JP2005084047A

JP2005084047A - たんぱく質分離用高速二次元電気泳動システム

Info

Publication number: JP2005084047A
Application number: JP2003354347A
Authority: JP
Inventors: Kinsho Ri; 金祥李; Tamao Kawanishi; 玉緒川西; Tomoya Umemura; 知也梅村; Kinichi Tsunoda; 欣一角田; Ayaka Ogasawara; 絢香小笠原; Takehiko Kitamori; 武彦北森
Original assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Current assignee: Kanagawa Academy of Science and Technology
Priority date: 2003-09-06
Filing date: 2003-09-06
Publication date: 2005-03-31

Abstract

【課題】従来の二次元ゲル電気泳動システムの利点を保持しつつ、前記のとおりの、技術的に熟練が必要で、特に一次元ゲルの取り扱いが難しく、一次元目の電気泳動に２〜１６時間を要し、二次元の分離終了までに場合によっては２日間もの長い時間がかかり、高分子量たんぱく質への適用が困難であって、一次元目から二次元目のゲルへのたんぱく質の輸送効率が低く試料の無駄が多い、などの問題点を解決する新たな二次元ゲル電気泳動システムを実現する。
【解決手段】二次元ゲル電気泳動システムにおける等電点分離系において、ゲルの支持体としてナイロン系糸状体を配設一体化しているたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システムとする。
【選択図】なし

Description

この出願の発明は、たんぱく質分離用の高速二次元電気泳動システムに関するものである。

二次元ゲル電気泳動法は、ポストゲノム研究の中心的課題である細胞内たんぱく質の種類・量・機能などの解析（プロテオー厶解析）のための重要なバイオツールの一つである。この方法は、たんぱく質の分離に関し、非常に優れた分解能を有し、一度に数百種類にも及ぶたんぱく質の分離が可能であって、様々な目的に広く適用可能で、比較的大量の試料処理が可能である、などの他法の追随を許さない優れた特長があり、一応完成された方法と認められている。しかし、次のような重要な問題点も残されている。それは、技術的に熟練が必要で、特に一次元ゲルの取り扱いが難しいこと、一次元目の電気泳動に２〜１６時間を要し、二次元の分離終了までに場合によっては２日間もの長い時間がかかること、高分子量たんぱく質への適用が困難であり、一次元目から二次元目のゲルへのたんぱく質の輸送効率が低く試料の無駄が多いこと、などである。

これらの諸点については、以下に、より詳しく例示説明することができる。

たとえば、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２−ＤＰＡＧＥ）はプロテオームの解析において、その分離能が非常に高いことから、強力な（タンパク質の）分離技術として用いられている。この分離技術は、一次電気泳動として、棒状もしくはストリップゲルで等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行い等電点（ｐＩ）により分離した後に、二次電気泳動としてスラブ（平板）ゲルでＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、分子量（ＭＭ）に従い、タンパク質を分離する。最終的に、分離されたタンパク質は通常はＣＢＢ染色もしくは銀染色により可視化される（非特許文献１−２）。

２−ＤＰＡＧＥは１９７５年に初めて開発され（非特許文献３）、過去２８年間にわたり、特に一次泳動については、多くの手法と機器の改良が行われてきた。これらの改良は簡便化および再現性の向上に貢献してきたが、この技術にはいまだ多くの制約が残されている（非特許文献４−５）。

