JPS59164950A - 電気泳動用媒体材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するものであり、さ
らに詳しくは、特にＤＮＡの塩基配列決定操作において
用いられる水性ゲル電気泳動用媒体材料として適した電
気泳動用媒体材料に関するものである。

ポストラベル法に基づ＜ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列決定
法においては、ポリアクリルアミドゲル膜を用いたスラ
ブ電気泳動操作が必須の操作となっている。特に近年に
おいて遺伝子関連の研究が進むにつれて、ＤＮＡ塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。

ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミドのような
単量体を触媒の存在下にてＮ、Ｎ”−メチレンビスアク
リルアミドのような二官能性の架橋剤を用い架橋重合さ
せることにより得られる。

なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際して通
常は、尿素あるいはホルムアミドのような変性剤を含有
させる。

上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸素の影響
により反応が阻害されるため、ゲル１１りは酸素を遮断
した状態で作成する必要がある。この理由から、現在で
は−・殻に、ポリアクリルアミドケル膜は２枚のカラス
板で形成されたセル（−・定の空間、たとえば０．３ｍ
ｍ−１ｍｍを有する）の中にゲル形成液を注入させ、酸
素を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形成させて
いる。

この方法は２枚のカラス板の間でゲル膜を形成するため
に、取り扱い性が悪く、かつ量産化が困難であるといっ
た大きな欠点を有している。

以りのようにして形成したポリアクリルアミドゲル膜を
用いる電気泳動は、たとえば、次のようにして実施され
る。

ポリアクリルアミドゲル膜は、カラス板に挟んだ才まの
状態で垂直に合てられ、前電気泳動を行なったのち、サ
ンプルスロントに試料（マキサム・ギル八−１・分解し
たＰラベル化ＤＮＡ）を−・定量注入し、電気泳動を行
なう。そして、＝　５ｉ　ｔｉｙ間（例、約６時間〜１
２時間）の゛電気泳動を行なった後、片面のガラス板を
注意深く除去し、ポリ塩化ビニリデンフィルムなどの合
成樹脂製フィルムでゲル膜を覆い、これを用いてオート
ラジオグラフィー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被
覆しているフィルムの上にＸ線フィルム、増感紙を順次
のせて、低温（たとえば、−８０°Ｃ）で一定時間（た
とえば、約１０〜２０時間）露光を行なう。そして露光
終了後、Ｘ線フィルムを現像し、ＤＮＡの分離泳動パタ
ーンを読、みとることにより、ＤＮＡの塩基配列を決定
することができる。

オートラジオグラフィー処理は以上のように長時間を必
要とするため、その迅速化が望まれ、更に読みとりの高
分解能化も望まれている。

高分解能化を達成する手段としては、オートラジオグラ
フィー処理に際してゲル膜を乾燥状態とする方法が知ら
れている。すなわち、電気泳動終了後にゲル膜を１０％
酢酸水溶液中に浸漬して、ＤＮＡを固定化しつつ尿素な
どの変性剤を除去する。カラス板とゲル膜の接着力は極
めて弱いか、または実質的に接着力がないため、この浸
漬工程において、ゲル膜はガラス板から剥離し、液中に
浮遊する。このゲル膜を注意深く取出し、濾紙上にのせ
た後、減圧下で乾燥することにより濾紙上に固定する。

このようにして乾燥したゲル膜を使ってオーＩ・ラジオ
グラフィー処理を実施した場合には分解能が大きく　−
，１：　臂する。しかし、上記のようなゲル膜の分離お
よび乾燥工程は、ゲル膜か極めてもろいため、高瓜の熟
練と注意を必要とし、また、実際にこの工程においてゲ
ル膜の破損が発生することも多い。

そこで本発明の目的は、湿潤状態でのゲル膜と支持体と
の接着性を高く（接着力を大きく）するだめの接着層形
成用の塗布液を提供し、さらにゲル１１シの脱尿素処理
後の乾燥工程においても、支持体から剥離しないゲル膜
を提供することにある。

本発明者は、以」二のような従来使用されている電気泳
動用媒体材料の欠点の克服を目的として鋭７ａ、研究を
行なった結果、本発明に到達した。

本発明は、 ［Ｉ］支持体層； ［ＩＩ］特定の一般式により表わされる構成繰返し中位
を有するポリマーを含有する接着層；および、 ［１［［］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水のイＩ
在ドで架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル
、および変性剤として少なくとも１個のカルバモイル基
をもつ化合物を含む電気泳動用媒体層、 が順次積層されてなる三層構造を含む電気泳動用媒体材
料にある。

本発明の電気泳動用媒体材料は」ユ記のように支持体層
と電気泳動用媒体層とを特定の接着層により接合してな
る三層構造を含むものであり、前述の電気泳動用媒体層
（ゲル膜）の乾燥工程における各種の操作によっても、
その三層構造が分離しにくいため、電気泳動用媒体層の
破損が発生することは沿どなく、また濾紙なとを使用す
る必要がない。

さらに１本発明の電気泳動用媒体材料は、水平に置いた
支持体の上に接着層を形成し、次いで電気体動用媒体層
をその上に形成する方法によっても製造することが可能
であるため、電気泳動用媒体材料の量産化にも大きく寄
与するものである。

次に本発明の詳細な説明する。

本発明の電気泳動用媒体材料の支持体としては、カラス
板、紙ある−いは各種のプラスチック製シートなとを用
いることができるが、本発明による利点を生かすために
は、支持体としてプラスチック製シートを用いることが
好ましい。このプラスチック製シーＩ・とじては、任意
のプラスチックから形成したものを用いることかできる
が、特にポリエチレンテレフタフタレートから形成され
たシーＩ・を用いることが好ましい。

