JP2014196914A - 電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】所望の濃度勾配を有する電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法を提供する。【解決手段】電気泳動用分離媒体の製造装置であって、電気泳動用分離媒体の前駆体を含む第１溶液と、第１溶液とは前駆体の濃度が異なる第２溶液とが、混合比を線形に変化させながら混合され、得られた混合液が注入される注入容器１０ａと、注入容器１０ａの内部空間１０ｘに配置されることで内部空間１０ｘの容積を低減させ、内部空間１０ｘに混合液を注入したときの混合液の液面高さの変化量に対する混合比の変化量を低減させる充填部材１３と、を有する電気泳動用分離媒体の製造装置。【選択図】図２

Description

本発明は、電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法に関するものである。

近年、タンパク質の研究分野において「プロテオーム解析」が盛んに行われている。「プロテオーム」とは、特定の細胞、器官および臓器など、ある生物学的な系において存在しているタンパク質全体のことである。プロテオーム解析によれば、プロテオームに含まれる個々のタンパク質を特定することができ、例えば、正常細胞と癌細胞とのプロテオーム同士を比較することで、癌に特有のタンパク質を特定し、癌の治療方法を検討する、といった効果的な研究への応用が期待されている。

プロテオーム解析においては、タンパク質の分離手法として、ゲル電気泳動が広く用いられている。ゲル電気泳動では、通常、水と、水を担持する高分子量の担体分子と、を含むゲル状の分離媒体（電気泳動用分離媒体）を用いる。

分離媒体は平面視矩形を呈し、一端側にタンパク質の混合物などの分析対象物を付して用いる。分析対象物を付した分離媒体について、一端側と他端側とに電位差を生じさせると、荷電粒子であるタンパク質がゲル内を移動する。その際、ゲル中の担体分子がタンパク質の移動を遮る「分子ふるい効果」のため、タンパク質の電荷、分子量、形等の違いに基づいて、電圧印加時に単位時間当たりのタンパク質の移動距離が異なる。その結果、分析対象物に含まれる複数のタンパク質を個別に分離することができる。

このようなゲル電気泳動としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ：Polyacrylamide Gel Electrophoresis）や等電点電気泳動、これらを組み合わせた二次元電気泳動等が知られている。ＰＡＧＥは、担体分子としてポリアクリルアミドを含むゲルを用い、タンパク質の分子量の差を検出する方法である。等電点電気泳動は、泳動方向にｐＨの勾配が形成された分離媒体を用い、タンパク質の等電点の差を検出する方法である。二次元電気泳動は、一次元目の電気泳動として等電点電気泳動を行った後、一次元目の泳動方向と直交する方向に、二次元目の電気泳動としてＰＡＧＥを行うことで、分解能を高めた方法である。

ＰＡＧＥで用いる分離媒体においては、分解能を高めるため、泳動方向に包含するポリアクリルアミドの濃度に勾配を形成したものが知られている（例えば、特許文献１参照）。このような濃度勾配が形成されたアクリルアミドゲルや、等電点電気泳動で用いるｐＨ勾配ゲルは、例えば、担体分子の前駆体溶液を２種の濃度で用意し、連続的に送液量を変化させながら混合することで２種の前駆体溶液の混合比を変化させて混合溶液を注入容器に注入し、その後モノマーを重合させることで、指定の濃度勾配を有するゲルを製造することができる（例えば、特許文献２参照）。

特開昭６３−２９８０４４号公報 特開平１−２６３５４８号公報

しかしながら、上述の方法では、様々な濃度勾配を有するゲルを作製する為には、目的の濃度勾配になるように２種の前駆体溶液の混合比をシミュレートし、送液量を正確に制御して注入容器に注ぎ込む必要がある。しかし、このような方法では、シミュレートした濃度勾配と実際に得られるゲルの濃度勾配とに誤差が生じやすく、所望の濃度勾配を有する分離媒体を容易に作製することが困難である。
また、ｐＨ勾配ゲルに関しては前駆体溶液状態のｐＨと重合後のゲルｐＨは異なるが、送液中の２種の前駆体混合溶液のｐＨを測定できないため、フィードバック制御によって所望のｐＨ勾配を有するｐＨ勾配ゲルを作製できないことも困難な理由として挙げることができる。

本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであって、所望の濃度勾配を有する電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法を提供することを目的とする。

上記の課題を解決するため、本発明の一形態は、電気泳動用分離媒体の製造装置であって、前記電気泳動用分離媒体の前駆体を含む第１溶液と、前記第１溶液とは前記前駆体の濃度が異なる第２溶液とが、混合比を線形に変化させながら混合され、得られた混合液が注入される注入容器と、前記注入容器の内部空間に配置されることで前記内部空間の容積を低減させ、前記内部空間に前記混合液を注入したときの前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量を低減させる充填部材と、を有する電気泳動用分離媒体の製造装置を提供する。

