JP4660776B2

JP4660776B2 - 腫瘍マーカー及びそれを用いた診断キット

Info

Publication number: JP4660776B2
Application number: JP2007507226A
Authority: JP
Inventors: 英昭島田; 毅朝長; 孝典西森; 一之松下; 武徳落合; 文夫野村; 英俊車; 和将松本
Original assignee: 国立大学法人千葉大学
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-13
Publication date: 2011-03-30
Anticipated expiration: 2026-03-13
Also published as: WO2006095905A1; JPWO2006095905A1

Description

本発明は、癌などの検出に役立つ腫瘍マーカー及びそれを用いた診断キットに関し、更にはそれを用いる方法に関する。

癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。食道、肺、子宮頸癌、泌尿器（腎臓、尿管、膀胱）などに発生した癌は自覚症状が少なく、発見時には病状が進行している危険性が高いためより早期発見がより重要である。

一方、悪性腫瘍の簡便かつ確実な早期診断を可能とする方法として、癌組織特異的タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験体への負担も少ないため、自覚症状のない多くの被験体に対しても広範囲に実施することが可能である。例えば、下記特許文献１には糖タンパク質３９の腫瘍マーカーとしての利用が開示されている。

特開平７−５１０６５号公報国際公開第２００４／０１８６７９号パンフレット

しかしながら、上記特許文献１に記載の技術は胃癌に関する技術であって、食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍についてまで適用できるものではない。また特許文献２に記載の技術も大腸癌に関する技術であって、食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍についてまで適用できるものではない。

以上、本発明は、食道癌の検出を行うための検出マーカー及び診断キットを提供することを目的とする。

本発明は、細胞間接着で重要な役割を果たすタンパク質ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎについて検討を行っていたところ、このタンパク質の発現が食道癌組織において低下していることをプロテオーム解析、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学染色法によって確認できたことに由来してなされたものである。

即ち、本発明に係る食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーは、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎを用いたものであること、又は、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いたものとする。

また、本発明に係る食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍の診断キットは、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有することとする。

また、本発明に係る方法としては、採取した二つの細胞に対しｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現量並びにそのタンパク質の細胞内局在を求めるステップ、その求めた発現量および細胞内局在の比を算出するステップ、を有することとする。またこの場合において、たんぱく質の発現量および細胞内局在を求めるステップは、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学染色法を用いてなること、採取した二つの細胞のうち一つは非癌部組織における細胞であることが望ましい。

以上、本発明は、食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカー及びそれを用いた診断キットを提供することができるようになる。

以下本発明の実施形態について説明する。本発明の実施形態としては食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍のマーカー、診断キット、タンパク質の発現を調べる方法が挙げられる。

まず、本発明の一態様としては、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎを食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍の検出マーカーとすることが挙げられる。これは後の実施例で明らかとなるように、タンパク質ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現が食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍組織において低下していることを本発明者らのプロテオーム解析、ウエスタンブロットおよび免疫組織化学染色法によって確認できたことを受けたものであって、患者の血液、尿、喀痰、擦過細胞診などにより細胞等を採取し、その仲におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現を調べ、これが減少している場合、食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍の可能性があると判定することができるものである。またｐｅｒｉｐｌａｋｉｎに対する抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いてこれを検出マーカーとして用いる態様も考えられる。もちろん、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体をプレートなどの担体に固定して診断キットとする態様も考えられる。なおこの検出マーカーの場合、一方の細胞を非癌部の健康な血液、尿、喀痰、擦過細胞診等から採取し、もう一方の細胞を癌部の疑いがある組織あるいは癌細胞が含まれる血液や尿、喀痰、擦過細胞診などにより採取して比較を行うことで、その細胞を採取した対象の者が食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍に罹患してしまっているか否かについての判断をより確実とすることも有用である。

また、本発明の一態様として患者より取り出した血液や尿、喀痰、擦過細胞診などによりに対してｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現を調べる方法とすることも挙げられる。またこの際、抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用い、血液、尿、喀痰、擦過細胞診などにより採取された細胞等に含まれるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎタンパク質の発現を調べることも有用である。特に、一方の細胞を非癌部の健康な血液、尿、喀痰、擦過細胞診などや採取した細胞や非癌部組織から採取し、もう一方の細胞を癌部の疑いがある組織あるいは癌細胞が含まれる血液や尿、喀痰、擦過細胞診などから採取することで、その細胞を採取した対象の者が食道、肺、子宮頸癌、泌尿器系悪性腫瘍に罹患してしまっているか否かについて判断をすることができるようになる。

