JPH0471180B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体に関するものであ
り、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決定
操作に用いるのに適した電気泳動用媒体に関する
ものである。 ［発明の背景］ ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。 従来のポリアクリルアミドゲル膜は、アクリル
アミドのような単量体を触媒の存在下において、
Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミドのような
二官能性の架橋剤を用いて架橋重合させることに
より得られている。なお、このDNA塩基配列決
定のための電気泳動用媒体として用いるポリアク
リルアミドゲル膜の形成に際しては通常、尿素あ
るいはホルムアミドのような変性剤を含有させ
る。 上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応が阻害されるため、ポリアク
リルアミドゲル膜は酸素を遮断した状態で作成す
る必要がある。この理由から、現在では一般に、
ポリアクリルアミドゲル膜は二枚のガラス板で形
成されたセル（一定の空間、たとえば約0.3〜１
mmを有する）の中にゲル形成液を注入させ、酸素
を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形成さ
せている。 以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動操作は、たとえば、次の
ようにして実施される。 ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだ
ままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行な
つたのち、ゲル膜上端部に設けられたサンプルス
ロツトに試料（たとえば、マキサム・ギルバート
分解した³²Pラベル化DNA）を一定量注入し、次
いで電気泳動を行なう。そして一定時間（例、約
６時間〜12時間）の電気泳動を行なつた後、片面
のガラス板を注意深く除去し、その露出面をポリ
塩化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグ
ラフイー処理を行なう。 すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆し
ているフイルムの上にＸ線フイルム、増感スクリ
ーンを順次のせて、低温（たとえば、−80℃）で
一定時間（たとえば、約10〜20時間）露光を行な
う。そして露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、
DNAの分離泳動パターンを読みとることからな
るオートラジオグラフイー処理により、DNAの
塩基配列を決定することができる。 ［発明の目的］ 本発明の第一の目的は、DNAの電気泳動分析
に使用するのに適した解像力が向上した電気泳動
用媒体を提供することにある。 本発明の第二の目的は、DNAの電気泳動分析
に適した加工性が優れた電気泳動用媒体を提供す
ることにある。 本発明の第三の目的は、保存、輸送等が容易な
軽量で壊れにくい電気泳動用媒体であつて解像力
および加工性が向上したDNAの電気泳動分析に
適した電気泳動用媒体を提供することにある。 ［発明の要旨］ 本発明は、下記一般式(1)および(2)のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するアクリル
アミド系コポリマー： 一般式(1) ［上式において、 R¹¹は、水素原子または１から６個の炭素原子
を有するアルキル基であり； Q¹は−COO−、