本発明において支持体の上には接着層が形成される。

１妾１１層は、下記の一煎′式（１）乃至（３）のいず
れかにより表わされる構成繰返し単位を有する（・般式
（１）において、 Ｒ１１は水素原子またはｌかも６個の炭素原子を４１す
るアルキル基である； Ｒ１＋ Ｑｌは−ｃｏｏ−１−ＣＯＮ−１またｌ±６カーら１０
個の炭素原子を有するアリーレン基、ＲＩＩ Ｌｌは、−ｃｏｏ−あるいは−〇〇Ｎ−の結合のいずれ
かを少なくとも１個含み、力）つ３カ）ら１５個の炭素
原子を有する二価の基、またｔよ。

　　ＩＩ ■ −０−１−Ｎ−１−ＣＯ−１−ＳＯ−１ｉｔ ■ −８０２−１−Ｓ　Ｏ３−１−３Ｏ２Ｎ−１ずれかを少
なくとも１個含み、かつ１カ）らＸ２（固の炭素原子を
有する二価の基である（ただしＲ１１は前述と同義であ
る）； Ｒ１２は−ＣＨ＝　ＣＨ２又は−ＣＨ２０Ｈ２Ｘｌのい
ずれかである（ただし、ＸｌＬ士求核基番こより置換さ
れる基、あるいは塩基によってＨＸｌの形で脱離しうる
基を表わす）。

Ｘｉとｙｌはモル百分率を表わし、Ｘｌとｙｌはそれぞ
れＯ〜９９と１〜１００（好ましくは、５０〜９５と５
〜５０）の自白をとり、ｘ　１　＋　ｙ　１は９０以」
−（Ｆｆましくは９５以Ｊ−１最も好ましくは１００）
である］　； −１，記の一般式（１）において、 ＲＩＩの例にはメチル基、エチル基、ブチルツ（、ｎ−
ヘキシル基が含まれる。

Ｑｌの例には次のような基が含まれる。

ＣＨ３ −ＣＯＯ−１−ＣＯＮＨ−１−ＣＯＮ−１Ｌ１の例には
次のような基が含まれる。なお、これらの二価の基の一
般式（１）における結合の方向は　ＱｌとＳ０２との結
合が可能なかぎり、いずれの方向をもとることかできる
。

−ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２− Ｃ’　Ｈ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２− ＣＨ２ＣＨｚ　Ｃ００ＣＨ２，− （ＣＨ２：）−５Ｃ００ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２−）−
Ｉｎ　ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−−ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＣＨ２
− ＣＨｚ　Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２− ＋　ＣＨ２’３−３　Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−＋ＣＨ
２←５Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−＋ＣＨ２）　ｔｏ　Ｎ
　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−−ＣＨ２０ＣＨ２− −ＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ３ＣＨ３ １ −ＮＣＨ２ＣＨ２−・−ＣＨ２Ｎ　ＣＨｚ　ＣＨ２−−
ＣＯＣＨｚ　ＣＨ２− −ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２− Ｓ　ＯＣＨ２ＣＨ２− −ＣＨ２Ｓ　ＯＣＨ２ＣＨ２− −Ｓ　Ｏ２ＣＨ２ＣＨ２− 一５Ｏ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−−Ｓ　Ｏ２
ＣＨ２ＣＨ２Ｓ　Ｏ２ＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｈ ｌ −３−（ＩＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− １ 一３Ｏ３ＣＨ２Ｃ００ＣＨ２ＣＨ２− ３Ｏ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−−ＳＯ３Ｍ　
ＨＣＨｚ　ＣＯＯＣＨｚ　ＣＨ２−−Ｓ　Ｏｚ　Ｎ　Ｈ
ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨｚ　Ｑ　Ｈ２Ｎ　ＨＣＯＮ　Ｈ
ＣＨ２ＣＨ２− ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨｚ−−Ｎ　ＨＣＯＯ
ＣＨｚ　　ＣＨ２− −ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＯＣＨｚ　ＣＨｚ−−ＣＨ２０Ｈ２
Ｘ’のいずれかであるが、この−Ｘｌの例には、次のよ
うな基が含まれる。

ハロケン原子（塩素、臭素など）；ヒドロキシル基：ア
ルキルスルホニルオキシ（例、メチルスル　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｏ１２ ホニルオキシ　Ｈ２Ｏ−３−０−、エチルスルホ１ ニルオキシ、プロピルスルホニルオキシなど）；アリー
ルスルホニルオキシ（例、フェニルスルホスルホニルオ
キシなど）：アルキルカルボニルオキシ（例、アセトキ
シ、プロピオニルオキシ、トリフルオロメチルカルボニ
ルオキシ、ジクロロメチル力ルホニルオキシなど）。

従って、Ｒ１２の例には、次のような基が含まれる。

−ＣＨ＝　ＣＨ２、−ＣＨ２０８２０文、−ＣＨ２ＣＨ
ｚ　Ｂ　　ｒ　、 １） −ＣＨ２ＣＨ２−０−Ｓ　−ＣＨａ　、１ −ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ１ ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＨ３゜ −ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＦ３、 −ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＨ０文３、 ［一般式（２）において、 Ｒ”は水素原子または１から６個の炭素原子をイｉする
アルギル基である； Ｒ２２は−ＣＨ＝ＣＨ２又４ｉ−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ２であ
る（ただし、Ｘ２は求核基によって置換されうる基、ま
たは塩基によってＨＸ２の形で脱離しうる基を表わす）
； Ｌ２は、１から６個の炭素原子を有するアルキレン基（
例、メチレン、エチレン、インブチレン）、６から１２
４１！ｌの炭素原子を有するアリーレン＆　Ｃ例、　フ
ェニレン、トリレン、ナフタレン）、−ｃｏｚ２−で表
わされる基、および−ＣＯＺ２１（２３−で表わされる
基（ただし、Ｒ２３は１から６個の炭素原子を有するア
ルキレン基、あるいは６から１２個の炭素原子を有する
アリーレン基であり、モしてＺ２は酸素原子あるいはＮ
Ｈである）から選ばれる二価の基である； Ｘ２とｙ２はモル百分率を表わし、Ｘ２とｙ２はそれぞ
れｌＯ〜９５と５〜９０（好ましくは、５０〜９５と５
〜５０）の値をとり、ｘ　２４　ｙ　２は９０以上（好
ましくは９５以上、最も好ましくは１００）である］　
； なお、上記一般式（２）のＲ”およびＲ２２の例には、
それぞれ前記−・般式（１）のＲ１１および１（１２と
同じ例が含まれる。

