JPH0558499B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は核酸（DNA，RNA）塩基配列決定の
ために用いられるポリアクリルアミド系水性ゲル
電気泳動用媒体に関するものであり、特にゲル媒
体の核酸塩基フラグメントの分離性能および泳動
像の読取り易さを改善したポリアクリルアミド系
水性ゲル電気泳動用媒体の組成に関するものであ
る。 〔従来技術〕 化学分解法、ジデオキシ法等による核酸
（DNA，RNA）の塩基配列決定法においてはポ
リアクリルアミド水性ゲル膜を用いたスラブ電気
泳動が必須の操作になつている。この目的に用い
られるポリアクリルアミド水性ゲル膜は、通常ア
クリルアミドのような単量体約95重量部とＮ，
N′−メチレンビスアクリルアミドのような二官
能性または多官能性の架橋剤約５重量部の混合物
と重合開始剤を含む約3w％〜約30w％水溶液中
で単量体と架橋剤を架橋重合させることにより形
成しており、核酸フラグメントの分離能を向上さ
せるためにゲル膜の薄層化が行われている。 しかしながら、現在用いられているポリアクリ
ルアミドゲル膜は薄層化すると、第２図に模式的
に示すように、核酸フラグメントの高分子量部分
の泳動像バンドが、泳動方向に垂直な方向（バン
ドの幅方向）に広がり、かつ個々の分離像に否を
生じるので、オートラジオグラム上での泳動像の
読取りが困難という問題がある。 一方、特開昭60−60548明細書等にゲル膜の湿
潤剤としてグリセロールをゲル媒体の容積に対し
て約1w／ｖ％から約40w／ｖ％の範囲で添加し
うることが記載されている。グリセロールは、そ
の添加量が下限値の近傍では湿潤効果が小さすぎ
て不十分であるために注目されていなかつた。ま
た、添加量を多くするとゲル媒体が柔らかくな
り、伸びが大きくなり、殊にゲル膜として用いる
場合に取扱い性が悪くなる傾向が見出されてい
た。ところがグリセロールを、湿潤効果はないと
考えられる少量添加することにより前述の泳動像
バンド幅の広がりと分離像の否が解消することが
見出され、本発明に到達した。 〔発明の目的〕 本発明の目的はポリアクリルアミド系水性ゲル
膜（以下、ゲル膜ということがある）の核酸
（DNA，RNA）フラグメントの高分子量部分の
泳動像バンド幅（泳動方向に垂直な方向）の広が
りおよび分離像（個々のフラグメント像）の否が
解消され、分離能が向上したポリアクリルアミド
系水性ゲル膜を提供することである。 本発明の他の目的は薄層のゲル膜においても泳
動像バンド幅の広がりと分離像（個々のフラグメ
ント像）の否が解消され、分離能が向上したポリ
アクリルアミド系水性ゲル膜を提供することであ
る。 本発明の他の目的はゲル膜の伸びが少なく取扱
いが容易なポリアクリルアミド系水性ゲル膜を提
供することである。 〔発明の構成〕 本発明は、アクリルアミド系化合物と架橋剤が
水の存在下に架橋重合してなるポリアクリルアミ
ド系水性ゲル、および変性剤として少なくとも１
個のカルバモイル基をもつ化合物を含む電気泳動
用媒体において、さらにグリセロールをゲル媒体
の容積に対して0.3w／ｖ％から0.8w／ｖ％の範
囲の量で含む電気泳動媒体である。 〔発明の構成の詳細な説明〕 本発明においてアクリルアミド系化合物（単量
体）と架橋剤は、水溶液または水分散液として水
に溶解または分散させておき、水中で両者を架橋
重合させて、架橋重合した水性ゲル媒体を形成さ
せる。本明細書においては特にことわらないかぎ
り、（水に）溶解と（水に）分散の両者を含めて
単に（水に）溶解といい、水溶液と水分散液の両
者を含めて単に水溶液という。溶媒または分散媒
としては、水だけでなく、所望により加えられる
有機溶媒を含む水−有機溶媒混合物をも包含す
る。 本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物（単量体）の例としては、アクリルアミ
ド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）ア
クリルアミド、ジアセトンアクリルアミド等のア
クリルアミドホモログがある。これらの化合物は
単独で、または２種以上を組合せて用いることが
できる。これらの化合物のうちではアクリルアミ
ドが好ましく、またアクリルアミドと他のアクリ
ルアミド系化合物の１種以上との併用も好まし
い。 架橋剤としては「Electrophoresis」２(4)，213
−219（1981）、同誌２(4)，220−228（1981）等に記
載の二官能性架橋剤化合物、特願昭59−122662等
に記載の三官能性以上の架橋剤化合物を用いるこ
とができる。二官能性架橋剤の具体例として、
