JP2003114216A - 電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 アガロースゲルよりなる電気泳動用担体を用
いて蛋白質の程度の分子サイズの電気泳動を行う。 【構成】物理的強度が低いアガロースゲルを主成分とす
る電気泳動担体を有する電気泳動装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は分子生物学および臨床検
査などの分野において生体試料などの性質を調べるため
に、試料を設置した担体の両端に電圧を印加して試料を
分離および解析する電気泳動方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質は生体内で極めて重要な機能
を果たし、また生体の状態を強く反映することから、臨
床検査の対象として非常に重要な生体物質となってい
る。またバイオテクノロジーの分野においても、生体を
解明するための情報としてゲノムだけでは不十分であ
り、ゲノムから発現するタンパク質へと研究の重点がシ
フトしつつある。タンパク質の特徴を示すパラメータと
しては、分子量と等電点が不可欠であり、いずれも電気
泳動法により決定されている。電気泳動法としては、試
料の支持体となる平板状ゲルを緩衝液中に水平に設置
し、緩衝液を介してゲルに電圧を印加するサブマリン方
式が扱いやすく、広く普及している。

【０００３】サブマリン方式における支持体ゲルには、
試料が核酸の場合にはアガロースゲル、試料がタンパク
質の場合にはポリアクリルアミドゲル（PAG）が用いら
れるのが一般的である。PAGはアガロースゲルよりも繊
細な網目構造を形成し、分離能が高いため、核酸よりも
分子サイズが小さいものが多いタンパク質に適している
ためである。しかしながら、PAGは毒性を有することに
加え、ゲルの作製法も煩雑で、取り扱いが難しい。一
方、アガロースゲルは分離能でPAGに劣るものの、毒性
もなくゲルの作製も容易であるうえ、泳動後の試料の染
色および脱色も容易である。取り扱いが容易なアガロー
スゲルをタンパク質の電気泳動に利用できれば、臨床検
査およびタンパク質研究での利点は非常に大きい。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明では、分子ふる
い効果が小さく低分子の電気泳動には適さないとされる
アガロースゲルを用いて、主に低分子タンパク質の電気
泳動の確立を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記に鑑み本発明は、物
理的強度が低いアガロースゲルを担体として用いること
により、アガロースゲル濃度値、厚みに特定の選択を行
うことにより、緩衝液に界面活性剤を添加することによ
り、又はこれら３つの要素のうち２つ又は全部を組み合
わせることによりアガロースゲルによる低分子蛋白質の
電気泳動を実現する。本発明における物理的強度とは、
例えばゲル粘度、ゲル強度（本発明では例えば1000g/cm
² 以上の範囲で好適に利用できるが、これに限るもの
ではない）のことをしめすものであり、本発明では、ゲ
ル濃度が高濃度であり、場合によっては高融点で物理的
強度の低いものが好適に使用される場合がある。物理的
強度が低いアガロースゲルは、取り扱いにおいても比較
的楽に使用できるものでもある。

【０００６】更に本願発明は、電気泳動用担体を形成す
るゲルを純水、アルカリイオン水等を用いて作成するこ
とにより、安全なゲル担体の製造を可能とする。当該ゲ
ルの成分は、アガロースでなくても良いが、アガロース
にすることにより更に安全性の高い、効率の良い電気泳
動を実現する。

【０００７】更に本発明は、電気泳動用担体ゲルの厚み
を厚くし、当該ゲルを用いて電気泳動を行った後、泳動
方向面（片面または両面）に記録媒体を重ねて、記録媒
体方向へ泳動電気出力を印加することにより、１回の電
気泳動から、複数の電気泳動パターンの記録を得ること
を実現する。この場合のゲルの厚みは、３mm〜８mm（好
ましくは５mm〜８mm）の範囲が例示され、材質、緩衝液
等のその他の成分は、適宜選択される。

【０００８】更に本発明は、電気泳動用の緩衝液に、Ｓ
ＤＳ及びＬＤＳの複数の界面活性剤を混合することによ
り、アガロースゲルを用いて低分子蛋白質の好適な電気
泳動を実現する。

【０００９】更に本発明は、電気泳動用担体を、押圧し
て圧縮する押圧部を蓋部に設けることにより、ゲルの密
度を上げることで、ゲル濃度を上げるのと等価的な電気
泳動を実現すると共に、ゲルの押圧を非等方的に行うこ
とにより分子量にばらつきがある蛋白質等の電気泳動を
も可能とする。

