及分子靶向治疗中的应用。本发明联合表达谱芯片和蛋白质组学的方法对肾癌组织和癌旁组织差异表达蛋白质进行筛选，发现PDZK1在肾癌组织中显著低表达，再通过常规的生物化学与分子生物学手段进行鉴定，明确PDZK1作为一种新型特异的肾癌标志物可进一步为肾癌发病机制的研究、肾癌的诊断及预测病人预后提供新思路，也为肾癌的治疗提供新的靶点。

Description

肾癌标志物PDZK1及其应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一种肿瘤标志物PDZK1在肾癌诊断和预测预后中的应用，及PDZK1作为肾癌标志物在制备分子靶向药物中的应用。
背景技术
肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据相关报道，2014年美国有63000余例新增肾癌患者，并有13000多人死于肾癌。肾癌的发病率在男性比女性更为常见，男女发病比例在1.5:1到2.5:1之间。男女发病比例通常随年龄的增加而增加，从30岁开始呈几何数字增长，大多数病人的发病年龄在50岁以上，60-70岁时达到高峰。
肾癌中最常见的是肾细胞癌，约占肾癌的90％。近些年来，全球范围内的肾细胞癌年发病率以2％的速度逐年上升，让肾癌成为少数发病率持续增加的肿瘤之一。肾癌不易进行早期诊断，当患者出现临床症状就诊时，约有30％的病人已发生了转移。目前肾癌的主要治疗手段以外科手术切除为主，但复发率很高，而且转移的病人对常规放化疗不敏感，免疫治疗也仅对10％-20％患者有效，并由于副作用大而难以普和应用。同时，分子靶向药物的治疗效果也不是很理想，当一线靶向药物治疗失败换用mTOR抑制剂疗效依然不理想，反应率也只有5％左右。所以，有效地诊断肾癌的发生及改善肿瘤药物的疗效显得尤为重要。
发展新型肾癌标志物作为诊断与治疗的靶点一直是肾癌研究的热点。然而全球的肾癌诊断筛查方案尚不成熟，约20％-30％的肾癌患者在初诊时已经发现存在转移了。因此，诊断筛查已经成为肾癌防治急需解决的的重大科学问题。肿瘤标志物的发现和合理应用是肿瘤诊断和治疗的前提。然而，目前对于肾癌发病机制的研究和认识仍然不足，因此，联合表达谱芯片和蛋白质组学的手段研究肾癌的发病机制，为找出更好的肾癌诊断和预后分子标志物，也为肾癌的分子靶向治疗提供了重要的理论依据。
迄今为止，尚未见有效地发现诊断和筛查肾癌的可供临床应用的分子标志物。以PDZK1作为标志物用于肾癌检测的试剂和方法，都将为深入研究和大规模验证PDZK1与肾癌的相关性，对肾癌进行诊断及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的是提供PDZK1的新用途。本发明提供了PDZK1作为肾癌诊断和预后分子标志物的用途，以及以PDZK1为靶标筛选辅助治疗肾癌药物的应用，为肾癌的诊断和治疗提供参考依据。
本发明提供了PDZK1作为肾癌标志物的用途，主要针对肾透明细胞癌。
本发明中，检测样本中PDZK1含量时，通常采用特定的PCR引物和PDZK1相关抗体。
本发明采用表达谱芯片结合蛋白质组学的方法，对肾癌/癌旁组织中差异表达蛋白质进行筛选，鉴定其中显著的差异表达蛋白。PDZK1为其中一个显著的差异表达蛋白质。
具体检测时，可以先取待检测样本，然后分析比较待检测样本与正常对照样本中PDZK1的表达量。
本发明的实验结果用独立使用的平均值和标准差表示，用双侧t检验来比较差异是否具有显著性。P<0.01认为具有统计学差异。所有数据采用SPSS19.0软件分析。实际检测时，待检测样本比正常对照样本中PDZK1的表达量低为阳性结果，实验结果显示：在癌组织中，PDZK1的mRNA和蛋白水平异常低表达，且PDZK1蛋白表达水平可以明显区分正常与肾癌组织。