本発明の一形態においては、前記充填部材は、複数の小片を有し、前記小片が集積されて前記充填部材を形成している構成としてもよい。

本発明の一形態においては、前記充填部材は、前記内部空間を仕切り、前記混合液が注入されない空間を形成する板材である構成としてもよい。

本発明の一形態においては、前記充填部材は、表面が親水性である構成としてもよい。

本発明の一形態においては、前記充填部材には、前記内部空間に前記充填部材を配置したときの、前記内部空間に注入した前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量に関する情報が付されている構成としてもよい。

本発明の一形態は、電気泳動用分離媒体の製造方法であって、前記電気泳動用分離媒体の前駆体を含む第１溶液と、前記第１溶液とは前記前駆体の濃度が異なる第２溶液とが、混合比を線形に変化させながら混合し、得られた混合液を注入容器に注入する工程と、前記混合液に含まれる前記前駆体を重合させる工程と、を有し、前記注入する工程においては、前記注入容器の内部空間の容積を局所的に低減させておくことで、前記内部空間に前記混合液を注入したときの前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量を低減させる電気泳動用分離媒体の製造方法を提供する。

本発明によれば、所望の濃度勾配を有する電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法を提供することができる。

第１実施形態に係る製造装置を有する製造システムの概略図である。 第１実施形態の製造装置の概略組立図である。 第１実施形態の製造装置の模式図である。 第１実施形態の分離媒体の製造方法の説明図である。 第１実施形態の分離媒体の製造方法の説明図である。 第１実施形態の製造装置を有する製造システムの変形例を示す図である。 第２実施形態の製造装置に係る製造装置を示す模式図である。 第３実施形態の製造装置に係る製造装置を示す模式図である。 第４実施形態の製造装置に係る製造装置を示す模式図である。 第４実施形態の製造装置に係る製造装置を示す模式図である。 第５実施形態の製造装置に係る製造装置１０Ｆを示す模式図である。 実施例で用いた製造装置の内部空間および充填部材を示す模式図である。 実施例の結果を示すグラフである。 実施例の結果を示す写真である。

［第１実施形態］
以下、図を参照しながら、本実施形態に係る電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法について説明する。なお、以下の全ての図面においては、図面を見やすくするため、各構成要素の寸法や比率などは適宜異ならせてある。

以下の説明においては、まず本実施形態に係る電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法における製造目的物である電気泳動用分離媒体（以下、単に「分離媒体」と称することがある）について説明し、その後、電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法について説明する。

［分離媒体］
本実施形態に係る電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法は、目的物として、水と、水を担持する高分子量の担体分子と、を含むゲル状の分離媒体を製造する。製造される分離媒体においては、ｐＨや担体分子の濃度に勾配を有する。

（１．ｐＨ勾配）
ｐＨに勾配を有する分離媒体、例えば、通常知られた固定化ｐＨ勾配ゲル（ＩＰＧゲル：Immobilized pH gradient gel）は、（ｉ）置換基を有していてもよいアクリルアミド（以下、アクリルアミド系モノマーと称することがある）と、（ｉｉ）アクリルアミド系モノマーと共重合可能な架橋剤と、（ｉｉｉ）アクリルアミド系モノマーと共重合可能であり、且つ水中で酸性を示す解離基（酸性基）または塩基性を示す解離基（塩基性基）を有するアクリルアミド誘導体と、を重合させて製造する。

（ｉ）アクリルアミド系モノマーとしては、例えば、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、ジアセトンアクリルアミドなどを挙げることができる。

（ｉｉ）架橋剤としては、例えば、ビスアクリルアミド、ピペラジンジアクリルアミド、ジアリルテトラジアミド、ビスアクリロイルシスタミンなど、アクリルアミド系モノマーが有するアクリル基やアミノ基に共重合可能な官能基を２以上有するモノマーを挙げることができる。

（ｉｉｉ）アクリルアミド誘導体が有する酸性基としては、カルボキシ基、スルホ基を挙げることができ、塩基性基としてはアミノ基を挙げることができる。

重合開始剤としては、例えば過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）を挙げることができる。また、重合促進剤としては、例えばテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を挙げることができる。

このような（ｉ）アクリルアミド系モノマー、（ｉｉ）架橋剤、（ｉｉｉ）アクリルアミド誘導体を重合させることにより、アクリルアミド系モノマーと架橋剤とが重合した担体分子とし、さらに、担体分子の側鎖に酸性基または塩基性基を導入する。

重合においては、酸性基を有するアクリルアミド誘導体を溶解した前駆体溶液と、塩基性基を有するアクリルアミド誘導体を溶解した前駆体溶液とを用意する。ここで、酸性の前駆体溶液は、本発明における第１溶液に該当し、塩基性の前駆体溶液は、本発明における第２溶液に該当する。塩基性の前駆体溶液は、酸性の前駆体溶液とは、酸性基を有するアクリルアミド誘導体や塩基性基を有するアクリルアミド誘導体の濃度が異なっている。

酸性の前駆体溶液は、目的のｐＨ勾配の始点と同等または低いｐＨ（例えばｐＨ３の酸性溶液）となるように調整し、塩基性の前駆体溶液は、目的のｐＨ勾配の終点と同等または高いｐＨ（例えばｐＨ１０の塩基性溶液）となるように調整する。さらに、一方にグリセロール（グリセリン）を加え高比重溶液とする。