【００１０】以下に本発明を詳細に分説する。電気泳動
担体用ゲルについて、本発明では、高濃度のアガロース
ゲルを用いることが好ましい。とくに、本発明で主眼と
している分子量100kD以下の低分子タンパク質を試料と
する場合には、濃度３％以上であることが望ましい。た
だし、実用的なゲルの特性を保つためには、濃度は８％
以下とすることが好ましいが、泳動の態様、目的等に応
じ、その他の濃度を選択的に用いる場合もあり得る。

【００１１】また、ゲルの厚みは薄いものを用い、例え
ば３mm以下であることが望ましい。泳動後にゲルを染色
して泳動パターンを検出するうえでも、ゲルは薄い方が
よい。ただし、泳動パターンを他の記録媒体に転写して
から検出するような場合には、この限りでなく、８mm以
下まで範囲を広げてもよい場合もあり、ゲルの厚みは状
況に応じ適宜選択される。ゲルの密度が高く厚さが薄い
ものが適しているという点では、ゲル作製時は濃度を３
％未満とし、電気泳動装置にゲルを設置する際に冷却あ
るいは物理的に圧縮してゲルの密度を高めても、同様の
効果が得られる。圧縮を非等方的に行えば、試料を濃縮
したり、より広範囲の分子サイズの試料が混合している
場合に適用することも可能となる。

【００１２】本発明における、純水等によるゲルの作成
について、ゲルの作製においては、一般的には泳動用緩
衝液が用いられているが、泳動用緩衝液とは異なる液体
を用いてもよく、純水やイオン溶液、泳動用緩衝液を希
釈したものなどが例示される。当該イオン溶液は、例え
ば，アルカリイオン水、海洋深層水等生体に対し無毒な
ものを選ぶことができ、好ましくは、弱アルカリイオン
水によりゲルの作成を容易に実現可能とする。又純水
は、実質的に純水であればよく多少の不純物を含んでも
良い場合もある。弱アルカリ性は、ｐＨが例えば８〜１
０が例示されるが、これに限るものではない。

【００１３】泳動パターンの他の記録媒体への転写方法
について泳動パターンを他の記録媒体へ転写する際、厚
みがあるゲル（例えば３ｍｍ〜８ｍｍが例示されるがこ
れに限るものではない）を使用することにより、複数の
転写が可能となるが、具体的には、 （ステップ１）厚みのあるゲルを用いて試料を電気泳動
させる。 （ステップ２）ゲルを取り出し、セロファン、メンブレ
ン、記録媒体などを重ねる。必要に応じ、これらは複数
枚重ねてもよい。記録媒体は種類が異なるものを重ねる
場合もある。 （ステップ３）ゲル内の試料が記録媒体の方向に移動す
るように電圧（例えば電気泳動時と同様の電圧、電流又
は、それ以下の電圧、電流）を印加し、泳動パターンを
記録媒体に転写する。 （ステップ４）必要に応じ、セロファン、メンブレン、
記録媒体を交換し、同様にして同一のゲルから異なる記
録媒体に転写する。 という手順で行う。この様にゲルの厚みを大きくするこ
とで、複数の記録媒体へ、同一の泳動パターンを記録す
ることができ、実験の手間を省くことが可能となる。

【００１４】電気泳動用の緩衝液について 泳動用の緩衝液としては、弱アルカリ性のものが望まし
い。具体的には、トリス-グリシン緩衝液、トリス-酢酸
-EDTA（TAE）緩衝液、トリス-ホウ酸-EDTA（TBE）緩衝
液、トリス-トリシン緩衝液などのトリス系緩衝液が例
示される。ただし、等電点がアルカリ性領域にあるよう
なタンパク質を試料とする場合には、酸性の緩衝液を用
いることも可能である。タンパク質を一次元構造にする
ために必要な界面活性剤は、陰イオン性であることが望
ましい。具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、ドデシル硫酸リチウム（LDS）、アルキル硫酸塩、
ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル
ベンゼンスルフォン酸塩などが例示される。必要に応じ
て、これらを混合して用いる。これらは緩衝液中濃度が
0.05〜0.2％となるように調整して用いる。ただし、タ
ンパク質の性質に応じて、陽イオン性、非イオン性、両
性の界面活性剤を用いることもありうる。

