SE449225B - Gelprodukt baserad pa partiklar innehallande galaktan for separationsendamal, molekyl- och partikelimmobilisering - Google Patents

Description

449 225 jämförda med många oorganiska geler såsom kiselgel och även mjuka- re än t.ex. styrenbaserade geler. Detta begränsar gelernas använd- barhet och gör dem mindre lämpade för eller otjänliga till hög- tryckskromatografi och för teknisk användning. Vätskeflödet blir för lågt vid högt tryck och vid lågt tryck även i djupa och breda gelpartikelbäddar på grund av partikeldeformationen.

Föreliggande uppfinning avser en produkt med mekaniska egenskaper överlägsna hittills tillgängliga polysackaridgeladsorbenter. Ka- rakteristiskt för uppfinningen är att en galaktangel i partikel- form genom krympning och efterföljande tvärbindning av polysacka- ridkedjorna med gelen i krympt tillstånd härdats så, att partiklar- nas rigiditet mycket väsentligt förbättrats. Så kan man exempelvis genom att höja agaroshalten från 6% till 10% höja flödeshastighe- ten i en 1 meter djup bädd mer än tre gånger. Vid högre agaroshalt ökar gelstyrkan så, att höga tryck kan påläggas och förhållandevis höga flöden kan därigenom också erhållas i preparativa kromatografi- bäddar. Flödesegenskaperna hos en gelbädd där agarkoncentrationen överstiger 14% är utomordentligt goda, när partiklarnas diameter överstiger 10 mikrometer.

Tillverkning av galaktangeler med hög polysackaridkoncentration ut- gör ett problem. Det gäller för carragenaner såväl som för agar och agaros. Det är utomordentligt svårt att erhålla en 8%-ig agargel genom att i värme och under tryck lösa agarn. Uppfinningen avser en krympt gel av matriskoncentration som överstiger den spontant bildade gelens. Den krympta gelen innehåller minst 10% galaktan, till vilken kovalent eller på annat sätt bundits ämnenexmxger gelen önskvärda adsorptionsegenskaper. Särskilt goda egenskaper har en gel som i krympt tillstånd består av partiklar av sfärisk eller nä- ra sfärisk form.

En agargels rigiditet förklaras av att polysackaridkedjorna bildar knippen av mer eller mindre parallella strängar sammanhållna genom vätebindningar. På så sätt "stagas" gelen och en gelstyrka erhålles som är betydligt större än för en gel uppbyggd av slumpvis oordna- de polysackaridkedjor. Den ursprungliga strukturen förefaller del- vis konserverad i gel enligt uppfinningen, vilket torde förklara den förhållandevis höga permeationen genom gelfasen. De galaktan- baserade gelerna är uppbyggda enligt samma mönster som agar- och 449 225 agarosgelerna, varför de också inbegripes i uppfinningen. Det är karakteristiskt för krympningen som ger produkt enligt uppfinningen att gelpartikelns ursprungliga form i stort sett bibehåller sin form. Om man utgår från sfäriska gelpartiklar erhålles således ef- ter krympningen sfäriska partiklar. Någon sprickbildning i partik- larna till följd av kontraktionen har inte observerats.

Som mått på permeabiliteten kan man ange hur en oladdad testsub- stans eller allmännare en substans utan affinitet till gelen av giv- na molekylära dimensioner fördelas mellan gelfasen och omgivande vätskefas. Som lämpligt mått kan fördelningskoefficienten väljas dvs kvoten mellan koncentrationerna i gelen och omgivande lösning.

Av teknisk betydelse är geler permeabla för molekyler vars vikt överstiger 10 000 dalton, dvs geler som kan penetreras av protei- ner och andra biopolymerer. Ett protein är mindre lämpligt för per- meabilitetstest, eftersom det möjligen kan adsorberas på ytan eller i ett tunt skikt nära fasgränsen mellan gel och lösning, varvid 7 missvisande höga värden erhålles. Den ideala testsubstansen skall därför icke ha någon affinitet till gelmatrisen. Tillräckligt nära idealet kommer polyglykos, t.ex. en hydrolyserad dextranfraktion, vars medelmolekylvikt ligger i intervallet 10-20 kilodalton. Pro- dukter enligt uppfinningen penetreras av en sådan testsubstans så att koncentrationskvoten (fördelningskoefficienten) överstiger 1/10.

