JP5475358B2 - ２次元電気泳動方法 - Google Patents

Description

本発明は２次元電気泳動方法に関する。更に詳しくは本発明は、１次元目電気泳動ゲルのゲル長を比較的短く設定すると共に、２次元目電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度を低くした２次元電気泳動方法に関する。

本発明において「ゲル濃度」とは、直接的には当該ゲルの重合反応時のモノマー濃度を意味するが、重合反応時のモノマー濃度が高い程ゲルの網目構造は密になるので、実質的にはゲルの網目構造の密度を意味する。

従来、細胞抽出物などから蛋白質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した析出、遠心分離などはその一例であるといえる。

また、蛋白質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量篩によるカラムクロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥを例示できる。

近年、少量のサンプルから多様な蛋白質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。

特表２００２−５０３８１３号公報。 この特許文献１は、肝細胞性のガンの診断のために被験者の血清又は血漿について行う２次元電気泳動を開示している。

David R.M.Grahamet al. 「Improvements in two-dimensional gelelectrophoresis by utilizing a low cost "in-house" neutral pH sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis system」 Proteomics 2005,5,2309-2314。 この非特許文献１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２次元電気泳動における「イン−ハウス・システム」と称する一定の改良について開示している。

通常、電気泳動においては、第１に、泳動用ゲルのゲル長と分離能が対応するため、多くのスポットを得る観点から、ゲル長を長く設定している。例えば、上記特許文献１及び非特許文献１では、実施例の１次元目等電点電気泳動においてゲル長を１８ｃｍ以上の長さとしている。又、第２に、２次元目電気泳動ゲルのゲル濃度については、一般的に１２％程度に設定される場合が多いようであるが、このゲル濃度は、１次元目電気泳動ゲルのゲル長との関連においては、必ずしも十分に考慮されていない。

しかし、上記の第１の点に関しては、泳動距離が長くなると分離能が良くなるが、泳動時間も長くなり、一定時間当たりの泳動回数（スループット）が落ちる。加えて、検出されるスポットがブロードしてしまう傾向がある。スポットのブロードは蛋白質等の分離対象物質の検出限界値の上昇という不具合に結びつく。

一方、１次元目電気泳動ゲルのゲル長を単に短く設定した場合、泳動時間が短くなり、一定時間当たりの泳動回数（スループット）が向上し、１次元目電気泳動におけるスポットがよりシャープになるものの、１次元目電気泳動ゲルにおける蛋白質スポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。

従って、１次元目電気泳動ゲルのコンパクトなスポット中に濃縮された蛋白質の２次元目電気泳動ゲルへの移行が相対的に困難になり、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、蛋白質スポットが２次元目電気泳動においてその泳動方向に対する横向きにブロードしてしまうという不具合があった。

そこで本発明は、１次元目電気泳動ゲルのゲル長を比較的短く設定して泳動時間の短縮、１次元目電気泳動のハイスループット化、スポットのブロード抑制等の利点を確保すると共に、それに伴う蛋白質の移行漏れ、２次元目電気泳動における蛋白質スポットの横向きのブロード等の不具合を抑制することを解決すべき課題とする。

（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、１次元目電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が５〜１０ｃｍであって、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を３〜６％とした、２次元電気泳動方法である。

（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明において、２次元目電気泳動ゲルがポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）である、２次元電気泳動方法である。

（第３発明）
上記課題を解決するための本願第３発明の構成は、前記第１発明又は第２発明において、２次元目電気泳動ゲルを用いて行う電気泳動がＳＤＳ−ＰＡＧＥである、２次元電気泳動方法である。

（第４発明）
上記課題を解決するための本願第４発明の構成は、前記第１発明〜第３発明のいずれかにおいて、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が高く設定されている、２次元電気泳動方法である。

（第１発明）
本願発明者は、電気泳動用のゲルが網目構造を持ち、そのゲル濃度がゲルの網目構造の密度を意味することから、第１に、２次元目電気泳動ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が、蛋白質が１次元目電気泳動ゲルより２次元目電気泳動ゲルへ移行する際の関門（バリア）になっていると考えた。第２に、蛋白質の２次元目電気泳動ゲルへの移行は、この関門のバリア性の高さと、移行しようとする蛋白質スポットの相互間隔及びスポット中の蛋白質濃度との相対関係によって規定されると考えた。