【００１５】電気泳動装置について 電気泳動装置はサブマリン型のものが扱いやすく、望ま
しいがこれに限るものではない。 又電気泳動用出力と
しては、直流、半波整流、全波整流等を出力とし、５０
Ｖ〜２００Ｖで用いることが例示されるが、その他の電
圧値、或いは、波形（例えば矩形波等）を選択的に使用
しても良い場合もある。

【００１６】図１に本発明で用いる電気泳動装置の一例
として一般的なサブマリン型の電気泳動装置を示す。図
１において電気泳動層１内に泳動用緩衝液４が注入さ
れ、ゲル３が設置されている。ゲル３には溝５をあらか
じめ作成しておき、溝５にタンパク質などの試料６を設
置する。電極２から泳動用緩衝液４を介して、ゲル３に
電圧が印加され、生じた電場によって試料６が泳動す
る。本発明の電気泳動方法では、核酸の電気泳動では１
〜２％程度の濃度で用いられるアガロースゲル（図１の
ゲル３）を、濃度３％以上となるように作製することに
より、網目構造をより細かくし、低分子のタンパク質に
対しても十分な分離能が実現される。アガロースは毒性
がなく、ゲルの作製も容易である。

【００１７】ゲル３の厚さは３mm以下と薄くすること
で、ゲル内の温度分布が小さくなり、泳動速度も均一と
なる。したがって、分離能を高くすることが可能であ
る。さらに、染色して泳動パターンを検出する場合に
は、染色剤がゲル内に浸透しやすいという点でも、ゲル
は薄い方がよい。

【００１８】ただし、タンパク質の泳動パターンの検出
には、他の記録媒体に泳動パターンを転写する場合も多
い。記録媒体はタンパク質の種類や用途に応じてさまざ
まな種類が用意されているが、同一ゲルの泳動パターン
を複数の記録媒体に転写すれば、より詳細な情報の取得
が可能となる。このような場合には、ゲルを８mm程度ま
で厚くし、試料の量を十分に確保しておくことにより、
複数の記録媒体への転写が可能となる。これにより、一
度にあるいは連続的に、ニトロセルロース，PVDF，セパ
ラックスS（商標）などの複数の転写用膜に泳動後の蛋
白を転写し，それぞれをLD染色，リポ蛋白染色，糖蛋白
染色など異なる方法で染色できる。このように、記録媒
体および発色系を複数利用することにより、同一検体よ
り得られる情報量が飛躍的に増大し、さまざまな解析を
行うことが可能になる。

【００１９】なお、ゲル作製時は濃度を３％未満とし、
電気泳動装置１にゲル３を設置する際に冷却あるいは物
理的に圧縮すれば、ゲル３の密度を高めると同時に厚さ
を薄くすることも可能であるから、同様の効果が得られ
る。圧縮を非等方的に行えば、試料を濃縮したり、より
広範囲の分子サイズの試料が混合している場合に適用す
ることも可能となる。

【００２０】ゲル３の圧縮は、例えば図５のように行
う。一般的なサブマリン型の電気泳動装置では、泳動槽
の蓋は単に泳動槽を覆うだけの構造となっているが、図
５の蓋７のように中央部分を窪ませておけば、蓋７によ
ってゲル３を圧縮することが可能である。図５におい
て、ゲル３の上面８は蓋７によって押し下げられてい
る。また、分子サイズが大きな試料は、ゲル濃度が高す
ぎるとほとんど泳動できずに分離できない。一方、分子
サイズが小さな試料は、ゲル濃度が低すぎると泳動距離
に差がつかずに分離できない。したがって、分子サイズ
が大きく異なる試料が混合している場合には、濃度が均
一なゲルで分離することは難しい。この場合に対して
は、蓋７の形状を工夫し、ゲル３を非等方的に圧縮すれ
ば、ゲル３内に密度分布を作り出すことができる。例え
ば図６のように、試料６の泳動方向に傾斜した形状にす
れば、試料６が泳動するほど高密度な領域に入っていく
ことになる。したがって、分子サイズが大きな試料は溝
５の付近（ゲル密度が低い領域）で分離され、分子サイ
ズが小さな試料は溝５から遠く離れた部分（ゲル密度が
高い領域）で分離される。この方法で、分子サイズが大
きく異なっている試料が混合している場合にも、一枚の
ゲルで分離することが可能となる。