（実験例）
上記実施形態について効果の立証するため以下の実験を行った。以下図面を用いて説明する。

（組織試料の調整）
組織試料は、組織試料採取前にいかなる抗癌補助療法も受けていない１２症例の胸部食道癌患者それぞれから癌部組織及び非癌部組織を採取することによって得た。ここで癌部組織とは、食道癌病変部であって肉眼的に変性の無い部位における組織であって、非癌部組織とはこの食道癌病変部から５ｃｍ以上離れ、ルゴール試薬にて染色される部位における組織である。なお組織試料は、採取後１時間以内に液体窒素にて急速冷凍し、−８０℃フリーザーを用いて凍結保存した。

（タンパク質の抽出）
−８０℃で冷凍した組織試料を液体窒素下で更に冷却し、凍結状態で物理的粉砕を行った後、約５００μｌの溶解バッファーとともにＰｏｌｙｔｒｏｎホモジェナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｋａ、Ｌｉｔｔａｕ−Ｌｕｚｅｒｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に加え、約３０秒間溶解し、超高速遠心機（１００，０００×ｇ）を用いて４℃で１時間遠心分離し上清を回収した（以下この上清を「タンパク質溶解液」という。）。なお溶解バッファーは、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．５、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％（ｗ／ｖ）３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（ＣＨＡＰＳ））、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた。

（蛍光色素（ＣｙＤｙｅ）標識）
蛋白質の蛍光色素標識はＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のプロトコール（２Ｄ−ＤＩＧＥ）に従った。上記の処理にて得たタンパク質溶解液５０μｇ相当に対し蛍光色素４００ｐｍｏｌを混合し３０分氷温遮光下にて静置し、ｌｙｓｉｎｅ１０ｎｍｏｌにて反応を中断したあと等量の２×サンプルバッファを加えた。なお、２×サンプルバッファとしては７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、２％Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）、２％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ^ＴＭＢｂｒｏａｄｒａｎｇｅｐＨ３−１０）を用いた。また、採取した組織試料が癌部組織から採取したものである場合は蛍光色素Ｃｙ５を、非癌部組織から採取したものである場合は蛍光色素Ｃｙ３を用いて標識した。

標識完了後、それぞれの症例毎の組み合わせで癌部蛋白・非癌部蛋白の上記タンパク質溶液を混合し、二次元電気泳動を行った。なお全組織試料（全症例の癌部組織および非癌部組織から採取した２４個）の等量の蛋白質を混合し、５０μｇに分注した蛋白溶解液を蛍光色素Ｃｙ２にて標識し、内部標準蛋白溶解液として後の解析の標準化に用いた。

（アガロース２Ｄ−ＤＩＧＥと２−ＤＥ）
アガロースゲルを用いた電気泳動の詳細は北里大学の大石らの論文（Oh-Ishi M, Satoh M, Maeda T. Preparative two-dimensional gel
electrophoresis with agarose gels in the first
dimension for high molecular mass proteins. Electrophoresis 2000;21:1653-69.）に記載されている方法に従って行った。一次元目用アガロースゲル（アガロースＩＥＦゲル）の作成も同じ論文に記載されている。各色素で標識された蛋白溶解液混合液（計１５０μｇ
をアガロースＩＥＦゲルに添加し一次元目の等電点電気泳動は４℃にて１２０００Ｖｈｒ（８００Ｖ×１５ｈ）行い、引き続いて１０％トリクロロ酢酸＋５％スルホン酸による固定４５分、蒸留水による洗浄４５分を室温で行った。

その後アガロースＩＥＦゲルを６〜１０％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルの上部にセットし、泳動槽（日本エイドー社製）及びガラス板を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った。

泳動終了後、ガラス板に装着したままゲルを蛍光イメージスキャナーＴｙｐｈｏｏｎ９４００^ＴＭ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて取り込み、解析ソフトＤｅＣｙｄｅｒ^ＴＭ
（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にて解析した。