−・ｎシ式（３） ［−・般式（３）において、 Ｒ３１は水素原イ、または１から６個の炭素原子を有す
るアルキル基である； Ｌ３はＩから２０４ｆＪの炭素原子を有する二価の連結
基（更に好ましくは一〇〇ＮＨ−又は−ｃ。

−結合のうち少なくとも１つを含む炭素数１−１２の二
価の基）である； Ｘ３は活性エステル基である； Ｘ３とｙ３はモル百分率を表わし、ｘ３とｙ３はそれぞ
れ０〜９５と５〜１００（好ましくは、５０〜９５と５
〜５ｏ）の値をとり、Ｘ３＋ｙ３は９０以」二（好まし
くは９５以上、最も好ましくは１００）である； ｍはＯあるいはｌである］ 上記一般式（３）のＲ３１には前記一般式（１）のｌ（
１１の例と同じものが含まれる。

一般式（３）のＬ３には次のような基が含まれる。−〇
〇ＣＨ２− −Ｃ’ＯＣＨ２ＣＨｚ　ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２−−ＣＯＮ
　ＨＣＨ２− ＣＯＮ　ＨＣＨｚ　ＣＨ２− −ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− ＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨｚ　ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＮ
　ＨＣＨ２ＣＯＮ　ＨＣＨ２− ＣＯＮＨＣＨｚ　Ｃ０ＮＨＣＨｚ　Ｃ０ＮＨＣＨ２−Ｃ
ＯＮＨＣＨｚ　Ｎ）ＩＣＯＣＲ２Ｇ）＋２　ＣＨ２Ｓ　
ＣＨ２ＣＨ−ｚ−−ＧＯＮｔ（ＣＨ２０ＣＯＣＨｚ　Ｇ
Ｈｚ−な−ど一般式（３）のｘ３には次のような基が含
まれる。

Ｑ −ＣＯＯＣＨ２ＣＮ −ＣＯＯＣＨ２Ｃ００Ｃ２Ｈ５ ＣＯＯＣＩ（ｚ　ＣＯＮ　Ｈ２ −ＣＯＯＣＨ２ＣＯＣＨ３ Ｃ００ＣＨｚ　ＣＯＯＣＨ＝　ＣＨ２ −ＣＯＯＮ　＝　ＣＨＣＨａ ｏ　００　Ｎ　＝　Ｃ（ＣＨ３）　　２−ＣＯ０Ｃ＝Ｃ
ＨＣＯＣＨａ ＣＨ３ ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２Ｂ　　ｒ −ＣＯＯＣＨ、ＣＨ□　ＣＮ 以ドに、上記の一般式（Ｆ′）乃至（３）のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するポリマーの合成
に用いることができる代表的なビニルスルホニル基ある
いはその前駆体となる官能基をイイするエチレン性不飽
和モソマーの合成法を基体的に示す。

以下全トも 、２ ［合成例１］　２−［３−（２−クロロエチルスルホニ
ル）プロピオニルオキシ］エチルアクリレートの合成 ＣＨ＝ＣＨ２ Ｃ＝Ｏ ！ 反応容器にテトラヒドロフラン６００　ｍ　ｌ、ヒドロ
キシエチルアクリレ−ｌ−４５、８ｇ、３−（２−クロ
ロエチルスルホニル）プロピオン酸クロリド’　７２　
ｇを加え、氷水により冷却しながら、５℃以下で、ピリ
ジン：ｊｌ、２ｇをテトラヒドロフラン１００ｍＭに溶
解したものを１．７５時間で滴下した。その後室温で２
時間攪拌を続け、反応萬料を２．５文の氷水中に注ぎ込
み、クロロホルム３００　ｍ　ｌにより４回抽出した。