【００２１】図６では蓋７の傾斜が直線状になっている
が、放物線状や指数関数的な形状にすれば、試料の状態
に柔軟に対応することが可能である。例えば図７に示す
ように、ゲルの中央付近から急激に勾配が大きくなるよ
うな関数の形状にしておけば、分子サイズが数十倍から
数百倍も異なる試料が混合している場合にも、分離する
ことが可能である。ヒトの体液のように分子サイズが全
く異なるタンパク質が混合した試料を、特別な分離処理
を事前に行うことなく迅速に検査したい場合などには有
用な方法である。

【００２２】また、図８のように試料６を設置する溝５
の付近は圧縮せずに、ある程度の距離を泳動してから圧
縮領域（高密度領域）に入るような構造にしておく方法
も考えられる。この方法では、圧縮がない領域では試料
が高速に移動し、途中から圧縮によって泳動が低速に変
化するため、溝５の幅よりもバンドをシャープにするこ
とができるという利点がある。一般的には、バンドをシ
ャープにするためには溝５を細く形成せざるを得ない。
しかしそれでは試料を設置できる量が減少し、バンドが
薄くなってしまう。そのため、試料を事前に濃縮処理す
る必要がある。しかし、図８に示す方法を用いれば、溝
５を細くせずとも泳動中にバンドがシャープになるの
で、非常に都合が良い。

【００２３】なお、図５〜図８に示した方法は一例であ
って、必ずしも泳動槽の蓋を変形させる必要はなく、ゲ
ルを変形させるための専用の部材を用いてもよい。もち
ろん、ゲルの一面のみに圧力を加えるだけでなく、上下
左右前後の複数の面から圧力を加えてもよい。ゲルは平
板状でなくとも、円筒の管内にゲルを作成し、圧縮する
ことも考えられる。また、部分的に冷却するなどの方法
によっても同様の効果が得られる。ゲルはアガロースで
なくとも効果は変わらないことは明白である。

【００２４】また、図５〜図８に示した方法のように、
泳動槽の蓋がゲルに接触するような構造では、 一般的
なサブマリン型の電気泳動法のようにゲル上面のバッフ
ァ電流経路が存在しないため、電流の大部分はゲルを通
過することになる。このような構造では、一般的に泳動
用緩衝液を用いて作製するゲルを、緩衝液とは異なる液
体を用いて作製するのもよい。例えば、希釈した緩衝液
や純水、イオン溶液などで作製する。その理由は、ゲル
の電気抵抗が増加することによりゲルへの印加電圧が高
くなり泳動が高速化すること、電流がほとんど流れない
ため泳動用緩衝液の機能が長時間持続すること、さらに
電流による発熱が抑制されることによりゲル内の温度分
布が生じにくく、バンドがシャープになることなどが挙
げられる。とくにゲルを圧縮する場合には泳動時間が長
くなるため、この方法は有効である。 また、消費電力
が大幅に削減されるため、乾電池や太陽電池、あるいは
充電式にするなど動力源の選択肢が豊富になり、携帯性
や利便性が向上する。当然ながら、一般的なサブマリン
型あるいはキャピラリー型などの電気泳動装置において
も、同様の効果は得られる。 このように、緩衝液とは
異なる液体でゲルを作製すれば、ゲルの濃度だけを問題
にすればよいため、あらかじめゲルを大量に作って保存
しておくなど、実験上の手間が省けるという利点もあ
る。これとゲルの圧縮を組み合わせることにより、一種
類のゲルをかなり広範囲の電気泳動に適用することが可
能となる。

【００２５】泳動用緩衝液４としては弱アルカリ性のも
のを用いることで、十分な泳動速度が得られ、かつ分離
能も高くなる。例えば、ｐＨ8.3のトリス-グリシン緩衝
液などである。ただし、少数ではあるが等電点がアルカ
リ性領域にあるタンパク質も存在しており、このような
試料に対しては緩衝液を酸性にするなど、最適値は変動
しうる。タンパク質を一次元構造にするために必要な界
面活性剤は、陰イオン性のものを用いて、陽極側に泳動
させると、十分な泳動速度が得られ、かつ分離能も高く
なる。例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ドデ
シル硫酸リチウム（LDS）、あるいは複数の界面活性剤
の混合物などを用いる。緩衝液中濃度は0.05〜0.２％程
度とする。濃度がこれよりも低いと分子サイズ以外にタ
ンパク質の構造因子の影響が生じ、電気泳動による分離
ができなくなる。また、濃度が高くなると、泳動速度と
分離能が低下する。電気泳動装置としては、水平サブマ
リン型のものを用いることにより、取り扱いがより容易
となる。