このようにして調製した２種の前駆体溶液を、連続的に送液速度を変化させながら混合することで前駆体溶液の混合比を変化させながら、分離媒体の製造装置に流し入れる。その際、２種の前駆体溶液のうち、グリセロールを加えていない方の送液速度を漸増し、グリセロールを加えた高比重溶液の送液速度を漸減するようにして送液することで、前駆体溶液の混合液は徐々に比重が減少することとなる。すなわち、分離媒体の製造装置内においては、ｐＨ勾配とともに比重の勾配も形成されることとなり、前駆体のｐＨ勾配が崩れにくくなる。
その後、分離媒体の製造装置内で、前駆体を重合させることで、酸性基と塩基性基の存在比に勾配を形成し、ｐＨ勾配を有する担体分子が得られる。担体分子は水を保持するため、全体としてゲル状となり、目的物である分離媒体が得られる。

（２．担体分子の濃度勾配）
担体分子の濃度に勾配を有する分離媒体については、（ｉ）アクリルアミド系モノマーと、（ｉｉ）架橋剤と、の合計の濃度が異なる２種の前駆体溶液を用意し、さらに、一方にグリセロール（グリセリン）を加え高比重溶液とする。ここで、２種の前駆体溶液は、一方が本発明における第１溶液に該当し、他方が本発明における第２溶液に該当する。

これら２種の前駆体溶液を、上述したように連続的に送液速度を変化させながら混合することで前駆体溶液の混合比を変化させ、モノマーを重合させて製造する。これにより、担体分子の濃度に勾配が形成された分離媒体が得られる。

本実施形態に係る電気泳動用分離媒体の製造装置および電気泳動用分離媒体の製造方法を用いると、上記のような濃度勾配を有する分離媒体において、１つの分離媒体内で濃度勾配を変化させる分離媒体を容易に製造することができる。

［電気泳動用分離媒体の製造装置］
図１は、本実施形態に係る電気泳動用分離媒体の製造装置を有する製造システム１００の概略図である。図に示すように製造システム１００は、分離媒体の製造装置１０Ａと、前駆体溶液を貯留する貯留部２０と、前駆体溶液を送液する送液装置３０とを有する。

製造装置１０Ａは、内部に前駆体溶液が流し込まれ、重合させることで目的物である分離媒体が形成される容器である。詳しくは後述する。

貯留部２０は、少なくとも２つの貯留部２１，２２を有している。貯留部２１，２２には、上述したような２種の前駆体溶液がそれぞれに貯留される。

送液装置３０は、一端が貯留部２１に接続され、貯留部２１から前駆体溶液を排出する配管３１ａと、配管３１ａの途中に配設された送液ポンプ３１と、一端が貯留部２２に接続され、貯留部２２から前駆体溶液を排出する配管３２ａと、配管３２ａの途中に配設された送液ポンプ３２と、配管３１ａ，３２ａの他端が接続されるミキサー３３と、ミキサー３３と製造装置１０Ａとを接続する配管３４と、を有する。

送液ポンプ３１，３２は、合計の送液量を一定に保ちつつ、例えば送液ポンプ３１は送液速度を漸増させ、送液ポンプ３２は送液速度を漸減させることで、２種の前駆体溶液の仕込み量を変化させるように制御される。送液ポンプ３１，３２としては、ペリスタティックポンプやピエゾポンプのような、配管の外部から押圧することにより前駆体溶液に非接触で送液が可能であるポンプが好ましい。

ミキサー３３は、前駆体溶液の送液経路内に設けられ、２種の前駆体溶液を混合する。ミキサー３３としては、通常知られたスタティックミキサーを用いることができる。

図２，３は、製造装置１０Ａの模式図である。図２は、製造装置１０Ａの概略組立図である。図３（ａ）は、製造装置１０Ａの正面視における断面図であり、図３（ｂ）は、製造装置１０Ａの側面視における断面図である。製造装置１０Ａは、第１部材１１と第２部材１２と充填部材１３とを有している。

図２に示すように、第１部材１１は、板状の主部１１ａと、主部１１ａの主面に設けられた２つの側壁１１ｂおよび側壁１１ｂ同士を接続する底部１１ｃと、を有している。第２部材１２は、板状を呈する部材である。

また、主部１１ａには、形成されるゲルを保持するための保持シート５０が配置される。保持シート５０としては、例えば、ｌｏｎｚａ社製のゲルボンドフィルムを用いることができ、ゲルの保持面が第２部材１２に対向するように配置されている。保持シート５０は、第２部材１２に配置されることとしてもよい。その場合、保持シート５０におけるゲルの保持面が第１部材１１の主部１１ａに対向するように配置される。

このような、第１部材１１と第２部材１２とは、第２部材１２が第１部材１１の側壁１１ｂおよび底部１１ｃと接するように第１部材１１と脱着自在に接合されることで、注入容器１０ａを形成する。第１部材１１と第２部材１２との接合は、前駆体溶液が漏れ出すことが無ければ種々の方法を採用することができ、例えば、クリップ状の部材を用いた把持や、ボルト止めなどを選択することができる。

