JPH0354791B2 - - Google Patents

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JPH0354791B2
JPH0354791B2 JP60139681A JP13968185A JPH0354791B2 JP H0354791 B2 JPH0354791 B2 JP H0354791B2 JP 60139681 A JP60139681 A JP 60139681A JP 13968185 A JP13968185 A JP 13968185A JP H0354791 B2 JPH0354791 B2 JP H0354791B2
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Description

【発明の詳现な説明】 発明の分野 本発明は、電気泳動甚媒䜓材料に関するもので
あり、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決
定操䜜に甚いるのに適した電気泳動甚媒䜓材料に
関するものである。 発明の背景 ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においおは、ポリアクリルアミドゲル膜
を甚いたスラブ電気泳動操䜜が必須の操䜜ずな぀
おいる。特に近幎においお遺䌝子関連の研究が進
むに぀れお、DNA塩基配列決定の操䜜の迅速化
が急務ずな぀おいる。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
のような単量䜓を觊媒の存圚䞋におN′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官胜性の架
橋剀を甚い架橋重合させるこずにより埗られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の圢成に際
しお通垞は、尿玠あるいはホルムアミドのような
倉性剀を含有させる。 䞊蚘の重合反応はラゞカル架橋重合であり、酞
玠の圱響により反応が阻害されるため、ポリアク
リルアミドゲル膜は酞玠を遮断した状態で䜜成す
る必芁がある。この理由から、珟圚では䞀般に、
ポリアクリルアミドゲル膜は枚のガラス板で圢
成されたセル䞀定の空間、たずえば玄0.3〜
mmを有するの䞭にゲル圢成液を泚入させ、酞玠
を遮断した状態で架橋重合させおゲル膜を圢成さ
せおいる。 この方法は二枚のガラス板の間でゲル膜を圢成
するために、取り扱い性が悪く、か぀ゲル膜の量
産化が困難であるずい぀た倧きな欠点を有しおい
る。 以䞊のようにしお圢成したポリアクリルアミド
ゲル膜を甚いる電気泳動操䜜は、たずえば、次の
ようにしお実斜される。 ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだ
たたの状態で垂盎に立おられ、前電気泳動を行な
぀たのち、ゲル膜䞊端郚に蚭けられたサンプルス
ロツトに詊料たずえば、マキサム・ギルバヌト
分解した32Pラベル化DNAを䞀定量泚入し、次
いで電気泳動を行なう。そしお䞀定時間䟋、玄
時間〜12時間の電気泳動を行な぀た埌、片面
のガラス板を泚意深く陀去し、その露出面をポリ
塩化ビニリデンフむルムなどの合成暹脂補フむル
ムでゲル膜を芆い、これを甚いおオヌトラゞオグ
ラフむヌ凊理を行なう。 すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被芆し