【００２６】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明する。後述する
実験例１．３に基づき、アガロースゲルを用いた電気泳
動におけるゲル濃度依存性を図２に示す。試料６として
は、分子量14.4kD〜97kDの低分子タンパク質を用いた。
ゲル濃度が2％と低い場合には分離能が低下し、試料の
分子量と移動度の間に明確な関係が得られない。一方、
ゲル濃度が５％と高い場合には、試料の分子量と移動度
の間に直線関係が見出されるものの、移動度は小さく分
離状態が不鮮明になる。分離状態がもっとも鮮明で、試
料の分子量と移動度の関係も明確になるのは、ゲル濃度
が４％の場合であった。ただし最適な濃度は試料の分子
量あるいはアガロースの種類などに応じて変化しうる値
である。アガロースゲル３の厚さは３mm以下で鮮明な分
離状態が得られたが、温度を一定に保つ冷却機構を用い
たり、泳動後の染色剤を選定するなどの工夫をすれば、
これより厚いサイズでも問題ない。

【００２７】後述する実験例１．２に基づき、アガロー
スゲルを用いた電気泳動における緩衝液のＰＨ依存性を
図３に示す。泳動用緩衝液４として、中性（pH7.0）の
リン酸、弱アルカリ性（pH8.3）のトリス-グリシン緩衝
液、強アルカリ性（pH9.5）のイミダゾール緩衝液を用
いた。試料６は分子量14.4kD〜97kDの低分子タンパク質
である。中性では試料の移動度が極めて小さい。また強
アルカリ性では試料の移動度は高かったものの、分離状
態は不明瞭であった。弱アルカリ性では試料の移動度が
大きく、明瞭な分離状態が得られた。したがって、泳動
用緩衝液４は弱アルカリ性であることが望ましい。ただ
し、試料の種類によって最適なｐHは変化する。

【００２８】後述する実験例１．５に基づき、アガロー
スゲルを用いた電気泳動における緩衝液に添加される界
面活性剤依存性を図４に示す。泳動用緩衝液４およびア
ガロースゲル３には、タンパク質を一次元構造にするた
めの界面活性剤（SDS）を加えている。図４に、本実施
例における電気泳動のSDS濃度依存性を示す。試料６は
分子量14.4kD〜97kDの低分子タンパク質である。SDS濃
度が0.2％の場合には、とくに低分子のものほど相対的
に移動度が小さく、分離状態が不明瞭であった。SDS濃
度が0.05％および0.1％の場合には、明瞭な分離状態が
得られた。SDS濃度を0.05％よりも低下させると、タン
パク質の構造因子の影響が生じ、分離そのものができな
かった。したがって、SDS濃度は0.05〜0.1％であること
が望ましい。ただし、これは試料の分子量などにより変
化しうる値である。

【００２９】電気泳動装置としては、取り扱いが容易な
水平サブマリン型のものを用いた。もちろん、キャピラ
リー型あるいは垂直型の電気泳動装置を用いても、同様
の作用を得ることは可能である。本実施例では、アガロ
ースゲルを支持体とした電気泳動法により、分子量14.4
〜97kDの低分子タンパク質を明瞭に分離することができ
た。その条件は、アガロースゲル濃度を４％と高くする
こと、アガロースゲルの厚さは３mm以下と薄くするこ
と、泳動用緩衝液は弱アルカリ性のものを用いること、
SDS濃度は0.05〜0.1％とすることである。

【００３０】更に本発明の実施例を詳述すべく具体的な
実験例を以下に示す。実験例１．１ 本実験例では、図１に示す一般的なサブマリン型の電気
泳動装置であり、直流電気泳動出力を行う「i-Mupid
（商標）アドバンス社製」を用いて、電気泳動を行っ
た。本実験例ではまず、各種アガロースゲルの比較を行
った。具体的には、以下の表１に示すアガロースゲルを
用いた。これら製品名は、いずれも商標である。