【式】または６から 10個の炭素原子を有するアリーレン基であり； L¹は、−COO−あるいは

【式】の結合の いずれかを少なくとも一個含み、かつ３から15個
の炭素原子を有する二価の基、または、−Ｏ−、

【式】−CO−、−SO−、−SO₂−、−SO₃−、

【式】

【式】あるいは

【式】の結合のいずれかを少なくとも一 個含み、かつ１から12個の炭素原子を有する二価
の基（ただしR¹¹は前述と同義である）であり； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹（ただし、
X¹は求核基により置換され得る基、あるいは塩
基によつてHX¹の形で脱離し得る基を表わす）
のいずれかであり； A¹はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基であり； x¹、y¹およびz¹はモル百分率を表わし、x¹は50
〜99、y¹は１〜50、z¹は残余の値をとる、ただし
z¹は０であつてもよい］ 一般式(2) ［上式において、 R²¹は水素原子または１から６個の炭素原子を
有するアルキル基であり； R²²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²（ただし、
X²は求核基により置換され得る基、あるいは塩
基によつてHX²の形で脱離し得る基を表わす）
であり； L²は、１から６個の炭素原子を有するアルキ
レン基、６から12個の炭素原子を有するアリーレ
ン基、−COZ²−で表わされる基、および−
COZ²R²³−で表わされる基（ただし、R²³は１か
ら６個の炭素原子を有するアルキレン基、あるい
は６から12個の炭素原子を有するアリーレン基で
あり、そしてZ²は酸素原子あるいはNHである）
から選ばれる二価の基であり； A²はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基であり； x²、y²およびz²はモル百分率を表わし、x²は50
〜99、y²は１〜50、z²は残余の値をとる、ただし
z²は０であつてもよい］ とアクリルアミド系化合物とが水の存在下で架橋
重合してなり、変性剤として尿素またはホルムア
ミドを含むポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳
動層を有する電気泳動用媒体を提供するものであ
る。 本発明の電気泳動用媒体は高い解像力を示し、
また加工性が良い。すなわち長尺状に製造した電
気泳動用媒体の切断作業あるいはサンプルスロツ
トの付設作業などの刃物によるポリアクリルアミ
ドゲル膜の切断加工がゲル膜の破壊や切断面付近
の形状の変化を伴なうことなく容易かつ確実にで
きるため、得られる電気泳動用媒体は優れた性能
を示し、また大量生産により製造することが容易
となる。 なお電気泳動用媒体を大量生産する場合には、
これをプラスチツク材料製支持体の上に付設した
形状とするのが有利である。このような形状とす
ることにより本発明の電気泳動用媒体の大量生産
が容易となり、また支持体が軽量で、壊れにくい
ため、電気泳動用媒体の保存、輸送等が容易とな
る。従つて、ポリアクリルアミドゲル膜（電気泳
動用媒体）を集中的に製造し、必要に応じて
DNA分析のための電気泳動操作担当者に供給す
るようなゲル膜製造・使用システムの実現に極め
て有効である。 ［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体の支持体としては、ガ
ラス板、ポリマーコート紙、プラスチツク材料製
シートなどの任意の耐水性シート状支持体を用い
ることができる。ただし、本発明の電気泳動用媒
体の利点を生かすためには、支持体としてプラス
チツク材料製シートを用いることが望ましい。 電気泳動用媒体のプラスチツクシート支持体と
しては各種のプラスチツクシートを用いることが
できる。好ましいプラスチツクシートの例として
は、親水性ポリマーまたは公知の表面処理により
表面を親水化したポリマー（例、ポリエチレンテ
レフタレート、ビスフエノールＡのポリカルボネ
ート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビ
ニルコポリマー、ポリメチルメタアクリレート、
ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセ
テート類、セルロースアセテートプロピオネート
等）のシート（フイルム、板状物も含む）等を挙
げることができる。特に好ましい支持体はポリエ
チレンテレフタレートである。 次に電気泳動用媒体層（本明細書において、電
気泳動層、ゲル媒体層、ポリアクリルアミドゲル
膜あるいは単にゲル膜という）について説明す
る。 ポリアクリルアミドゲル膜は、前述のように、
一般にはアクリルアミド系化合物と架橋剤とを、
水溶液または水分散液として水中に溶解または分
散させてゲル形成液を調製したのち、液中で両者
を架橋重合させて架橋重合した水性ゲル膜として
形成することにより得ることができる。なお、本
明細書においては、特にことわらない限り、（水
中に）溶解と（水中に）分散の両者を含めて単に
（水中に）溶解といい、水溶液と水分散液の両者
を含めて単に水溶液という。また溶媒または分散
媒としては、所望により加えられる有機溶媒と水
の混合物をも包含する。 これに対して本発明においては、ポリアクリル
アミドゲル膜を、特定のポリアクリルアミド系コ
ポリマーとアクリルアミド系化合物とを水の存在
下で架橋重合して製造する。なお、この架橋重合
の実施に際して多官能架橋剤（特に三官能性架橋
剤）を関与させると、得られるポリアクリルアミ
ドゲル膜の解像力と加工性は更に向上する。 本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物の例としては、アクリルアミド、Ｎ−メチ
ルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルア
ミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホ
モログや、メタクリルアミド系化合物、例えばメ
タクリルアミドがあげられ、これらの化合物は単
独で、あるいは二種以上を併用して用いることが
できる。これらのアクリルアミド系化合物のうち
ではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリ
ルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜の製造に関
与させる特定のポリアクリルアミド系コポリマー
は下記一般式(1)および(2)のいずれかにより表わさ
れる構成繰返し単位を有するアクリルアミド系コ
ポリマーである。 一般式(1) 上式において、R¹¹は水素原子または１から６
個の炭素原子を有するアルキル基であり、その例
にはメチル基、エチル基、ブチル基、ｎ−ヘキシ
ル基などが含まれる。 Q¹は−COO−、

