JPH01263548A

JPH01263548A - 電気泳動用媒体

Info

Publication number: JPH01263548A
Application number: JP63092057A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Sugihara; 充杉原; Masashi Ogawa; 雅司小川
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1988-04-14
Filing date: 1988-04-14
Publication date: 1989-10-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）塩基配列決定、又は核
酸フラグメントの分離分取、又は蛋白に代表される生体
高分子物質等の分離分析のために用いられるポリアクリ
ルアミド系水性ゲルからなる膜（層）状。

又は柱状く角柱状又は円柱状（カラム状））の電気泳動
用ゲル媒体（以下、ゲル媒体又はゲルということがある
）に関するものであり、さらに詳しくは。

電気泳動方向にポリアクリルアミド系水性ゲル相対濃度
の高濃度−低濃度−高濃度の順の濃度勾配を有する膜状
又は柱状のポリアクリルアミド系水性ゲル（グラジェン
トゲル）電気泳動用ゲル媒体に間するものである。

［従来の技術］化学分解法、ジデオキシ法等による核酸（ＤＮＡ　。

ＲＮＡ）の塩基配列決定法においてはポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体膜（以下、ポリアクリルア
ミドゲル膜又はゲル膜ということがある）を用いたスラ
ブ電気泳動が必須の操作になっている。近年では電気泳
動分析が頻繁に利用されるようになっている。そしてジ
デオキシ法の発達により、核酸フラグメントの高分子量
部分まで精度よく分離できるポリアクリルアミドゲル膜
の要請が高まってきた。

一方、核酸の塩基配列決定のために、核酸塩基フラグメ
ントをその分子量の違いにより電気泳動分離する場合１
通常の濃度一定のポリアクリルアミドケル膜では２分離
したフラグメントのバンド間隔が低分子量部分ては広く
、高分子量部分ては狭くなる。このため核酸フラグメン
トの高分子量部分の分離が悪くなる。そこで低分子量部
分から高分子量部分まで広い分子量範囲にわたって均等
に良好な分離性能を得るために、電気泳動方向にポリア
クリルアミドゲル濃度又は緩衝液濃度に勾配をもたせた
ポリアクリルアミドゲル膜（グラジェントゲル膜）が使
用されている。

特開昭（ｉｏ−２３５８１９（ＥＰ　０１５９６９４Ａ
）にはポリアクリルアミド濃度（ゲル濃度又は孔径サイ
ズ）勾配を有するポリアクリルアミドゲル電気泳動用媒
体膜を、アクリルアミドと架橋剤を含む水溶液の薄層を
支持体の表面で電子ビーム等の電離放射線を用いて架橋
重合させて製造する方法及び装置が記載されている。こ
の方法に用いられる装置及び濃度勾配をゲル膜中に発現
させるための電子ビーム等のコントロール法はきわめて
複雑である。

特開昭６２−１８２６５６にはサンプル注入スロット側
のゲル濃度をｆｉ＜（１６％）、検出部側（サンプルが
泳動される１１）の濃度を薄く（８％）した２段の階段
状の濃度変化及び連続濃度変化のポリアクリルアミドゲ
ル膜が記載されている。このゲル膜は泳動中のＤＮＡフ
ラグメントをβ線検出器で検出する際に検出器部分て泳
動速度を早くして泳動像バンド間隔を広くシ、泳動像バ
ンド検出の分離能を向上させることができるものである
。しかしこの検出方法を適用するためのゲル膜の濃度勾
配については。

２段の階段状の濃度変化のほかには詳しい記載はない。

一般にグラジェントゲル膜は製造に手数がかかり、ａ度
勾配の再現性が悪＜、ｆＪｉ造に失敗することが多いた
めに、電気泳動方向に濃度を漸次的に増加させたもの以
外については、従来注目されていなかった。

［発明が解決しようとする課題］本発明の目的は核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）塩基配列決定
のために用いられるポリアクリルアミド系水性ゲル電気
泳動用媒体において、核酸フラグメントの低分子量部分
から高分子量部分までほぼ同等な良好な高分離性能を持
つ、改良されたポリアクリルアミド系水性ゲル濃度グラ
ジェントを有するゲル媒体を提供することである。