おいるフむルムの䞊に線フむルム、増感スクリ
ヌンを順次のせお、䜎枩たずえば、−80℃で
䞀定時間たずえば、玄10〜20時間露光を行な
う。そしお露光終了埌、線フむルムを珟像し、
DNAの分離泳動パタヌンを読みずるこずからな
るオヌトラゞオグラフむヌ凊理により、DNAの
塩基配列を決定するこずができる。 オヌトラゞオグラフむヌ凊理は以䞊のように長
時間を必芁ずするため、その迅速化が望たれ、曎
に読みずりの高分解胜化も望たれおいる。 埓来のアクリルアミドゲル膜を甚いた電気泳動
媒䜓材料は䞊蚘のようにガラス板を甚いるために
取り扱い性に問題があり、しばしばガラスを割぀
たりしお実隓を倱販するこずがある。曎に、オヌ
トラゞオグラフむヌに際し、䞊蚘のように片面の
ガラスを陀く必芁があり、この時にゲル膜を砎損
したりする事もあり、この操䜜は非垞に熟緎を必
芁ずする。したが぀お、この様な欠点を改良した
取り扱い性の良奜なポリアクリルアミドゲル膜の
開発が熱望されおいる。 発明の芁旚 本発明の目的は、ガラス板の代りにプラスチツ
クフむルムあるいはシヌトを支持䜓ずしお甚
い、か぀支持䜓ず電気泳動甚媒䜓局ポリアクリ
ルアミドゲル膜ずの間の接着性が向䞊した電気
泳動媒䜓材料を提䟛するこずにある。 本発明の他の目的は、高分解胜な分離性胜を瀺
す電気泳動媒䜓材料を提䟛するこずにある。 本発明の第䞀の態様は、䞋蚘の各局が順次積局
されおなる電気泳動甚媒䜓材料  プラスチツク支持䜓局  スルフむン酞基含有ポリマヌを含有する
接着局  アクリルアミド系化合物ず架橋剀が氎の
存圚䞋で架橋重合しおなるポリアクリルアミド
系氎性ゲル、および倉性剀ずしお少なくずも
個のカルバモむル基をも぀化合物を含む電気泳
動甚媒䜓局および  プラスチツクカバヌフむルム局 からなる。 ただし、本発明においおは、䞊蚘のスルフむン
酞基含有ポリマヌを含有する接着局は、支持䜓局
ず電気泳動甚媒䜓局ずの間の代りに電気泳動甚媒
䜓局ずカバヌフむルム局ずの間にあ぀おもよく
本発明の第二の態様、あるいは支持䜓局ず電気
泳動甚媒䜓局ずの間および電気泳動甚媒䜓局ずカ
バヌフむルム局ずの間の双方に蚭けられおいおも
よい本発明の第䞉の態様。 本発明が提䟛する電気泳動甚媒䜓材料は前述の
電気泳動埌の電気泳動甚媒䜓局の也燥工皋におけ
る各皮の操䜜によ぀おもその耇合局構造が分離し
にくいため、電気泳動甚媒䜓局の砎損が発生する
こずは殆どないずの利点がある。 さらに、本発明の電気泳動甚媒䜓材料は、氎平
に眮いたプラスチツク支持䜓たたはプラスチツク
カバヌフむルムの䞊に接着局を圢成し、次いで電
気泳動甚媒䜓局をその䞊に圢成し、さらに電気泳
動甚媒䜓局の䞊に、所望により同様の接着局を蚭
けたのち、カバヌフむルムたたは支持䜓を付蚭す
る方法によ぀お補造するこずが可胜であるため、
電気泳動甚媒䜓材料の量産化にも倧きく寄䞎する
ものである。 発明の詳现な蚘述 たず、本発明の第䞀の態様および第䞉の態様に
぀いお説明する。 本発明の電気泳動甚媒䜓材料の支持䜓は、プラ
スチツク補シヌトあるいはフむルムである。
このプラスチツク補シヌトずしおは任意のプラス
チツクから圢成したものを甚いるこずができる。
奜たしいプラスチツクシヌトの䟋ずしおは、芪氎
性ポリマヌたたは公知の衚面凊理により衚面を芪
氎化したポリマヌ䟋、ポリ゚チレンテレフタレ
ヌト、ビスプノヌルのポリカルボネヌト、ポ
リ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポ
リマヌ、ポリメチルメタアクリレヌト、ポリ゚チ
レン、ポリプロピレン、セルロヌスアセテヌト
類、セルロヌスアセテヌトプロピオネヌト等の
フむルム、板たたはシヌト等の成圢物をあげるこ
ずができる。特にポリ゚チレンテレフタレヌトか
ら圢成されたシヌトを甚いるこずが奜たしい。 これらのポリマヌ成圢物の衚面を芪氎化するた
めの凊理のためには、玫倖線照射、グロヌ攟電凊
理、コロナ攟電凊理、火焔凊理、電子線照射、ケ
ミカル゚ツチング、電解゚ツチング等の公知の方
法を適甚するこずができる。 支持䜓は䞀般に厚さが、玄50ÎŒm〜玄500ÎŒm、
奜たしくは玄70ÎŒm〜玄300ÎŒmのものが甚いられ
る。 本発明においおプラスチツク補支持䜓局の䞊に
はスルフむン酞基含有ポリマヌを含有する接着局
が蚭けられる。 本発明においお甚いられるスルフむン酞基含有
ポリマヌは特に制限はないが、具䜓䟋ずしおは、
䞋蚘䞀般匏によ぀お衚されるくり返し単䜍
を有するポリマヌを挙げるこずができる。 ただし䞊蚘䞀般匏においお、 は氎玠原子、炭玠数〜のアルキル基
䟋、メチル基、゚チル基、たたはハロゲン原子
䟋、塩玠、臭玠であり、は氎玠原子、アル
カリ金属原子䟋、ナトリりム、カリりム、ア
ルカリ土金属原子䟋、カルシりム、マグネシり
ムたたは有機塩基䟋トリ゚チルアミンであ
り、は0.1たたはであり、そしお、はた
たはである さらに、本発明に甚いられるポリマヌの䟋ずし
おは、䞋蚘䞀般匏によ぀お衚されるモノマ
ヌを重合しお埗られるホモポリマヌすなわち䞀
般匏によ぀お衚されるくり返し単䜍だけか
らなるポリマヌ、䞀般匏で衚されるモノ
マヌず他の付加重合性䞍飜和結合を少なくずも
぀有するモノマヌずを重合しお埗られるコポリマ
ヌ及び重合埌に偎鎖にスルフむン酞基を導入しお
埗られるポリマヌおよびそれらポリマヌの誘導䜓
等も挙げるこずができる。 ただし䞊蚘䞀般匏においお、 は氎玠原子、炭玠数〜のアルキル基
䟋、メチル基、゚チル基、たたはハロゲン原子
䟋、塩玠、臭玠であり、は氎玠原子、アル
カリ金属原子䟋、ナトリりム、カリりム、ア
ルカリ土金属原子䟋、カルシりム、マグネシり
ムたたは有機塩基䟋トリ゚チルアミンであ
り、は0.1たたはであり、そしお、はた
たはである 䞀般匏によ぀お衚されるモノマヌの具䜓
䟋ずしおは、 等を挙げるこずができる。これらのうちで特に
奜たしいモノマヌは(A)の化合物である。モノマヌ
(A)はケミストリヌ・レタヌズChemistry
Letters pp 419−4201976蚘茉の合成法に埓い
合成するこずができるが、必ずしもこの合成法に
限定されるものではない。他のモノマヌの合成も
基本的には察応するスルホン酞塩化物を合成しさ
えすれば、そのあず䞊蚘ケミストリヌ・レタヌズ
Chemistry Lettersず同様の方法もしくは亜
硫酞ナトリりム等の還元剀で還元し、必芁に応じ
おビニル化すればよい。 たたポリスチレン等のポリマヌを出発原料ずし
おポリマヌ反応を甚いお「䞊蚘方法」で䞀般匏
のくり返し単䜍を有するポリマヌを埗おも
よい。 䞀般匏で衚されるモノマヌず共重合させ
るこずのできるモノマヌずしおは、付加重合性䞍
飜和結合を少なくずも個有するモノマヌならば
䞀般に䜿甚するこずができる。䞊蚘付加重合性䞍
飜和化合物ずしおは、 アリル化合物、 アリル゚ステル類䟋えば、酢酞アリル、カプ
ロン酞アリルなど、 ビニル゚ヌテル類䟋えば、メチルビニル゚ヌ
テル、ブチルビニル゚ヌテル、ヘキシルビニル゚