その大きな制約のひとつは、不溶性（すなわち疎水性）タンパク質の検出能が、１００ｋＤａを超えるような水溶性タンパク質に匹敵するほど低いことが挙げられる。これらのタンパク質はサンプル調製の際に、ＩＥＦゲルにロードする際に、等電点もしくは等電点近傍に凝集する際に、また一次泳動から二次泳動へ移る際に、損失が発生する。この弱点を克服するためにいくつかの方法が用いられている。たとえば、より強力なカオトロープや界面活性剤を使用してＩＥＦ泳動に際して不溶性タンパク質を可溶化させておく（溶解度を増大および維持する）方法、サンプルの調製方法の改良、およびＩＥＦアクリルアミドゲルの（ゲル網目）細孔サイズの拡大する方法、もしくはアクリルアミドゲルの代用としてアガロースゲルを使用する方法が挙げられる。これらの方法のなかでも、ゲル細孔サイズの拡大が単純かつもっとも効果的な方法であると思われる。たとえば、Ｃａｎｄｉａｎｏらによって（非特許文献６）、通常４％Ｔであるアクリルアミド濃度を３．３％Ｔに下げ、単純にゲルマトリックスを薄めて使用することで、２〜３倍強いタンパク質の染色強度を示す２−Ｄマップ（＝二次元電気泳動像）を得られることが報告されている。しかしながら、（アクリルアミド濃度が）３％Ｔ以下になると通常の取扱いが非常に困難となるため、それ以上ゲル濃度を低くするにはいたらなかった。他の例としては、一次泳動でアガロースゲルを用いる方法では、例えば一次泳動にアクリルアミドゲルを用いた場合に２−Ｄマップで検出されないｍｙｏｓｉｎＨ鎖（〜２００ｋＤａ）のような分子量の大きなタンパク質を含むニワトリ骨格筋のほぼすべてのタンパク質が分離されている。しかし、アガロースゲルの場合、ＩＥＦ泳動中に２−Ｄマップの再現性を低下させる電子浸透圧効果（ｅｌｅｃｔｏｒｅｎｄｏｓｍｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔ）による悪影響を受けることがよく知られている。

他の制約（問題点）として、ＩＥＦで特に両性電解質キャリア（ＣＡ）によって形成されたｐＨ勾配を利用している場合に、２−Ｄマップの再現性が悪いことが挙げられる。ＣＡを用いた場合、ｐＨ勾配はカソードに向かう性質（カソードドリフト）とともに中央部で平坦化する性質（プラトー現象）があり、泳動の時間経過とともにｐＨ勾配が不安定化するため、ＩＥＦ平衡に到達することができない。すなわち一次泳動（１−Ｄ）パターンは泳動時間依存性となる。さらにアルカリ性のタンパク質はカソードドリフトによりカソード溶液中に散逸してしまうので、非平衡ｐＨ勾配電気泳動（ｎｏｎ−ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｐＨ−ｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＮＥＰＨＧＥ）によってのみ分離することが可能である。この問題点は１９８２年に導入された不動ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧｓ）により大きく改善された（非特許文献７）。ＩＰＧｓはアクリルアミドのゲルマトリックスに共有結合するＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（イモビリン）とよばれる化合物を用いることで作られており、ゲル中のｐＨ勾配は所望のｐＨ勾配の端値にそれぞれ調製されたＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅでｇｒａｄｉｅｎｔｇｅｌを作成することで形作られる。そのため、ｐＨ勾配はゲル中で固定化される。しかし、ＩＰＧｓの作成は、ＣＡによるｐＨ勾配ゲルの作成にくらべより手が込んで複雑で、より高度なゲル作成装置が必要ある。現在では市販の（プレキャスト）ＩＰＧｓも利用することできるようになったが、ＣＡによるｐＨ勾配ゲルに比較して非常に大きなコストがかかる。

さらに、現在用いられている２−ＤＰＡＧＥはいまだにたくさんの段階で手作業に依存しているため再現性が悪く、この点での問題を抱えている。たとえば、ＩＥＦは通常はガラス管内に充填された一次泳動ゲルで行われることが多いが、一次泳動後はガラス管から機械的にゲルを取り出して二次泳動に供する。このガラス管内の泳動ゲルを押し出す操作において加えられた力により、軸方向にゲルが圧縮される。さらに、この取り出されたゲルは二次泳動に供される前の処理操作中に引き伸ばす力も加えられる。この力によりゲルは引き伸ばされ、さらに破損する場合もある。２−Ｄマップの再現性の保証するためには、ＩＥＦゲル（一次泳動ゲル）を変形または破損させる可能性のあるいかなる力が加えられないことが望ましい。