［課題を解決するための手段］本発明は、電気泳動方向に予め定められた濃度勾配（濃
度グラジェント）を有し、変性剤として少なくとも１個
のカルバモイル基を含む化合物を含むポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体において、アクリルアミド
系化合物、架橋剤、又は両者の濃度がサンプル注入部か
ら電気泳動方向に漸次的又は段階的に減少し、一定の濃
度の部分を経て、あるいは最小濃度の位置から直ちに漸
次的又は段階的に増加していることを特徴とする電気泳
動用媒体である。

［発明の構成の詳細な説明コ本発明のポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体
は、膜（又は層）状のゲル媒体と柱状（角柱状又は円柱
状（又はカラム状）のゲル媒体にほぼ同しく適用できる
ので、以下においては膜（又は層）状のゲル媒体（ゲル
媒体膜）を主にして説明する。

ゲル媒体に用いることができるアクリルアミド系化合物
（単量体）の例としては、アクリルアミド。

Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド。

ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログ
がある。これらの化合物は単独で、又は２種以上を組合
せて用いることができる。これらの化合物のうちではア
クリルアミドが好ましく、またアクリルアミドと他のア
クリルアミド系化合物の１種以上との併用も好ましい。

架橋剤としてはｒＥＩｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＪ　
、７（４）＋２１３−２１９（１９８１）、同誌２（４
）、２２０−２２８（１９８１）等に記載の二官能性架
橋剤化合物、特開昭６１−２０５８等に記載の三官能性
以上の架橋剤化合物を用いることができる。二官能性架
橋剤の具体例として、Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアクリル
アミド（８１５）　；　Ｎ、Ｎ’−プロピレンビスアク
リルアミド（ＰＢＡ）　ニジアクリルアミドジメチルエ
ーテル（ＤＡε）　；　１，２−ジアクリルアミドエチ
レングリコール（ＤＥＣ）　；エチレンウレアビスアク
リルアミド（Ｅｕ２Ｏ）　；エチレンジアクリレ−）（
ＥＤＡ）　；　Ｎ、Ｎ’−ジアリルタルタルジアミド（
ＤＡＴＤ）　；　Ｎ。

Ｎ′−ビスアクリリルシスタミン（ＢＡＣ）がある。二
官能性架橋剤の具体例として、　１．３．５−　）リア
クリロイルへキサヒドロ−５−）リアジン（ＴＡＨＴ）
　；　）リアリルシアヌレート　（ＴＡＣ）　；　）リ
アリルイソシアヌレート（ＴＡＩＣ）等がある。これら
の架橋剤のうちでＢＩＳとＴＡ）ＩＴが好ましい。架橋
剤は２ｉ以上を組合わせて用いることもできる。

架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約０
．５ｗ％から約３０ｗ％、好ましくは約１．０冒％から
約１０ν％の範囲で用いられる。

ゲル媒体を形成するためのゲル形成用水溶液には液の粘
度を調整する目的及び他の諸目的でアガロース、水溶性
ポリマー（例、水溶性セルロース誘導体、ポリアクリル
アミド）の１種類又は２種類以上を添加することができ
る。

アガロースとしては、特開昭５５−５７３０　、特開昭
５５−１１０９４６．特表昭５７−５０２０９８　、特
開昭５９−１２６２３６等に記載の低電気浸透性アガロ
ース、中電気浸透性アガロース、高電気浸透性アガロー
スのいずれも用いることができる。アガロースの添加量
は単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して、約０
、１ｗ／ｖ％から約２．Ｏｗ／ｖ％、好ましくは約０．
２ｗ／ｖ％から約１．２ｗ／ｖ％の範囲である。