注入容器１０ａは、第１部材１１と第２部材１２とで囲まれた内部空間１０ｘを有する容器である。内部空間１０ｘは例えば直方体であり、内部空間１０ｘの体積、すなわち注入容器１０ａの容積、は設計値または実測値から既知の値である。

これら第１部材１１、第２部材１２は、前駆体溶液による腐食や劣化が生じにくいまたは生じない材料を用いて形成することができる。このような形成材料としては、例えば、ガラスが挙げられる。

また、第１部材１１、第２部材１２は、光透過性を有する材料を用いて形成すると、分離媒体の製造時に内部の様子が観察できるため、操作が容易となり好ましい。

なお、図では、第１部材１１は、第１部材１１の側壁１１ｂおよび底部１１ｃが主部１１ａと一体となっていることとして示したが、これに限らない。例えば、主部１１ａとして、第２部材１２と同様の板状の部材を用い、主部１１ａと第２部材１２との間に、複数のスペーサと、正面視Ｕ字状としたシリコンチューブと、を配置して挟持することで、注入容器１０ａを構成することとしてもよい。このような構成の場合、板状部材である主部１１ａおよび第２部材１２と、シリコンチューブと、で囲まれた空間が内部空間１０ｘとなる。

このような構成によれば、形成される分離媒体の厚みをスペーサで規定しながら、シリコンチューブで前駆体溶液の漏れを防ぐことができる。

充填部材１３は、注入容器１０ａの容積を調整する部材であり、内部空間１０ｘに配置して用いる。本実施形態の充填部材１３は、直方体状のブロックである。充填部材１３は、例えば、第１部材１１と第２部材１２とに挟持され、図３（ａ）に示すように、内部空間１０ｘにおいて一方の側壁１１ｂに接し、図３（ｂ）に示すように、主部１１ａに配置された保持シート５０および第２部材１２の内壁に接している。また、充填部材１３は、両面テープのような粘着部材を用いて内部空間１０ｘに配置することとしてもよい。

充填部材１３の形成材料としては、例えば、金属、ガラス、セラミック、セルロース、樹脂材料などを挙げることができ、表面が親水性を示すように加工されていてもよい。
本実施形態の製造装置は、以上のような構成となっている。

［電気泳動用分離媒体の製造方法］
次に、製造装置１０Ａを用いた、濃度勾配を有する分離媒体の製造方法について説明する。以下の説明においては、泳動方向にｐＨ勾配が変化するＩＰＧゲルを製造する方法について説明する。本実施形態の製造方法においては、上記製造システム１００を用いるものとし、適宜図１、２に示した符号を用いて説明する。

図４、５は、分離媒体の製造方法の説明図であり、各図（ａ）は、製造装置１０Ａの正面視における断面図、各図（ｂ）は、形成されるＩＰＧゲルのｐＨ勾配を示すグラフである。各図（ｂ）のグラフでは、横軸がＩＰＧゲルにおける酸性端からの距離、縦軸がｐＨを示している。

まず、図４を用い、製造装置１０Ａとして、充填部材１３を備えないもの（すなわち、注入容器１０ａ）を用いて、ｐＨが４から７に線形で変化するようなｐＨ勾配を有する分離媒体を形成する場合を考える。例えば、貯留部２１には酸性の前駆体溶液を貯留し、貯留部２２には塩基性の前駆体溶液を貯留して、送液ポンプ３１，３２による送液速度は一定としたままで、送液ポンプ３１の送液速度を線形で漸減、送液ポンプ３２の送液速度を線形で漸増させて製造装置１０Ａに注入し、重合させる。これにより、線形のｐＨ勾配を有する分離媒体を形成することができる。

このとき、図４（ａ）に示すように、製造装置１０Ａに注入した前駆体溶液Ｍの体積（すなわち形成されるＩＰＧゲルの体積）をＶ、正面視における製造装置１０Ａ内の前駆体溶液Ｍの横幅をＬ_ｗ、奥行きをＬ_ｄ、高さをＬ_ｈとすると、図４（ｂ）に示すｐＨ勾配の傾きｋは、ｋ＝（７−４）／Ｌ_ｈとなる。

次に、充填部材１３を備える製造装置１０Ａを用いる場合、前駆体溶液の送液速度を一定とすると、図５（ａ）に示すように、製造装置１０Ａに注入した前駆体溶液Ｍの量を一定とすると、前駆体溶液Ｍの高さＬ_ｈ２は、充填部材１３の体積Ｖ_Ａ分だけ図４（ａ）に示す高さＬｈから高くなる。Ｌ_ｈ２とＬ_ｈとの差は、充填部材１３の体積を製造装置１０Ａの底部の面積で除した値（Ｖ_Ａ／（Ｌ_ｗ×Ｌ_ｄ））である。