有機層を硫酸すトリウムにより乾燥後、濃縮して、２−
［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロピオニルオ
キシ］エチルアクリレ−）８７ｇを得た。（収率８８％
） ［合成例２］　Ｎ−［３−（２−クロロエチ、ルスルホ
ニル）プロパンアミドメチルコアクリルアミドの合成 Ｃｌ１−ＣＨ２ Ｃセ０ 「 ＣＨ２ＮＨＣＣＨ２ＣＨｚ　−Ｓｏ。−〇８２Ｃ）Ｉ２
ＣＩ２ｆＬの反応容器に蒸留水１，４００ｍ文、亜硫酸
すトリウム２４４ｇ、炭酸水素ナトリウム２２０ｇを加
え、攪拌して溶解させた後、氷水により冷却しながら約
５°Ｃで、クロロエチルスルホニルクロリＩ・２６０ｇ
を１．５１１４間で滴下した。その後４９％硫酸１６０
ｇを約１５分で滴下し、５℃で１時間はど攪拌を続けて
、析出した結晶を濾過した後、結晶を４００ｍ文の蒸留
水で洗浄し、濾液と洗浄液とを一緒にして３文の反応容
器に入れた。この中にメチレンビスアクリルアミド２４
６ｇを蒸留水４８０ｍＭ、エタノールｌ　、４８０ｍ文
に溶解させたものを、氷冷しながら約５°Ｃで、３０分
間で滴下した後、全体を冷蔵庫に５日間放置して反応を
完結させた。析出した結晶を癌取した後、冷却した蒸留
水８００ｍ文で洗浄し、２゜ｏｏｏｉの５０％エタノー
ル水溶液から再結晶して、２’　１９　ｇの千ツマ−を
得た。収率は４９％であった。（分析結果、Ｈ：５．１
７、Ｃ：３７゜９０、Ｎ：　９．４８、Ｃｌ：１２．５
８）［合成例３］　　（［３−（２−クロロエチルスル
ホニル）プロパンアミドコメチル）スチレンの合成反応
容器にテトラヒドロフランｌｏｏｍＪｌｊ、ビニルベン
ジルアミン２０．１ｇ、トリエチルアミン１６．７ｇ、
ヒドロキノン０．１ｇを入れ、氷水により冷却しながら
β−クロロエチルスルホニルプロピオン酸クロリド３６
．１ｇを２００　ｍ　ｌのテトラヒドロフランに溶解さ
せたものを３０分で滴下した。その後室温で一夜放置し
、反応試料を濃硫酸１６．５ｇを尿水１．５文で希釈し
た溶液中に注ぎ込み、生成する沈毅を癌取した。この沈
Ｖをエタノール２００ｍ文、水２００ｍ文の混合溶媒か
ら書結晶することにより、２６．８ｇの（［３−（２−
クロにエチルスルボニル）プロパンアミドコメチル）ス
チレンを得た。収率は５７％であった。（分析結果、Ｈ
：５．７４、ｃ：５３．４７、Ｎ：４．８３、Ｃ１：１
０．９９、Ｓ：１０．４９） ［合成例４］　　１−　［２−（４−ビニルフェニルス
ルホニル）エチルスルホニル］　−３−（２−クロロエ
チル）スルホニル−２−プロパツール（’）　ｂ　Ｉ＆
ＣＨ 以下余白 反応容器に１，３−ビス（２−クロロエチル）スルホニ
ル−２−プロパツール１５７ｇ（特Ｎ昭５３−５７２５
７明細書に開示の方法により合成された化合物）、メタ
ノール１Ｍ、蒸留水１Ｍを加え、４６°Ｃに加熱しなが
らビニルベンゼンスルフィン酸カリウム５２ｇをメタノ
ール１００＋ｎＪｌと蒸留水１００ｍ文に溶解させたも
のを１時間で滴下した。その後４６°Ｃに保ったまま５
．５時間攪拌を続け、生成する沈澱を濾取して５５ｇの
１−　［２−（４−ビニルフェニルスルホニル）エチル
スルホニル］　−３−（２−クロロエチル）スルホニル
−２−プロパツールを得た。収率は４９％であった。（
・分析結果、Ｈ：４．６７、Ｃ：３９８９、Ｓ：２１．
４３） 本発明の接着層の形成用のポリマーとして好ましいもの
としては、次に示す構成繰返し単位を有するポリマーを
挙げることができる。

ここで、括弧外の数字はモル百分率を表わし、Ｒは下記
の置換基をノｆζす、。

Ｐ−Ｉ　　　Ｃｏｏ　ＧＨｚ　ＣＨｚ　ＯＣＯＣＨｚ　
ＣＨ２５ｏ□ＣＨ＝　ＣＨ２Ｐ−２Ｃ０ＮＨＣＨ２ＮＨ
ＣＯＣＨｚ　ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝　ＣＨｚｐ４　　　Ｃ
［ＯＣＨ２ＧＨｚ　ＯＣＯＣＨｚ　５Ｃ１２ＧＨｚ　Ｃ
Ｈ２（ＩＩＰ−５０ＯＮＨＣ）１２　ＮＨＣＯＣＨｚ　
ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ１０ 次に、上記のポリマーのうちでも特に好ましいポリマー
であるＰ−１、Ｐ−２およびＰ−５の合成例を次に示す
。

［合成例５コ　ポリ−２−［３−（ビニルスルホニル）
プロピオニルオキシコエチルアクリレートーコーアクリ
ルアミド（Ｐ−１）の合成反応容器にＮ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド６０ｍＭ、２−　［１（２−クロロエチル
スルホニル）プロピオこルオキシ］エチルアクリレート
１４．５ｇ、アクリルアミド３２．６ｇを入れ、窒素カ
スで脱気後６０’Ｏに加熱して、２，２゛−アゾヒス（
２，４−ジメチルバレロニトリル）　　［ＣＡＳ　　Ｒ
ｅｇｉｓｔｒｙ　Ｎｏ　４４１９−１１−８　］　０　
、４０　ｇを加え、２吟間加熱、攪拌を続けた。その後
さらに２゜２゛−アンビス（２，４−ジメチルバレロニ
トリル）０．２０ｇを加え、２時間加熱、攪拌を続けた
後、５°Ｃに冷却して炭酸ナトリウム１２ｇとトリエチ
ルアミン４．９ｇを加え、１時間攪拌を行なった。さら
に室温で１時間攪拌を続けた後、反応試料をセルロース
チューブに入れて２０間透析し、凍結乾燥によって４３
ｇの白色ポリマーを得た（収率９５％）。