【表１】

【００３１】上記の各ゲルを用いて低分子タンパク質の
アガロースゲル電気泳動を行った結果、図９に示す電気
泳動像が得られた。ゲル濃度はすべて４％であり、泳動
用緩衝液はpH8.3の25mMトリス-190mMグリシン緩衝液
（0.1％濃度のSDSを含む）を用いた。試料は分子サイズ
14.4kD〜97kDの低分子量マーカー（製品名Low Molecula
r Weight Calibration Kit for Electroforesis [LMWと
略す]、ファルマシア社製）のほか、正常ヒト血清検体
および患者尿検体をそれぞれ２検体ずつ用いた。正常ヒ
ト血清は10倍、患者尿は２倍に各緩衝液で希釈した。

【００３２】図９において、左から（ａ）Nusieve3:1、
（ｂ）SeaPlaque、（ｃ）Seakem LE、（ｄ）Agarose S
の結果となっている。まずSeaPlaqueでは非常に分離が
悪かった。Seakem LEおよびAgarose Sでは、分離能は高
いがバンドがシャープではなかった。分離能およびバン
ドのシャープさで最も優れていたのはNusieve3:1であっ
た。

【００３３】実験例１．２ 本実験例では次に、泳動用緩衝液の比較を行った。緩衝
液としては以下の表２に示すものを用いた。

【表２】 ゲルは上記の検討で結果が優れていた濃度４％の比較的
ゲル粘度が低く、またゲル強度も低いNusieve3:1を用い
た。試料はゲル検討時と同じである。結果は以下の図１
０のようになった。図１０において、左から（ａ）トリ
ス-グリシン緩衝液、（ｂ）イミダゾール緩衝液、
（ｃ）リン酸緩衝液の結果である。リン酸緩衝液では泳
動距離が短く、十分に分離されなかった。イミダゾール
緩衝液ではバンドがシャープではなかった。結局、分離
能が高くバンドもシャープであったのは、トリス-グリ
シン緩衝液であった。この結果をグラフにしたものが、
図３である。

【００３４】実験例１．３ さらに本実験例ではここで、ゲル濃度の最適値を検討し
た。ゲル濃度としては２％、３％、４％、５％の４種類
を比較した。ゲルはNusieve3:1、泳動用緩衝液は緩衝液
の比較で結果が優れていたトリス-グリシン緩衝液（0.1
％SDSを含む）を用いた。試料はこれまでの検討に用い
たものと同じである。結果は以下の図１１のようになっ
た。

【００３５】図１１において、左からゲル濃度（ａ）２
％、（ｂ）３％、（ｃ）４％、（ｄ）５％である。２％
では分子ふるい効果が小さく、泳動距離が長くなる代わ
りに分離能が悪かった。５％では泳動距離が短く、十分
に分離されなかった。３％と４％は分離能が高くバンド
もシャープであるが、４％の方がLMWマーカー（左端の
レーン）の分離状態がより優れている。この結果をグラ
フに示したものが、図２である。

【００３６】実験例１．４ また本実験例では、ゲルの厚さの最適値についても検討
を行った。厚さとしては３mm、４mm、５mmの３種類を検
討した。ゲルは濃度４％のNusieve3:1、泳動用緩衝液は
トリス-グリシン緩衝液を用い、試料はこれまでの検討
に用いたものと同じである。結果は図１２のようになっ
た。図１２において、左から（ａ）３mm、（ｂ）４mm、
（ｃ）５mmである。分離能に大差はなかったが、LMWマ
ーカー（左端のレーン）のバンドのシャープさでは、厚
さ３mmの場合がもっとも優れていた。このことから、ゲ
ルの厚さは薄い方が上下の温度差が小さく、泳動のばら
つきが抑えられることが推測できる。

【００３７】実験例１．５ 本実験例では、SDS濃度の最適値を検討した。SDS濃度と
しては0%、0.05％、0.1％、0.2％の４種類を検討した。
ゲルは濃度４％のNusieve3:1、泳動用緩衝液はトリス-
グリシン緩衝液を用い、試料はこれまでの検討に用いた
ものと同じである。結果は図１３のようになった。図１
３において、左からSDS濃度（ａ）0％、（ｂ）0.05％、
（ｃ）0.1％、（ｄ）0.2％である。SDSが0％ではタンパ
ク質の構造による影響などが大きく、有意な分離を得ら
れなかった。0.2％では低分子サイズの分離が悪く、バ
ンドもシャープではなかった。0.05％と0.1％では分離
能が高かったが、0.1％の方がとくにLMWマーカー（左端
のレーン）の分離能で優れていた。この結果をグラフに
示したものが、図４である。