即ち、仮に１次元目電気泳動ゲルのゲル長が十分に長い（例えば１８ｃｍ）場合、そのことによる前記の不具合は別にして、２次元目電気泳動ゲルへ移行しようとする蛋白質スポットの相互間隔は十分に大きく、スポット中の蛋白質濃度も十分に低いので、２次元目電気泳動ゲルのゲル濃度が１２％程度と高い（高バリア性である）場合でも、蛋白質の移行には比較的支障を生じないと考えられる。

しかし、１次元目電気泳動における泳動時間の短縮、スポットのブロード抑制等を目的として１次元目電気泳動ゲルのゲル長を短く設定した場合には、蛋白質が上記の高バリア性の関門をスムーズに通過できず、前記した蛋白質の移行漏れ、蛋白質スポットの横向きのブロード等の不具合を生じるのである。

そして、本願発明者の研究によれば、通常の検体において、１次元目電気泳動ゲルの長手方向のゲル長が５〜１０ｃｍである場合、２次元目電気泳動ゲルにおける、少なくとも泳動方向基端部のゲル濃度を３〜６％の範囲の低濃度に設定することにより、この低バリア性の関門を蛋白質がスムーズに通過し、蛋白質の移行漏れ、蛋白質スポットの横向きのブロード等の不具合を抑制できる。

従って、第１発明によれば、１次元目電気泳動ゲルのゲル長を比較的短く設定して泳動時間の短縮、１次元目電気泳動のハイスループット化、スポットのブロード抑制等の利点を確保すると共に、それに伴う蛋白質の移行漏れ、２次元目電気泳動における蛋白質スポットの横向きのブロード等の不具合を抑制することができる。

（第２発明）
本発明で用いる２次元目電気泳動ゲルの種類は、必ずしも限定されないが、ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）を好ましく例示することができる。

（第３発明）
本発明の２次元電気泳動方法において、２次元目電気泳動の種類は必ずしも限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを好ましく例示することができる。

（第４発明）
本発明の２次元電気泳動方法においては、必要に応じて（例えば、２次元目電気泳動における分離能を高くしたい場合等には）、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度を高く設定することにより、対応することができる。

第１実施例及び第１実施例に対する比較例１に係る２次元電気泳動の結果を示す。

第１実施例に係る２次元電気泳動の各ゲルのゲル長と、それらのゲルのｐＨ勾配又はゲル濃度勾配を示す模式図である。

第１実施例に対する比較例１に係る２次元電気泳動の各ゲルのゲル長と、それらのゲルのｐＨ勾配又はゲル濃度勾配を示す模式図である。

第１実施例に対する比較例２に係る２次元電気泳動の結果を示す。

第１実施例に対する比較例２に係る２次元電気泳動の各ゲルのゲル長と、それらのゲルのｐＨ勾配又はゲル濃度勾配を示す模式図である。

次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。

〔１次元目電気泳動〕
本発明の１次元目電気泳動は特に限定されないが、等電点電気泳動を好ましく例示することができる。１次元目に等電点電気泳動を行う場合は、検体中の蛋白質等の分離対象物質が有する等電点を利用して分離を行う。正に荷電した分離対象物質は陰極側に移動し、他方、負に荷電した分離対象物質は陽極側に移動する。そして、等電点（ｐＩ）と等しいｐＨのゲルの位置で分離対象物質の正味の電荷がゼロとなり、泳動を止める。よって泳動開始後は荷電状態の化合物が移動するので、電流が流れることとなる。

〔１次元目電気泳動ゲル〕
１次元目電気泳動ゲルは特に限定されないが、等電点電気泳動用ゲルを好ましく例示できる。ゲルの種類としては、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。１次元目電気泳動ゲルの形態は、２次元目電気泳動ゲルの検体適用側（泳動方向基端部側）にそなえることができる限りにおいて特に限定されない。棒状、円柱状を好ましい形態として例示することができる。