Om testsubstansen har affinitet för de adsorptionsbefrämjande grup- perna - "liganderna" - som är bundna till gelen, antar fördelnings- koefficienterna högre värden så att koncentrationen av testsubstan- sen vida överstiger koncentrationen i omgivande lösning. Detta förhållande karakteriserar också uppfinningen.

Krympning av gelen sänker permeabiliteten och kan om gelkontrak- tionen är mycket stark, resultera i för proteiner och andra ämnen av liknande molekylära dimensioner impermeabla partiklar. En ka- rakteristisk variant på uppfinningen består i en gel med vätske- fyllda hålrum av betydligt mindre dimensioner än själva gelpartik- larna. Hålrumsdiametern bör vara mindre än 1/10 av gelpartikel- diametern. En “hålrumsgel" består alltså av ett kontraherat gelnät- verk med vätskefyllda regioner, i vilka makromolekyler och,om hål- rummen är tillräckligt stora, även små partiklar kan intränga.

Gelprodukten enligt uppfinningen kännetecknas av att den framstäl- 449 225 les genom att partiklar innehållande galaktan och vatten i gelform eller som droppar suspenderade i en med vatten icke blandbar väts- kefas, impregneras med i alkalisk miljö nedbrytbara makromolekyler eller mikropartiklar av mindre dimensioner än gelpartiklarna eller vätskedropparna, varefter vattnet helt eller delvis ersättes med ett organiskt lösningsmedel, företrädesvis metanol eller etanol, som därpå avdunstas, företrädesvis vid starkt reducerat tryck, så att gelens volym.reduceras till hälften eller mindre, varefter ge- len tvärbinds i lösningsmedel som högst ökar den krympta gelens vo- lym med 50%, varefter de impregnerade makromolekylerna eller par- tiklarna sönderdelas i alkaliskt medium, varvid absorptionsbefräm- jande grupper införes i den krympta gelen förefaller efter utlös- ning av de impregnerade molekylerna eller mikropartiklarna.

En hålrumsgel enligt uppfinningen erhålles på endera av följande Sätt: A. I en partikulär galaktangel - exempelvis agar- eller agarosgel - med lämplig polysackaridkoncentration, t.ex. i intervallet 2-8%, får en högmolekylär substans, t.ex. ett protein, intränga. Lösnin- gen som omger de índränkta partiklarna avläganas t.ex. genom avsug- ning på filter. Partiklarna tvättas och slammas upp i ett organiskt lösningsmedel. Det är lämpligt att välja ett lösningsmedel som kan uppta vatten. Särskilt har metanol och etanol visat sig bra. Agar- gelkulorna bibehåller därvid sin form och krymper endast obetydligt.

Effektiv krympning åstadkommes genom att det organiska lösningsmed- let tillsammans med kvarvarande vatten avdunstas helst vid starkt reducerat tryck. För att säkerställa en effektiv krympning kan be- handling med lösningsmedel och efterföljande evakuering upprepas.