またこれとは別に、蛍光色素で標識していない上記のタンパク質溶解（癌および非癌部）５００μｇを同様のアガロースゲル二次元電気泳動を行い、電気泳動後３０％メタノール＋１０％酢酸溶液で固定した後クマシーブルーにて染色し、スポットを切り出し質量分析に用いた。スポットの切り出しに当たって画像解析した蛍光ゲルイメージと比較し参照する方法で行った。

（ゲル内タンパク質消化）
二次元ポリアクリルアミドゲル上のクマシーブルーにて認識されたスポットを用手的に切り抜き、１ｍｍ角程度の大きさにした上でゲル内トリプシン消化を行った。まず５０％アセトニトリル／５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム溶液で脱色し、超純水で洗浄した。

次に、１００％アセトニトリルに１５分浸透させた後ＳｐｅｅｄＶａｃ真空乾燥器（和研薬、京都、Ｊａｐａｎ）を４５分間使用し、脱水乾燥した。ゲル片は２５ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９）／２０％アセトニトリル＋２５ｎｇ／μｌトリプシン
（Ｔｒｙｐｓｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｇｒａｄｅ、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）溶液１０〜３０μｌに４５分間浸透（氷温）した。未吸収のトリプシン溶液を取り除いた後５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ９）／２０％アセトニトリル溶液を１０〜２０μｌ加え３７℃で２０時間ミキシングした。その後溶液を回収し、残ったゲルに５％ギ酸／５０％アセトニトリルを１０〜３０μｌ加え２０分間室温で撹拌、ゲル内に残っているペプチド分解物を回収、先に回収した溶液と混合した。

（タンパク質の質量分析）
二次元電気泳動ゲルから用手的に抽出されたペプチド分解溶液は、直径２．１ｍｍ長さ３０ｍｍの逆相Ｃ８カラム（ＡｑｕａｐｏｒｅＲＰ−３００
カラム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ））が取り付けられたＨＰＬＣ装置（ＮａｎｏｓｐａｃｅＳＩ−２、ＳｈｉｓｅｉｄｏＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）によって取り込み、更に液体クロマトグラフィにより質量分析計に取り込んだ。ＨＰＬＣの流速は２００μｌ／分で、バッファーＡに０．０５％ギ酸、バッファーＢに９０％アセトニトリル＋０．０５％ギ酸を用いた。ＨＰＬＣではバッファーＡで５分洗浄しその後バッファーＢの０〜６０％直線濃度勾配を３〜３０分の間に行い液体クロマトグラフィ装置に続いて金属針装着エレクトロスプレイイオン化装置ＡＰ１２でイオン化しイオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、にて質量分析およびタンデムＭＳ測定を行った。質量分析データはデータ解析ソフトＳＥＱＵＥＳＴ（ＴｈｅｒｍｏＱｕｅｓｔ）にて解析、蛋白質を同定した。

（ウエスタンブロット）
ヤギポリクローナル抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎはＳａｎｔａＣｒｕｚ社（ＣＡ）製の市販品を用いた。各組織よりの蛋白溶液１５μｇ相当を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、Ｕｎｉｔｅｄ
Ｓｔａｔｅｓ）製泳動装置を用い１０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行いＢｉｏ−ｒａｄ社タンク型転写装置を使いＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）製ＰＶＤＦ膜に転写、ウエスタンブロットを行った。ＰＶＤＦ膜は５％スキムミルク／ＰＢＳ１時間でブロックし、５００倍希釈の抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体／ブロッキング液１時間で一次抗体反応を行った。５００倍希釈ＨＲＰ標識ウサギ−抗ヤギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ，Ｗｅｓｔ
Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）／ブロッキング液にて二次抗体反応を行いＥＣＬ^ＴＭ検出試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて検出した。同様の方法でＳａｎｔａ
Ｃｒｕｚ社（ＣＡ）製ヤギポリクローナル抗βａｃｔｉｎ（５００倍希釈）を用いβａｃｔｉｎを検出し、これを標準化に用いた。ＮＩＨＩｍａｇｅソフトウエアを用い信号強度を測定しｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ発現量の比較検定をｐａｉｒｅｄ
ｔ−ｔｅｓｔにて行った。