采用Real-time PCR(以下简称RT-PCR)、western blot和免疫组化的技术对组学结果进行验证，分别检测肾癌患者及其配对的正常组织中的PDZK1的mRNA和蛋白表达水平，发现PDZK1在肾癌组织中表达明显低于配对的正常组织。实验结果与组学结果一致，且PDZK1的蛋白表达水平可显著区分肾癌和正常组织，表明PDZK1能够作为一种新型特异的肾癌诊断标志物。生存分析结果显示：PDZK1低表达的患者预后不良，提示其同样可以作为新的肾癌预后分子标志物。
从另一个角度说明，本发明中的PDZK1可以作为筛选肾癌药物的新靶点。
本发明采用组学的方法对肾癌/癌旁组织中差异表达基因进行比较分析，PDZK1即其中的一个差异蛋白。PDZK1在肾癌中显著低表达，且可明显区分肾癌患者和正常人。由此，提供了本发明的肾癌标志物PDZK1在肾癌诊断、预测病人预后中的用途，及PDZK1作为标志物用于肾癌的检测试剂及方法，将为深入地研究和大规模验证PDZK1与肾癌的相关性，对癌症进行诊断以及为个体患者提供辅助治疗方案具有重要意义。
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
附图说明
图1是人肾癌与癌旁组织的mRNA芯片(microarray)差异表达分析图
图2是验证PDZK1在肾癌组织中低表达及预后分析图
图3是RT-PCR检测肾癌组织和癌旁组织中PDZK1mRNA表达水平图
图4是Western Blot检测肾癌组织和癌旁组织中PDZK1蛋白表达水平图
图5是免疫组化检测肾癌及癌旁组织中PDZK1蛋白表达情况和差异分析图
图6是CCK8实验检测PDZK1抑制肾癌细胞体外增殖能力图
图7是细胞划痕实验评估PDZK1一直肾癌细胞体外迁移能力图
图8是裸鼠荷瘤实验检测PDZK1抑制肾癌细胞体内增殖能力图
具体实施方法
实施例一：人肾癌与癌旁组织的mRNA芯片(microarray)表达分析
(一)材料和方法
1.材料
组织样品来自于18对肾癌患者的外科手术切除样本：每对包含肾癌组织和配对的癌旁组织，分别来自四个不同分期的病人。
2.方法
(1)肿瘤组织和癌旁组织总mRNA的提取：Qiagen公司的RNA提取试剂盒说明书提取肾癌组织和癌旁组织的总RNA。
(2)反转录合成cDNA：互补DNA(cDNA)合成：利用反转录(Reverse Transcription)原理，以T7Oligo(dT)为引子产生第一股cDNA，接着再加入RNase及DNA Polymerase合成第二股cDNA。
(3)反股RNA(aRNA)合成及标定：利用基因表达的原理，以T7启动子(Promoter)进行反股RNA(Antisense RNA，简写为aRNA)合成，过程中加入Amino Allyl UTP(5-(3-aminoallyl)-UTP，简称aa-UTP)，形成AminoAllyl-aRNA(aa-aRNA)，再加入NHS-CyeDye。NHS与Amino Allyl产生化学反应，使aa-aRNA变成CyeDye-aRNA完成标定。
(4)杂交反应：产物纯化后与Phalanx OneArrayTM进行杂交反应，经清洗及讯号侦测后进入分析流程。
(5)影像扫描与数据提取：全基因体基因表达图谱
Figure DEST_PATH_GDA0001180497100000031
芯片可利用市售许多芯片荧光扫描仪进行扫描，我们所提供的微小核酸表达服务所使用的扫描仪为AgilentMicroarray Scanner(G2505C)。藉由适当的荧光强度设定与分辨率(10μm)获得最适化之影像(tiff格式)。利用GenePixTM4进行影像数据撷取，获得初级数据格式gpr档案即完成将影像转成数值，进行后续数据分析。