Den krympta gelen sväller helt eller delvis tillbaka, när den kon- taktas med vatten. För att förhindra återsvällning tvärbindes ge- len i krympt tillstånd. Detta kan ske i en lösning av ett organiskt lösningsmedel med 0-25% vatten. Tvärbindningen bör ske så att bryg- gorna ej innehåller laddade grupper. Exempel på lämpliga brygg- strukturer är -0-CH2-CHOH-CH2-O och -O-CH2-CH2-S02-CH2-CH2-O-1 B som erhålles när galaktanen tvärbinds med bifunktionella bisepoxi- der eller epiklorhydrin resp. divinylsulfon. Tvärbindning i alka- lisk miljö med epiklorhydrin, bisepoxider eller divinylsulfon i metanol eller etanol ger en produkt som kan överföras i en hålrums- 449 225 gel enligt uppfinningen genom alkalisk behandling - längre tid vid rumstemperatur, kortare tid vid uppvärmning - och efterföljan- de urtvättning av hydrolysprodukterna från proteinet eller annan alkalilabil polymer, om sådan använts för impregneringen. Tvärbind- ningen stabiliserar gelen så att den ger en produkt enligt uppfin- ningen med hög gelstyrka men större permeabilitet än en tvärbunden gel som bildats i frånvaro av det penetrerande högmolekylära ämnet.

Det senare bör ej reagera med tvärbindaren. När protein används för framställning av hålrumsgel, kan man blockera reaktiva grupper i detsamma t.ex. genom alkylering innan tvärbindning sker. På så sätt förhindrar man att partier av proteinmolekylen byggs in i gelmat- risen. ' B. Galaktan, t.ex. agar eller agaros, löses i en varm - gärna nä- ra 1000-ig - vattensuspension av mikropartiklar med en diameter som helst bör understiga 10 pm, gärna mindre än 1 pm, och som kan upp- lösas i alkali eller på annat sätt som lämnar galaktanstrukturen väsentligen intakt, exempelvis små kiselgelpartiklar, membranfrag- ment, virus eller bakterier. Mikropartikel-galaktansuspensionen dis- pergeras i ett organiskt lösningsmedel med begränsad blandbarhet i vatten, t.ex. toluen eller etylendiklorid, under stark omröring, varvid för emulsionsstabiliseringen ytaktiva ämnen med fördel kan tillsättas. Vid avsvalning övergår dropparna i sfäriska gelpartik- lar innehållande inklusioner av de mindre partiklarna som selektivt kan sönderdelas under betingelser, där galaktanen är väsentligen intakt. De inkluderade mikropartiklarna upplöses nu med alkalibe- handling eller i de fall, där de utgöres av kiselgel, kan även ut- spädd fluorvätesyra användas.

I viss utsträckning kan hålrumsgel "skräddarsys" för olika permea- bilitetskrav. Det är givetvis av vikt att avpassa koncentration av protein, alkalilösliga mikropartiklar etc. så att den önskvärda permeabiliteten uppnås med bibehållande av tillfredsställande par- tikelrigiditet.

Karakteristiskt för uppfinningen är vidare att till den krympta gelens galaktanskelett bundits grupper som förlänar gelpartiklar- na karaktär av adsorbent. De adsorptionsbefrämjande grupperna kan vara kovalent bundna till polysackariden. Gruppernas eller substi- tuenternas (ligandernas) natur kan väljas så att gelen förlänas en- 449 225 ligt uppfinningen karakteristiska adsorptionsegenskaper (se sid. 1). Substituenterna kan införas i galaktanen på olika stadier av framställningen av gelprodukten. Sålunda kan agar i löslig form substitueras, varefter gelen bildas. Detta är dock inte en sär- w skilt bra metod, eftersom gelbildningen försvåras särskilt vid högre substitutionsgrad. Det är därför lämpligaæe att införa grup- perna när galaktanen bildat gel. Detta kan ske antingen före eller t efter krympningen. Före krympningen är galaktanen steriskt mer tillgänglig för substitution än efter. En tvärbunden gel kan sub- stünmmas med mer drastiska metoder t,ex. högre temperatur med mind- re eller ingen risk för upplösning av gelen. Ett adsorbent kan också framställas enligt "sandwichprincipen". Härvid adsorberas ett protein, nukleinsyra, cellmembran, virus etc. till en gel en- ligt uppfinningen, varvid nya adsorptionsegenskaper tillkommer, vilka avspeglar de adsorberade ämnenas affinitetsförhållanden.