水溶性ポリマーとしては、特開昭５９−１２６２３６　
。

特開昭６０−６０５４８等に記載の分子量約１万〜約１
００万の範囲の付加重合型または縮重合型の水溶性の非
イオン性ポリマー、特開昭６１−１８８５２等に記載の
ビニルスルホニル基等含有の架橋性アクリルアミド系コ
ポリマー、特開昭６３−７０１５６に記載の水溶性セル
ロース誘導体等を用いることができる。付加重合型の水
溶性の非イオン性ポリマーの例としてポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンがあ
る。縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの例として
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、
ポリ−Ｎ−ビニルピロリドンがある。架橋性アクリルア
ミド系コポリマーの例として、Ｎ−［［３−（ビニルス
ルホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド−
アクリルアミドコポリマー；　　Ｎ（［３−（２−クロ
ロエチルスルホニル）プロパンアミド］メチル］アクリ
ルアミド−アクリルアミド−Ｎ−（１，１−ジメチル−
３−オキソブチル）アクリルアミドコポリマーがある。

水溶性セルロース誘導体の例としてメチルセルロース。

エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース。

ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチ
ルメチルセルロース等の水溶性セルロースエーテルがあ
る。これらの水溶性ポリマーのうちではポリアクリルア
ミド、ポリエチレングリコール、Ｎ−［［３−（ビニル
スルホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド
−アクリルアミドコポリマーが好ましい。水溶性ポリマ
ーの添加量は、付加重合型または縮重合型の水溶性の非
イオン性ポリマーの場合、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約２ｗ％から約１００−％、好ましくは約５−％
から約５０ｖ％の範囲、架橋性アクリルアミド系コポリ
マーの場合、アクリルアミド系化合物の重量に対して約
１−％から約５０ｗ％、好ましくは約５−・％から約４
０−・％の範囲である。

ゲル媒体には核酸フラグメントの高分子量部分の泳動像
バンド幅の広がりと分離像の歪の発生防止の目的でグリ
セロールをゲル膜の容積に対して約０．Ｉｗ／ｖ％〜約
１．０ｗ／ｖ％の範囲で添加することができる。また、
湿潤剤としてグリセロール、エチレングリコール等のポ
リオール化合物を添加することができる。その添加量は
ゲル媒体の容積に対して約１ｗ％から約４０−％の範囲
である。

アガロース及び／又は水溶性ポリマーはゲル形収液をＦ
Ｊ４製する時からポリアクリルアミド系水性ゲルの形成
時までの間に添加することが好ましい。

グリセロール、エチレングリコール等のポリオール化合
物をゲル媒体に添加する時期は通常単量体と架橋剤を水
に溶解する時からポリアクリルアミド系水性ゲルの形成
時までの間何時でもよいが。

単量体と架橋剤を水に溶解する時からゲル形成液を流延
塗布する前（又は管に充填する前）までの間が好ましい
。

ゲル媒体にはノニオン性、アニオン性又は両性界面活性
剤を添加することができる。界面活性剤の例として。

Ｃ６Ｆ＋７Ｓ０２Ｎ−（ＣＨ２ＣＨ２０）＋４−ＨＥｔ等のノニオン性界面活性剤。

Ｎａ０３Ｓ＋ＣＨＣＯＯＣＨ２ＣＨ（Ｅｔ）Ｃ４Ｈｇ■ ＣＣＨ２Ｃ００ＣＨ２ＣＨ（Ｅｔ）Ｃ４Ｈ等のアニオン
性界面活性剤。

ｅＣ１ｌ　Ｈ２３ＣＯＮ　Ｈ−（ＣＨ２）３−Ｎ＋−ＣＨ
ｚＣ００−ｅ等の両性界面活性剤がある。界面活性剤の添加量は、単
量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して、ノニオン
性又はカチオン性界面活性剤の場合。

約Ｉ　Ｘ　１０−’から約５ＸＩＯ−’ｗ／ｖ％、好ま
しくは約ｌＸｌ０−３から約Ｉ　Ｘ　１０−２警／Ｖ％
の範囲、アニオン性界面活性剤の場合、約＋　ｘ　ｉｏ
−’から約５Ｘ１０−２警／Ｖ％、好ましくは約ｌＸｌ
０−３から約５ＸＩＯ−２警／Ｖ％の範囲である。