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド（BIS）、
Ｎ，N′−プロピレンビスアクリルアミド
（PBA）、ジアクリルアミドジメチルエーテル
（DAE）、１，２−ジアクリルアミドエチレング
リコール（DEG）、エチレンウレアビスアクリル
アミド（EUB）、エチレンジアクリレート
（EDA）、Ｎ，N′−ジアリルタルタルジアミド
（DATD）、Ｎ，N′.ビスアクリリルシスタミン
（BAC）がある。三官能性架橋剤の具体例とし
て、１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ
−ｓ−トリアジン（TAHT）、トリアリルシアヌ
レート（TAC）トリアリルイソシアヌレート
（TAIC）等がある。これらの架橋剤のうちでは
BISとTAHTが好ましい。架橋剤は２種以上を
組合わせて用いることもできる。 架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重量に対
して約1w％から約30w％、好ましくは約2w％か
ら約10w％の範囲で用いられる。 本発明の電気泳動媒体にはアガロースを添加す
ることができる。アガロースとしては特開昭55−
5730、特開昭55−110946、特表昭57−502098、特
開昭59−126236等に記載の低電気浸透性アガロー
ス、中電気浸透性アガロース、高電気浸透性アガ
ロースのいずれも用いることができる。アガロー
スの添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容
積に対して約0.2w／ｖ％から約2.0w／ｖ％、好
ましくは約0.3w／ｖ％から約1.2w／ｖ％の範囲
である。 本発明の電気泳動媒体には水溶性ポリマーを添
加することができる。水溶性ポリマーとしては特
開昭59−126236、特開昭60−60548等に記載の分
子量約１万から約100万の範囲の付加重合型また
は縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーを用い
ることができる。付加重合の水溶性の非イオン性
ポリマーの例としてポリアクリルアミド、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドンがある。
縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの例とし
てポリエチレングリコール、ポリプロピレングリ
コールがある。これらの水溶性ポリマーのうちで
はポリアクリルアミドとポリエチレングリコール
が好ましい。水溶性ポリマーの添加量は単量体と
架橋剤の合計重量に対して約2w％から約100w
％、好ましくは約5w％から約50w％の範囲であ
る。アガロースおよび／または水溶性ポリマーを
ゲル媒体に添加する場合には、その添加時期は通
常単量体と架橋剤を水に溶解する時からポリアク
リルアミド系水性ゲルの形成時までの間が好まし
い。 変性剤としては少なくとも１個のカルバモイル
基をもつ化合物が用いられる。その具体例として
尿素、ホルムアミド等がある。変性剤の添加量は
単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約
40w／ｖ％から約60w／ｖ％の範囲である。変性
剤として尿素を用いる場合には、単量体と架橋剤
を含む水性ゲル１ｌに対して約６モル（約360g）
から飽和溶解量（約420g）まで、好ましくは約
７モルから飽和溶解量までの範囲で用いられる。
変性剤は添加量が多いので、その添加時間は通常
単量体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解する時が
好ましい。 本発明のボリアクリルアミド系水性ゲル電気泳
動媒体の特徴をなすグリセロールの添加量は単量
体と架橋剤を含む水性ゲル媒体の容積に対して約
0.1w／ｖ％から約1.0w／ｖ％、好ましくは約
0.3w／ｖ％から約0.8w／ｖ％までの範囲である。
グリセロールの添加時期は通常単量体、架橋剤を
水に溶解する時から水性ゲルの形成時までの間が
好ましい。 本発明の電気泳動用ゲル媒体には公知のPH緩衝
剤を含有させて電気泳動実施時のPH値を8.0から
9.0の範囲に調節することができる。用いうる緩
衝剤としては、日本化学会編「化学便覧 基礎
編」（東京、丸善(株)、1966年発行）1312−1320頁、
R.M.C.Dawson et al編「Data for
Biochemical Research｝第２版（Oxfod at the