得られたポリマーのビニルスルホニル含量はｌ、　ＯＸ
　１０−３当量／ｇであった。

［合成例６］　ポリ−Ｎ−（［３−（ビニルスルホニル
）プロパンアミドコメチル）アクリルアミドーコーアク
リルアミド（Ｐ−２）の合成２００ｍｌの反応容器に、
合成例２のモノマー５．６５ｇ、アクリルアミド１２．
８ｇ、５０％メタノール水溶液８０ｍ文を加え、攪拌し
ながら６０°Ｃに加熱し、２，２゛−アゾヒス（２、４
−ジメチルバレロニトリル）０．１ｇを加え、さらに３
０分後にも回しものをＯ，Ｉｇ加えて１時間加熱、攪拌
を続けた。その後、氷水により約１０００に冷却して、
トリエチルアミン２．５ｇを８０ｍ１のメタノールに溶
解させたものを加え、１時１１１目児拌を続けてから、
反応試料を攪拌しなから１文のアセＩ・ンに注ぎ込み、
生成した沈毅を癌取して、１５．９ｇのＰ−２を得た（
収率９０％４カ、）。

ｔＩＩられたポリマーのスルホニル含量は０，９５ｘ　
ｉ　ｏ−３当量／ｇであった。

［合成例７］　ポリ−Ｎ−（［３−（２−クロロエチル
スルホニル）プロパンアミドコメチル）アクリルアミド
ーコーアクリルアミド（Ｐ−５）の合成 ５００ｍＭの反応容器に、合成例２のモノマー１０、’
３ｇ、アクリルアミド１５．６ｇ、５０％メタノール水
溶液１６０ｍＭを加え、攪拌しながら６０°Ｃに加熱し
、２，２′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）０．２ｇを加え、さらに３０分後にも同じものを０
．２ｇ加えて、１時間加熱、撹拌を続けた。反応試料を
セルロースチューブに入れて２日間透析し、凍結乾燥に
よって２３ｇの白色ポリマー（収率９０％）を得た。

二のポリマーのクロロエチルスルホニル含量は１　、　
ＯＸ　１０−３当量／ｇであった。

接着層は前述のコポリマーからなる層で、公知の方法に
より支持体の表面に設けることができる。前述のコポリ
マーのうち水溶性または親水性のものを用いる場合には
、それの水溶液または、水を主成分とする水−有機溶媒
混合溶媒溶液を、公知の方法により支持体の上に塗布、
乾燥して接着層を形成する。前述のコポリマーのうち疎
水性で水不溶性のものを用いる場合には、それの有機溶
媒溶液または、有機溶媒を主成分とする有機溶媒−水混
合溶媒溶液を、公知の方法により支持体の１−に塗布、
乾燥して接着層を形成する。

用いることができる有機溶媒の具体例として、アセトン
、メチルエチルケトンなとのケトン類；メタノール、エ
タノールなどのアルコール類−Ｎ、Ｎ−ジメチルホルム
アミド；ジメチルスルホキシド；ジメチルエーテル、ジ
オキサンなどのエーテル類などを挙げることができる。

乾燥後の接着層の厚さは、約０　、１　ｇｍから約３川
ｍ、好ましくは約０．２７ｉ、ｍから約２川ｍの範囲で
ある。

次に電気泳動用媒体層（以下において、ポリアクリルア
ミドゲル膜という）について説明する。

ポリアクリルアミドゲル膜の製造に際して、アクリルア
ミド系化合物と架橋剤とは、水溶液または水分散液とし
て水中に溶解または分散させておき、水中で両者を架橋
重合させて、架橋重合した水性ゲル媒体を形成する。本
明細書においては、特にことわらない限・す、（水中に
）溶解と（水中に）分散の両者を含めて単に（水中に）
溶解といい、水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶
液という。また、溶媒または分散媒として、所望により
加えられる有機溶媒と水との混合物をも包含する。

本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物と
しては、アクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、
Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメ
チル）アクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド等の
アクリルアミド系化合物が挙げられ、これらの化合物は
単独で、あるいは二種以上を併用して用いることができ
る。そして、これらのアクリルアミド系化合物のうちで
はアクリルアミドが最も好ましく、またアクリルアミド
と他のアクリルアミド系化合物の一種以上の併用も好ま
しい。

架橋剤としてはｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　
　Ｊ　　１９Ｂ１゜２、２２０−２２８等に記載の公知
の化合物（一種または二種以上の組合せ）を用いること
ができる。架橋剤の具体例としては、Ｎ、Ｎ’−メチレ
ンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）、Ｎ、Ｎ’−プロピレ
ンヒスアクリルアミド（ＰＢＡ）、ジアクリルアミドジ
メチルエーテル（ＤＡＥ）；　ｌ　、２−ジアクリルア
ミドエチレングリコール（ＤＥＣ）、エチレンウレアビ
スアクリルアミド（ＥＵＢ）、エチレンジアクリレ−１
−（ＥＤＡ）；　Ｎ、Ｎ　’−ジアリルタータルジアミ
ド（Ｎ、Ｎ’−ｄｉａｌｌｙｌｔａｒｔａｒｄｉａｍｉ
ｄｅ　　：ＤＡＴＤ）；Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリルシス
タミン（Ｎ、Ｎ’−ｂｉｓａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍ
ｉｎｅ、　Ｂ　Ａ　Ｃ）等の二官能性化合物が挙げられ
る。架橋剤は、単量体と架橋剤の総重量に対して約２重
量％がら約３０重量％が用いられ、特に約３重量％から
約１０重量％が好まし′〈用いられる。

なお、ゲル濃度はゲル１００ｍＪｌｊ中に含まれる単量
体と架橋剤の総グラム数で示し、一般にＴ％で表示する
。

ポリアクリルアミドゲル膜の形成時に共存させられる変
性剤としては、少なくとも１個のカルバモイル基を持つ
化合物を用いることができ、その具体例として、尿素、
ホルムアミド等が挙げられる。これらのうちで尿素が好
ましく用いられる。