変性剤としては少なくとも１個のカルバモイル基をもつ
化合物が用いられる。その具体例として尿素、ホルムア
ミド等がある。変性剤の添加量は単量体と架橋剤を含む
水性ゲルの容積に対して約４０ｖ／ｖ％から約６０ν／
Ｖ％の範囲である。変性剤として尿素を用いる場合には
、単量体と架橋剤を含む水性ゲル１０００＋ａＬに対し
約６モル（約３８０ｇ）から飽和溶解ｊ１（約４２０ｇ
）まで、好ましくは約７モルから飽和溶解量までの範囲
で用いられる。変性剤は添加量が多いので、その添加時
期は通常単量体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解する時
が好ましい。

ゲル媒体には公知のｐ）ｌ緩衝剤を含有させて電気泳動
実施時のｐＨ値を８．０から９．０の範囲に調節するこ
とができる。用いつるｐＨ緩衝剤としては９日本化学会
編「化学便覧基礎編」（東京、丸善■、　１９６６年発
行）１３１２−１３２０頁；　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏ
ｎ　ｅｔ　ａｔ編ｒＤａｔａｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪｒｄ　ａ
ｔ　ｔｈｅＣｌａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、１９６９
年発行）４７Ｂ　−５０８頁；　ｒＢｉｏ−ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙＪ　Ｍ、４６７−４７７頁（１９６６年）　；
　ｒＡｎａｌｙｔｉｃａ１８ｉｏｃｈｅ＋ａｉｓｔｒｙ
Ｊ　−■腫、３００−３１０頁（１９８０年〉等に記載
のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩衝剤の具体例として。

トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）
を含む緩衝剤；　Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル
）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　；　４−（２−ヒドロキ
シエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＨＥ
ＰＰＳ）、　Ｎａ塩又はに塩等；　β−ヒドロキシ−４
−（２−ヒドロキシエチル）−Ｉ−ビペラジンブロバン
スルホン酸（ＩＩＥＰＰｓＯ）、　Ｎａ塩又はに塩等；
　３−［［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシ
メチル）エチル］アミノ］−１−プロパンスルホン酸（
ＴＡＰＳ）、　Ｎａ塩又はに塩等；３−（シクロへキシ
ルアミノ）−１−プロパンスルホン１ｍ（ＣＡＰＳ）、
　Ｎａ塩又はに塩等；及びこれらのいずれかと必要によ
り組合せられる酸、アルカリ又は塩がある。好ましい緩
衝剤の例としてＴｒｉｓ　−ｍ酸−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩
（ｐＨ８，２〜８．３用絹成）がある。

ラジカル重合開始剤組成物としてはｒＥＩｅｃｔｒｏ−
ｐｈｏｒｅｓｉｓＪ２（４）、２＋３−２１９（＋９８
１）、同誌２（４）、２２０−２２Ｂ（１９８１）、特
開昭５９−１２６２３６　、青水、永井編「最新電気泳
動法Ｊ（１９７３年発行）等に記載の低温ラジカル重合
開始剤組成物のうちから適宜に選択して用いることがで
きる。ラジカル重合開始剤組成物の例として、β−（ジ
メチルアミノ）プロピオニトリル（ＤＭＤＰＮ）−ペル
オクソニ硫酸アンモニウム混合物：Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’
−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ　）−ベ
ルオクソニ硫酸アンモニウム混合物；　ＴＥＭＥＤ−リ
ボフラビン混合物：　ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過酸
化水素混合物；リボフラビンーベルオクソニ硫酸アンモ
ニウム混合物；リボフラビン−過酸化水素混合物（リボ
フラビン等の光増感剤併用の場合には紫外線又は可視光
の照射を併用する〉等がある。ラジカル重合開始剤組成
物の添加量は単量体と架橋剤の合計重量に対して約０．
３−％から約５゜０−・％、好ましくは約０．５ｗ％か
ら約３．０ｗ％の範囲である。

アクリルアミド系化合物（単量体）と架橋剤は。

水溶液又は水分散液として水に溶解又は分散させておき
、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した水性ゲル
媒体を形成させる。本明細書においては特にことわらな
いかぎり、（水に）溶解とく水に）分散の両者を含めて
単に（水に）溶解といい。

水溶液と水分散液の両者を含めて単に水′？ｉＩ液とい
う。溶媒又は分散媒としては、水だけでなく、所望によ
り加えられる有機溶媒を含む水−有機溶媒混合物をも包
含する。