本発明において「１次元目電気泳動ゲルの長手方向」とは一般的に棒状、円柱状の形状のゲルの軸方向をいい、より本質的には分離対象となる検体の電気泳動の泳動方向を意味する。１次元目電気泳動ゲルの長手方向のゲル長は５〜１０ｃｍが好ましく、５〜８ｃｍが特に好ましい。

１次元目電気泳動が等電点電気泳動である場合は、当該等電点電気泳動ゲルには適宜なｐＨ勾配が設定されることが望ましい。当該ｐＨ勾配は検体の種類や調製方法により、適宜に設定することができる。その設定方法としては、両性担体をゲルに添加し、電場をかけて所望のｐＨ勾配を形成する手法や、種々の等電点の側鎖を持つモノマー誘導体を用いて、ポリマーゲルの作成と同時にｐＨ勾配を固定的に形成する手法（ＩＰＧ法）等が好ましく用いられる。

例えば検体がヒト細胞等の生物細胞の抽出物である場合、１次元目電気泳動は等電点電気泳動とすることが好ましく、当該等電点電気泳動に用いるゲルは、ゲルのｐＨの範囲を３〜１０とし、かつ、ゲルのｐＨ勾配が、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合に「ａ＜ｂ」及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たすものであり、より好ましくは、ゲルの全長を１とした場合に、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるものであり、とりわけ好ましくは、「ａ+ｃ≦ｂ」の関係を満たすものである。

本願発明者は、ヒト細胞等の生物細胞の抽出物から調製した検体は、ｐＨ５〜７に等電点を持つ蛋白質を多数含んでいる場合が多いことを経験的に把握している。前記等電点電気泳動に用いるゲルは、ｐＨ５〜７に等電点を持つ多数の蛋白質を高い分離能で分離することができる。その一方で他のｐＨ域に等電点を持つ蛋白質は、ｐＨ５〜７に等電点を持つ蛋白質よりも少ない（分離対象数が少ない）ので、当該他のｐＨ域においては、ゲル中のｐＨ勾配がｐＨ５〜７に比べて急であっても十分な分離能を発揮することができる。各ｐＨ域において必要な分離能を持たせることで、ゲル長を抑えることができる。その一方で分離対象蛋白質の泳動距離は減少するので、高スループットが実現できる。また、前記他のｐＨ域においてはｐＨ勾配が急であるので、分離対象蛋白質は高濃度スポットとなる。よって、当該他のｐＨ域に等電点を持つ分離対象蛋白質の検出限界値を低くすることができる。

〔等電点電気泳動方法〕
１次元目電気泳動が等電点電気泳動である場合において、泳動に用いられる機器は特に限定されない。しかし、小型装置・高分解能・高スループットを実現するためには、ゲル長５〜１０ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が好ましい。

１次元目電気泳動のプロトコルは特に限定されない。しかし、高分解能、高スループットを実現するためには、電気泳動のプロトコルにも留意する必要がある。１次元目電気泳動が等電点電気泳動である場合、検体溶液を調製する段階において、分離・精製の対象とならない荷電性の物質である粗雑物はできるだけ除くことが好ましい。例えば、分離・精製の対象が蛋白質である場合は、リン脂質、ゲノムＤＮＡやＲＮＡを含む核酸、脂肪酸、金属イオン、抽出用の界面活性剤等が粗雑物に含まれる。しかし、検体中に当該粗雑物が少量残存することがあるので、等電点電気泳動において機器に大きな負荷を与えることなく除くことが好ましい。粗雑物はゲル中の移動速度が速い。よって、等電点電気泳動のプロトコルの早い段階に、検体を含むゲル１本につき比較的弱い電圧である１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始め、当該電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内とすることが好ましい。仮に、等電点電気泳動のプロトコルの早い段階に高い電圧を使用すると、粗雑物が急速に電極側に移動し、強い電流が流れることになるので機器に負荷がかかるとともに、蛋白質ごとの分離が悪くなる（ゲル中のスポットの詰まりが生じる）おそれがある。また、分離対象物質の等電点がずれないように、電気泳動中はゲルの温度を一定に保つことが好ましい。