変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性ゲルの容積に
対し、約４０　ｗ　ｔ　／　ｖ％から約６０ｗｔ／■％
の範囲で用いられる。また尿素を用い、る場合には、単
量体と架橋剤とを含む水性ゲル媒体１１に対し約６モル
（約３　ｓ　ｏ　ｇ）から飽和溶解量まで、好ましくは
約７モル（約４２０ｇ）から飽和溶解量までの範囲で用
いることができる。

本発明のゲル媒体にはｐ）ｌ緩衝剤を含有させることが
できる。緩衝剤としては、ｐＨ８，０から９．０、好ま
しくはｐＨ８，２から８．３の範囲内のｐＨ値に緩衝で
きる緩衝剤であれば、いずれをも用いることができる。

用いうる緩衝剤としては、日本化学全編「化学便覧　基
礎ｍｊ　　（東京、丸首■　１９６６年発行）　１３１
２−１３２０ページ；ＦＤａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｊ　（Ｒ，Ｍ、Ｃ。

Ｄａｗｓｏｎ　　ｅｔ　ａ１編　第２版、　０ｘｆｏｒ
ｄ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、
１９８９年発行）　４７Ｂ−５０８ページ；１１　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｊ　、　５４６７（１９８Ｂ）
　；：ｌ’Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ　ｊ　１０４３００−３１０（＋９８０）　７％
’のｔｌＪｆｆｉｉ物に記載の緩衝剤があげられる。そ
して、その具体例としてはトリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン（Ｔｒｉｓ）　、　Ｎ　、　Ｎ−ビス（２
−ヒＩ・ロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　、
Ｎ　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−ヒ
ドロキシプロパン−３−スルホン癩のＮａ塩またはＫ　
Ｉｊ、４等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ
’−３−プロパンスルホン酸のＮ　ａ　１５４またはｒ
＜　１１ＡＡ６、Ｎ−［１リス（ヒドロキシメチル）メ
チル］−３−アミノプロパンスルホン酎のＮ　ａ　塩ま
たはＫ　１１．ｊおよび、これらのいずれかと心霊によ
り組合せられる酸、アルカリまたは塩等をあげることが
できる。特に（ｌｒましい緩衝剤の例としては。

Ｔｒｉｓ、ホウ酪およびＥＤＴＡ・２Ｎａ塩のＭ１合せ
（ｐＨ８，２）がある。

未発ＩＪＩのポリアク１，１ルアミドゲル１１りは、さ
らに水溶性の合成高分子化合物を添加することが好まし
い。この合成高分子化合物は、単量体と架橋剤の耐重ｊ
−に対して２玉量％から１００重量％の範囲で用いられ
、好ましくは５重量％から５０重量％の範囲で用いられ
る。

上記の水溶性の合成高分子化合物の分子量としては、１
万から１００万の範囲が好ましい。

水溶性合成高分子の好ましい例としては、付加重合型ま
たは縮重合型の、水溶性ポリマーを用いることができる
。付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド
等の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。また縮重
合型ポリマーの具体例としてポエチレングリコール、ポ
リプロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアル
キレングリコール等が挙げられる。なかでもポリエチレ
ングリコール、ポリアクリルアミドが特に女子ましい。

このポリマーを添力■することにより、湿潤ゲル膜は可
塑的となり、もろさが改良される。また乾燥ゲル膜の状
態でも、可塑化効果はさらに有効に作用し、ひびわれ等
のもろさが改良される。

本発明のポリアクリルアミドゲル膜は更にアガロースを
含有することが好ましい。アカロースは、種類として特
に制限はなく、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸
透性アガロースのいずれをも用いることができる。用い
ることのできる７カロースの例としては、特開昭５５−
５７３０号、特開昭５５−１１０９４６号、特表昭５７
−５０２０９８号等の公報に開示されているアガロース
等を用いることもできる。アガロースの添加量は単量体
と架橋剤を含むゲル組成液の容積に対して約０．２ｗ／
ｖ％から約２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．３ｗ／ｖ％か
ら約１．２Ｗ／Ｖ％の範囲から選ばれる。アカロースを
含有させた組成においては、溶液温度を変化させること
により、適当な溶液粘度にコントロールすることが可能
となる。

本発明の電気泳動用媒体層は、上記のようにアクリルア
ミドに代表される単量体、二官能性・めアリル（ａｌｌ
ｙｌ　）化合物またはアクリル化合物（架橋剤）、水溶
性ポリマー、およびアガロース゛□を実質的に均一な水
溶液中で単量体と架橋剤とをラジカル架橋重合させて得
られるものであり、単量体と架橋剤から形成された三次
元架橋重合体に水溶性ポリマーとアガロースが実質的に
分散されて、後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合体と
からみあっている構造を有すると推定される。

上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の不存在下
で過酸化物の存在および／または紫外線照射等の公知の
方法により発生させることができる。更に該反応は加熱
および紫外線照射により加速することもできる。

ラジカル架橋重合用触媒としては、ｒ　Ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｊ　１８Ｂ１．２１２１３−２１９
．同１９８１．　ｇ、　２２０−２２８　、青米、永井
編「最新電気泳動法Ｊ　　（１９７３年発行）等に記載
の公知の低温ラジカル重合開始剤のうちから適宜選択し
て用いることができる。

好ましいラジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジ
メチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＡ　ＰＮ）−ペル
オクソニ硫酸アンモニウム混合物、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ
’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）−ペ
ルオクソニ硫酸アンモニウム混合物、ＴＥＭＥＤ−リボ
フラビン混合物、ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過酸化水
素混合物と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカ
ル重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約０．３重量％から約５重量％、そして好ましく
は約０．５重量％から約３重量％の範囲である。