このとき、図５（ｂ）に示す領域ＡＲ１においては、図４の状態と比べ、製造装置１０Ａ内の容積の変更がないため、ｐＨ勾配の傾きｋは、ｋ＝（７−４）／Ｌ_ｈとなる。

一方、図５（ｂ）に示す領域ＡＲ２においては、前駆体溶液の送液速度が一定であるのに対し、容積が低減しているため、前駆体溶液の液面高さの変化速度が速くなる。その結果、ｐＨ勾配の傾きｋＡは、ｋＡ＝ｋ×（Ｌ_ｗ−Ｌ_ｗＡ）／Ｌ_ｗとなり、領域ＡＲ１よりもｐＨ勾配の傾きが小さくなる。

このようにして、前駆体溶液を注入した後、重合開始剤の反応開始温度以上に加熱し、前駆体を重合させ、分離媒体を得る。分離媒体は、保持シート５０に付着して形成され、製造装置１０Ａから第２部材１２および充填部材１３を取り外し分解することで、保持シート５０ごと取り出すことが可能である。

得られた分離媒体は、そのまま用いることとしてもよく、適宜乾燥させて保存することとしてもよい。乾燥させた分離媒体は、水や電気泳動に用いる展開溶媒に浸漬することで、ゲル状になる。また、乾燥させた分離媒体は、保持シート５０ごと短冊状に切削して用いることとしてもよい。このような短冊状の分離媒体は、二次元電気泳動の一次元目の分離媒体に好適に用いられる。
以上のようにして、電気泳動用分離媒体を製造することができる。

以上のような電気泳動用分離媒体の製造装置によれば、容易に濃度勾配を有する分離媒体を製造することが可能となる。

また、以上のような電気泳動用分離媒体の製造方法によれば、容易に濃度勾配を有する分離媒体を製造することが可能となる。

なお、本実施形態の製造装置１０Ａは、貯留部毎に送液ポンプに接続されることとして示したが、これに限らない。

図６は、本実施形態の製造装置が適用される製造システムの変形例を示す概略図であり、図１に対応する図である。図に示すように製造システム２００は、分離媒体の製造装置１０Ａと、前駆体溶液を貯留する貯留部２０と、前駆体溶液を送液する送液装置４０と、を有する。

送液装置４０は、一端が貯留部２１に接続され、貯留部２１から前駆体溶液を排出する配管４１ａと、配管４１ａの途中に配設された弁４１と、一端が貯留部２２に接続され、貯留部２２から前駆体溶液を排出する配管４２ａと、配管４２ａの途中に配設された弁４２と、配管４１ａ，４２ａの他端が接続されるミキサー４３と、ミキサー４３と製造装置１０Ａとを接続する配管４４と、配管４４の途中に配設された送液ポンプ４５と、を有する。

弁４１，４２は、例えば弁４１は開度を漸増させ、弁４２は開度を漸減させることで、２種の前駆体溶液の仕込み量を変化させるように制御される。弁４１，４２としては、通常知られた電磁弁を用いることができる。

ミキサー４３は、前駆体溶液の送液経路内に設けられ、２種の前駆体溶液を混合する。ミキサー４３としては、上述のミキサー３３と同様のものを用いることができる。

送液ポンプ４５は、合計の送液量を一定に保ちながら、ミキサー４３で混合された前駆体溶液を送液する。送液ポンプ４５としては、上述の送液ポンプ３１，３２と同様のものを用いることができる。

このような製造システム２００においては、送液ポンプが共通化されているため、操作が容易である。また、上述の製造システム１００と同様に、製造装置１０Ａにおいて、充填部材１３を用いることで、容易に濃度勾配を有する分離媒体を製造することが可能となる。

［第２実施形態］
図７は、第２実施形態の製造装置に係る製造装置１０Ｂを示す模式図であり、図５（ａ）に対応する図である。第１実施形態の製造装置１０Ａにおいては、充填部材１３として直方体の部材を１つ有することとして示したが、本実施形態の製造装置１０Ｂは、充填部材１４として、複数の小片１４ａを用いることとしている。

このような充填部材１４においては、図７（ａ）に示すように、充填部材１４が全体として直方体状となるように小片１４ａを集積して配置してもよく、図７（ｂ）に示すように、内部空間１０ｘの高さ位置によって配置されている小片１４ａの数が異なるように配置することとしてもよい。

このような充填部材１４を有する製造装置１０Ｂにおいては、濃度勾配を段階的に多段に制御することが容易となる。例えば、図７（ｂ）の製造装置１０Ｂでは、領域ＡＲ１から領域ＡＲ４の４種に対応した４段階の濃度勾配を有する分離媒体を製造することができ、多段に濃度勾配が変化する分離媒体を容易に製造することが可能となる。

また、例えば複数の小片１４ａを用いた充填部材１４で、予め内部空間１０ｘの容積を低減させた状態（以下、「基準状態」と称する）としておくと、基準状態から小片１４ａの使用数を減らすことで、前駆体溶液が注入される空間の容積を基準状態から増やすように変化させることができる。製造装置１０Ｂをこのように用いることで、所望の濃度勾配を有する分離媒体を製造しやすくなる。