（免疫組織化学染色）
２Ｄ−ＤＩＧＥに用いた症例とは別に当施設での食道癌手術症例３０例の凍結組織標本より４μｍ厚の薄切切片を作成し、免疫組織化学染色を行った。４℃アセトン１０分にて固定、０．３％Ｈ_２Ｏ_２／メタノール溶液１５分室温にて処理．ＰＢＳにて３回洗浄の後１％ブタ血清／ＰＢＳ
１時間でブロッキング、５０倍希釈（１％ＢＳＡ/ＰＢＳ）抗−ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）３０分間（室温）にて一次抗体反応を行いＰＢＳにて洗浄後ＤＡＫＯＬＳＡＢ＋キット（ＤＡＫＯＪａｐａｎ，京都）
にてマニュアルに従いＤＡＢ発色にて検出した。３０秒間ヘマトキシリンで核染色を行った後１００％エタノールおよびキシレンで脱水透徹、マリノールとカバーグラスで封入し、観察した。

（結果）
多重蛍光標識二次元電気泳動法（２Ｄ−ＤＩＧＥ）の合成画像を図１に示す。食道癌部から採取された蛋白質は赤色で非癌部粘膜から採取された蛋白は緑色で表示されている。従って癌部非癌部で変化のないものは白色ないしは黄色を呈する。別々の１２例分のゲルを合わせての蛋白発現の検出および標準化，発現量変化の検定には，２Ｄ−ＤＩＧＥシステム専用に開発されたＤｅＣｙｄｅｒ^TM（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた（結果は図１参照）。１６３の蛋白スポットで癌部での発現増加を、２４５の蛋白スポットで癌部での発現減少を認めた。発現量の変化を蛍光イメージから肉眼的に確認出来たスポットを７４スポット選んだ。蛋白同定を行うため５００μｇの蛋白抽出液をアガロース２Ｄ法で泳動しクマシーブルーで染色したゲルからスポットを切りだし（結果は図2参照）、７４個の蛋白スポットから５１スポット（３３蛋白質）を質量分析により同定した（表１）。

ｅｎｏｌａｓｅ１，Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ，ＡｎｎｅｘｉｎＡ８，Ａｎｎｅｘｉｎ１，ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ７０，ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ，ｖｉｍｅｎｔｉｎ
等食道癌で報告のある蛋白質やｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ，ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ，ｃａｌｄｅｓｍｏｎ１，ｃａｌｐｏｎｉｎ１，Ａｎｎｅｘｉｎ６，ｖｉｎｃｕｌｉｎ，ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ−ｐｒｏｌｉｎｅ，Ａｌｄｏｌａｓｅ
Ａ，ｌｕｍｉｃａｎ，Dｅｓｍｉｎ，ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅｋｉｎａｓｅ１，ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ
ｎｕｃｌｅａｒｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎＡ２等他の悪性新生物での報告がある蛋白が同定され、我々が大腸癌で確立したアガロース２ＤＥ法に矛盾しない結果が得られた。

これら同定された蛋白質の中で，我々はこれまでに悪性腫瘍との関連の報告がない蛋白質について注目し検討することとした。まず，ウエスタンブロットを用いアガロース２Ｄ−ＤＩＧＥで発現変化を認めた蛋白質数種類について検討した。これらの中でｐｅｒｉｐｌａｋｉｎは、癌部と非癌部においての発現変化が最もはっきりしていた
（図３参照）。ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎはｐｌａｋｉｎ族に属するタンパク質であり、重層扁平上皮で表層に分化した角化細胞の細胞膜表面に発現する蛋白として見つかった。また増殖型類天疱瘡ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎに対する自己抗体の産生が分かっており、抗原であるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎとの抗原抗体反応が発症に関わっていることが分かりつつある。

免疫組織化学染色では発現量の変化だけでなく細胞内の局在の変化も観察された。手術標本切片より抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を用いた免疫組織化学染色を示す（図４参照）。非癌部粘膜においてはｐｅｒｉｐｌａｋｉｎは主に角化細胞の細胞膜に発現しているが（図４（Ａ））、対照的に癌部ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎは発現していない（図４（Ｅ）、（Ｆ））。特に表層型の早期癌の症例ではその発現により癌部と非癌部の境界が明瞭に認識できた
（図４（Ｅ）、特に図中の▲参照）。９例の癌部においてはｐｅｒｉｐｌａｋｉｎが若干発現しているのが確認されたが、これらの症例ではｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現は細胞質内であり、局在が変化していた（図４（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ））。