そして、付け加えるならばゲルの作成、サンプルのロード、電気泳動、染色は非常に手間がかかり、時間がかかる作業である（非特許文献８−９）。
ＲａｂｉｌｌｏｕｄＴ．，Ｅｄ．ＰｒｏｔｅｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ：Ｔｗｏ−ＤｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ；ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ，２０００．Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．，Ｅｄ．２−ＤＰｒｏｔｅｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓＰｒｏｔｏｃｏｌｓ；ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９９．Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．Ｊ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ．１９７５，２５０，４００７−４０２１．Ｏｎｇ，Ｓ．−Ｅ．；Ｐａｎｄｅｙ，Ａ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．２００１，１８，１９５−２０５．Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ，Ｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ２００２，２，３−１０．Ｃａｎｄｉａｎｏ，Ｇ．；Ｍｕｓａｎｔｅ，Ｌ．；Ｂｒｕｓｃｈｉ，Ｍ．；Ｇｈｉｇｇｅｒｉ，Ｇ．Ｍ．；Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｂ．；Ａｎｔｏｎｕｃｃｉ，Ｆ．；Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２００２，２３，２９２−２９７．Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ，Ｂ．；Ｅｋ，Ｋ．；Ｒｉｇｈｅｔｔｉ，Ｐ．Ｇ．；Ｇｉａｎａｚｚａ，Ｅ．；Ｇｏｒｇ，Ａ．；Ｗｅｓｔｅｒｍｅｉｅｒ，Ｒ．；Ｐｏｓｔｅｌ，Ｗ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１９８２，６，３１７−３３９．Ｇｏｒｇ，Ａ．；Ｏｂｅｒｍａｉｅｒ，Ｃ．；Ｂｏｇｕｔｈ，Ｇ．；Ｈａｒｄｅｒ，Ａ．；Ｓｃｈｅｉｂｅ，Ｂ．；Ｗｉｌｄｇｒｕｂｅｒ，Ｒ．；Ｗｅｉｓｓ，Ｗ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０００，２１，１０３７−１０５３．Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．Ｆ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０００，２１，１０８２−１０９３．

そこで、この出願の発明は、以上のような背景を踏まえて、技術的に熟練が必要で、特に一次元ゲルの取り扱いが難しいことや、一次元目の電気泳動に時間を要し、二次元の分離終了までに場合によっては２日間もの長い時間がかかること、高分子量たんぱく質への適用が困難であり、一次元目から二次元目のゲルへのたんぱく質の輸送効率が低く試料の無駄が多い、などの問題点を解消した、改善された新しいたんぱく質分離用の高速二次元電気泳動システムを提供することを課題としている。

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、二次元ゲル電気泳動システムにおける等電点分離系において、ゲルの支持体としてナイロン系糸状体を配設一体化していることを特徴とするたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システムを提供する。

また、この出願の発明は、第２には、糸状体はマルチフィラメント糸状体であることを特徴とする上記のたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システムを提供し、第３には、糸状体の存在下での重合ゲル化により糸状体とゲルとが一体化されていることを特徴とする上記のたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システムを提供する。

さらには第４には、アクリルアミドゲルの濃度が２％Ｔまでの低濃度範囲にあることを特徴とするたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システムを提供する。

以上のとおりのこの出願の発明は、従来の二次元電気泳動システムにおけるボトルネックは等電点分離系（ＩＥＦ）の一次電気泳動用ゲルにあると考えてなされたものであって、特有のナイロン系を一次電気泳動用ゲルの支持体として用いることにより、（Ａ）ゲルが物理的に強くなったため、扱いやすく、またゲル中をたんぱく質が動きやすい低濃度ゲルの作製が可能になり、また、（Ｂ）ゲルが細くなったため、電気泳動中の放熱効果が改善され高電圧の印加が可能になるという、二つの効果が発現される。このナイロン系担持ゲルを用いることにより、従来の二次ゲル電気泳動システムの利点を保持しつつ、前記のとおりの、技術的に熟練が必要で、特に一次元ゲルの取り扱いが難しく、一次元目の電気泳動に２〜１６時間を要し、二次元の分離終了までに場合によっては２日間もの長い時間がかかり、高分子量たんぱく質への適用が困難であって、一次元目から二次元目のゲルへのたんぱく質の輸送効率が低く試料の無駄が多い、などの問題点を解決することのできる新たな二次元ゲル電気泳動システムが実現される。すなわち、このシステムでは、扱いやすい、極めて高速、高分子量のたんぱく質の分離へ適用可能、一次元目から二次元目のゲルへのたんぱく質の輸送効率が高い、といった特長を有している。さらにナイロン系担持ゲルは、実験室でも簡単に製作可能である。