［第３実施形態］
図８は、第３実施形態の製造装置に係る製造装置１０Ｃを示す模式図であり、図５（ａ）に対応する図である。第１実施形態の製造装置１０Ａにおいては、充填部材１３としてブロック状の部材を１つ有することとして示したが、本実施形態の製造装置１０Ｃは、充填部材１５として、複数の板材１５ａを用いることとしている。

このような充填部材１５を有する製造装置１０Ｃにおいては、板材１５ａの配置位置や板材１５ａの大きさ変更の自由度が高く、充填部材１５による内部空間の容積制御の自由度が高まる。そのため、濃度勾配が変化する分離媒体を容易に製造することが可能となる。

また、充填部材１５で、予め内部空間１０ｘの容積を低減させた状態（以下、「基準状態」と称する）としておくと、基準状態から充填部材１５を構成する板材１５ａの配置位置や大きさを変更することで、前駆体溶液が注入される空間の容積を基準状態から増やすように変化させることができる。製造装置１０Ｃをこのように用いることで、所望の濃度勾配を有する分離媒体を製造しやすくなる。

［第４実施形態］
図９，１０は、第４実施形態の製造装置に係る製造装置１０Ｄを示す模式図であり、図５に対応する図である。第１実施形態の製造装置１０Ａにおいては、充填部材１３として直方体状の部材であることとしたが、充填部材の機能としては、注入容器１０ａの内部空間の容積を制御することができれば、形状は限定されない。

例えば、図９（ａ）に示す製造装置１０Ｄにおいては、充填部材１６と前駆体溶液Ｍとの接触面が内部空間１０ｘの高さ方向に対して傾斜している。このような製造装置１０Ｄにおいては、図９（ｂ）に示すように、濃度勾配が連続的に変化した分離媒体となる。このとき濃度勾配は、下に凸となるように変化する。

また、図１０（ａ）に示す製造装置１０Ｅにおいては、充填部材１７と前駆体溶液Ｍとの接触面が下に凸の曲面となっている。このような製造装置１０Ｅにおいては、図１０（ｂ）に示すように、濃度勾配が連続的に変化した分離媒体となる。このとき濃度勾配は、上に凸となるように変化する。

このように、製造装置１０Ｄ，１０Ｅにおいては、濃度勾配を連続的に変化させた分離媒体を容易に製造することが可能となる。

なお、図１０に示した製造装置１０Ｅにおいては、充填部材１７と前駆体溶液Ｍとの接触面が下に凸の曲面となっていることとしたが、もちろん、前駆体溶液Ｍとの接触面が上に凸の曲面となっている充填部材を用いることとしてもよい。その場合、濃度勾配が下に凸となるように連続的に変化した分離媒体が得られる製造装置となる。

また、充填部材１６や充填部材１７は、部材の前駆体溶液Ｍとの接触面が全面にわたって斜面であったり曲面であったりすることとしているが、例えば、第１実施形態の充填部材１３の角部を面取りして曲面としたもののように、充填部材の一部に斜面や曲面が形成されていることとしても構わない。

［第５実施形態］
図１１は、第５実施形態の製造装置に係る製造装置１０Ｆを示す模式図であり、図１１（ａ）は概略斜視図、図１１（ｂ）は断面図である。

上述の実施形態の製造装置１０Ａ〜１０Ｅにおいては、充填部材が注入容器１０ａの第１部材１１と第２部材１２とで挟持されることとしていたが、これに限らない。本実施形態の製造装置１０Ｆにおいては、図１１に示すように、充填部材１８が第１部材１１に設置され、第２部材１２には接していない。保持シート５０は、充填部材１８に接し、第１部材１１と第２部材１２との中間位置付近に配置され、ゲルの保持面が第２部材１２に対向している。

このような充填部材１８を有する製造装置１０Ｆにおいては、保持シート５０に保持されるゲルが、正面視の幅方向において均質なものとなるため、歩留まりが高くなる。また、通常ＩＰＧゲルの厚みは数百μｍであるため、充填部材１８の厚みをわずかに変更するだけでも、ゲルの厚みに対しては十分な容積変化を生じさせることができ、ｐＨ勾配が変化する分離媒体を容易に製造することが可能となる。

なお、充填部材を配置した高さ位置において、注入容器１０ａにおける濃度勾配に対してどのように変化するかは、注入容器１０ａの内部空間１０ｘの断面積に対する充填部材の断面積の比として算出することができる。そのため、充填部材の表面に、どのように濃度勾配するかの情報を付しておくことで、複数の充填部材から、所望の濃度勾配を形成するための適切な充填部材を選択しやすくなる。

濃度勾配の情報は、具体的な情報を充填部材の表面に付しておくこととしてもよく、濃度勾配の情報をバーコードや二次元コードなどに変換したうえで、充填部材の表面に付しておくこととしてもよい。

以上、添付図面を参照しながら本発明に係る好適な実施の形態例について説明したが、本発明は係る例に限定されないことは言うまでもない。上述した例において示した各構成部材の諸形状や組み合わせ等は一例であって、本発明の主旨から逸脱しない範囲において設計要求等に基づき種々変更可能である。