clarendon Press，1969年発行）476−508頁、
「Biochemistry」５，467頁以降（1966年）、
「Analytical Biochem−istry」104，300−310頁
（1980年）等に記載のPH緩衝剤系がある。PH緩衝
剤の具体例として、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（Tris）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ−２−ヒ
ドロキシピペラジン−N′−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸Na塩またはＫ塩等、Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−ス
ルホン酸Na塩またはＫ塩等、Ｎ−〔トリス（ヒド
ロキシメチル）メチル〕−３−アミノプロパンス
ルホン酸Na塩またはＫ塩等、およびこれらのい
ずれかと必要により組合せられる酸、アルカリま
たは塩がある。好ましいPH緩衝剤系の例として
Tris−硼酸−EDTA−2Na塩（PH8.2〜8.3用組
成）がある。 本発明の電気泳動用媒体は実質的に無色透明で
あることが泳動像の検出または読取りに一般的に
好ましい。 本発明の電気泳動用媒体を電気泳動媒体膜とし
て用いる場合には、実質的に電気不伝導性で水不
浸透性の平滑な表面のシート状（フイルム状、ま
たは平板状）支持体の上に設けるのが好ましい。
実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面
のシート状支持体としては公知のガラス板、有機
ポリマーシート等を用いることができる。有機ポ
リマーシートの具体例としてポリエチレンテレフ
タレート、ビスフエノールＡのポリカルボネー
ト、ポリスチレン、セルロースエステル（例、セ
ルロースジアセテート、セルローストリアセテー
ト、セルロースアセテートプロピオネート等）等
のポリマーからなる厚さ約50μmから約１mm、好
ましは約80μmから約500μmの範囲の透明な、す
なわち波長約200nmから約900nmの範囲内の少な
くとも一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させ
る平滑な表面を有するシート状または平板状の支
持体がある。有機ポリマー支持体を用いる場合に
はその表面を親水化しゲル媒体膜との接着を良好
にするために、紫外線照射、グロー放電処理、コ
ロナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカル
エツチング、電解エツチング等の公知の表面処理
方法を適用することができる。有機ポリマー支持
体の表面には必要に応じて特開昭59−164950、特
開昭59−212752、特願昭59−50294、特願昭59−
96152、特願昭59−136247、特願昭59−103307等
に記載の下塗層または接着層を設けて支持体の上
に設けられる水性ゲル媒体膜と支持体との接着を
強固にすることができる。 本発明の電気泳動用媒体は前述の諸成分とラジ
カル重合開始剤組成物を含む水溶液（以下、ゲル
形成液ということがある）を平面状支持体の上に
層状に流延または塗布し、分子状酸素の不存在下
で、必要により紫外線照射および／または加熱し
て、単量体（アクリルアミド系化合物）と架橋剤
とが架橋重合したポリアクリルアミド系ゲル媒体
膜として製造され用いられる。 ラジカル重合開始剤組成物としては
「Electrophoresis」２(4)，213−219（1981）、同誌
２(4)，220−228（1981）、特開昭59−126236、青
木、永井編「最新電気泳動法」（1973年発行）等
に記載の低温ラジカル重合開始剤組成物のうちか
ら適宜に選択して用いることができる。ラジカル
重合開始剤組成物の例として、β−（ジメチルア
ミノ）プロピオニトリル（DMDPN）−ペルオク
ソ二硫酸アンモニウム混合物；Ｎ，Ｎ，N′，
N′−テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）
−ペルオクソ二硫酸アンモニウム混合物；
TEMED−リボフラビン混合物；TEMED−リボ
フラビン−過酸化水素混合物（この系の場合には
紫外線照射する）等がある。ラジカル重合開始剤
組成物の添加量は、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約0.3w％から約5.0w％、好ましくは約
0.5w％から約3.0w％の範囲である。 本発明の電気泳動媒体はゲル濃度として、S.