【式】また６から10 個の炭素原子を有するアリーレン基であり、その
例には次のような基が含まれる。 −COO−、−CONH−、

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】

【式】 L₁は、−COO−あるいは

【式】の結合の いずれかを少なくとも一個含み、かつ３から15個
の炭素原子を有する二価の基、または、 −Ｏ−、

【式】−CO−、−SO−、−SO₂−、 −SO₃−、

【式】

【式】ある いは

【式】の結合のいずれかを少なくと も一個含み、かつ１から12個の炭素原子を有する
二価の基（ただしR¹¹は前述と同義である）であ
り、その例には次のような基が含まれる。なお、
これらの二価の基の一般式（）における結合の
方向は、Q¹とSO₂との結合が可能なかぎり、いず
れの方向をもとることができる。 −CH₂COOCH₂− −CH₂COOCH₂CH₂− −CH₂CH₂COOCH₂− （―CH₂）₅――COOCH₂CH₂− （―CH₂）₁₀――COOCH₂CH₂− −CH₂NHCOCH₂− −CH₂NHCOCH₂CH₂− （―CH₂）₃――NHCOCH₂CH₂− （―CH₂）₅――NHCOCH₂CH₂− （―CH₂）₁₀――NHCOCH₂CH₂− −CH₂OCH₂− −CH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂− −COCH₂CH₂− −CH₂COCH₂CH₂− −SOCH₂CH₂− −CH₂SOCH₂CH₂− −SO₂CH₂CH₂− −SO₂CH₂CH₂SO₂CH₂CH₂− −SO₃CH₂COOCH₂CH₂− −SO₃CH₂CH₂COOCH₂CH₂− −SO₂NHCH₂COOCH₂CH₂− −SO₂NHCH₂CH₂COOCH₂CH₂− −NHCONHCH₂CH₂− −CH₂NHCONHCH₂CH₂− −NHCOOCH₂CH₂− −CH₂NHCOOCH₂CH₂− R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹（ただし、
X¹は求核基により置換され得る基、あるいは塩
基によつてHX¹の形で脱離し得る基を表わす）
のいずれかであり、このX¹の例には次のような
基が含まれる。 ハロゲン原子（塩素、臭素など）；ヒドロキシ
ル基；アルキルスルホニルオキシ（例、メチルス
ルホニルオキシ