ゲル濃度としてはＳ、Ｈｊｅｒｔｅｎ　：　ｒＡｒｃｈ
ｉｖｅｓ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃｓＪ　１（Ｓｕｐｆ）１．）＋１４７
−１５１（＋９６２）に記載の定義に従って表示して、
単量体。

架橋剤および水からなるゲル媒体の容積に対して単量体
と架橋剤の合計量が約５／ｖ％から約３０ｗ／ｖ％の範
囲で用いられる。

予め定められた厚さのゲル媒体膜は実質的に無色透明で
あることが泳動像又は泳動パターンの検出又は読取りに
一般的に好ましい。

ゲル媒体膜は前述の諸成分とラジカル重合開始剤組成物
を含む水溶液（以下ゲル形成液ということがある）を支
持体の上に予め定められた濃度変化を有する膜又は層と
して流延又は塗布し９分子状酸素の不存在下で、又はゲ
ル形成液をモールドの中に注入して分子状酸素の不存在
下で、必要により紫外線又は可視光の照射及び／又は加
熱して。

単量体（アクリルアミド系化合物）と架橋剤が架橋重合
したポリアクリルアミド系水性ゲル媒体膜（又は層）と
して製造する。

ゲル媒体膜は、実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平
滑な表面のシート状（フィルム状、又は平板状）支持体
又はカバーシートの上に予め定められた厚さを有する膜
又は層として設けられる。

実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面のシー
ト状支持体又はカバーシートとして公知のガラス板、有
機ポリマーシート等を用いることができる。有機ポリマ
ーシートの具体例としてポリエチレンテレフタレート、
ビスフェノールへのポリカルボネート、ポリスチレン、
セルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セ
ルローストリアセテート、セルロースアセテートプロピ
オネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０ｕｍから
約２ｍｍ、好ましくは約８０ｕｍから約５００ｕｍの範
囲の透明な。

（波長約２００ｎｍから約９０Ｏｒ＋ｍの範囲内の少な
くとも一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる）平
滑な表面を有するシート状物又は平板状物がある。

有機ポリマー支持体又はカバーシートを用いる場合には
その表面を親水化しゲル膜との接着を良好にするために
、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電処理、火焔
処理、電子線照射、ケミカルエツチング、電解エツチン
グ等の公知の表面処理方法を適用することができる。有
機ポリマー支持体又はカバーシートの表面には必要に応
じて特開昭５９−１６４９５０．特開昭５９−２１２７
５３．特開昭６０−１９４３４９゜特開昭６０−２３９
６５８　、特開昭６０−２４４８５０　、特開昭６１−
１４５５７等に記載の下塗層又は接着層を設けてその上
に設けられるゲル媒体層と支持体又はカバーシートとの
接着を強固にすることができる。

本発明のゲル媒体の特徴をなす濃度勾配の形成方法とし
て、２枚の平板状ガラス（支持体とカバーシート）の間
にスペーサ板を固定したガラスモールドの中に、泳動方
向に予め定めた長さになる量の相対的に高濃度のゲル形
成液を注入してゲル化させた後、泳動方向に予め定めた
長さになる量の相対的に低濃度のゲル形成液を注入して
ゲル化させる工程を順次繰り返す方法；堀尾、山下編「
蛋白質・酵素の基礎実験法バ南江堂、１９８１年発行）
３０４〜３０８頁、特開昭５４−４３８８１に記載され
ているように。