本実施形態においては、ＩＰＧゲルを製造することとして説明したが、本発明の製造装置および製造方法を用いて、ＰＡＧＥ用の濃度勾配ゲルを製造することもできる。ＰＡＧＥ用の濃度勾配ゲルにおいて、濃度勾配を変化させることで、例えばターゲットとする試料の分子量が特定分子量領域に集まっている場合に、広範囲の分子量分離が可能というグラジエントゲルのメリットを確保した上で、当該ターゲット試料を含む領域を拡大することによって泳動結果を見やすくすることが可能となる。

［実施例］
以下に本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（分離媒体の製造）
（実施例１）
アクリルアミド、メチレンビスアクリルアミド、複数種のアクリルアミドバッファー（Acrylamido buffer、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、蒸留水を混ぜ合わせ、酸性の前駆体溶液（酸性溶液）および塩基性の前駆体溶液（塩基性溶液）を調整した。この際、酸性溶液は、ｐＨが３．５となるように複数種のアクリルアミドバッファーを適宜混合し、塩基性溶液は、ｐＨが１０．２となるように複数種のアクリルアミドバッファーを適宜混合した。さらに、塩基性溶液にグリセロールを混ぜ合わせた。

得られた酸性溶液および塩基性溶液に対し、各々酢酸または水酸化ナトリウム溶液を加えｐＨが中性になるように調整した後、重合開始剤としてＡＰＳ、重合促進剤としてＴＥＭＥＤをそれぞれの前駆体溶液に加えた。

次いで、酸性溶液及び塩基性溶液の２液を各々グラジエントミキサー（アドバンテック東洋株式会社製、型番ＣＨＧ０４２ＡＡ）に２０５０μＬずつセットし、混ぜ合わせる割合を連続的に変化させながら、保持シート（ゲルボンドフィルム、ｌｏｎｚａ社製）を内部に配置した製造装置に、１１μＬ／秒の流速で流し込んだ。

図１２は、実施例１で用いた製造装置の内部空間および充填部材を示す模式図である。図中の数字は各寸法を示しており、単位はｍｍである。充填部材の形成材料としては、親水性の高い材料であるポリイミド製のテープを用いた。製造装置の内部空間において、充填部材の垂直面と同じ高さ位置の領域をＡ領域、充填部材の斜面と同じ高さ位置の領域をＢ領域、底面から充填部材までの領域をＣ領域と称する。

酸性溶液及び塩基性溶液を製造装置に注入した後、さらに純水を重層し、５０℃で１時間加熱することで、モノマーを重合させてゲル化させた。製造装置から保持シートに保持されたゲル（分離媒体）を取り出し、純水で洗浄し、未重合バッファーを取り除いた。その後、ゲル表面上に保護フィルムを張り付ける為にグリセロール水溶液に置換した。

グリセロール水溶液に置換後、保持シートに保持された分離媒体を取り出し、分離媒体が十分に乾燥するまで室温で放置した。分離媒体が十分に乾燥したことを確認した後、乾燥した分離媒体の表面に保護フィルムを接着し、その後、保護フィルムと保持シートに挟持された分離媒体を、短冊状に切断することで、実施例１の分離媒体１を製造した。

（比較例１）
製造装置が、充填部材を有さないこと以外は、実施例１と同様にして、比較例１の分離媒体２を製造した。充填部材を有さない製造装置に、酸性溶液及び塩基性溶液をそれぞれ２０５０μＬずつ注入すると、製造装置の底部から約７０ｍｍ程度の長さを有する分離媒体が得られる。

（分離媒体の評価１）
分離媒体１および分離媒体２を、それぞれ、尿素、チオ尿素、3-（3-cholamidepropyl）dimethylammonio-1-propanesulphonate（ＣＨＡＰＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、両性電解質（Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）および等電点が既知であるペプチド９種類を混ぜ合わせた溶液に浸漬し、１６時間放置した。

浸漬後、分離媒体を取り出し、等電点電気泳動を行って、製造した分離媒体１，２のｐＨ勾配の確認を行った。結果を表１及び図１３に示した。
表１に示した９種の等電点は、等電点電気泳動を行った９種のペプチドの等電点である。
図１３は、表１の結果をグラフ化したものであり、横軸は酸性端からの距離（単位：ｍｍ）、縦軸はｐＨを示している。図１３のグラフから、実測値に基づいた分離媒体１，２のｐＨ勾配を算出することができる。

表１に示すように、比較例１の分離媒体２において、ｐＨ８．８のペプチドは酸性端から４７．３ｍｍの位置に検出された。分離媒体２の泳動方向における全長を７０ｍｍとすると、塩基性端（製造装置下部）から、７０−４７．３＝２２．７ｍｍの位置となる。

図１２に示したように、実施例１で用いた製造装置において、Ａ領域とＢ領域との境界は、製造装置下部から２２ｍｍの高さ位置である。そのため、比較例１の分離媒体２において２２．７ｍｍの位置に検出されたｐＨ８．８のペプチドは、実施例１の分離媒体１において、Ａ領域とＢ領域との境界近傍に検出されると予想できる。