【式】エチルスルホニ ルオキシ、プロピルスルホニルオキシなど）；ア
リールスルホニルオキシ（例、フエニルスルホニ
ルオキシ

【式】ｐ−トリルスルホ ニルオキシなど）；アルキルカルボニルオキシ
（例、アセトキシ、プロピオニルオキシ、トリフ
ルオロメチルカルボニルオキシ、ジクロロメチル
カルボニルオキシなど） 従つて、R¹²の例には、次のような基が含まれ
る。 −CH＝CH₂、−CH₂CH₂Cl、 −CH₂CH₂Br、 −CH₂CH₂OH、 −CH₂CH₂OOCCH₃、 −CH₂CH₂OOCCF₃、 −CH₂CH₂OCCCl₃。 A¹はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基であり、その例としては、下記のよう
なエチレ性不飽和モノマーから誘導された基を挙
げることができる。 エチレン、プロピレン、１−ブテン、イソブテ
ン、スチレン、クロロメチルスチレン、ヒドロキ
シメチルスチレン、ビニルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、ビニルベンジルスルホン酸ナトリウ
ム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジ
ルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ
−ベンジル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウムク
ロリド、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、
４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ベン
ジルビニルピリジニウムクロリド、Ｎ−ビニルア
セトアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、１−ビニル
−２−メチルイミダゾール、脂肪族酸のモノエチ
レン性不飽和エステル（例えば酢酸ビニル、酢酸
アリル）、エチレン性不飽和のモノカルボン酸も
しくはジカルボン酸およびその塩（例えばアクリ
ル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、
アクリル酸ナトリウム、アクリル酸カリウム、メ
タクリル酸ナトリウム）、無水マレイン酸、エチ
レン性不飽和のモノカルボン酸もしくはジカルボ
ン酸のエステル（例えばｎ−ブチルアクリレー
ト、ｎ−ヘキシルアクリレート、ヒドロキシエチ
ルアクリレート、シアノエチルアクリレート、
（ジエチルアミノ）エチルアクレート、メチルメ
タクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ベン
ジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリ
レート、クロロエチルメタクリレート、メトキシ
エチルメタクリレート、（ジエチルアミノ）エチ
ルメタクリレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−Ｎ
−メタクリロイルオキシエチルアンモニウムｐ−
トルエンスルホナート、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ−
メチル−Ｎ−メタクリロイルオキシエチルアンモ
ニウムｐ−トルエンスルホナート、イタコン酸ジ
メチル、マレイン酸モノベンジルエステル）、エ
チレン性不飽和のモノカルボン酸もしくはジカル
ボン酸のアミド（例えばＮ，Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−
［（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミド、
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−（アクリロイルプ
ロピル）アンモニウム、ｐ−トルエンスルホナー
ト、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンス
ルホン酸ナトリウム、アクリロイルモルホリン、
メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−N′−ア
クリロイルプロパンジアミンプロピオナートベタ
イン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−N′−メタクリロイル
プロパンジアミンアセテートベタイン。 また一般式(1)のコポリマーを架橋されたラテツ
クスとして用いる場合には、A¹として、上記の
エチレ不飽和モノマーから誘導された基のほか
に、少なくとも共重合可能なエチレ性不飽和基を
２個以上もつモノマー（例、ジビニルベンゼン、
メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコー
ルジアクリレート、トリメチレングリコールジア
クリレート、エチレグリコールジメタクリレー
ト、トリメチレングリコールジメタクリレート、
ネオペンチルグリコールジメタクリレート等）か
ら誘導された基を用いることができる。 x¹、y¹およびz¹はモル百分率を表わし、x¹は50
〜99、y¹は１〜50、z¹は残余の値をとる、ただし
z¹は０であつてもよい。 一般式(2) 上式において、R²¹、R²²およびA²は、それぞ
れ前記一般式(1)のR¹¹、R¹²およびA¹と同意義で
あり、それらの例も同様である。 L²は、１から６個の炭素原子を有するアルキ
レン基（例、メチレン、エチレン、イソブチレン
など）、６から12個の炭素原子を有するアリーレ
ン基（例、フエニレン、トリレン、ナフタレンな
ど）、−COZ²−で表わされる基、および−
COZ²R²³−で表わされる基（ただし、R²³は１か
ら６個の炭素原子を有するアルキレン基、あるい
は６から12個の炭素原子を有するアリーレン基で
あり、そしてZ²は酸素原子あるいはNHである）
から選ばれる二価の基である。 x²、y²およびz²はモル百分率を表わし、x²は50
〜90、y²は１〜50、z²は残余の値をとる、ただし