【００３８】本実験例における以上の検討から、アガロ
ースゲルを用いて分子量14.4kD〜97kDの低分子タンパク
質を分離するためには、次の方法が適していることが明
らかになった。電気泳動装置としては扱いやすいサブマ
リン型の電気泳動装置を用いる。例としては、i-Mupid
（アドバンス社製）が挙げられる。ゲルとしては濃度４
％、厚さ3mmのNusieve3:1（Takara社製）を用いる。泳
動用緩衝液としてはpH8.3の25mMトリス-190mMグリシン
緩衝液（0.1％濃度のSDSを含む）を用いる。以上の条件
で電気泳動を行った結果と、一般にタンパク質の電気泳
動に用いられているSDS−ポリアクリルアミドゲル（濃
度12.5％）を用いて電気泳動を行った結果の比較を図１
４に示す。（ａ）がSDS−ポリアクリルアミドゲル（濃
度12.5％）、（ｂ）がSDS−アガロースゲル（４％Nusie
ve）である。とくに正常ヒト血清（中央２レーン）など
の試料で、本発明で着目している低分子領域のタンパク
質の泳動では同等の結果が得られている。

【００３９】実験例２ 本実験例では、純水および弱アルカリイオン溶液を用い
て作製したアガロースゲルにより、電気泳動を行った結
果を示す。アガロースはNusieve3:1を濃度４％で用い、
ゲルの厚さは３mmである。緩衝液はｐH８．３のトリス-
グリシン緩衝液、界面活性剤はSDSを濃度0.1％で用いて
いる。電気泳動装置はサブマリン型のi-Mupidを用い
た。試料は実験例１と同じである。図１５に結果を示
す。(a)がｐH８．９のアルカリイオン溶液、(b)がｐH
５．８の純水を用いて作製したゲルである。分離能、バ
ンドのシャープさともに十分であり、実用上問題ないこ
とが明らかになった。

【００４０】実験例３ 本実験例では、界面活性剤を変更および混合した場合の
効果を検証する。アガロースゲル濃度は４％、ゲルの厚
さは3mm、泳動用緩衝液はトリス-グリシン緩衝液（pH8.
3）を用いた。試料は５種類で、左のレーンからそれぞ
れ患者尿、患者尿、ヒト血清、ヒト血清、LMWマーカー
である。電気泳動装置はサブマリン型の「i-Mupid」を
用いた。界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）、ドデシル硫酸リチウム（LDS）、およびこれら
の混合物の３種類を用いた。界面活性剤の濃度は、ゲ
ル、緩衝液ともに0.05％となるように調整した。これ
は、実験例１で結果が良好であった濃度である。SDSとL
DSを混合する場合では、それぞれ0.025％ずつとし、混
合物の濃度が0.05％となるようにしている。本実験例で
はまず、試料にも界面活性剤を添加すべきかどうかを検
討した。図16に結果を示す。図16において、(a)が試料
に界面活性剤を添加しない場合、(b)が試料にも界面活
性剤（SDS濃度１％）を添加する場合である。結果とし
ては(b)の方が明らかに分離状態がよく、試料にも界面
活性剤を添加すべきであることが判明した。本実験例で
は次に、前述した３種類の界面活性剤の比較を行った。
ゲルと緩衝液には濃度0.05％となるように界面活性剤を
添加し、上記の結果に基づき、試料にも濃度１％（SDS
とLDSの混合物ではそれぞれ0.5％）で界面活性剤を添加
した。図17に結果を示す。図17において、(a)SDS、(b)L
DS、(c)SDSとLDSの混合物である。図17から明らかなよ
うに、SDSとLDSを混合した場合には、マーカーの低分子
領域（泳動距離が長い領域）でSDSあるいはLDS単体では
はっきりしなかったバンドが２つに分離されている。こ
のことから、本発明で主眼としている低分子タンパク質
の分離には、界面活性剤を混合する方法が有効であるこ
とが判明した。

【００４１】

【発明の効果】従来、低分子タンパク質の電気泳動を行
うためには、毒性を有し、かつ作製も煩雑なポリアクリ
ルアミドゲルを用いるのが一般的であった。しかし、本
発明の電気泳動方法を用いれば、毒性がなく作製も容易
なアガロースゲルにより、低分子タンパク質の電気泳動
を行える。しかも、操作が簡便な水平サブマリン型電気
泳動装置で実施が可能であることから、全体として極め
て容易に低分子タンパク質の電気泳動が行える。