(6)数据前处理与差异基因表达分析：基因表达谱检测芯片的数据分析是用Rosetta
Figure DEST_PATH_GDA0001180497100000032
System(Rosetta Biosoftware)进行数据前处理(含数据筛选、校正)与统计计算等动作，步骤如下：
a.芯片数据文件产生(GPR file)，芯片以芯片扫描仪进行扫描，再利用GenePix软件套入芯片探针信息文件，将影像转成对应探针的讯号数值文件(GPR file)。此档案包含探针信息、探针讯号值、芯片背景值、讯号判定值(flag)、探针讯号噪声比等数据。
b.探针讯号可信度以Rosetta Resolver软件的error model进行，考虑每一探针观察讯号值与真实讯号的误差，并与negative control比较后，以p-value代表不可信的机率。华联的数据分析文件中之p-value(Detected)代表的就是探针讯号的可信程度，值越大表示越不可信，使用者可以利用此值观察有兴趣的基因之讯号可信度。华联的探针讯号可信度不同以往用讯号强度或是探针讯号噪声比进行，可避免人为任意设定所造成的变异，采用统计的方式来估计探针讯号变异程度，采用之error model模型考虑了背景噪声程度、杂交过程中产生的随机性误差、雷射光激发造成的噪声与探针质量好坏的侦测等等，此模型可谨慎的估计讯号的误差，并且用此值来稳定变异数的估计量，较一般t-test更为严谨。
c.探针筛选以讯号判定值(flag)进行筛选，若该探针在所有芯片讯号中皆无可用之值(也就是说，所有flag都等于-50)则此探针将不纳入后续校正分析。
d.校正(normalization)，针对同一样本技术性重复的数据进行median scaling校正，然后在同一探针重复的数据中取其平均值为该探针的代表讯号，华联的数据分析文件之normalized data中的值即为此运算值，提供使用者了解每一探针的讯号值。
e.任两样本讯号比值计算，将这两样本(含技术性重复)根据上述”探针筛选”的规则先进行探针筛选，接着以此两样本的数据进行median scaling校正。两样本讯号比值计算时，每一探针的pair-wise ratio值皆会被计算并同时以error model考虑其对应的error值后，进行加权平均值的计算，得到每一探针log2(ratio)值与p-value(Differentially expressed)。
f.根据log2(ratio)与p-value(Differentially expressed)的大小可挑选有显着差异表现的探针(预设显着差异表现的条件为|log2(Ratio)|>＝1and P-value(Differentially expressed)<0.05，后续将会视客户提供之实验设计做适当修改)。
(二)结果
关于人肾癌的mRNA芯片聚类分析结果见图1。芯片筛查了多个差异表达基因，其中PDZK1明显在肾癌组织中表达下调且具有生物学和临床意义，鉴于该基因主要在蛋白水平发挥生物学功能，本发明还将通过iTRAQ定量蛋白质组学、Western blot和免疫组化的方法对样品PDZK1的表达进行大规模分批次验证。
实施例二：iTRAQ定量蛋白质组学初步验证PDZK1在肾癌组织中蛋白水平同样显著下调
(一)材料和方法
1.材料
选取mRNA芯片相同的肾癌组织和癌旁组织(18对)，运用iTRAQ定量蛋白质组学的方法对mRNA芯片筛选的差异基因的蛋白表达进行验证。
2.方法
(1)从样品中提取蛋白。
a.称取适量的样品，液氮下研磨成粉末；
b.加入5倍体积的10％TCA丙酮，同时添加终浓度为30mM的DTT，-20℃下沉淀两小时；
c.冷丙酮清洗三次，去除丙酮并简单晾干；
d.加入适量蛋白裂解液，同时添加终浓度为10％的cocktail蛋白酶抑制剂，终浓度为10mM的DTT，2mM的EDTA；