z²は０であつてもよい。 以下に、上記の一般式(1)もしくは(2)のいずれか
にり表わされる構成繰返し単位を有するポリマー
の合成に用いることができる代表的なビニルスル
ホニル基あるいはその前駆体となる官能基を有す
るエチレン性不飽和モノマーの合成法の一例を示
す。 合成例 １ Ｎ−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロ
パンアミドメチル］アクリルアミド合成 ２の反応容器に蒸留水1400ml、亜硫酸ナトリ
ウム244ｇおよび炭酸水素ナトリウム220ｇを加
え、撹拌して溶解させた後、氷水により冷却しな
がら約５℃で、クロロエタンスルホニルクロリド
260ｇを1.5時間で滴下した。その後49％硫酸160
ｇを約15分で滴下し、５℃で１時間ほど撹拌を続
けて、析出した結晶を濾過した後、結晶を400ml
の蒸留水で洗浄し、濾液と洗浄液とを一緒にして
３の反応容器に入れた。この中にメチレンビス
アクリルアミド246ｇを蒸留水480ml、エタノール
1480mlに溶解させたものを、氷冷しながら約５℃
で、30分間で滴下した後、全体を冷蔵庫に５日間
放置して反応を完結させた。析出した結晶を濾取
した後、冷却した蒸留水800mlで洗浄し、2kの
50％エタノール水溶液から再結晶して、219ｇの
モノマーを得た。収率は49％であつた。 本発明で用いるアクリルアミド系コポリマーと
して好ましいコポリマーは次に挙げる式で表わさ
れるものである。 ここで、ｘ、ｙ、ｚはモル百分率であり、Ｒと
R′は下記の置換基を示す。 Ｐ−１ ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｒ＝COO CH₂CH₂OCO CH₂CH₂SO₂CH＝
CH₂ Ｐ−２ ｘ＝90、ｙ＝10、ｚ＝０ Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH＝CH₂ Ｐ−３ ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH＝CH₂ R′＝CONH₂C（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−４ ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｐ−５ Ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｐ−６ ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｐ−７ ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂Cl Ｐ−８ ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂Cl R′＝CONH₂C（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−９ ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 R′＝CONHCH₂OH Ｐ−10 ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｐ−11 ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 R′＝CON（CH₃）₂ Ｐ−12 ｘ＝92、ｙ＝８、ｚ＝０ Ｒ＝COO CH₂CH₂OCO CH₂SO₂CH＝CH₂ 次に、前記のコポリマーのうちＰ−２およびＰ
−８と名付けられたコポリマーの合成例を示す。 合成例 ２ Ｎ−｛［３−（ビニルスルホニル）プロパンアミ
ド］メチル｝アクリルアミド・アクリルアミド
コポリマー（Ｐ−２）の合成 200mlの反応容器に、合成例１で得られたモノ
マー5.65ｇ、アクリルアミド12.8ｇおよび50％メ
タノール水溶液80mlを加え、撹拌しながら60℃に
加熱し、２，2′−アゾビス（２，４−ジメチルバ
レロニトリル）0.1ｇを加え、さらに30分後にも
同じものを0.1ｇ加えて、１時間加熱撹拌を続け
た。その後、氷水により約10℃に冷却して、トリ
エチルアミン2.5ｇを80mlのメタノールに溶解さ
せたものを加え、１時間撹拌を続けてから、反応
液を撹拌しながら１のアセトンに注ぎ込み、生
成した沈澱を濾取して、15.9ｇの白色ポリマー
（前記Ｐ−２に該当）を得た（収率は90％）。この
ポリマーのスルホニル基含量は0.95×10^-3当量／
ｇであつた。 合成例 ３ Ｎ−｛［３−（２−クロロエチルスルホニル）プ
ロパンアミド］メチル｝アクリルアミド・アク
リルアミド・Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オ
キソブチル）アクリルアミドコポリマー（Ｐ−
８）の合成 500mlの反応容器に、合成例１で得られたモノ
マー10.3ｇ、アクリルアミド29.2ｇ、Ｎ−（１，
１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミ
ド（ジアセトンアミド）11.3ｇおよび50％メタノ
ール水溶液160mlを加え、撹拌しながら60℃に加
熱し、２，2′−アゾビス−（２，４−ジメチルバ
レロニトリル）0.2ｇを加え、30分後更に同じも
のを0.2ｇを加えて１時間加熱撹拌を続けた。反
応液をセルロースチユーブに入れて２日間透析
し、凍結乾燥により43.2ｇの白色のポリマー（前
記Ｐ−８に該当）を得た。（収率85％）このポリ
マーのクロロエチルスルホニル基含量は0.8×
10^-3当量／ｇであつた。 本発明において好ましく用いられるアクリルア
ミド系コポリマーの分子量は約１万から約100万
の範囲にある。 架橋重合反応に用いられるアクリルアミド化合
物とアクリルアミド系コポリマーとの比率は、ア
クリルアミド系化合物に対して該コポリマーが通
常は約１〜50重量％であり、好ましくは約５〜40
重量％である。 前述のように本発明のポリアクリルアミドゲル
膜の製造に際しては架橋剤を併用してもよい。架
橋剤としては、たとえば、「Electrophoresis」
1981、２、213−228等に記載の公知の化合物を用