上記の実施形態により、以下の効果を期待できる。即ち、電圧上昇工程の前に１００Ｖ〜６００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行うことで、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させる。このことにより、機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができる。又、単位時間当たりの電流変化の測定により粗雑物の除去を判断できるので、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程となることもない。更に、最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができ、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。

電圧上昇工程における電圧上昇の態様は特に限定されないが、電圧の上昇を徐々に行うことが好ましい。具体的には、電気泳動装置の電流値の上限をゲル１本につき４０〜８０μＡの範囲内の値に設定する。そして、ゲル温度が一定に保たれるようにして、最終電圧まで電圧を上昇させることが好ましい。

〔２次元目電気泳動〕
本発明の２次元目電気泳動は特に限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを好ましく例示することができる。当該ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、検体に界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、検体に含まれる蛋白質の高次構造を解くと共に、蛋白質のアミノ酸残基の荷電もＳＤＳによって相対的に減少させたもとで、分子篩効果を利用して電気泳動を行うものである。

〔２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
２次元目電気泳動ゲルは特に限定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルを好ましく例示できる。ゲルの種類は特に限定されないが、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。この場合、ゲル濃度はアクリルアミド濃度を示すこととなる。

１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスでは、接着用（封入用）アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃である高融点アガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置することが好ましい。

上記の実施形態によって、２次元目電気泳動中に発生する熱により接着用アガロースのゲル化が弱くなる（ゲルがゆるくなる）ことが防止される。従って、そのような不具合に起因する２次元目電気泳動での検出スポットの広がり、検出限界の上昇、検出蛋白質の減少等の不具合を抑制できる。又、接着用アガロースの先入れにより、高融点アガロースが２次元目電気泳動用ゲルと接触して迅速に冷却されるため、ＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えていた場合でも、その熱分解が起こりにくい。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う機器は特に限定されない。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うＰＡＧ（ポリアクリルアミドゲル）に関し、アクリルアミドと架橋剤の総濃度（Ｔ％）は３〜２０であることが好ましい。また、アクリルアミドと架橋剤の総重量中で架橋剤が占める割合（Ｃ％）は０．０５〜２．０であることが好ましい。

〔２次元目電気泳動用ゲル基端部のゲル濃度〕
１次元目電気泳動用ゲルのゲル長が短く設定されているので、２次元目として行うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、その電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％程度の低濃度であることが好ましい。

上記の実施形態によれば、次の効果を期待できる。即ち、１次元目等電点電気泳動用ゲルのゲル長を、例えば５〜１０ｃｍ程度と短くすると、１次元目の電気泳動時間を短縮してハイスループット化等が可能となる一方、蛋白質のスポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。これに対して２次元目電気泳動用ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度が高い（ゲルの網目が密である）と、スポット中に濃縮された蛋白質の２次元目電気泳動用ゲルへの移行に対して高いバリア性を示し、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、スポットが泳動方向に対して横向きにブロードしてしまう。上記の実施形態により、このような不具合が抑制される。

２次元目電気泳動ゲルの泳動方向へのゲル濃度の変化については特に限定されないが、スポットのブロード抑制、検体の検出限界値を下げるという観点からは、検体の泳動方向に向かってゲルの濃度が連続して直線的に増加することが好ましい。泳動方向先端側の部分のゲル濃度が１０〜２０％の範囲内、特に１０〜１５％の範囲内であることが好ましい。

例えばポリアクリルアミドゲルにおいては、濃度勾配ゲルは２種類の濃度のアクリルアミド溶液を混合し、アクリルアミド濃度の勾配をつけて作成することができる。ゲル濃度変化を設けないゲルで行った２次元目電気泳動では検出されなかったが、ゲル濃度勾配を設けたゲルで行った２次元目電気泳動において新たにスポットが検出された場合、２次元電気泳動において当該新たに検出されたスポットについての検出限界値が低くなったことを意味する。

〔検体の調製〕
本発明である２次元電気泳動方法に適用される検体は特に限定されないが、動物、植物、微生物由来の抽出物や、化学、生化学的に合成された化合物、蛋白質、核酸等を含む種々の検体が適用できる。検体が生物細胞、特に動物細胞、とりわけヒト細胞の抽出物であることが好ましい。