Hjerten：「Archives of Biochemistry、and
Biophysics」１，（Suppl.），147−151（1962）に
記載の定義に従つて表示して、単量体、架橋剤お
よび水からなるゲル媒体の容積に対して、単量体
と架橋剤の合計量が約3w／ｖ％から約30w／ｖ
％の範囲用いられる。 本発明の電気泳動媒体ゲル膜の厚さは約50μm
から約５mm、好ましくは約80mmから約500μmの範
囲である。本発明のゲル膜は薄層化しても泳動像
バンド幅の広がりと分離像（個々のフラグメント
像）の歪の発生が実質的にないので、ゲル膜の厚
さを約50μmから約300μmの薄層にして泳動像の
解像度を高めることができる。 ゲル形成液を平面状の支持体の表面上で架橋重
合させる場合には、ゲル形成液の流延塗布とその
後の架橋重合を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素
の不存在下で実施するか、あるいは流延塗布した
ゲル形成液の表面上に直ちにカバー用フイルム、
シートまたは板等の被覆材料で覆い架橋重合させ
ることが好ましい。この目的に使用される被覆材
料としては前述の平面状支持体と同様な素材から
なるものを用いることができる。カバーフイルム
が有機ポリマーフイルムである場合、その厚さは
約300μm以下であり、実用的な範囲としては約
4μmから約200μm、好ましくは約4μmから約
100μmである。被覆材料がガラス板の場合、その
厚さは平面状ガラス板と同様な厚さであればよ
い。 本発明の電気泳動用媒体は公知のポリアクリル
アミド系水性ゲル媒体と同様にして調製すること
ができる。また、本発明の電気泳動用媒体はゲル
膜にして前述の諸文献や特許明細書等に記載の公
知の方法に従つて、水平型および垂直型スラブ電
気泳動法等に用いることができる。 本発明のポリアクリルアミド水性ゲル電気泳動
媒体のサンプルスロツに試料（Maxam−Gilbert
分解した³²PラベルされたDNAなど）を一定量注
入し電気泳動を行なう。一定時間電気泳動を行な
つた後、片面のカバーフイルム又はカバーシート
を注意深く剥離除去し、ゲル電気泳動媒体膜を用
いてオートラジオグラフイ処理を行なう。その
後、写真フイルムの上に得られたオートラジオグ
ラムを読み取りDNAの塩基配列決定処理操作を
行なう。 実施例１および比較例１ 平滑表面の厚さ２mm、サイズ20cm×40cmの長方
形の平面状ガラス板（支持体）を水平におき、縁
辺部に厚さ200μm、幅10mmのスペーサー板を固定
し、ガラス支持体の上に第１表に示す組成のゲル
形成液を流延し、液層の上に支持体と同じガラス
板を重ね合せ静置し２枚のガラス板の間で架橋重
合させて厚さ200μmのポリアクリルアミド水性ゲ
ル膜を形成した。 得られた２種のゲル膜を用いてDNA塩基配列
決定用の泳動像の読取り実験をジデオキシ法によ
り調製された試料を用い常法に従い実施した。写
真フイルムの上に得られたオートラジオグラムに
ついて個々の泳動像の幅を物差で測定した。その
結果、グリセロールを0.5w／ｖ％含む本発明の
ゲル膜１では、オートラジオグラムの各泳動像と
も高分子量フラグメント部分の分離像（個々のフ
ラグメント像）のバンド幅W^Hと低分子量フラグ
メント側部分の分離像（個々のフラグメント像）
のバンド幅W^L（第１図参照）との比W^H／W^Lが平
均1.05で高分子量フラグメント部分でバンド幅広
がりと個々の泳動像の歪は実質的になく、その部
分で泳動像の読取りが容易にかつ正確にできた。
一方、従来技術であるグリセロール不含の比較ゲ
ル膜２では全泳動像の高分子量フラグメント部分
で比W^H／W^Lが平均1.13でバンド幅広がりと個々
の泳動像の歪があり、その部分で泳動像の読み取
りが困難であつた。 本発明のゲル膜はDNAの高分子量フラグメン
ト部分の解像度の向上が明らかである。 【表】 実施例２および比較例２ 紫外線照射処理で表面を親水性にした平滑表面
の厚さ180mm、サイズ20cm×40cmの長方形のポリ
エチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）を水平におき、縁辺部に厚さ200μm、幅10mm
のスペーサー板を固定し、支持体の上に第２表に
示す組成のゲル形成液を流延し、窒素雰囲気下で
架橋重合させて厚さ200μmのポリアクリルアミド
水性ゲル膜を形成した。 得られた３種のゲル膜を用いてDNAの塩基配
列決定のための泳動像の読取り実験を実施例１と
同様に常法に従い実施した。その結果、グリセロ