e.冰上超声3min，20,000g离心10min，取上清；
f.上清液在56℃条件下加入终浓度10mM DTT处理1小时，还原打开二硫键；
g.再加入终浓度55mM IAM暗室静置45分钟，进行半胱氨酸的烷基化封闭；
h.加入适量冷丙酮，在-20℃静置2h；
i.20,000g离心10分钟，弃上清液；
j.沉淀在适量体积的0.25M TEAB中超声溶解3分钟；
k.20,000g离心15min后取上清液，使用GE healthcare的2D-Quant Kit定量试剂盒进行蛋白质定量。
(2)蛋白质浓度鉴定。
(3)等体积SDS电泳。
配置12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶，每个样品上样20μg，Marker上样10μg。在80V电压下浓缩25min，之后在120V下分离90min。电泳结束后使用考染液染色2h，再用脱色液反复脱色至条带清晰，每次30min。
(4)不同的蛋白质样品C1、C2、C3、C4、P1、P2、P3和P4,首先分别进行蛋白酶水解。
a.每个样品按照定量结果准确取出150ug蛋白；
b.按照酶：蛋白＝1:50的比例加入胰蛋白酶，37℃酶解过夜；
c.按照酶：蛋白＝1:100的比例再次加入胰蛋白酶，37℃酶解4h；
d.抽干后使用0.1％TFA溶解肽段，除盐，抽干，使用20ul 0.5M TEAB重新溶解。
(5)采用不同的iTRAQ试剂标记对酶解片段进行标记。
a.标记试剂使用80ul ACN溶解；
b.与溶解好的肽段充分混合；
c.在室温下孵育2h，混合后使用反相色谱进行分离。
(6)iTRAQ标记多肽的反相色谱分离。
使用ThermoExtend C18(5μm，4.6*250mm)反相色谱柱对标记后的多肽进行液相分离。标记、混合后的样品抽干并使用bufferA复溶(10mM NH4COOH,2％ACN,pH10)。色谱总流速为1ml/min，梯度中逐步提高bufferB(10mM NH4COOH,90％ACN,pH10)的比例以使多肽依次被洗脱下来：5min内bufferB由5％上升到8％，紧跟着在35min内上升到18％，再在20min内上升到35％；使用2min使bufferB快速上升到95％，保持4min后再平衡到5％。收集洗脱液后按需求合并组分并抽干待用。
(7)基于QE的液质联用分析。
a.将抽干的组分用buffer A(5％ACN,0.1％FA)复溶。每个组分上样约4μg蛋白，通过Thermofisher的Easy-nLC 1000型号纳升液相色谱仪进行分离。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱两部分。分离程序如下：先以20μl/min的流速将样品loading到Trap柱上，然后以一个总流速为300nl/min的分析梯度将样品带入分析柱，分离并传输至质谱系统。先由一个28min的线性梯度使buffer B(95％ACN,0.1％FA)的比例由5％上升至25％，然后在6min内上升到45％，在接下来的2min内提高到80％并保持4min。
b.经过液相分离的肽段进入到串联ESI质谱仪：Q-EXACTIVE(ThermoFisherScientific,San Jose,CA)。一级质谱分辨率设置为70000，二级分辨率为17500。在母离子中挑选电荷为2+～5+，峰强度超过30000的20个母离子进行二级分析，用碰撞能量为27(±12％)的HCD模式对肽段进行碎裂，碎片在Orbi中检测，。动态排除时间设定为色谱半峰宽时长。离子源电压设置为1.8kV。AGC通过orbi来实现，其设置为：一级控制强度为3E6二级1E5，扫描的质荷比范围为一级350～1600，二级100-1800。