ヌテル、デシルビニル゚ヌテル、゚チルヘキシル
ビニル゚ヌテル、メトキシ゚チルビニル゚ヌテ
ル、クロル゚チルビニル゚ヌテル、−メチル−
−ゞメチルプロピルビニル゚ヌテル、−
゚チルブチル゚ヌテル、ヒドロキシ゚チルビニル
゚ヌテル、ゞメチルアミノ゚チルビニル゚ヌテ
ル、ブチルアミノ゚チルビニル゚ヌテル、ビニル
トリル゚ヌテル、ビニルクロルプニル゚ヌテ
ル、ビニル−ゞクロルプニル゚ヌテル、
ビニルナフチル゚ヌテルなど、 ビニル゚ステル類䟋えば、ビニルアセテヌ
ト、ビニルプロピオネヌト、ビニルブチレヌト、
ビニルむ゜ブチレヌト、ビニルゞメチルプロピオ
ネヌト、ビニル゚チルブレヌト、ビニルクロル゚
セテヌト、ビニルゞクロルアセテヌト、ビニルメ
トキシアセテヌト、ビニルプニルアセテヌト、
ビニルアセトアセテヌト、ビニル−β−プニル
フチレヌト、ビニルシクロヘキシルカルボキシレ
ヌト、安息銙酞ビニル、サリチル酞ビニル、クロ
ル安息銙酞など、 ビニル異節環化合物䟋えば、−ビニルオキ
サゟリドン、−ビニルむミダゟヌル、−ビニ
ルピロリドン、−ビニルカルバゟヌル、ビニル
チオプン、−ビニルカルバゟヌル、ビニルチ
オプン、−ビニル゚チルアセトアミドなど。 スチレン類䟋えば、スチレン、メチルスチレ
ン、ゞメチルスチレン、゚チルスチレン、む゜プ
ロピルスチレン、ブチルスチレン、ヘキシルスチ
レ、ゞクロヘキシルスチレ、ベンゞルスチレン、
クロロメチルスチレン、トリフルオロメチルスチ
レン、アセトキシメチルスチレン、メトキシスチ
レン、−メトキシ−メチルスチレン、ゞメト
キシスチレン、クロロスチレン、ゞクアオアオス
チレン、トリク゜゜スチレン、ブロモスチレン、
ペヌドスチレン、フルオロスチレン、−ブロモ
−−トリフルオロメチルスチレン、ビニル安息
銙酞メチル゚ステルなど、 クロトン酞類䟋えば、クロトン酞、クロトン
酞アミド、クロトン酞゚ステル、クロトン酞ブチ
ルなど、 オレフむン類䟋えば、ゞシクロペンタゞ゚
ン、゚チレン、プロピレン、−ブテン、−ペ
ンテン、−ヘキセン、−メチル−−ペンテ
ン、−ヘプテン、−オクテン、−ゞメ
チル−−オクテン、−メチル−−ヘキセ
ン、−メチル−−ヘキセン、−メチル−
−ヘプテン−−メチル−−ヘプテンなど、 むタコン酞類䟋えば、むタコン酞、むタコン
酞メチルなど、 ゜ルビン酞、桂皮酞、゜ルビン酞メチル、シト
ラコン酞、クロロアクリル酞、メサコン酞、マレ
むン酞、フマヌル酞、゚タクリル酞、 ハロゲン化オレフむン類䟋えば、塩化ビニ
ル、塩化ビニリデンなど、 アクリル酞類䟋えば、アクリル酞、アクリル
酞メチルなど、 メタクリル酞類䟋えば、メタクリル酞、メタ
クリル酞メチルなど、そしお、 アクリルアミド類等を挙げるこずができる。 これらの付加重合性䞍飜和化合物のうちでは、
特にスチレン類、ビニル異節環化合物類、ビニル
゚ヌテル類、ビニル゚ステル類およびオレフむン
類が奜たしい。 本発明で䜿甚できるポリマヌは䞀般匏で
衚わされるくり返し単䜍をすくなくずも0.01モル
含む必芁があり、奜たしくは0.1モル以䞊、
曎に奜たしくはモル以䞊含む必芁がある。 本発明に䜿甚するこずができるポリマヌの化合
物の具䜓䟋を以䞋の−から−14に瀺す。な
お組成比は党おモル比で瀺しおある。 本発明においおスルフむン酞基含有ポリマヌず
共に被膜圢成胜を有するポリマヌを䜵甚しおも良
い。䜵甚できるポリマヌずしおは、特に制限はな
く、氎溶性のポリマヌあるいは氎䞍溶性のポリマ
ヌを甚いるこずができる。奜たしく甚いられるポ