いることができる。架橋剤の例としは、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミド（BIS）；Ｎ，
N′−プロピレンビスアクリルアミド（PBA）；ジ
（アクリルアミドジメチル）エーテル（DAE）；
１，２−ジアクリルアミドエチレングリコール
（DFG）；エチレンウレアビスアクリルアミド
（EUB）；エチレンジアクリレート（EDA）；Ｎ，
N′−ジアリルタータルジアミド（Ｎ，N′−
diallyltartardiamide：DATD）；Ｎ，N′−ビス
アクリリルシスタミン（Ｎ，N′−
bisacrylylcystamine、BAC）などの二官能性化
合物、およびトリアリルシアヌレート、トリアリ
ルイソシアヌレート、１，３，５−トリアクリロ
イルヘキサヒドロ−ｓ−トリアジンなどの酸官能
性化合物が挙げらる。架橋剤は単独で使用しても
よく、あるいは二種以上を併用してもよい。 架橋剤は、アクリルアミド系化合物、アクリル
アミド系コポリマーそして架橋剤の総重量に対し
て約30重量％以下、好ましくは約10重量％以下の
範囲の量で用いる。 本発明の電気泳動用媒体の製造において用いら
れるポリアクリルアミドゲルのゲル濃度として
は、S.Hjerten：「Arch.Biochem.Biophys.」１
（Suppl.）、147（1962）に記載の定義に従つて表示
して、アクリルアミド系化合物、アクリルアミド
系コポリマー、および水、そして場合により架橋
剤、からなるゲル媒体の容積に対して、アクリル
アミド系化合物およびアクリルアミド系コポリマ
ー（そして場合により架橋剤）の量が約3w／ｖ
％から約30w／ｖ％の範囲が好ましく用いられ
る。 本発明のDNAの電気泳動分析に適した電気泳
動用媒体（ポリアクリルアミドゲル膜には変性剤
が添加される。添加される変性剤としては、尿素
またはホルムアミドが挙げられる。これらのうち
で尿素が特に好ましく用いられる。変性剤は水性
ゲルの容積に対し、約40wt／ｖ％から約60wt／
ｖ％の範囲の量で用いられる。尿素を用いる場合
には、水性ゲル１に対し約６モル（約360ｇ）
から飽和溶解量まで、好ましくは約７モル（約
420ｇ）から飽和溶解量までの範囲で用いること
ができる。 本発明の電気泳動用媒体層には、場合によつて
水溶性ポリマーが添加される。水溶性ポリマーと
しては、付加重合型または縮重合型の水溶性ポリ
マーを用いることができる。付加重合型ポリマー
の例としては、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、ポリアクリルアミド等の非イオン
性水溶性ポリマーが挙げられる。また縮重合型ポ
リマーの例としては、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール等の非イオン性水溶性
ポリアルキレングリコールが挙げられる。これら
の水溶性ポリマーのうちでは、ポリアクリルアミ
ドとポリエチレングリコールが好ましい。 水溶性ポリマーの分子量は約１万から約100万
の範囲のものが好ましい。水溶性ポリマーは単量
体と架橋剤の合計重量に対して、約２重量％から
約100重量％の範囲、そして好ましくは約５重量
％から約50重量％の範囲で用いられる。 水溶性ポリマーの添加によりポリアクリルアミ
ドゲル膜が可塑性を有するようになり、裁断加工
時に壊れることがなくなり、またゲル膜は乾燥時
にも可塑性を有するようになり、もろさが改良さ
れ壊れにくくなるとの利点がある、また、水溶性
ポリマーの分子量および添加量を選択することに
より、ゲル膜の粘度をコントロールすることもで
きる。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、さらに
アガロースを含有することが好ましい。アガロー
スとしては任意のものを使用することができ、低
電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロ
ースのいずれをも用いることができる。用いるこ
とができるアガロースの例としては、特開昭55−
5730号、特開昭55−110946号、特表昭57−502098
号等の各公報に開示のアガロース等がある。アガ
ロースは、単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積
に対して約0.2w／ｖ％から約2w／ｖ％、好まし
くは約0.3w／ｖ％から約1.2w／ｖ％の割合で用
いられる。 ポリアクリルアミドゲル膜がアガロースを含有
する場合には、ゲル形成液の温度を変化させるこ
とによつて適当な液粘度にコントロールすること
が可能となるため、その流動性を止めることがで
き、またゲル膜を成形する操作において成形しや
すくなるとの利点がある。 本発明の電気泳動用媒体層にはPH緩衝剤を含有
させることができる。緩衝剤としては、PH8.0か
ら10.0（好ましくはPH8.0から9.0）の範囲内のPH値
に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して用い
ることができる。 用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学
便覧 基礎編」（東京、丸善(株)1966年発行）1312
−1320ページ；青木、永井編「最新電気泳動法」
（東京、広川書店、1973年発行320−322ページ；
「Data for Biochemical Research」（R.M.C.
Dawson et al.編、第２版、Oxford at the
Clarendon Press、1969年発行）476−508頁；
「Biochemistry」５、467（1966）、「Analytical
Biochemistry」104、300−310（1980）等に記載
の緩衝剤が挙げられる。 緩衝剤の例としては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（Tris）［CAS Registry No.
77−86−１］、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン（Bicine）、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−N′−２−ヒドロキシプロパ