単量体（アクリルアミド系化合物）、架橋剤９重合開始
剤の含有量の異なる高低濃度の２種類のゲル形成液をそ
れぞれ収容する２個の容器を底面のすぐ上部を導管で連
結し、さらに一方の容器底面のすぐ上部から混合液送出
導管を結合し、混合液送出導管の接続されている側の容
器（低濃度液側又は高濃度液側のいずれか一方）の中の
液を撹拌しながら混合液送出導管の途中に設けられてい
るポンプで混合液を送り出す方法；特開昭６２−１６７
４５９に記載されているように、高低濃度の２種類のゲ
ル形成液をそれぞれ収容する２個のゲル形成液収容容器
、２種類のゲル形成液を受は入れて混合撹拌する１個の
混合撹拌容器、２個のゲル形成液収容容器それぞれから
１個の混合撹拌容器に液を輸送する液輸送導管、各液輸
送導管の途中に設けられている液輸送流速設定手段、各
液輸送流速設定手段を予め定めた流速の漸次変化函数に
対応した情報（信号）に従って各液輸送流速に設定する
ためのコントロール手段、混合撹拌容器から出ている１
個の液輸送導管とその先端部に接続されている流延塗布
手段を有する装置を用いる方法；特願昭６２−１２９９
２４に記載されているように、高低・濃度の２種類のゲ
ル形成液の流量比を予め定めた漸次変化に対応する函数
に従って液送出手段くポンプ）で送り出し、スタティッ
クミキサー中で混合する方法等がある。

変化させるアクリルアミド系化合物と架橋剤の濃度勾配
（ポリアクリルアミド系水性ゲル濃度の勾配）の範囲は
約３ｖ％から約３０ｖ％、好ましくは約４Ｗ％から約２
５ｗ％の範囲である。

本発明のゲル媒体において、ゲル濃度勾配は、基本的に
サンプル注入端部から電気泳動方向に沿って高濃度−低
濃度−高濃度の順の漸次的濃度変化又は階段状濃度変化
である。

本発明のゲル媒体の特徴をなすゲル媒体の濃度勾配は、
サンプル注入端部から泳動方向に沿う距離に対してゆる
く折れた直線状、直線状；あるいは階段関数、指数間数
、対数間数、懸垂線、追跡線。

放物線、双曲線、楕円、３次曲線等の関数で現わされる
曲線の一部分状、その他の任意の漸次的変化の曲線、又
は曲線と直線の組合せでゲル濃度が減少し９次いで予め
定めた長さにわたって実質的に一定濃度を保ち、又は濃
度の最小値の部分から直ちに、前記のいずれかの勾配で
濃度が増加するような濃度勾配をもたせることができる
。サンプル注入部分の形状は長方形状、正方形状、三角
形状（シャークスティース状）２円形状等公知の形状か
ら適宜に選択して設けることができる。

ゲル媒体膜は、前述のようにして高低濃度の２種類のゲ
ル形成液を混合して予め定められた漸次の濃度（アクリ
ルアミド系化合物と架橋剤の含有量）の変化を有するゲ
ル形成液を平面状支持体又はカバーシートの上に膜状又
は層状に流延又は塗布し、あるいは、ガラスモールドの
中に注入し。

分子状酸素の不存在下で、必要により紫外線又は可視光
の照射及び／又は加熱して、単量体くアクリルアミド系
化合物）と架橋剤とが架橋重合したポリアクリルアミド
系水性ゲル媒体膜又は層として製造され用いられる。角
柱状又は円柱状（カラム状）のゲル媒体は、ガラスモー
ルドのかわりに角柱又は円柱（カラム）の中に前記と同
様にして高低濃度の２種類のゲル形成液を注入して製造
することができる。

ゲル媒体膜の厚さは、一般に約５０１ｆｆ１１から約５
１゜好ましくは約８０ｕｍから約１０００ＬＸＩＴＩＩ
Ｉ＋の範囲である。

本発明のゲル媒体は蛋白の分離分画に用いることもでき
る。その目的の場合には、変性剤としてカルバモイル基
含有化合物のかわりに、ドデシル硫酸す゛トリウムに代
表されるアルキル硫酸塩等の陰イオン界面活性剤を添加
するか、あるいは変性剤を添加しないゲル媒体とすれば
よい、また、　ｐＨ緩衝剤は、ｐＨ値約２．０〜約１０
．０の範囲の公知の緩衝剤を試料に応じて選択して用い
ればよい。変性剤不含のゲル媒体は核酸フラグメントの
分離分取に用いることもできる。

本発明のゲル媒体膜又は柱状のゲル媒体は前述の諸文献
や特許明細書等に記載の公知の方法に従って、水平型及
び垂直型スラブ電気泳動法、カラム電気泳動法、ディス
ク電気泳動法等に用いることができる。