リマヌの䟋ずしおは、セルロヌスおよびニトロセ
ルロヌス、二酢酞セルロヌス、䞉酢酞セルロヌス
などのセルロヌス誘導䜓、デキストラン、アガロ
ヌス、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコヌ
ル゚ステル䟋、ポリ酢酞ビニル、ポリアクリ
ル酞゚ステル䟋、ポリヒドロキシ゚チルアク
リレヌト、プルラン、およびプルラン誘導䜓等
を挙げるこずができる。 䞊蚘接着局の厚さは玄0.1〜30ÎŒm、奜たしくは
箄0.2〜15ÎŒmの範囲である。 䞊の接着局の䞋偎支持䜓偎には曎にポリマ
ヌ局を蚭けるこずができる。ポリマヌ局ずしおは
䞊蚘接着局のバむンダヌポリマヌからなる薄膜局
厚さ0.1〜3ÎŒmが奜たしい。 次に電気泳動甚媒䜓局以䞋においお、ゲル媒
䜓局、ポリアクリルアミドゲル膜あるいは単にゲ
ル膜ずもいうに぀いお説明する。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
系化合物ず架橋剀ずを、氎溶液たたは氎分散液ず
しお氎䞭に溶解たたは分散させおゲル圢成液を調
補したのち、液䞭で䞡者を架橋重合させお架橋重
合した氎性ゲル膜ずしお圢成するこずにより埗る
こずができる。本明现曞においおは、特にこずわ
らない限り、氎䞭に溶解ず氎䞭に分散の
䞡者を含めお単に氎䞭に溶解ずいい、氎溶液
ず氎分散液の䞡者を含めお単に氎溶液ずいう。た
た、溶媒たたは分散媒ずしお、所望により加えら
れる有機溶媒ず氎の混合物をも包含する。 ポリアクリルアミドゲル膜の圢成に甚いるこず
ができるアクリルアミド系化合物ずしおは、アク
リルアミド、−メチルアクリルアミド、
−ゞメチルアクリルアミド、−ヒドロキシメ
チルアクリルアミド、ゞアセトンアクリルアミ
ド等のアクリルアミド系化合物やメタクリルアミ
ドの様なメタクリルアミド系化合物が挙げられ、
これらの化合物は単独で、あるいは二皮以䞊を䜵
甚しお甚いるこずができる。これらのアクリルア
ミド系化合物のうちではアクリルアミドが最も奜
たしく、たたアクリルアミドず他のアクリルアミ
ド系化合物あるいはメタクリルアミド系化合物の
䞀皮以䞊の䜵甚も奜たしい。 架橋剀ずしおは、「゚レクトロフオレシス
Electrophoresis」1981213−228等に蚘
茉の公知の化合物䞀皮たたは二皮以䞊の組合
せを甚いるこずができる。架橋剀の䟋ずしお
は、二官胜性化合物および䞉官胜性化合物を挙げ
るこずができる。二官胜性化合物の䟋ずしおは、
N′−メチレンビスアクリルアミドBIS
N′−プロピレンビスアクリルアミド
PBAゞアクリルアミドゞメチル゚ヌテ
ルDAE−ゞアクリルアミド゚チレン
グリコヌルDEG゚チレンりレアビスアクリ
ルアミドEUB゚チレンゞアクリレヌト
EDAN′−ゞアリルタヌタルゞアミド
N′−diallyltartardiamideDATDおよ
びN′−ビスアクリリルシスタミン
N′−bisacrylylcystamineBAC等を挙げるこ
ずができる。䞉官胜性架橋剀の䟋ずしおは、
−トリアクリロむルヘキサヒドロ−−
トリアゞン、トリアリルシアヌレヌト、トリアリ
ルむ゜シアヌレヌト等を挙げるこずができる。な
かでも、䞉官胜性等架橋剀を甚いた堎合には特に
電気泳動甚媒䜓局ず接着局ずの間の高い接着が実
珟される。 架橋剀の量は、単量䜓ず架橋剀の総重量に察し
お玄0.1wtから玄30wt、奜たしくは玄0.5wt
から玄10wtの範囲で甚いるこずができる。 ゲル濃床ずしおは、゚ス・ヘゞダヌテンS.