Ett protein med två skilda adsorptionscentra - ett för en grupp i gelen -.och ett för tex. ett kolhydrat, bildar efter adsorption till gelen ett adsorbent för kolhydratet.

Med föreliggande uppfinning kan man också göra hårda gelpartiklar med mycket stora hålrum för adsorption av t.ex. cellfragment, mi- tokonder etc. Före krympningen inneslutes stora partiklar med en diameter företrädesvis uppgående till 1-10% av gelpartiklarnas dia- meter, varvid det kvarvarande gelskelettet efter krympning och ut- lösning av de inneslutna partiklarna kommer att innehålla en hög torrsubstanshalt, medan de vattenfyllda hålrummen trots detta läm- nar utrymme för adsorption av stora partiklar. Motsvarande resultat har tidigare endast gått att åstadkomma med gelpärlor med en torr- substanshalt av omkring 1-2%, men därvid har separationerna gått mycket långsamt. Genom att krympningen sker över så stora partik- lar, kan man betrakta de uppkomna hålrummen som inneslutande en se- parat fas.

Exempel 1 200 g i vatten svällda agarospärlor innehållande 6% polysackarid överfördes till en büchnertratt. En 10% albuminlösning i vatten ' fick långsamt rinna in i bädden. När hela bädden genomdränkts av albuminlösningen, sögs lösningen mellan gelkornen bort vid svagt f reducerat tryck. Den så med albumin preparerade gelen överfördes i en 2 liters rundkolv. 500 ml metanol tillsattes och kolven kopp- lades till en indunstningsapparat och hölls under reducerat tryck. 449 225 Kolven värmdes och roterades sakta tills ingen lösning mer gick över. En blandning av 40 ml 0,1 M NaOH + 10 ml NaOH tillsattes portionsvis under omröring med glasstav. 500 ml metanol tillsat- tes under kraftig omskakning och omröring så att gelkornen suspen- derades effektivt. Lösningen indunstades på nytt vid 40°C under reducerat tryck till ett torrt pulver. Ytterligare 200 ml metanol tillsattes jämte 10 ml etylbromid för att blockera grupper som skulle reagera med tvärbindaren i efterföljande operation och lös- ningen indunstades. Den krympta gelen vägde 128 g. 6 g av den torkade gelen försattes med 75 ml lösning och 90 volym-% etanol och 10 volym-% 1 M NaOH och 10 ml epiklorhydrin. Suspensio- nen uppvärmdes till 60°C och fick stå vid denna temperatur i 12 timmar under svag omröring. Gelen överfördes på büchnertratt och tvättades först med vatten och därpå med 1 M NaOH, gelen överfördes i en kolv med återloppskylare; 200 ml 1 M NaOH och 1 g natriumbor- hydrid tillsattes och innehållet värmdes till 50°C och fick stå vid denna temperatur 1 dygn. Gelen överfördes på büchnertratt och tvät- tades med vatten tills tvättvätskan inte visade någon absorption vid 280 nm. Gelen hade genom metanolbehandlingen och efterföljande operationer krympt till omkring en tredjedel av sin ursprungliga volym. 2 g av denna gel överfördes i 10 ml 0,1 M NaOH och behandlades med 2 ml divinylsulfon under 30 minuter vid 25°C. Gelen tvättades med 0,1 M natriumkarbonat och överfördes i en 100 ml rundkolv och för- sattes med 10 ml 0,1 M natriumbikarbonat, pH justerades till 11 och 1 ml tetraetylenpentamin tillsattes. Gelsuspensionen omrördes vid rumstemperatur 2 timmar, gelen överfördes på filter och tvättades med vatten. Dess förmåga att adsorbera kopparjoner, nukleotider (adenosintrifosfat och cytidinmonofosfat) testades vid pH 5 och 7 i acetat resp. fosfatbuffert. Aktiveringen och kopplingen med amin ändrade inte mycket på gelvolymen (uppskattningsvis mindre än 10%- ig volymökning) och torrsubstanshalten för den svällda gelen blev omkring 13%. Vid andra liknande försök med intensivare urvattning har geler med över 25% torrsubstans erhållits. Vanligen har vi dock stannat för 14 eller 15%.