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

この出願の発明では、前記のように、二次元ゲル電気泳動システムにおける等電点分離系（ＩＥＦ）において、ゲルの支持体としてナイロン系糸状体を用いて、これとゲルとを一体化している。この場合のゲル支持体としての糸状体は、その素材がナイロン、もしくはナイロンを主として、たとえばナイロンが半量以上を占めるナイロン系の糸状体である。そしてより好適には、マルチフィラメントを紡いだものの使用が考慮される。この場合、ナイロン以外のアミド系、たとえばアクリルアミドや、ポリエステルとの混紡として構成することも考慮される。

なお、糸状体については、分析サンプルを汚染するものであってはならない。また、表面に固定された負電荷がないものとする。固定された負電荷はＩＥＦの際に使用するＣＡ（両性電解質キャリア）によるｐＨ勾配を不均一にしてしまうおそれがある。

このようなナイロン系糸状体は、ゲルの全体積に占める割合としては、通常５〜８０％（ゲル体積２０〜９５％）が考慮される。

ゲルとしては従来同様のアクリルアミドゲルが代表的なものとして例示される。これらのゲルは、上記の糸状体の存在下での重合ゲル化によって、糸状体と一体化されることになる。このような一体化ゲルは、たとえば、ガラス板等の板状体に成形した溝内に糸状体を装入し、次いでゲル化用の溶液を注入して重合ゲル化させることで形成することができる。

この出願の発明によれば、従来では通常４％Ｔ程度までのゲル濃度しか達成できなかったが、２％Ｔ程度の低濃度まで可能とすることができる。

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。もちろん、以下の例によって発明が限定されることはない。

ＬＭＳゲルの調製
まず図１に示したゲル作成用の装置を組み立てた。作成装置の上板（１）および下板（２）は５ｍｍ厚のアクリル板から作製されている。機械処理で幅１．２ｍｍ、深さ１．２ｍｍ、延長１２０ｍｍの溝（３）が下板（２）に正確に彫られている。ゲルの注入口（４）および排出口（５）は上板（１）と、これに連通する形態で下（２）に設けてある。超低濃度・極細ゲルの調製に際しては、不織マルチフィラメント糸（〜１．０ｍｍ直径／ナイロン製）をゲル構造の保持および強化に用いた。