ン−３−スルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−プ
ロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−［ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ
プロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩および、
これらのいずれかと必要により組合せられる酸、
アルカリまたは塩等をあげることができる。特に
好ましい緩衝剤の例としてはTris、ホウ酸およ
びEDTA・2Na塩の組合せ（PH8.3）がある。 また、本発明の電気泳動用媒体層には、湿潤剤
としてグリセリン、エチレングリコール等のポリ
オール化合物を含有させることもできる。ポリオ
ール化合物の含有量は、電気泳動用媒体層の容積
に対して約5w／ｖ％から約40w／ｖ％の範囲か
ら選ばれる。これらの化合物のうちではグリセリ
ンが特に好ましい。湿潤剤を配合することにより
ポリアクリルアミドゲル膜の保存時の極端な水分
の蒸発による乾燥を防ぐことが可能となり、また
極端な乾燥に起因するもろさの発生を防ぎ、ひび
われを防ぐ等のゲル膜の物性が改善されるとの利
点がある。 本発明の電気泳動用媒体層には、必要に応じて
抗酸化剤を含有させることができる。抗酸化剤と
しては、ポリアクリルアミドゲル膜に配合しうる
ことが知られている種々の化合物を用いることが
できる。抗酸化剤の例としては、ジチオスレイト
ール、２−メルカプトエタノールなどを挙げるこ
とができる。 本発明の電気泳動用媒体における電気泳動用媒
体層（ポリアクリルアミドゲル膜）の代表的なも
のは、上記のようにアクリルアミドに代表される
単量体、二官能性のアリル（allyl）化合物また
はアクリル化合物（架橋剤）、水溶性ポリマー、
およびアガロースなどを、実質的に均一な水溶液
中でアクリルアミド系化合物およびアクリルアミ
ド系コポリマー（そして場合により架橋剤）とを
ラジカル架橋重合させて得られるものであり、ア
クリルアミド系化合物およびアクリルアミド系コ
ポリマー（そして場合により架橋剤）から形成さ
れた三次元架橋重合体に水溶性ポリマーとアガロ
ースが実質的に分散されて、後二者のポリマー鎖
と三次元架橋重合体とがからみあつている構造を
有すると推定される。 本発明で利用されるラジカル架橋重反応は分子
状酸素の不存在下で過酸化物の存在および／また
は紫外線照射等公知の方法により発生させること
ができる。さらに、この架橋重合反応は加熱また
は紫外線照射により加速することもできる。 ラジカル架橋重合用触媒としては、「Electro
phoresis」1981、２、213−219、同1981、２、
220−228；青木、永井編「最新電気泳動法」
（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重
合開始剤のうちから適宜選択して用いることがで
きる。好ましいラジカル重合開始剤の具体例とし
ては、β−ジメチルアミノプロピオニトリル
（DMAPN）・ペルオクソ二硫酸アンモニウム混
合物、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレン
ジアミン（TEMED）・ペルオクソ二硫酸アンモ
ニウム混合物、TEMED・リボフラビン混合物、
TEMED・リボフラビン・過酸化水素混合物と紫
外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合
開始剤の含有量は、アクリルアミド系化合物およ
びアクリルアミド系コポリマー（そして場合によ
り架橋剤）の合計重量に対して約0.3重量％から
約５重量％、そして好ましくは約0.5重量％から
約３重量％の範囲である。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、平滑表
面を有する支持体の上にゲル形成液を公知の方法
により塗布して塗布層を形成させたのち、その塗
布層を架橋重合させて製造する。ただし、ゲル形
成液を支持体に塗布するに際しては、電気泳動用
媒体層と支持体の接着性を向上させるために、予
め支持体表面に接着層を設け、この上にゲル形成
液を塗布し、ゲル化させる方法を利用することも
できる。接着層の付設は、プラスチツク製支持体
シートを用いた際に特に有利となる。 ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上を更にカバーフイルム、
シートまたは板などの被覆材料でおおうことがで
きる。この目的に使用されるカバーフイルム等と
しては前記支持体と同様な素材からなるものを用
いることができる。この被覆材料の厚さは300μ
ｍ以下であり、実用的に好ましい範囲としては約
４〜200μｍである。 なお、本発明の電気泳動媒体を製造するに際し
て、カバーフイルム等の上に電気泳動媒体を形成
させたのち、その上に支持体を付設する方法を利
用することも可能である。 本発明の電気泳動用媒体は、前述の諸文献等に
記載の公知の方法に従つて、水平型および垂直型
平板電気泳動法、デイスク電気泳動法等のいずれ
にも用いることができる。 電気泳動媒体層の製造に際してカバーフイルム
が付設させた電気泳動媒体は電気泳動に付された
のちカバーフイルムを除き、あるいはカバーフイ
ルムを除去することなくオートラジオグラフイー
処理行なうことにより、泳動結果の解析が行なわ
れる。 次に本発明の実施例を示す。 実施例 １ 表面を親水性にした厚さ180μｍのポリエチレ
ンテレフタレート（PET）シート（支持体）上
に約300μｍの厚さになるように第１表記載のゲ
ル形成液を塗布し、窒素雰囲気中で架橋重合させ
てポリアクリルアミドゲル膜を製造した。これに
カツターを用いてサンプル注入口を形成した。次
に、表面を親水性にしたPETシート（カバーフ
イルム、厚さ100μｍ）をこのゲル膜の表面に置
いて被覆し、電気泳動媒体材料を得た。 なお、第１表において試料番号１は比較試料に
該当し、試料番号２〜４は本発明に従う試料に該
当する。