Exempel 2 200 g hårt avsugen gel av 6%-ig tvärbunden agaros till vilken cys- tein kopplats och karboxylmetylerats, torkades vid reducerat tryck 449 225 tre gånger med 50% metanol och därpå tre gånger med ren metanol, varvid 13,8 g torr gel erhölls. Det torra cysteinagarpulvret sväll- des i 150 ml 90% etylalkohol över natt. Lösningsmedlet dekantera- des av. En blandning av 20 g KOH, 65 ml 90%-ig etanol och 0,2 ml epiklorhydrin tillsattes portionsvis under omröring. Efter 2 timmar hade pH sjunkit till ca 10. 20 g KOH löst i 15 ml vatten tillsattes jämte 10 ml epiklorhydrin och gelsuspensionen fick stå 2 dygn un- der sakta omröring. Gelen tvättades med vatten. En mindre mängd (17 ml) reducerades i 0,1 M tris-HCl, pH 8,1, med 5.ml merkaptoeta- nol under 3 timmar. Produkten tvättades med vatten tills filtratet inte gav fällning med HgCl2. En bädd (1 x 10 cm) packades och mät- tades med HgCl2. Ungefär 220 pmol kvicksilverjoner upptogs per ml gel. 20-30 pmol Hg2+ tvättades ut med 0,1 M etylmorfolinacetat, pH 7. Mer än 100 mg protein från ett växtextrakt adsorberades till den kvicksilverhaltiga gelen. Adsorptionsförsöket exemplifierar "sandwichmetoden". Cysteingelen är adsorbent för kvicksilverjoner och den med kvicksilverjoner uppladdade cysteinagarosgelen är i sin tur adsorbent för protein. Försöket visar också att protein kan effektivt tränga in i gelen. Ett försök med den ovan packade gelen där 0,5 ml dextranhydrolysat av molekylvikt 20 000 kromatografera- des i bäddar, visade att maximum för dextrandistributionen (påvisad med orcinol efter hydrolys med svavelsyra) låg förskjuten bakåt i förhållande till voidvolymen med ca 25%, alltså överstiger fördel- ningskoefficienten värdet 0,1.

Utbytet gel uppgick till 52 g hårt avsugen vattensvälld gel, var- av följer att koncentrationen agar i gelen ökat ca 4 gånger, dvs var minst 20% och högst 25%.

Exempel 3 225 ml 6% furcellaran ("dansk agar“) tvättades i metanol och över- fördes i rotationsindunstare tillsammans med 500 ml metanol. Meta- nolen avdunstades under reducerat tryck. Proceduren upprepades tre gånger. 11 g torkad gel erhölls. Gelen svälldes i 75% etanol i 1 timme och befriades från fri vätska genom avsugning. Gelen tvär- bands med epiklorhydrin såsom beskrivits i exempel 1. Efter tvätt- ning överfördes gelen i 175 ml 4 M NaOH, 1 g NaBH4 tillsattes och därpå 33 ml epiklorhydrin i portioner under långsam uppvärmning 11111 4o°c. Efter 2 timmar tvättaaes gelen. 15 g histidin löst i 2,90 ml 0,5 M Na2CO3 jusfiäïïæs till pH 11,3 och tillsattes gelen. *en 449 225 Suspensionen fick stå under omskakning vid 60°C under 1 timme.

Gelen togs upp på filter, sögs av och tvättades med vatten. Gelen innehöll 4,5% kväve och färgades starkt blå av kopparjoner. Koppar- gelen adsorbetade i sin tur peptider och proteiner i fosfat- och trisbuffert vid pH 7. Kapaciteten för serumalbumin översteg 50 mg per ml gel.

Gelutbytet var 66 g, dvs gelen höll minst 15 volym-% agar.