（考察）
以上の結果により、デスモソーム関連の１９５ｋＤａのタンパク質であるｐｅｒｐｌａｋｉｎが食道癌において発現の低下を示すことがプロテオーム解析によって示された。なお我々が用いるアガロース２ＤＥ法の最大の特徴は一般的に用いられる固相化ゲル法に比べはるかに多量の蛋白質が分離できるという特徴を持つ。最初に添加できる蛋白質が多ければ固相化ゲルでは銀染色などの方法でないと検出できない存在比率が少ない蛋白質もクマシーブルーにて検出可能となる。質量分析に用いるペプチドの量が増えるので，蛋白同定に非常に有利となる。加えて，固相化ゲルでは分子量１５０ｋＤａ以上の高分子蛋白の分離が困難であるが、アガロース２ＤＥ法で高分子蛋白の分離も可能である。このような特徴のあるアガロース２ＤＥ法に多重蛍光染色法（２Ｄ−ＤＩＧＥ）を加えることにより、発現量解析の信頼性を増すとともに多数のゲル間の比較を自動化により可能とした。

ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎはまず皮膚重層扁平上皮の角化細胞の細胞膜で見つかった。多くの組織のＲＮＡ解析により，皮膚重層扁平上皮だけでなく食道粘膜や他の上皮でも発現していることが確認された。ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ
は他のｐｌａｋｉｎ族蛋白と協同して角化細胞同士の結合や角化細胞の分化・角質形成に役割をなしている。食道扁平上皮癌において、ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現減少は癌化や癌の浸潤・転移に何らかの役割をなしている可能性がある。プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ）はアポトーシス（細胞死）の導に関わるＦｏｒｋｈｅａｄ蛋白質活性を抑制的に調節していることが解っているが、最近の文献でｐｅｒｉｐｌａｋｉｎがプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ／ｃ−Ａｋｔ）と結合し、プロテインキナーゼＢの細胞内局在を制御していることが示された（ｖａｎ
ｄｅｎＨｅｕｖｅｌ, Ａ.Ｐ. ＪＣｅｌｌＳｃｉ, ２００２）。すなわち，仮説ではあるが，ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎが正常に発現することによりプロテインキナーゼＢが
ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎに結合することによりＦｏｒｋｈｅａｄ蛋白質活性の抑制が起きなくなり（つまり活性化され）、このためアポトーシスの誘導が起きる。癌化状態におけるｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現異常は、プロテインキナーゼＢが補足されなくなるためＦｏｒｋｈｅａｄ蛋白質の抑制を生じることとなる。Fｏｒｋｈｅａｄ蛋白質の抑制はアポトーシス誘導の抑制（不死化）であり癌化状態を示す。また、ＴｒｋＢ遺伝子の，与していることが示されているがるがnari いる可能性がある．発現が癌細胞の浸潤や着床（転移）に関与していることが示されているが（Ｄｏｕｍａ, S. Nａｔｕｒｅ, ２００４. ），
ＴｒｋＢ蛋白質によりプロテインキナーゼＢが活性化されることから，ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの発現異常は何らかの形で食道癌の浸潤や転移に関与している可能性がある。今後検証及びｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ蛋白質が発現異常を来すメカニズムの解明の必要があるが、食道癌においてｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ蛋白の発現異常は癌化の重要な役割を担っており、食道癌においてｐｅｒｉｐｌａｋｉｎが発現異常を示すことは，新たな知見として重要であると考えられる。

以上により、上記実施形態について効果の確認することができ、食道癌を検出するマーカー及びそれを用いた診断キット等を提供することができるようになる。

多重蛍光標識二次元電気泳動法（２Ｄ−ＤＩＧＥ）の合成画像蛍光色素で標識していない二次元電気泳動法の画像食道癌より抽出した蛋白質に対する抗Periplakin抗体を用いたウエスタンブロットによるPeriplakinの発現量解析の画像食道癌組織における抗Periplakin抗体を用いた免疫組織化学染色によるPeriplakinの発現解析の画像

Claims

ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎを用いる食道悪性腫瘍の検出マーカー。
抗ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎ抗体を含有する食道悪性腫瘍の検出キット。
ｐｅｒｉｐｌａｋｉｎの塩基配列からなるプライマーを用いた食道癌診断キット。