【図面の簡単な説明】

【図１】一般的なサブマリン型の電気泳動方法を示す図

【図２】本発明の一実施例における電気泳動のアガロー
スゲル濃度依存性を示す図

【図３】本発明の一実施例における電気泳動の泳動用緩
衝液依存性を示す図

【図４】本発明の一実施例における電気泳動のSDS濃度
依存性を示す図

【図５】本発明のゲル圧縮方法を示す図

【図６】本発明のゲル非等方的直線状圧縮方法を示す図

【図７】本発明のゲル非等方的関数曲線状圧縮方法を示
す図

【図８】本発明の部分的ゲル圧縮方法を示す図

【図９】本発明の一実験例を説明するための写真により
示した図

【図１０】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１１】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１２】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１３】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１４】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１５】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１６】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【図１７】本発明の実験例を説明するための写真により
示した図

【符号の説明】

１電気泳動槽 ２電極 ３アガロースゲル ４泳動用緩衝液 ５溝 ６試料 ７泳動槽の蓋 ８ゲル変形前の上面

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 山崎 伸彦 東京都中央区日本橋小舟町５番７号 株式 会社アドバンス内 Ｆターム(参考） 2G045 BB52 DA36 FB05

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】物理的強度が低いアガロースゲルを主成分
   とする電気泳動担体を有する電気泳動装置。
2. 【請求項２】前記アガロースゲルの濃度が８％以下であ
   る請求項1に記載の電気泳動装置。
3. 【請求項３】泳動用緩衝液に界面活性剤を含む請求項１
   記載の電気泳動装置。
4. 【請求項４】前記泳動用緩衝液がトリス系緩衝液である
   請求項３記載の電気泳動装置。
5. 【請求項５】前記泳動用緩衝液がトリス-グリシン緩衝
   液である請求項３記載の電気泳動装置。
6. 【請求項６】前記泳動用緩衝液がトリス-酢酸-EDTA（TA
   E）緩衝液である請求項３記載の電気泳動装置。
7. 【請求項７】前記泳動用緩衝液がトリス-ホウ酸-EDTA
   （TBE）緩衝液である請求項３記載の電気泳動装置。
8. 【請求項８】前記泳動用緩衝液がトリス-トリシン緩衝
   液である請求項３記載の電気泳動装置。
9. 【請求項９】ゲルの厚さが８mm以下である請求項１〜６
   記載の電気泳動装置。
10. 【請求項１０】前記界面活性剤が濃度0.05〜0.2％の陰
    イオン性界面活性剤である請求項3記載の電気泳動装
    置。
11. 【請求項１１】前記界面活性剤が濃度0.05〜0.2％のド
    デシル硫酸ナトリウム(SDS)である請求項3記載の電気泳
    動装置。
12. 【請求項1２】前記界面活性剤が濃度0.05〜0.2％のドデ
    シル硫酸リチウム(LDS)である請求項3記載の電気泳動装
    置。
13. 【請求項1３】泳動用緩衝液または電気泳動担体の少な
    くとも一方に複数の界面活性剤の混合物を含む電気泳動
    装置。
14. 【請求項1４】前記混合物がドデシル硫酸ナトリウム(SD
    S)とドデシル硫酸リチウム(LDS)を含む請求項１１記載
    の電気泳動装置。
15. 【請求項１５】試料が分子量330kD以下のタンパク質で
    ある請求項１〜１４記載の電気泳動装置。
16. 【請求項１６】アガロースを主成分としたゲルであっ
    て、当該ゲルを圧縮して密度を高めて得られた電気泳動
    担体を有する電気泳動装置。
17. 【請求項１７】泳動用緩衝液とは異なる液体を用いて得
    られた電気泳動担体を有する電気泳動装置。
18. 【請求項１８】前記液体が純水である請求項１７記載の
    電気泳動装置。
19. 【請求項１９】前記液体がアルカリ性のイオン溶液であ
    る請求項１７記載の電気泳動装置。
20. 【請求項２０】前記液体が酸性のイオン溶液である請求
    項１７記載の電気泳動装置。
21. 【請求項２１】前記液体が泳動用緩衝液を希釈した液体
    である請求項１７記載の電気泳動装置。
22. 【請求項２２】同一電気泳動担体の電気泳動パターンを
    複数の媒体に転写して記録する電気泳動パターンの測定
    方法。