■ココ１囲実施例！及び比較例１平滑表面の厚さ５１．サイズ２０ｃｍ　Ｘ　４０ｃｍの
長方形の無色透明平面状ガラス板２枚の間にその長辺に
沿った両縁辺部に厚さ２００ＬｆｆＴ＋、幅１ＯＩＩＩ
ＩＷ×長さ４０ｃｍのスペーサー板を接着固定し１間隔
２００１ｆｆｌの空間を有するガラスモールドを作成し
た。このモールドの中に第１表に記載の組成の５種類の
濃度のゲル形成液を第１図に示す階段状の濃度変化にな
るように適宜に順次静かに注入し、室温（約り３℃〜約
２５℃）で放置して架橋重合させて第１図に示した階段
状のゲル濃度変化を有するポリアクリルアミド水性ゲル
膜■（本発明）を調製した。

別に上記と同じ寸法のガラスモールドに第１表に示す８
％濃度のゲル形成＋ｆｆ（Ｂ液）だけを注入したほかは
上記の方法と同様にして一定濃度８％のポリアクリルア
ミド水性ゲル膜■（比較例）を調製した。

得られた２種のゲル膜を用いてＤＮＡ塩基配列解析の実
験をＭ１３−　ｍｐ８０ＮＡに対してジデオキシ法によ
り調製されたＤＮＡフラグメントサンプルを用いて常法
に従い電気泳動操作を実施した。その後ガラス板から濾
紙にゲル膜を移し取り、その上面をビニリデンクロリド
ービニルクロリトコボリマー薄フィルム（サランラップ
）で覆フてゲルドライヤーで乾燥させ、サランラップの
表面にＸ−線用写真フィルムを密着させてオートラジオ
グラフィ処理を実施した。その結果、２種類のゲル膜の
読み取り可能な塩基フラグメントの範囲は次のとおりで
あった。

ゲル膜■：　５番〜２８０番ゲル膜０２５０番〜２３５番泳動像の幅と間隔ゲル膜■：読み取れる範囲内で極端に狭まらずゲル膜■
：読み取れる範囲内で漸次狭まるこの結果から本発明の
濃度穴−小−大の階段状の変化のゲル濃度グラジェント
を有するポリアクリルアミド水性ゲル電気泳動用媒体膜
は核酸塩基フラグメントの低分子量部分から高分子量部
分まで広い分子量範囲にわたってほぼ一様にレーンでの
間隔が維持されていて良好な分離が得られ、かつ読み取
り可能な塩基フラグメントの数が多く。

精度の高いＤＮＡ塩基配列解析を行うことができること
が明らかになった。

図工Ｉ亘第１表　ゲル形成液の成分組成りｐｏｏｓ　：へ６ｎオキソニ硫酸アンモニウム（５−
・％水会ｉＦｔ？支）ＴＥＭＥＤ　：　Ｎ、Ｎ、Ｎ’　
、Ｎ’−テトラメチルエチ１ンシ−７ミシ（２５−％水
溶液）リネー乃じン：リネー万ヒ゛シ燐酸エステｌｌＮ
ａ塩（０，２５ｗ％水溶液）←　：左側欄と同じ数値及
び単位実施例２及び比較例２表面を紫外線照射処理て親水性にした平滑表面の厚さ１
８ｏＩＪＴＩ２幅２０ｃｍの無色透明ポリエチレンテレ
フタレー）　（ＰＥＴ）シート（支持体）の長辺に沿っ
た両縁辺部に一定厚さ２００ｕｍ、幅１０ｍｎ＋のスペ
ーサー板を接着固定した。