本発明のゲル媒体には、必要に応じて抗酸化剤を含有さ
せることができる。抗酸化剤としては、ゲル電気泳動媒
体に配合しうろことが知られている種々の化合物を用い
ることができる。抗酸化剤の具体例としては、ジチオス
レイトール、２−メルカプトエタノールを挙げることが
できる。

その他の添加剤としては湿潤剤があり、本発明のゲル媒
体にグリセリン、エチレングリコール等のポリオール化
合物を含有させることもできる。

ポリオール化合物の含有量は、ゲル媒体の容積に対して
約５ｗ／ｖ％から約４０　ｗ　／　ｖ％の範囲から選ば
れる。このうちではグリセリンが特に好ましい。湿潤剤
を配合することによりゲル媒体の保存時の極端な水分の
蒸発による乾燥を防ぐことが可能となり、また極端な乾
燥に起因するもろさの発生を防ぎ、ひびわれを防ぐ等の
ゲル媒体の物性が改善されるとの利点がある。

本発明のゲル媒体を層または膜として用いる場合には、
平滑な親水性表面を有する電気絶縁性支持体の上にゲル
形成液を公知の方法により塗布して設けたのちにゲル形
成液を架橋重合させることによりゲル層またはゲル膜に
成形することができるや 支持体については前述したが、さらに具体的には、ガラ
ス板、親木性ポリマーまたは公知の表面処理しより表面
を親水化したポリマー（例、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリ塩化ビ
ニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマー、ポリメ
チルメタアクリレート、ポリエチレン、ポリ、プロピレ
ン、セルロースアセテート類、セルロースアセテートプ
ロピオネート等）のフィルム、板またはシート等の成形
物をあげることができ番。これらのポリマー成形物の表
面を親水化するための処理としては。

紫外線照射、クロー放電処理、コロナ放電処理、火焔処
理、電子線照射、ケミカルエツチング、電解エツチング
等の公知の方法を適用することができる。

ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合には、
ゲル形成液の上をさらにカバーフィルム、シートまたは
板などでおおうことができる。このＩＪ的に使用される
カバーフィルム、シート、または板としては前記支持体
と同様な素材からなるものを用いることができる。

本発明の電気泳動用媒体材料を用いることにより、たと
えば、従来ＤＮＡの塩基配列決定において必要とされて
いた複雑な乾燥工程が簡略化され、支持体上にゲル膜を
のせたままで、電気泳動、乾燥、さらにオートラジオグ
ラフィー処理が可能となるなどの利点がある。

以下に本発明の実施例を記載するが、これらは本発明の
範囲を限定するものではない。

［実施例１］ 紫外線照射処理により表面を親水性にしたポリエチレン
テレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）上に約０．
５ルｍの厚み（固形分）になるように第１表記載のポリ
マーを塗布し、約１１０　’０で乾燥して接着層を形成
した。

埴１表　接着層形成用塗布液の組成 試料　　　　ポリマー　　　　　ポリマー濃度１　ポリ
アクリルアミド　　　　　５ｇ２　ポリアクリルアミド
　　　　４．５ｇＢＩＳ　　　　　　　　Ｏ，５ｇ ３　　　Ｆ−２５ｇ ４　　　　　　Ｐ　−５同　］二 ５　　　　　　　ｐ−６１司　」二 註）ポリマー濃度は上記の量のポリマーに水を加えて塗
布液の容積を１００ｍ文としたことを意味し、ＢＩＳは
、　Ｎ、　Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドを意味し
、またＰ−２、Ｐ−５およびＰ−６は前述の該当する式
により表わされるポリマーを、ａ、味する。

まず、ＰＥＴシート（支持体）と接着層との間の接着性
をクロスカット法により評価した。その結果、試料番号
３．４および５（本発明に従う試料）は接着性が良好で
あったが、試料番号ｌおよび２（比較試料）については
、かなりの部分でシートと接着層間に剥離がみられた。

支持体上に設けられた各接着層の上に、アクリルアミド
１１．８７ｇ、ＢＩＳｏ、６３ｇ、尿素４２ｇ、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン［ＣＡ　Ｓ　　Ｒｅ
ｇｉｓｔｒｙ　Ｎｏ　７？−８８−１］　１　、０８　
ｇ、ホウ酸０．５５ｇおよびＥＤＴＡ・２Ｎａ１１Ａ９
３　ｍ　ｇを含有する１００ｍ文の溶液に重合開始剤と
して過硫酸アンモニウム（５重量％）１．３ｍ文、ＴＥ
ＭＥＤ３３ｇＭを加えたものを０．５ｍｍの厚みで成形
し、ポリアクリルアミドゲル膜を１７）だ。

得られたゲルｌｌｌ１を指でおさえ、ゲル膜と支持体間
の接着性を評価した。その結果、試料番号３．４および
５（本発明に従う試料）を接着層とじたものは、接着性
が優れていたが、試料番号１および２（比較試料）は接
着性が劣っていた。

［実施例２］ 実施例１の第１表と同じポリマーを用いて接着層が形成
されたＰＥＴシートを作成し、この接着層の上にアクリ
ルアミド１１．８７ｇ、ＢＩ３０．６３ｇ、アガロース
１６００　（和光紬薬■製）０．３ｇ、ポリアクリルア
ミド２．５ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン１．０８ｇ、ホウ酸０．５５ｇ、およべＥＤＴＡ−２
Ｎａ塩９３ｍｇからなる１００ｍＪ１の溶液に重合開始
剤として過硫酸アンモニウム（５重量％）１．３ｍ文、
ＴＥＭＥＤ３３ｇ文を加えたものを０．５ｍｍの厚みで
成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を得た。