このナイロンマルチフィラメント糸としては、市販品（Ｈａｍａｎａｋａ社の販売するＲｉｃｈＭｏｖｅ製の糸（Ｃｏｌ．Ｎｏ．５１０，ＬｏｔＮｏ．Ｃ）を用いた。この糸はナイロンマルチフィラメントを紡いだもので、やわらかく、艶がない。ナイロン糸は適当な長さにして溝（３）にはめ合わせてのち、上板（１）をのせた。上板（１）と下板（２）を固定し、窒素ガスを注入口（４）から溝（３）に流し、排出口（５）から排出させ、これを数分間行った。この窒素置換は（表面積の大きい）ナイロン繊維が吸収した酸素を除去するのに必要である。アクリルアミドゲル溶液は蒸留水で所定の濃度に調製し、真空脱気した。ゲルの原溶液にはアクリルアミドとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド以外の試薬は含まれていない。過硫酸アンモニウムとＴＥＭＥＤを適量づつ脱気したゲル溶液に加えた後に、ゲル溶液をシリンジでゆっくりと溝に注入し、最低でも１時間は静置して重合させた。ついで、下板（２）から上板（１）をはずした。固まったゲル（以下、これをＬＭＳゲルと呼ぶ。ＬＭＳ＝ＬｏｏｓｅＭｕｌｔｉｆｉｌａｍｅｎｔｎｙｌｏｎＳｔｒｉｎｇｓ）は一組のピンセットで蒸留水中に移し、少なくとも１時間は蒸留水に浸しておいた。この操作はＬＭＳゲル中の遊離イオンの除去に必要であった。最後にＬＭＳゲルをＣＡ（両性電解質キャリア）、界面活性剤、そしてカオトロープ（６ｍｏｌ／１尿素、２ｍｏｌ／１チオ尿素）というＩＥＦ用試薬を含む溶液中で１時間静置した。ＩＥＦに先立ち、ＬＭＳゲルを適当な長さ（７．１ｍｍ）にカットして分割した。上記の手順により２％Ｔ（５．４％Ｃ）まで希釈した超低濃度ＬＭＳゲルの作成に成功した。
ＬＭＳゲルを用いたＩＥＦ
図２に示したＬＭＳゲル用のＩＥＦ装置を新たに作成した。装置本体は５ｍｍ厚のアクリル板でできている。冷却水チャンバーの上板（６）には５つの幅の広い溝（７）（幅１０ｍｍ、深さ２ｍｍ、全長７０ｍｍ）が成形されており、この幅広の溝（７）の中にそれぞれ５つの幅の狭い溝（８）（幅１．２ｍｍ、深さ１．２ｍｍ、全長７０ｍｍ）が彫り込まれている。泳動サンプルは細い溝にそってマイクロピペットでアプライしたのち、先ほど作成したＬＭＳゲル（９）を細い溝にはめ込んだ。ＩＥＦ中にＬＭＳゲル（９）が乾燥しないよう、広い溝にカバー（１０）（幅１０ｍｍ、高さ５ｍｍ、長さ７０ｍｍアクリルブロックを使用）を置いて、ゲルが入った狭い溝を覆った。ＬＭＳゲル（９）はゲル両端からそれぞれ０．５ｍｍ以内の部分で直接電極（白金ホイルで覆った銅ブロック）に接続されている。冷却水は１０℃に設定し、窒素雰囲気下で空気中二酸化炭素の影響を排除してＩＥＦ電気泳動を行った。ＩＥＦは所定電圧到達までは定電流で行い、所定電圧到達後は泳動終了まで所定ＩＥＦ電圧を保持（定電圧泳動）した。
ｐＨ勾配の測定
ＩＥＦに用いたＬＭＳは５ｍｍづつに断片化して、それぞれ窒素雰囲気下のバイアルで１時間、脱気した蒸留水２５μｌに溶解させた。ｐＨ値はｐＨ測定器（Ｂ２１２、Ｈｏｒｉｂａ、ＪＡＰＡＮ）で測定した。
平衡、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、染色
平衡およびＳＤＳ−ＰＡＧＥは、基本的にＯ’Ｆａｎｎｅｌの方法（非特許文献３）に従って行った。
平衡に達するまでの時間は、Ｏ’Ｆａｎｎｅｌの方法で使用されてたゲルに比べて、ＬＭＳゲルが非常に薄いため、本研究では４０分に短縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥではスタッキングゲルでの起こりうる大分子量のタンパク質の逸失を最小限に押さえるため、スタッキングゲル（幅８ｃｍ、高さ１ｃｍ、厚さ１ｍｍ）を２．５％Ｔ（２．６％Ｃ）まで希釈した。ランニングゲル（＝ｒｅｓｏｌｖｉｎｇｇｅｌ）は幅８ｃｍ、高さ６．５ｃｍ、厚さ１ｍｍで、９％Ｔ（２．６％Ｃ）一定濃度であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥはゲル１枚あたり５０ｍＡの定電流でおこなった。染色は市販の銀染色キットを使用し、定法により行った。
ｐＨ勾配の安定性
ＣＡによるｐＨ勾配は「カソードドリフトと「プラトー現象」によって悪影響を受ける。一般的なＩＥＦ系において、これらの現象は泳動（分離）時間とともにその影響が増し、また電圧上昇をもたらす。この出願の発明の新規なＩＥＦ系の評価にあたり、ＣＡによるｐＨ勾配の安定性についても評価を行った。その結果を図３（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）図４（Ａ）（Ｂ）に示した。なお、図４（Ｃ）は異なった電流値における分離時間の作用としての電圧変化を示したものである。