上記したゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。

泳動用ゲル中においては分子量により泳動の速度が異なるが、ナトリウムイオン等分子量の小さい物質は篩にかからないので素早くゲル中を移動する。また、ゲノムＤＮＡは分子量が大きいが、大きく負に荷電しているため、陽極に素早く移動する。検体の調製においては、機器への負荷を軽減し、定電圧工程を短くし、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するため、分離・精製の対象とならない粗雑物を除くことが好ましい。そのために、透析、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、親水−疎水相互作用を利用した分画等、種々の前処理を適用することができる。蛋白質が分離・精製の対象となる場合は、酸による沈殿及び有機溶媒による沈殿を好ましく例示できる。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）による沈殿及びアセトンによる沈殿を更に好ましい手法として例示できる。

分離・精製に供される検体は、等電点電気泳動に使用するゲルの膨潤用の緩衝液に溶解して膨潤用検体溶液とし、ゲルの膨潤とともにゲル中に検体を取り込ませることができる。また、検体を適当な溶液に溶解し、膨潤後のゲルに適用することもできる。

このような等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成においては、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルにオイルを流し込むことが行われるが、その際、従来のようにゲル表面に油性成分を流し込むのではなく、ゲルの長手方向の側端部から、とりわけゲルの長手方向の両側の側端部から同時に、油性成分を流し込むという方法が特に好ましい。油性成分としては、シリコンオイル又はミネラルオイル、とりわけ前者が好ましい。

上記の実施形態により、油性成分はゲルの側端部から中央部に向かって広がりゲルを覆う。油性成分がゲルを覆った状態でしばらく放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。その際、ゲルの側端部から中央部に向かって広がる油性成分によって膨潤用検体溶液がはじかれるため、膨潤用検体溶液のゲルへの染み込みが促進され、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了する。従来のようにゲル表面に油性成分を流し込んだ場合、油性成分がゲルから広がるので、その流れに押されてはじかれた、染み込みきれていない膨潤用検体溶液の一部がゲルから拡散してしまい、検出できる蛋白質等の減少及びゲルの膨潤不足につながっていたと考えられるが、上記の実施形態によれば、このような検体成分の脱落を生じない。

２次元目電気泳動に移行する前に、１次元目電気泳動を終えた１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動に用いる移動相等で平衡化する。平衡化の後、アガロースなどのゲル支持材を用いて１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動ゲルの検体適用側に密着させる。その後、２次元目電気泳動を開始する。

２次元目電気泳動がＳＤＳ−ＰＡＧＥである場合は、分子量篩を利用した電気泳動を行うので、検体の立体構造を解くために１次元目電気泳動ゲルをまず還元剤を含む緩衝液で平衡化することが好ましい。当該還元剤は特に限定されないが、ＤＴＴを好ましく例示することができる。その後、１次元目電気泳動ゲルの２回目の平衡化においては、アルキル化剤を含む緩衝液で平衡化することが好ましい。アルキル化剤は特に限定されないが、Iodoacetamideを好ましく例示することができる。

以下に本発明の実施例と比較例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例、比較例によって限定されない。

〔第１実施例〕
(蛋白質の抽出)
ヒトケラチノサイトからなる再構成３次元培養皮膚（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製の商品名LabCyte EPI-MODEL 12）の培養物１枚（約１ｃｍ^２）を、蛋白質抽出液であるmammalian cell lysis
kit；MCL1（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）５００μｌに浸漬し、４℃で２時間、ｖｏｌｔｅｘを使用して振とう破砕した。この振とう破砕の後、蛋白質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ） Deoxycholic acid sodium salt
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol）
適量のProtease Inhibitor
その後、2D-CleanUPキット〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製〕を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡを加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。回収した当該検体は全量５００μｇであった。

（検体溶液の調製）
得られた検体の一部３０μｇを１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１３０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ
２Ｍ Ｕｒｅａ
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧbuffer；ＧＥ社製
適量のDeStreakReagent；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
（１次元目等電点電気泳動用ゲルの調製）
前記したＩＰＧ法により、本実施例で用いる１次元目の等電点電気泳動用ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を調製した。このゲルは長さが７ｃｍで径が０．３ｃｍの棒状ゲルであり、Ｔ=４％、Ｃ＝３％であって、ｐＨの範囲を３〜１０に設定した。