このゲル膜を使用して、”Ｐ−ＤＮＡをマキサム・ギル
バート分解した試料について電気泳動にかけ、ＤＮＡ塩
基配列決定の実験を行なった。電気泳動後にゲル膜を、
脱尿素とＤＮＡ固定のために、１０％酢酸水溶液中に１
時間浸漬した。このゲル膜を乾燥し１次いでオートラジ
オグラフィー処理を１θ法にしたかって行なった。

１０％酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持体とゲ
ル膜の接着状態を観察した。

試料番号ｌ（比較試料）のゲル膜は支持体から完全に剥
離し、また、試料番号２（比較試料）については、ゲル
膜は一部支持体に接着した部分があるものの、その大部
分は支持体から剥離していた。

一方、試料番号３〜５（本発明に従うもの）については
、ゲル膜はいずれも支持体上に完全に接着していた。更
にゲル膜を乾燥させた後、それと支持体との間の接着状
態を観察した。ゲル膜はいずれも支持体によく接着して
いた。またオートグラフィー処理した後も各試料は接着
性に問題はなく良好な結果を示した。　　　　　　　　
　°４［実施例３］ 実施例２と同様にしてＰＥＴシート上にポリアクリルア
ミｌ’ゲル１１りを形成した。このゲルＩＩｔＩを支持
体ごよ裁断加工したのち、ゲル膜の切口を観察したとこ
ろ、試料番号１〜２（比較試料）についてはゲル膜の剥
離が一部観察されたのに対して、試料番号３〜５（本発
明）についてはいずれも裁断口の接着性は良好で、支持
体ごと裁断加工できることがわかった。

特許出願人　富士写真フィルム株式会社代理人　　　　
弁理士　　　柳川泰男

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ。下記の各層が順次積層されてなる三層構造を含む電
   気泳動用媒体材料： ［Ｉ］支持体層； ［１］一般式（１）乃至（３）のいずれかにより表わさ
   れる構成繰返し単位を有するポリマーを含有する接着層
   ； ［一般式（１）において、 Ｒ１１は水素原子または１から６個の炭素原子を有する
   アルキル基である； １（１１ Ｑｌは一〇〇〇−、−ＣＯＮ−１または６から１０個の
   炭素原子を有するアリーレン基、　１１ のいずれかを少なくとも１個含み、かつ３から１５個の
   炭素原子を有する二価の基、または、１１ 「 −０−１−Ｎ−５−ＣＯ−１−３〇− １１ 一５Ｏ２−１−ＳＯ，−１−５Ｏ□Ｎ−１ずれかを少な
   くとも１個含み、かつｌから１２個の炭素原子を有する
   二価の基である（ただしＲＩ＋は前述と同義である）； Ｒ１２は−ＣＨ＝　ＣＨ２又は−ＣＨ２ＣＨ２ｘ１のい
   ずれかである（ただし、ｘｌは求核基により置換される
   基、あるいは塩基によってＨＸＩの形で脱離しうる基を
   表わす）； ｘｌとｙｌはモル百分率を表わし、ｘＬとｙｌはそれぞ
   れ、０〜９９と１〜１００の値をとり、Ｘｌ　＋ｙ　１
   は９０以上であるコ； ［一般式（２）において、 Ｒ”は水素原子または１から６個の炭素原子を有するア
   ルキル基である； Ｒ２２は−ＣＨ＝ＣＨ２又ｉｆ　　ＣＨｚ　ＣＨ２Ｘ　
   ２である（ただし、ｘ２は求核基によって置換されうる
   基、または塩基によってＨＸ２の形で脱離しうる基を表
   わす）： Ｌ２は、１から６個の炭素原子を有するアルキレン基、
   ６から１２個の炭素原子を有するアリーレン基、−ｃｏ
   ｚ２−で表わされる基、および−ＣＯＺ２Ｒ２”−で表
   わされる基（ただし、ｌ（２３は１から６個の炭素原子
   を有するアルキレン基、あるいは６から１２個の炭素原
   子を有するアリーレン基であり、そしてＺ２は酸素原子
   あるいはＮＨである）から選ばれる二価の基である；　
   　ｘ２とｙ２はモル百分率を表わし、ｘ２とｙ２はそれ
   ぞれ、１０〜９５と５〜９０の値をとり、Ｘ２　＋　ｙ
   　２は９０以上である］　；［一般式（３）において、 Ｒ３１は水素原子、または１から６個の炭素原子を有す
   るアルキル基である； Ｌ３は１から２０個の炭素原子を有する二価の連結基で
   ある； ｘ３は活性エステル基である： Ｘ３とｙ３はモル百分率を表わし、Ｘ３とｙ３はそれぞ
   れ、Ｏ〜９５と５〜１００の値をとり、ｘ　３　＋ｙ　
   ３は９０以上である； ｍはＯあるいはｌである］ ［１［］アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下
   で架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、お
   よび変性剤として少なくとも１個のカル八モイル基をも
   つ化合物を含む電気泳動用媒体層。 ２゜電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーおよｑア
   ガロースを含むことを特徴とする特３１請求の範囲第１
   項記載の電気泳動用媒体材料。 ３゜前記変性剤が尿素またはホルムアミドである特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の電気泳動用媒体材料
   。 ４゜支持体層がプラスチックシーＩ・からなることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２ザ１記載の
   電気泳動用媒体材料。 ５゜プラスチックシートがポリエチレンテレフタレート
   からなることを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の
   電気泳動用媒体材料。 ６゜接着層が、−・般式（１）の構成繰返し単位を有す
   るポリマーを含有するものであることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材料。