この結果よりｐＨ勾配は基本的にゲルに沿ってリニアに形成されており、どの場合も優れた安定性が認められた。１１０分を超えるＩＥＦでのｐＨ勾配の時間安定性は検討されていない。というのは、１１０分というのが２４０ｋＤａのタンパク質をＩＥＦで分離（平衡化）するのに十分な時間であったからである。事実、１７０分までの分離時間に関して優秀な安定性を示している（図５）。

ｐＨ３．５〜１０のＣＡ（によるｐＨ勾配）の場合、測定されたｐＨ勾配はｐＨ４〜９．３（図３Ｂ、図４Ａ）の範囲であり、ゲル作成時より若干狭くなっている。尿素とＮＰ−４０を含む場合のｐＨ勾配（図３Ａ）は、それらをどちらも含まない場合のｐＨ勾配（図３Ｂ）より若干狭くなっていることから、尿素とＮＰ−４０がｐＨ勾配の形成に少し影響していることが示された。この２つの結果はＣＡによるｐＨ勾配全般について言えることと考えられる。
異なる（アクリルアミド）濃度のＬＭＳゲルを用いたＩＥＦ（の分離）時間
ＩＥＦ（でタンパク質を分離するのに必要な）時間は、いくつかのパラメーター、たとえばゲルの性質、ゲルマトリックスの網目の度合い、ｐＨ勾配の態様、温度、印加電力そして分析サンプルなどに依存する。一般的に、サンプルのロード操作にかかる時間を含めて、現在の一般的なＩＥＦけいでは、ＩＥＦが安定状態となる（＝タンパク質がそれぞれの等電点へ十分に分離）するのに１０時間以上必要とされている。

そこで、この出願の発明の新規ＩＥＦ系でのＩＥＦ時間は、３種類の天然色素タンパク質を用い、４％Ｔ、２．５％Ｔ、２％ＴのそれぞれのＬＭＳゲルを使って（それぞれＩＥＦを行って）評価した。

色素タンパク質としては、
Ｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＭＷ：２６４ｋＤａ，ｐＩ：４．３）
Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＭＷ：６７ｋＤａ，ｐＩ：７．２）
ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣ（ＭＷ：１３ｋＤａ，ｐＩ：９．６）
を用いた。測定結果を図５に示すが、これはそれぞれ異なった泳動時間において撮影した写真である。これらのタンパク質は泳動分離後（染色することなく）すぐに検出可能であるばかりでなく、幅広い分子量（１３〜２６４ｋＤａ）とｐＩ（４．３〜９．６）をカバーしている。

図５より次の３点が認められた。（１）すべての場合で、巨大タンパク質のｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（２６４ｋＤａ）に限ってみても、分離（に必要な）時間は１１０分より長くはない。これは既存のＩＥＦ系に比べて格段に短時間である。（２）分離（に必要な）時間は、２％Ｔで、２．５％Ｔでそれぞれ７０分、９０分であり、４％Ｔの場合にくらべてさらに短かった。これはゲルの濃度が低いとゲルの網目が拡大し、タンパク質の移動するさいの抵抗が弱まることに起因している。（３）どのタンパク質も等電点へ分離した後にはそこにとどまりつづけた。このことは、とりもなおさず、新規ＩＥＦ系では、ｐＨ勾配が非常によく安定したものであることを証明している。また同じくこのことより、（ＬＭＳゲルのアクリルアミド濃度が）２％Ｔ、２．５％Ｔおよび４％Ｔでそれぞれ７０分、９０分および１１０分以内にＩＥＦ平衡に達している。
異なった濃度のＬＭＳゲルへのサンプルのロード容量
より多くのタンパク質を一度に分離できる（←タンパク質のロード可能容量が大きい）というのが、特にゲル電気泳動で求められている。図５では、どの濃度のゲルにおいても同量のタンパク質を泳動しているにもかかわらず、低濃度ゲルの方が高濃度ゲルより、分離されたタンパク質バンドが狭い範囲（シャープ）であった。すなわちこれは、低濃度ゲルの方が、高濃度ゲルよりもより多くのタンパク質を泳動できるということを示している。より低濃度のＬＭＳゲルの使用は、より大きなサンプルのロード容量を実現するために簡便かつ効果的な方法である。
ＬＭＳゲルの再現性
ＩＥＦにおける分離パターンの再現性は天然色素タンパク質を使いＬＭＳゲルで検証した。その結果を図６に示した。この（図６は５つのＬＭＳゲルについて３種類のタンパク質でＩＥＦを行ったものである。ＩＥＦはそれぞれ別個に行い、泳動時間ごとに写真を撮影した５つのＬＭＳゲルは、どの時間の３種類のどのタンパク質のバンドにおいても、非常に類似したバンド位置を示し、これにより再現性が確実であることが示された。
新規ＩＥＦ系のプロテオーム２−ＤＰＡＧＥへの適用
最終的に、新規ＩＥＦ系では、一次泳動（ＩＥＦ）において４％Ｔおよび２％ＴのＬＭＳゲルを用い、タンパク質の２−ＤＰＡＧＥへ適用した。その結果を図７に示した。ニワトリ骨格筋より抽出したタンパク質をサンプルとして用いた。ニワトリの骨格筋には、従来の２−ＤＰＡＧＥでは検出が難しいとされているミオシンＨ鎖、Ｃ−Ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどの難水溶性、高分子量のタンパク質が含まれているために、サンプルとして選定した。比較のため、上記の２通りの実験（＝図７の２−ＤＰＡＧＥ）は、サンプルのロード、泳動、染色の条件を厳密に同一にして行った。