（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
上記の１次元目等電点電気泳動用ゲルを前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌに浸漬した後、シリコンオイルを流し込み、シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。その後、当該シリコンオイルは廃棄した。

（一次元目の等電点電気泳動）
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphor とCup Loading Manifold Light Kitを使用した。

検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、電極はゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態でセットした。その後、ゲル及び濾紙の全体をシリコンオイルで浸漬した。

等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）定電圧工程として３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで泳動を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流量の変化が５μＡ以内であった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまでとし、１次元目の等電点電気泳動を行った。

（等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化）
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） Iodoacetamide
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本実施例においては、電気泳動機器としてInvitrogen社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはInvitrogen社製NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels（検体適用方向のゲル長は８ｃｍ、泳動方向のゲル長は８ｃｍ）を使用した。
また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
又、本実施例においては上記泳動用緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ｗｅｌｌの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化したゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。

（ゲルの蛍光染色）
SyproRuby（Invitrogen社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。

まず、使用するタッパーを事前に高濃度のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄したタッパーにおき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｃｃのSyproRuby（Invitrogen社製）に浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SyproRubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。

（解析）
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１（ａ）に示す。左端はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用されたマーカーである。

〔第２実施例〕
第２実施例では、２Ｄ−ＤＩＧＥを行った。第２実施例においては、第１実施例に記載した手順の内、「（検体溶液の調製）」の項の手順を下記「（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）」の項の手順に変更し、又、「（ゲルの蛍光染色）」のプロセスを省略した以外は、第１実施例と同様の手順の操作を行った。

（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）
得られた検体の全量を下記の組成の溶液１００μｌに溶解した。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
２Ｍ ThioUrea
７Ｍ Urea
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ
溶解したサンプル２０μｇに対しCydye（ＧＥ社製）１６０ｐｍｏｌを添加し、その溶液の入った容器を氷上で３０分間静置した。その後１０ｍＭリジン水溶液を０．５μｌ添加して更に１０分間、容器を氷上で静置した。このような処理を行った後、溶液を等電点電気泳動に適した量である１３０μｌまでDeStreak Rehydration Solutionでメスアップした。メスアップ後充分に攪拌し、氷上で１０分以上静置して、１次元目の等電点電気泳動用の検体溶液とした。

〔第１実施例に対する比較例１〕
本比較例においては、以下の１）〜３）以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。
１）１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）３４０μｌに溶解する検体の総量を２７０μｇとした。
２）１次元目等電点電気泳動用ゲルの長手方向のゲル長を１８ｃｍと泳動距離を長くし、以下のプロトコルで等電点電気泳動を行った。
使用機器；クールホレスター（登録商標）IPG-IEF Type-PX（アナテック株式会社）
電圧プログラムを、（１）定電圧工程として５００Ｖ定電圧で１０００Ｖｈｒまで泳動を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流量の変化が５μＡ以内であった。）、（２）１０７００Ｖｈｒかけて３０００Ｖまで除々に電圧を上昇させ、（３）その後３５００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが４６７００Ｖｈｒになるまでとし、１次元目の等電点電気泳動を行った。なお、本比較例における等電点電気泳動においては電流値の上限は設けていない。
３）２次元目ゲルの検体適用方向のゲル長を２０ｃｍとし、泳動方向のゲル長を２０ｃｍとし、当該泳動方向のアクリルアミド濃度を１２％で固定し、３０ｍＡ定電流で３時間泳動した。
使用機器；クールホレスター（登録商標）SDS-PAGE Dual-200（アナテック株式会社製）。

本比較例における２次元電気泳動の結果を図１（ｂ）に示す。図１（ａ）及び図１（ｂ）において、図中で実線で区切り矢印により対応させた四角形の領域同士が分子量において対応している。図１（ａ）と図１（ｂ）の対比では、比較例である図１（ｂ）に見られるスポットは、実施例である図１（ａ）に比べ、１次元目の泳動方向においても２次元目の泳動方向においても全体的にブロードしている。また、本比較例においては、泳動に供された検体量が２７０μｇで第１実施例の９倍であるが、検出できているスポット数は第１実施例の結果である図１（ａ）に比べ少ない。さらに、本比較例の２次元電気泳動にかかった泳動時間は合計２２時間であり、第１実施例では合計７．５時間であった。よって、第１実施例は高スループット、ブロード抑制及び低検出限界値（蛋白質の移行漏れが極めて少ない）を実現する２次元電気泳動方法であるといえる。