Hjerten「アヌク・バむオケム・バむオフむズ
Arch.Biochem.Biophys.補遺1471962
に蚘茉の定矩に埓぀お衚瀺しお、単量䜓、架橋剀
および氎からなるゲル膜の容積に察しお、単量䜓
ず架橋剀の量が玄3wから玄30wの
範囲で奜たしく甚いられる。 ポリアクリルアミドゲル膜に含有させる倉性剀
ずしおは、少なくずも個のカルバモむル基を持
぀化合物を挙げるこずができ、その具䜓䟋ずしお
は、尿玠、ホルムアミド等が挙げられる。これら
のうちで尿玠が特に奜たしく甚いられる。倉性剀
の量は単量䜓ず架橋剀ずを含む氎性ゲルの容積に
察し、玄40wtから玄60wtの範囲で
甚いられる。尿玠を甚いる堎合には、単量䜓ず架
橋剀ずを含む氎性ゲル1lに察し玄モル玄360
から飜和溶解量たで、奜たしくは玄モル
玄420から飜和溶解量たでの範囲で甚いるこ
ずができる。 ポリアクリルアミドゲル膜には氎溶性ポリマヌ
を含有させるこずができる。 氎溶性ポリマヌずしおは、付加重合型たたは瞮
重合型の氎溶性ポリマヌを甚いるこずができる。
付加重合型ポリマヌの具䜓䟋ずしおは、ポリビニ
ルアルコヌル、ポリビニルピロリドン、ポリアク
リルアミド等の非むオン性氎溶性ポリマヌが挙げ
られる。瞮重合型ポリマヌの具䜓䟋ずしおポリ゚
チレングリコヌル、ポリプロピレングリコヌル等
の非むオン性氎溶性ポリアルキレングリコヌルが
挙げられる。氎溶性ポリマヌの分子量は、玄䞇
から玄100䞇の範囲のものが奜たしい。これらの
氎溶性ポリマヌのうちでは、ポリ゚チレングリコ
ヌル、ポリアクリルアミドが特に奜たしい。 氎溶性ポリマヌは、単量䜓ず架橋剀の合蚈重量
に察しお玄1wtから玄100wtの範囲、奜たし
くは玄2wtから50wtの範囲で甚いられる。氎
溶性ポリマヌを添加するこずにより、ポリアクリ
ルアミドゲル膜は可塑性を有するようになるた
め、裁断加工時に壊れるこずがなくなり、たたゲ
ル膜は也燥時にも可塑性を有するようになり、も
ろさが改良され壊れにくくなるずの利点がある。
たた、氎溶性ポリマヌの分子量および添加量を遞
択するこずにより、ゲル膜の粘床をコントロヌル
するこずもできる。 ポリアクリルアミドゲル膜にはアガロヌスを含
有させるこずができる。アガロヌスは公知のアガ
ロヌスであれば特に制限はなく、䜎電気浞透性、
䞭電気浞透性、高電気浞透性アガロヌスのいずれ
をも甚いるこずができる。甚いるこずのできるア
ガロヌスの䟋ずしおは特開昭55−5730号、特開昭
55−110946号および特開昭57−502098号等の公報
に開瀺されおいるアガロヌス等がある。 アガロヌスの添加量は、単量䜓ず架橋剀ずを含
むゲル組成液の容積に察しお玄0.1wから
箄2w、奜たしくは玄0.3wから玄
1.2wの割合で甚いられる。ゲル膜にアガ
ロヌスを添加するこずにより、ゲル圢成甚溶液枩
床を倉化させるこずにより、適圓な溶液粘床にコ
ントロヌルするこずが可胜ずなり、その流動性を
止めるこずができ、たたゲル膜を成圢する時には
成圢しやすくなるずの利点がある。 ポリアクリルアミドゲル膜にはPH緩衝剀を含有
させるこずができる。緩衝剀ずしおはPH8.0から
10.0、奜たしくはPH8.0から9.0の範囲内のPH倀に