一方、第２表に記載の組成の濃度（アクリルアミドと架
橋剤の含有量）の異なる２種類のゲル形成液を調製した
。

２種類のゲル形成液（重合開始剤組成物未添加）を、特
願昭６２−１２９９２４に記載の方法に従い、塗布方向
に４０ｃｍの長さにわたってゲル濃度が第２図のような
濃度勾配になるように漸次流量比を変化させながら９重
合開始剤を添加しつつ、スタティックミキサーで２液を
混合し、一定流量で流延塗布ヘッドに混合液を供給した
。この混合液を一定流量で窒素ガス雰囲気中で前記のＰ
ＥＴ支持体の上に流延塗布し、ゲル形成液膜に５００％
＋ｌキセノン放電灯を照射して架橋重合させ、ついで形
成されたゲル膜の上に厚さ６３Ｌｆｆ１１９幅２０ｃｍ
の無色透明ＰＥＴシートをカバーシートとして密着積層
して、一定膜厚２００ＩＩＩ１１で第２図に示したゲル
濃度変化を有する濃度グラジエントポリアクリルアミト
水性ゲル膜■（本発明）を調製した。

別に、４度８％のゲル形成液ｌｆｉ類だけを用いて一定
膜厚２００　ｕｍで一定濃度８％のポリアクリル７ミド
水性ゲル膜■（比較例）を調製した。

性能評価試験前記の２種類のゲル膜について実施例１と同様にしてＤ
ＮＡフラグメントの電気泳動操作した。その後カバーシ
ートを取り除き濾紙をゲル膜に密着させてゲルドライヤ
ーで乾燥させた。乾燥後、支持体をはがして、乾燥状態
のゲル膜に直接Ｘ−線用写真フィルムを密着させてオー
トラジオグラフィ処理を実施した。結果は次のとおりで
あった。

読み取り可能な塩基フラグメント数範囲ゲル膜■：ｌθ
番〜２１３０番ゲル膜■：５０番〜２３５番泳動像の幅と間隔ゲル膜■：読み取れる範囲内で極端に狭まらずゲル膜■
：読み取れる範囲内で漸次狭まるこの結果から本発明の
濃度穴−小−大の漸次的変化のゲル濃度グラジェントを
有するポリアクリルアミド水性ゲル電気泳動用媒体膜は
核酸塩基フラグメントの低分子量部分から高分子量部分
まで広い分子量範囲にわたってほぼ一様にレーンでの間
隔が維持されていて良好な分離が得られ、かつ読み取り
可能な塩基フラグメントの数が多く、精度の高いＤＮＡ
塩基配列解析を行うことができることが明らかになった
。

回工至百第２表　ゲル形成液の成分註コポリマー　：　Ｎ（［３−（ヒ゛ニルスル本ニル）
アロハ０ジアミド“］−］メヂル］１クリｎ１ミド−１
クリｌ朱アミドコ本９リマーアガロース：低電気浸透度
、ゲル化温度３６℃

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の本発明のゲル濃度グラジェントを有
するゲル膜■の電気泳動方向に沿う階段状のゲル濃度変
化（ＩＩＡ度勾配）を示す断面模式図である。第２図は実施例２の本発明のゲル濃度グラジェントを有
するゲル膜■の電気泳動方向に沿う漸次的なゲル濃度変
化（８度勾配）を示す断面模式図である。特許出願人　富士写真フィルム株式会社第１図第２図

Claims

【特許請求の範囲】

（１）電気泳動方向に予め定められた濃度勾配（濃度グ
ラジエント）を有し、変性剤として少なくとも１個のカ
ルバモイル基を含む化合物を含むポリアクリルアミド系
水性ゲル電気泳動用媒体において、アクリルアミド系化
合物、架橋剤、又は両者の濃度がサンプル注入部から電
気泳動方向に漸次的又は段階的に減少し、一定の濃度の
部分を経て、あるいは最小濃度の位置から直ちに漸次的
又は段階的に増加していることを特徴とする電気泳動用
媒体。
（２）前記少なくとも１個のカルバモイル基を含む化合
物が尿素である特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動
用媒体。
（３）前記電気泳動用媒体が平面状支持体と平面状カバ
ーシートとの間に層状の電気泳動用媒体膜として設けら
れる特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の電気泳動
用媒体。
（４）前記支持体と前記カバーシートがいずれもポリエ
チレンテレフタレートからなるシート状物である特許請
求の範囲第３項に記載の電気泳動用媒体。
（５）前記電気泳動用媒体が管状支持体の内部に柱状の
電気泳動用媒体として設けられる特許請求の範囲第１項
又は第２項に記載の電気泳動用媒体。