(8)对质谱仪所得的数据进行生物信息分析，定性和定量研究。
(二)结果
通过iTRAQ定量蛋白质组学分析出174个4期共同显著下调蛋白和38个4期共同显著上调蛋白。通过GO分析筛选出于细胞增殖密切相关的蛋白，并对这些蛋白进行预后分析，其中PDZK1在肾癌中显著下调，且参与细胞增殖过程并与病人预后密切相关(图2)。
实施例三：RT-PCR检测肾癌组织和癌旁组织中PDZK1mRNA的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
Trizol
PBS
氯仿
异丙醇
琼脂糖
ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit
PDZK1引物
β-actin引物
2.方法
2.1肾癌组织RNA的提取与鉴定
(1)取肾透明细胞癌及其癌旁组织标本收入2ml离心管中，置于冰上，用冰浴的PBS洗去残留的血液，每g组织加入1ml Trizol，用组织匀浆机将组织破碎至无明显块状。
(2)震荡混匀，冰浴5min。
(3)加入350μl氯仿，充分振荡混匀，冰浴5min。
(4)4℃12000rpm离心10min，取上清至新的离心管，加入等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。
(5)4℃12000rpm离心10min，弃上清，加入250μl 75％乙醇重悬沉淀。
(6)4℃7500rpm离心5min，弃上清，晾干。
(7)加入30μl DEPC水溶解。
(8)1％的琼脂糖凝胶中电泳。
2.2RT-PCR
(1)逆转录
具体操作按照ProtoScript M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行：
a.取6μl RNA加入2μl d(T)VN(50mΜ)，70℃变性5min，混匀后置于冰上。
b.分别加入M-MuLV Reaction Mix 10μl和M-MuLV Enzyme Mix 2μl(阴性对照用2μl H2O替代M-MuLV Enzyme Mix)，42℃温育1h。
c.80℃灭活5min。加入30μl H2O进行PCR反应。
(2)PCR
a.引物设计
NHERF3引物：
F:5'-CTTCAACCCCCGAGAATGTA-3'
R:5'-CTTTCAAGTCCACCCGTGTT-3'
β-actin引物：
F:GTACCACAGGCATTGTGATGGACT
R:CTTTGATGTCACGCACGATTTCCC
b.PCR步骤
反应体系如下：
成分 体积(μl)
dNTP 2
10×Taq酶buffer 2
5’引物 0.5
3’引物 0.5
cDNA模板 1
去离子水 补至20
梯度PCR仪中反应条件为：94℃，10mn；94℃，30s；58℃，30s；72℃,45s；30个循环；72℃10min；4℃保存。用1％浓度的琼脂糖电泳检测。
(二)结果
应用RT-PCR方法，选取3对肾癌及其癌旁组织的配对标本检测PDZK1mRNA的表达变化。结果显示，3对标本的癌旁组织中PDZK1mRNA均有明显的表达，而肾癌组织中PDZK1mRNA只有很微弱的表达(t＝2.908，P＝0.0438，n＝3)，表明肾癌组织中PDZK1mRNA的表达水平显著降低(图3)。
实施例四：Western Blotting检测肾癌组织和癌旁组织中PDZK1蛋白的表达变化
(一)材料和方法
1.材料
SDS-PAGE凝胶
PVDF膜
脱脂奶粉
一抗PDZK1抗体(abcam，1：1000)、β-actin抗体(abcam，1：1000)
TBST
荧光二抗(1：10000)
Odyssey
2.方法