ールを0.5w／ｖ％含む本発明のゲル膜３では、
オートラジオグラムの各泳動像とも比W^H／W^Lが
平均1.18と高分子量フラグメント部分でバンド幅
広がりは軽減しており、個々の泳動像の歪はな
く、その部分で泳動像の読取りが容易にかつ正確
にできた。一方、従来技術であるグリセロールを
2.0％含む比較ゲル膜４は各泳動像とも比W^H／
W^Lが平均1.10で高分子量フラグメント部分でバ
ンド幅広がりは軽減しており、個々の泳動像の歪
はなく、その部分で泳動像の読取りが容易にかつ
正確にできた。グリセロール不含の比較ゲル膜５
では全泳動像の高分子量フラグメント部分で比
W^H／W^Lが平均1.45で異常なバンド幅広がりと歪
があり、その部分で泳動像の読み取りが困難であ
つた。 ゲル媒体膜の弾性率を測定した結果は第２表に
記載のとおりで、グリセロールを0.5％含む本発
明のゲル膜３と従来技術であるグリセロール不含
のゲル膜５は伸びにくくて取扱いが容易であつ
た。グリセロールを2.0％含む従来技術である比
較ゲル膜４は伸びやすいので取扱いを慎重にする
必要があつた。 本発明のゲル膜はDNAと高分子量フラグメン
ト部分の解像度の向上と膜の伸びが少なくて取扱
いが容易であることが明らかである。 【表】 【表】 実施例３および比較例３ アガロースを加え、スペーサーの厚さを150μm
に変えた他は実施例２と同様にして、PET支持
体の上に第３表に示す組成のゲル形成液を流延
し、窒素ガス雰囲気下で架橋重合させて厚さ
150μmのポリアクリルアミド水性ゲル膜を形成し
た。 得られた２種のゲル膜を用いてDNAの塩基配
列決定のための泳動像の読取り実験を実施例１と
同様に常法に従つて実施した。 その結果、グリセロールを0.5w／ｖ％含む本
発明のゲル膜６では各泳動像とも実施例２のゲル
膜３と同様に高分子量フラグメント部分でバンド
幅広がり著しく軽減し、泳動像の歪はなく、その
部分の泳動像の読取りが容易に正確にできた。従
来技術のグリセロール不含の比較ゲル膜７では各
泳動像の高分子量フラグメント部分で比較例２の
ゲル膜５と同様に異常なバンド幅広がりと歪があ
り、その部分で泳動像の読み取りが困難であつ
た。 本発明のゲル膜はDNAと高分子量フラグメン
ト部分の解像度の向上が明らかである。 【表】 〔発明の効果〕 本発明のグリセロールを少量含むポリアクリル
アミド系水性ゲル電気泳動媒体は、核酸の高分子
量フラグメント部分でバンド幅広がりが実質的に
ないか、あるいは著しく軽減しており、個々の分
離像の歪はなく、その部分で泳動像の読取りが容
易に正確にできるので、従来公知のポリアクリル
アミド系水性ゲル膜と比較して核酸の高分子量フ
ラグメント部分の解像度が著しく向上するという
効果がある。また本発明のポリアクリルアミド系
水性ゲル電気泳動媒体は、弾性率が相対的に大き
いので、殊に薄層ゲル膜として用いる場合に、ゲ
ル膜の伸びが少なく取り扱いが容易という効果が
ある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、DNA塩基配列読取りのために常法
に従つて調製されたDNAフラグメント試料をポ
リアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体膜を用
いて電気泳動させた泳動像の１バンドの高分子量
フラグメント部分から低分子量フラグメント部分
側にかけての泳動像バンドの個々の分離像の両端
それぞれを結んだ線（一種の包絡線）で示した模
式図である。第２図は、泳動像においてDNAの
高分子量フラグメント部分でバンド幅広がりが生
じた場合の個々の分離像（フラグメント像）の歪
を示す模式図である。 １：個々の分離像、２：泳動像バンド、３：泳
動像バンド（個々の分離像の両端それぞれを結ん
だ包絡線で示した泳動像バンド）、W^H：高分子量
フラグメント部分の分離像（個々のフラグメント
像）のバンド幅、W^L：低分子量フラグメント部
分側の分離像（個々のフラグメント像）のバンド
幅。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
   下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性
   ゲル、および変性剤として少なくとも１個のカル
   バモイル基をもつ化合物を含む電気泳動媒体にお
   いて、さらにグリセロールをゲル媒体の容積に対
   して0.3w／ｖ％から0.8w／ｖ％の範囲の量で含
   むことを特徴とする電気泳動媒体。