〔第１実施例に対する比較例２〕
本比較例においては、以下の変更点以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。

１）２次元目電気泳動ゲルの泳動方向の濃度勾配
泳動方向基端部のゲル濃度 ： １０％
泳動方向先端側の部分のゲル濃度 ： ２０％
（泳動方向基端部から泳動方向先端側の部分へは直線的な濃度勾配を設けている）
２）解析におけるコントラスト（明暗）を第１実施例に比べて高く設定した。

本比較例における２次元電気泳動の結果を図４に示す。図４の左端はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて使用されたマーカーである。

図４左上部分に示す実線の略円形で囲まれた部分は、図１（ａ）の左上部分と比較してスポットのブロードが顕著である。１０％という高いゲル濃度がバリア作用をすることによって、スポット同士が左右に広がっていることが確認できる。

第１実施例及び本比較例で用いたマーカーの組成は同一であり、用いたマーカーの量も同量である。しかし、本比較例においては第１実施例に比べて解析におけるコントラストを高く設定しているので、ゲルの左端のマーカーの濃さは、図１（ａ）と図４との比較では図４の方が濃く表われている。このようなマーカーの濃さの相違を考慮に入れて比較すると、図４のほうがゲル中のスポットが薄いと判断できる。即ち、本比較例で検出される蛋白質量は第１実施例に比べて少ない。本比較例においては、１０％という高いゲル濃度がバリア作用をすることによって、２次元目電気泳動ゲルへの蛋白質の移行漏れが多いことも確認された。

次に、解析におけるスポットの検出条件を統一した上で、画像解析システムImageMaster 2D Platinum（ＧＥ社製）を使用して検出されたそれぞれのゲル中のスポットの数は、図１（ａ）に示したゲルからは約１５００スポット、図１（ｂ）に示したゲルからは約６００スポット、図４に示したゲルからは約１０００スポットであった。即ち、第１実施例に比べて本比較例においては約５００スポットが検出されていない。その理由として、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部の高バリア性によって、スポットの横向きのブロードが起こったこと(スポット同士が結合してしまった、及び／又は検出限界値を下回るように蛋白質が拡散してしまった)や、蛋白質の移行漏れにより検出限界値よりも蛋白質濃度が低くなっていることが考えられた。

本発明によって、１次元目電気泳動ゲルのゲル長を比較的短く設定して泳動時間の短縮、１次元目電気泳動のハイスループット化、スポットのブロード抑制等の利点を確保すると共に、それに伴う蛋白質の移行漏れ、２次元目電気泳動における蛋白質スポットの横向きのブロード等の不具合を抑制できる。

１，３，５ １次元目等電点電気泳動用ゲル
２，４，６ ２次元目ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲル

Claims (3)

1. ポリアクリルアミドゲルを用いた１次元目電気泳動ゲルとして、その長手方向のゲル長が５〜１０ｃｍであって、ポリアクリルアミドゲルを用いた２次元目電気泳動ゲルの検体適用側にそなえることができる扁平な棒状の形態を備えたものを用い、前記２次元目電気泳動ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度を３〜６％とし、かつ、電気泳動を完了した前記１次元目電気泳動ゲルを前記２次元目電気泳動ゲル上へ設置する際、ゲル化温度が３５〜４０℃である高融点アガロースを流し込んで前記両者のゲルを接着させることを特徴とする２次元電気泳動方法。
2. 前記２次元電気泳動方法において、２次元目電気泳動ゲルを用いて行う電気泳動がＳＤＳ−ＰＡＧＥであることを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動方法。
3. 前記２次元電気泳動方法において、２次元目電気泳動ゲルの泳動方向先端側の部分のゲル濃度が高く設定されていることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の２次元電気泳動方法。