取50μg总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，蛋白转印至PVDF膜上(100V，80min)，用5％脱脂奶粉室温封闭1h；一抗NHERF3抗体(1：1000)、β-actin抗体(1：1000)分别4℃孵育过夜，TBST洗膜3次；用红外荧光染料标记的二抗(1：10000)室温孵育1h，TBST洗膜3次，Odyssey扫描成像。
(二)结果
8对肾癌及其癌旁组织的配对标本，采用Western Blotting进一步验证PDZK1蛋白的表达变化情况。结果证明8对肾癌组织中PDZK1的表达水平与其相应癌旁组织比较均显著下降(t＝8.665，P＝0.0001，n＝8)，并具有统计学意义(图4)。
实施例五：应用免疫组化技术评估肾癌及癌旁组织中PDZK1蛋白表达强弱
(一)材料和方法
1.材料
PDZK1鼠抗人单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品
2.方法
(1)将组织切片在60℃烤箱中烘烤1h，室温保存备用。
(2)脱蜡及水化：二甲苯I 10min；二甲苯II 10min；100％乙醇I 5min；100％乙醇II 5min；95％乙醇5min；90％乙醇5min；80％乙醇5min；70％乙醇5min；蒸馏水5min。
(3)0.3％过氧化氢溶液避光室温孵育30min，用蒸馏水冲洗3次，每次2min。
(4)抗原修复:枸橼酸盐缓冲液微波修复，15min，室温冷却20～30min至常温，PBS洗3次，每次2min，再用PBST漂洗3次，每次5min。
(5)封闭：5％BSA(PBS配制)室温孵育30min。
(6)一抗4℃冰箱孵育过夜。
(7)用PBS液漂洗3次，每次5min。
(8)生物素化二抗工作液室温孵育30min，用PBS液漂洗3次，每次5min。
(9)DAB显色进行免疫组织化学显色，并在显微镜下进行观察，把握显色时间，一般不超过10min，用去离子水冲洗3次终止显色。
(10)苏木精复染10min，盐酸酒精分化1-2s，去离子水冲洗10-15min。
(11)梯度酒精脱水和二甲苯透明：蒸馏水5min；70％乙醇5min；80％乙醇5min；90％乙醇5min；95％乙醇5min；100％乙醇II 5min；100％乙醇I 5min；二甲苯II 10min；二甲苯I 10min。
(12)封片，显微镜下观察并分析和采图。
(13)对所采图片进行统计学分析。
(二)结果
112例肾癌及19例癌旁组织的标本，通过免疫组化染色观察标本PDZK1蛋白的表达情况，如图5所示，癌旁组织中均可见PDZK1蛋白呈强阳性表达，而肾癌组织中PDZK1蛋白染色接近阴性。且ROC曲线分析结果显示PDZK1蛋白表达量可以显著区分肾癌组织和癌旁组织，表明PDZK1具备作为肾癌诊断标志物的潜力(图5)。
实施例六：应用CCK8实验评估PDZK1对肾癌细胞增殖能力的影响
(一)材料和方法
1.材料
实验所用细胞系为本实验室构建的稳定过表达/敲低PDZK1的786-O和769-P肾癌细胞系。
CCK8试剂盒
96孔板
细胞计数板
2.方法
(1)接种细胞：在每个96孔板边缘标记实验分组及日期，每个实验组6个复孔，每孔加入相应处理的稀释好的细胞悬液200μl，即细胞数为3000个/孔。将96孔板放入培养箱(在37℃，5％CO2的条件下)培养中继续培养。
(2)检测OD值：分别在0、24、48、72、96、120小时后，吸弃96孔板中的培养基，向每孔加入100ul稀释好的CCK-8溶液(用双无培养基10倍稀释CCK8)，将96孔板在培养箱内孵育1小时，用酶标仪测定在450nm处的吸光值。
(3)数据处理：分别记录每个孔的OD值，用GraphPad Prism5软件进行统计分析作图。