そこで、実施例１の分離媒体１において、ｐＨ４〜８．８区間のｐＨ勾配を算出する場合、ペプチドマーカーはＡ領域に存在し、ｐＨ８．８〜１０．１区間のｐＨ勾配を計算する場合、ペプチドマーカーはＢ領域に存在するものと仮定して計算した。

具体的には、分離媒体１のＡ領域のｐＨ勾配は、充填部材の存在により、分離媒体２におけるｐＨ４〜８．８区間のｐＨ勾配を６８／８０倍した値となるものとして理論値を算出した。

同様に、分離媒体１のＢ領域のｐＨ勾配は、分離媒体２におけるｐＨ８．８〜１０．１区間のｐＨ勾配を（６８＋（１２／２））／８０倍した値となるものとして理論値を算出した。

表２は、図１３のグラフから求められる分離媒体１，２におけるＡ領域およびＢ領域のｐＨ勾配の実測値、および分離媒体１におけるＡ領域およびＢ領域のｐＨ勾配の理論値をまとめたものである。

表２に示すように、実施例１においては、Ａ領域、Ｂ領域ともに、ｐＨ勾配の傾きの実測値は、理論値に近い値となっており、本発明における製造装置を用いることで、ｐＨ勾配の制御が可能であることが示された。

（分離媒体の評価２）
以下、当該充填部材なしで作製したＩＰＧゲルと充填部材ありで作製したＩＰＧゲルを比較の為５０ｍｍに切り出して２次元電気泳動を行った結果を述べる。

まず、分離媒体１および分離媒体２を、それぞれ、尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ、ＤＴＴ、Ａｍｐｈｏｌｙｔｅ、およびマウス肝臓を混ぜ合わせたサンプルバッファーに浸漬し、１６時間放置した。
浸漬後、分離媒体１，２を取り出し、一次元目の等電点電気泳動を行った。一次元目の電気泳動終了後、ＳＤＳを含む平衡化バッファーに分離媒体１，２を浸漬し、１０分程度振とうさせ、平衡化を行った。平衡化後、分離媒体１，２をそれぞれＰＡＧＥゲルに接続し、定法に従って二次元目の電気泳動であるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。

二次元目の泳動終了後、イメージスキャナーで撮像し、スポットを可視化した結果を図１４に示す。図１４（ａ）は、一次元目の電気泳動に分離媒体２を用いた評価の結果、図１４（ｂ）は、一次元目の電気泳動に分離媒体１を用いた評価の結果である。

図１４（ａ）において示した破線の両矢印と、図１４（ｂ）において示した実線の両矢印とは、同じ２つのスポットを結んでいる。図１４（ｂ）においては、図１４（ａ）において示したものと同じ破線両矢印を重ねて示している。

図に示すように、図１４（ａ）において示した破線の両矢印よりも、図１４（ｂ）において示した実線の両矢印の方が長くなっており、分離媒体１を用いて一次元目の電気泳動を行うと、分離媒体２を用いた場合と比べ、スポット間隔が広がっていることが確認出来た。

これらの結果から、本発明の有用性が確かめられた。

本発明は、生体サンプルの電気泳動において、高い分解能で生体サンプルの分離を行うことが可能な分離媒体として好適に利用可能である。

１０Ａ，１０Ｂ，１０Ｃ，１０Ｄ，１０Ｅ，１０Ｆ…製造装置、１０ａ…注入容器、１０ｘ…内部空間、１３，１４，１５，１６，１７，１８…充填部材、１４ａ…小片、１５ａ…板材

Claims (5)

1. 電気泳動用分離媒体の製造装置であって、
   前記電気泳動用分離媒体の前駆体を含む第１溶液と、前記第１溶液とは前記前駆体の濃度が異なる第２溶液とが、混合比を線形に変化させながら混合され、得られた混合液が注入される注入容器と、
   前記注入容器の内部空間に配置されることで前記内部空間の容積を低減させ、前記内部空間に前記混合液を注入したときの前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量を低減させる充填部材と、を有する電気泳動用分離媒体の製造装置。
2. 前記充填部材は、複数の小片を有し、前記小片が集積されて前記充填部材を形成している請求項１に記載の電気泳動用分離媒体の製造装置。
3. 前記充填部材は、前記内部空間を仕切り、前記混合液が注入されない空間を形成する板材である請求項１に記載の電気泳動用分離媒体の製造装置。
4. 前記充填部材には、前記内部空間に前記充填部材を配置したときの、前記内部空間に注入した前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量に関する情報が付されている請求項１から３のいずれか１項に記載の電気泳動用分離媒体の製造装置。
5. 電気泳動用分離媒体の製造方法であって、
   前記電気泳動用分離媒体の前駆体を含む第１溶液と、前記第１溶液とは前記前駆体の濃度が異なる第２溶液とが、混合比を線形に変化させながら混合し、得られた混合液を注入容器に注入する工程と、
   前記混合液に含まれる前記前駆体を重合させる工程と、を有し、
   前記注入する工程においては、前記注入容器の内部空間の容積を局所的に低減させておくことで、前記内部空間に前記混合液を注入したときの前記混合液の液面高さの変化量に対する前記混合比の変化量を低減させる電気泳動用分離媒体の製造方法。