Claims (10)

10 449 225 Patentkrav

1. l. Gelprodukt för separationsändamål, molekyl- och partikelimmo- bilísering, k ä n n e t e c k n a d av att den framställes genom att partiklar innehållande galaktan och vatten i gelform eller som droppar suspenderade i en med vatten icke blandbar vätskefas, impregneras med i alkalisk miljö nedbrytbara makromolekyler eller mikropatiklar av mindre dimensioner än gelpartiklarna eller vätskedropparna varefter vattnet helt eller delvis ersättes med ett organiskt lösningsmedel, företrädesvis metanol eller etanol, som därpå avdunstas, företrädesvis vid starkt reducerat tryck så att gelens volym reduceras till hälften eller mindre varefter gelen tvärbinds i lösningsmedel som högst ökar den krympta gelens volym med 50 % varefter de impregnerade makromolekylerna eller partiklarna sönderdelas i alkaliskt medium, varvid absorptions~ befrämjande grupper införes i den krympta gelen före eller efter utlösning av de impregnerade molekylerna eller mikropartiklarna.

2. Gelprodukt enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att de adsorptionsbefrämjande grupperna ingår i den ursprungliga gelen.

3. 5. Gelprodukt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k'n a d av att i den okrympta gelen införes mikropartiklar innehållande kiselsyra.

4. Gelprodukt enligt krav l eller 2, k ä n n e t e c k n a d av att impregneringen sker genom diffusion av makromolekyler eller partiklar i gelen, eventuellt i galaktaninnehållande vätske- droppar som därpå överföres i gelpartiklar.

5. Gelprodukt enligt krav 1-H, k ä n n e t e c k n a d av att de i alkali nedbrytbara molekylerna utgöres av proteiner eller proteinaggregat.

6. Gelprodukt enligt krav l-5, k ä n n e t e c k n a d av att den utgöres av partiklar företrädesvis av sfärisk form innehållan- de en med adsorptionsbefrämjande grupper substituerad gelbildande galaktan, agar eller agaros eller därmed besläktade ämnen, där gelen är tvärbunden och i vattensvällt tillstånd innehåller minst 12 % torrsubstans varav minst 10 % utgöres av galaktanen.

7. Gelprodukt enligt krav l-6, k ä n n e t e c k n a d av att kr. 'm- 11 .AZÄ-å l den har så hög permeabilitet att en oladdad vattenlöslig polymer, s exempelvis hydrolyserad dextran med en molekylvikt 1 intervallet l0-20 kilodalton, fördelas mellan gelen och omgivande lösning så att koncentrationen per volymsenhet i gelen överstiger en tiondel av koncentrationen i den övriga lösningen, på grund av att gelen innehåller hålrum bildade genom utlösning av selektivt nedbryt- bara makromolekyler eller partiklar, eller innehåller regioner som kan innesluta eller penetreras av proteiner, makromolekyler, virus och subcellulära partiklar.

8. Gelprodukt enligt krav l-7, k ä n n-e t e c k n a d av att gelen är tvärbunden med glyceryldietergrupper -OCH2-CHOH-CH2-O-, eller kedjor av strukturen -CH2CH2-S02-CH2-CH2-O-.

9. Gelprodukt enligt krav l-8, k ä n n e t e c k n a d av att de adsorptionsbefrämjande grupperna är joner eller jonogena i vatten- lösning, företrädesvis av den typ som bildar kekfizmed di- och trivalenta metalljoner. “ '

10. Gelprodukt enligt något av föregående krav, k ä n n e-t e c k - nga d av att de adsorptionsbefflmüande grupperna är till gelmatri- sen kovalent bundna ligander för affinitetskromatografi, exempel- vis aminosyror, peptider, proteiner, nukleotider, oligonukleo- tider, nukleinsyror, eller biologiska partiklar såsom celler, cellfragment eller virus, och/eller hydrofoba grupper såsom alkyl och aryl för hydrofob adsorptionskromatografi.