(二)结果
CCK8实验表明PDZK1抑制肾癌细胞增殖的功能。如图6A、6C所示，先用westernblot验证成功构建了稳定过表达和敲低PDZK1的肾癌细胞系，再用CCK8实验检测PDZK1对肾癌细胞增殖能力的影响。如图6B、6D所示，稳定过表达PDZK1后细胞增殖能力明显降低，而敲低PDZK1后则促进了肾癌细胞的增殖，表明PDZK1与肾癌的发生密切相关。
实施例七：应用细胞划痕实验评估PDZK1对肾癌细胞迁移能力的影响
(一)材料和方法
1.材料
实验所需的细胞系为本实验室构建的稳定过表达vector和PDZK1的786-O肾癌细胞系。
6孔板
细胞计数板
2.方法
(1)准备6孔板：接种细胞前将6孔板底均匀画5条水平线，3条垂直线，用于标记划痕实验拍照位置。
(2)接种细胞：将3×105个细胞接种于6孔板中，使得细胞在第二天达到100％汇合度。
(3)细胞划痕及拍照：将200μl枪头剪去枪头前端，形成平滑切缘，在每个孔的正中划一条直线，形成细胞划痕。用预热的PBS冲洗细胞两次，洗去漂浮的细胞，更换细胞培养基为含1％胎牛血清的RMPI-1640，并在0点进行拍照。根据板底的网格线标记拍照位置，并在相应时间点再次拍照相同视野。每孔拍照取3个视野。
(4)应用Image Pro Plus软件计算出各视野细胞迁移距离，并进行统计分析。
(5)Western blot验证构建细胞系中PDZK1的表达水平。
(二)结果
细胞划痕实验表明PDZK1具有抑制肾癌细胞迁移的功能。
如图7A所示，0点划痕距离基本一致，24小时后，稳定转染vector组的细胞迁移距离明显变短。而稳定转染PDZK1的细胞迁移距离变短不明显。说明PDZK1具有抑制肾癌细胞786-O迁移的功能。测量细胞划痕的距离后的统计结果见图7B。图7C为肾癌细胞系中PDZK1蛋白表达水平的检测结果。
实施例八：应用裸鼠荷瘤实验在体内评估PDZK1对肾癌细胞增殖能力的影响
(一)材料和方法
1.材料
实验所用细胞系为本实验室构建的稳定过表达ACHN肾癌细胞系。
24只裸鼠
游标卡尺
电子天平
2.方法
选4-6周龄的雌性BALB/c裸鼠饲养在屏障环境中，并将24只裸鼠随机分为两组，取对数生长期的过表达PDZK1的ACHN细胞和对照组细胞分别接种于裸鼠皮下，每只小鼠注射(1×107个/只)，待成瘤至肉眼可观察时，每天监测裸鼠体重及瘤体积，按公式V＝0.5×a×b(V代表瘤体积，a为长径，b为短径)绘制瘤体增长曲线并比较差别。接种后第8周颈椎脱位处死小鼠，完整剥离肿瘤，检测肿瘤体积及瘤重，并用IHC方法检测各组PDZK1的表达情况后进行分析比较。
(二)结果
裸鼠荷瘤实验表明PDZK1可抑制肾癌细胞的体内增殖能力。如图8A所示，绘制第2天到第16天瘤体积增长曲线，发现过表达PDZK1后肿瘤生长明显被抑制。图8B展示了处死小鼠后剥离的肿瘤大小。图8C、8D分别展示了剥离肿瘤的体积和重量，表明过表达PDZK1组的肿瘤体积和重量都显著下降。图8E是免疫组化结果，过表达PDZK1后恶性程度显著下降。这些实验结果表明PDZK1在体内同样具有抑制肾癌细胞增殖的功能。

Claims (1)

1.一种生物大分子PDZK1蛋白和PDZK1 mRNA在制备肾癌诊断试剂盒的用途；
所述诊断试剂盒使用方法包括以下步骤：
（1）提取组织RNA；
（2）RT-PCR和Q-PCR检测肾癌组织中PDZK1的mRNA表达水平，并与癌旁或正常组织中相比较；
（3）WB和IHC检测肾癌组织中PDZK1的蛋白表达水平，并与癌旁或正常组织中相比较；
在肾癌组织中，PDZK1的mRNA和蛋白水平异常低表达；
所述PDZK1抑制肾癌细胞增殖和迁移。
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