【表】

【表】 上記の試料番号１（比較試料）のサンプル注入
口の形成に際しては、カツターにゲルが粘着した
ため、サンプル注入口付近のゲル膜部分に大きな
ゆがみを生じた。一方、試料番号２〜４（本発明
に従う試料）では、サンプル注入口の形成が問題
なく実現できた。 ³²P−DNAをマキサム・ギルバート分解して得
た分析試料について、上記の電気泳動用媒体を用
いて塩基配列決定操作のための電気泳動およびオ
ートラジオグラフイー処理を行なつた。 上記の試料番号２〜４（本発明に従う試料）で
はいずれも65個の塩基配列が解読されたが、これ
に対して、試料番号１（比較試料）で解読された
塩基配列は45個であつた。 実施例 ２ 第２表に示したゲル形成液を用い実施例１と同
様にして電気泳動媒体材料を形成した。 なお、第２表において試料番号５は比較試料に
該当し、試料番号６〜８は本発明に従う試料に該
当する。

【表】

【表】 上記の試料番号５（比較試料）のサンプル注入
口の形成に際しては、カツターにゲルが粘着した
ため、サンプル注入口付近のゲル膜部分に大きな
ゆがみが生じた。一方、試料番号６および７（本
発明に従う試料）では、サンプル注入口の形成が
問題なく実現できた。また、試料番号８（本発明
に従う試料）では、サンプル注入口の付近に若干
乱れが生じたが、実質的な問題はなかつた。 Ｍ−13・mp−11・SSDNAに対してジデオキ
シ法を施して得た分析試料について、上記の電気
泳動用媒体を用いて塩基配列決定操作のための電
気泳動およびオートラジオグラフイー処理を行な
つた。 上記の試料番号６〜８（本発明に従う試料）で
はいずれも82個の塩基配列が解読されたが、これ
に対して、試料番号１（比較試料）で解読された
塩基配列は53個であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記一般式(1)および(2)のいずれかにより表わ
   される構成繰返し単位を有するアクリルアミド系
   コポリマー： 一般式(1) ［上式において、 R¹¹は、水素原子または１から６個の炭素原子
   を有するアルキル基であり； Q¹は−COO−、【式】また６から10 個の炭素原子を有するアリーレン基であり； L¹は、−COO−あるいは【式】の結合の いずれかを少なくとも一個含み、かつ３から15個
   の炭素原子を有する二価の基、または、−Ｏ−、
   【式】−CO−、−SO−、−SO₂−、−SO₃−、 【式】【式】あるいは 【式】の結合のいずれかを少なくとも一 個含み、かつ１から12個の炭素原子を有する二価
   の基（ただしR¹¹は前述と同義である）であり； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹（ただし、
   X¹は求核基により置換され得る基、あるいは塩
   基によつてHX¹の形で脱離し得る基を表わす）
   のいずれかであり； A¹はその左側に示した各モノマー単位と共重
   合可能なエチレン性不飽和モノマーら誘導された
   二価の基であり； x¹、y¹およびz¹はモル百分率を表わし、x¹は50
   〜99、y¹は１〜50、z¹は残余の値をとる、ただし
   z¹は０であつてもよい］ 一般式(2) ［上式において、 R²¹は、水素原子または１から６個の炭素原子
   を有するアルキル基であり； R²²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²（ただし、
   X²は求核基により置換され得る基、あるいは塩
   基によつてHX²の形で脱離し得る基を表わす）
   であり； L²は、１から６個の炭素原子を有するアルキ
   レン基、６から12個の炭素原子を有するアリーレ
   ン基、−COZ²−で表わされる基、および−
   COZ²R²³−で表わされる基（ただし、R²³は１か
   ら６個の炭素原子を有するアルキレン基、あるい
   は６から12個の炭素原子を有するアリーレン基で
   あり、そしてZ²は酸素原子あるいはNHである）
   から選ばれる二価の基であり； A²はその左側に示した各モノマー単位と共重
   合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
   た二価の基であり； x²、y²およびz²はモル百分率を表わし、x²は50
   〜99、y²は１〜50、z²は残余の値をとる、ただし
   z²は０であつてもよい］ とアクリルアミド系化合物とが水の存在下で架橋
   重合してなり、変性剤として尿素またはホルムア
   ミドを含むポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳
   動層を有する電気泳動用媒体。 ２ 上記ポリアクリルアミド系水性ゲルが、上記
   アクリルアミド系コポリマーとアクリアミド系化
   合物として更に架橋剤が水の存在下で架橋重合し
   てなるものであることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の電気泳動用媒体。 ３ 上記架橋剤が三官能性架橋剤であることを特
   徴とする特許請求の範囲第２項記載の電気泳動用
   媒体。 ４ さらに水溶性ポリマーおよびアガロースを含
   むことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の
   電気泳動用媒体。 ５ プラスチツク材料製支持体に付設された形態
   にあることを特徴とする特許請求の範囲第１項乃
   至第４項のいずれかの項記載の電気泳動用媒体。