図７にも示したように、２％ＴのＬＭＳゲルによる２−ＤＰＡＧＥのタンパク質マップの方が、４％のＬＭＳゲルによる場合より、より強い染色強度を示すことが確認された。さらに、４％ＴＬＭＳゲルの場合の２−Ｄタンパク質マップには認められない多数のタンパク質のスポットが、２％ＴＬＭＳゲルの場合の２−Ｄタンパク質マップでは検出できることが明らかとなった。さらに重要なことには、２％ＴＬＭＳゲルの場合の２−Ｄタンパク質マップでは、ミオシンＨ鎖（〜２００ｋＤａ）が含まれるであろう１００ｋＤａを超える大分子量のタンパク質が、高い染色強度で明確に検出することができることである。Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉらは、何通りかの一般的な方法でを試みて、一次泳動にアクリルアミドゲルを使用した場合の２−Ｄタンパク質マップではミオシンＨ鎖は検出できなかったことを報告している。（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ２０００，２１，４４６−４５１）。これに対し、この出願の発明として例示された低濃度ＬＭＳゲルでは、ＩＥＦゲルへロードする際のサンプルタンパク質のゲル中への移動能、および一次泳動ゲル（ＬＭＳゲル）から二次泳動ゲルへのタンパク質の移動能が、明確に向上できることが示唆される。

以上のように、超低濃度（アクリルアミド）２％Ｔゲルを用いることで、２６０ｋＤａにいたる大分子量のタンパク質（例えば図５および図６のｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）が明確に（ＩＥＦで）分離され、１次泳動ゲルから２次泳動ゲルへ移動可能であるという事実が明らかになった。

以上のとおりの結果からは、この出願の発明のＩＥＦ系は既存のＩＥＦ系と比べ、以下の点で優れていることがわかる。
ルーズマルチフィラメントを用い２％Ｔまでアクリルアミド濃度を下げた（ＬＭＳｓ）超低濃度かつ極細のゲル（ＬＭＳゲル）を、簡便に作成可能である。
ＬＭＳゲルは超低濃度にかかわらず、頑丈で取扱いが容易である。
この出願の発明のＩＥＦ装置はＣＡによるＩＥＦ系で必須だった電極電解液を必要としない。これはＩＥＦの取扱いを簡略化するだけでなく、ｐＨ勾配の安定化にも大きく貢献している。
この出願の発明のＩＥＦ系は、ＩＥＦをガラス管で行わなくてよいため、既存のＩＥＦ系で問題となっているＣＡによるｐＨ勾配の安定性に対するガラス管の悪影響を完全に排除することができる。
電極電解液、ガラス管および遊離イオンによる悪影響を排除することによるＬＭＳゲルにおけるＣＡによるｐＨ勾配の非常に優れた安定性が、十分に長時間にわたるＩＥＦを可能としている。そしてこの系により、正確な（忠実な）ＩＥＦ平衡が実現することができる。これは既存のＣＡによるＩＥＦ系では不可能と考えられていたことである。
超低濃度ＬＭＳゲルの優れた分析的な特徴は、既存の系で用いられている４％（アクリルアミド）のＩＥＦゲルより、ＩＥＦ時間（＝等電点分離に要する時間）、ＬＭＳゲルへのタンパク質の導入（＝ロード可能量と透過分子量）、１次泳動ゲルから２次泳動ゲルへのタンパク質の移動能が格段に向上できる。
さらに、ＬＭＳゲルは容易に作成できることから、２−ＤＰＡＧＥの分析能をはっきりと向上させ、また高速なタンパク質分離手法として小型化された２−ＤＰＡＧＥ系が用いられるようになる可能性がある。

この出願の発明によって、高分子量たんぱく質への適用が可能な高速二次元電気泳動システムが実現され、プロテオーム解析のための革新技術として、医療や生命科学研究の発展に大きく貢献することができる。

ＬＭＳゲル作成装置の組み立てを例示した図である。ＬＭＳゲルを用いたＩＥＦ装置を例示した図である。ｐＨ勾配に対するＩＥＦの影響を例示した図である。ＬＭＳゲル濃度は２．５％Ｔ（５．４％Ｃ）である。ＬＭＳゲルをインキュベート（前処理）はそれぞれ図表に記載された試薬類を含む１０％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液で行った。ＩＥＦは９００Ｖに達するまでは定電流（０．０９ｍＡ／ｇｅｌ）で行い、９００Ｖに到達後はＩＥＦ終了まで９００Ｖの電圧を維持した。ｐＨ勾配に対する電圧の影響（ＡおよびＢ）、電流を一定とした場合のＩＥＦ時間と電圧変化（Ｃ）を例示した図である。ＬＭＳゲルとその前処理は図３の条件に同じ。異なる濃度のＬＭＳゲルを用いた色素タンパク質のＩＥＦを例示した図である。ＬＭＳゲルの前処理に用いられる処理液は１％（ｖ／ｖ）ｐＨ３．５−１０両性電解質、および１％（ｖ／ｖ）ｐＨ５−８両性電解質、２％ＮＰ−４０および１０％（ｖ／ｖ）グリセロール溶液であった。ＩＥＦの電力操作は図３と同様におこなった。タンパク質を適量のゲル前処理液に溶解し、どちらのＬＭＳゲルにもそれぞれのタンパク質を等量づつ次のとおりロードした：ｃ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（分子量２６４ｋＤａ、ｐＩ４．３、左側のバンド）１６μｇ、ヘモグロビン（分子量６７ｋＤａ、ｐＩ７．２．中央のバンド）７０μｇ、シトクロムｃ（分子量１３ｋＤａ、ｐＩ９．６．右側のバンド）３２μｇ。個別に泳動を行ったＬＭＳを用いた色素タンパク質のＩＥＦを例示した図である。凡例は図５と同様であるが、ゲル濃度のみ全て２．５％である。一次泳動に４％Ｔおよび２％ＴのＬＭＳゲルを用いたニワトリ骨格筋抽出サンプルの２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２−ＤＰＡＧＥ）を例示した図である。抽出サンプルをロード量はどちらのゲルに５μｌであった。ＩＥＦは１２００Ｖに達するまでは定電流（０．０９ｍＡ／ｇｅｌ）で行い、その後は１２００Ｖの電圧を維持し、１時間泳動を行った。

Claims

二次元ゲル電気泳動システムにおける等電点分離系において、ゲルの支持体としてナイロン系糸状体を配設一体化していることを特徴とするたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システム。
糸状体はマルチフィラメント糸状体であることを特徴とする請求項１のたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システム。
糸状体の存在下での重合ゲル化により糸状体とゲルとが一体化されていることを特徴とする請求項１または２のたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システム。
アクリルアミドゲルの濃度が２％Ｔまでの低濃度範囲にあることを特徴とする請求項１ないし３のいずれかのたんぱく質分離用高速二次元電気泳動システム。