緩衝できる緩衝剀であれば、いずれを甚いるこず
ができる。甚いうる緩衝剀ずしおは、日本化孊䌚
線〓化孊䟿芧 基瀎線〓東京、䞞善(æ ª)1966幎発
行1312−1320頁〓デヌタ・フオア・バむオケ
ミカル・リサヌチData for Biochemical
Research〓アヌル・゚ム・シヌ・ドヌ゜ン倖
R.M.C.Dawson etal線 第版 Oxford at
the Clarendon Press1969幎発行476−508ペ
ヌゞ〓バむオケミストリヌBiochemistry〓、
4671966〓アナリテむカル・バむオケミ
ストリヌAnalytical Biochemistry〓104
300−3101980等の刊行物に蚘茉の緩衝剀があ
げられる。そしお、その具䜓䟋ずしおはトリス
ヒドロキシメチルアミノメタンTris
GAS Registry No.77−86−、−ビス
−ヒドロキシ゚チルグリシンBicine、
−−ヒドロキシ゚チルピペラゞン−N′−−
ヒドロキシプロパン−−スルホン酞のNa塩た
たは塩等、−−ヒドロキシ゚チルピペラゞ
ン−N′−−プロパンスルホン酞のNa塩たたは
塩等、−トリスヒドロキシメチルメチ
ル−−アミノプロパンスルホン酞のNa塩たた
は塩および、これらのいずれかず必芁により組
合せられる酞、アルカリたたは塩等をあげるこず
ができる。特に奜たしい緩衝剀の䟋ずしおは
Tris、ホり酞およびEDTA・2Na塩の組合せ
PH8.3がある。 ポリアクリルアミドゲル膜には、必芁に応じお
抗酞化剀などの他の添加剀を含有させるこずがで
きる。抗酞化剀ずしおは、ゲル膜に配合しうるこ
ずが知られおいる皮々の化合物を甚いるこずがで
きる。抗酞化剀の具䜓䟋ずしおはゞチオスレむト
ヌル、−メルカプト゚タノヌルが挙げられる。
本発明においおポリアクリルアミドゲル膜はアク
リルアミドに代衚される単量䜓、二官胜性のアリ
ルallyl化合物たたはアクリル化合物架橋
剀、氎溶性ポリマヌ、およびアガロヌスを実質
的に均䞀に溶解させた氎溶液䞭で単量䜓ず架橋剀
ずをラゞカル架橋重合させお埗られるものであ
り、単量䜓ず架橋剀から圢成された䞉次元架橋重
合䜓に氎溶性ポリマヌずアガロヌスが実質的に分
散されお、埌二者のポリマヌ鎖が䞉次元架橋重合
䜓ずからみあ぀おいる構造を有するず掚定され、
この構造が特城をなすゲル媒䜓である。 䞊蚘のラゞカル架橋重合反応は、分子状酞玠の
䞍存圚䞋で過酞化物の存圚およびたたは玫倖線
照射等の公知の方法により発生させるこずができ
る。この反応を加熱および玫倖線照射により加速
するこずもできる。 ラゞカル架橋重合甚觊媒ずしおは、「゚レクト
ロフオレシスElectrophoresis」1981
213−219同1981220−228青朚、氞井線
「最新電気泳動法」1973幎発行等に蚘茉の公知
の䜎枩ラゞカル重合開始剀のうちから適宜遞択し
お甚いるこずができる。奜たしいラゞカル重合開
始剀の具䜓䟋ずしおは、β−ゞメチルアミノプロ
ピオニトリルDMAPN−ペルオク゜二硫酞ア
ンモニりム混合物、N′N′−テトラメ
チル゚チレンゞアミンTEMED−ペルオク゜
二硫酞アンモニりム産合物、TEMED−リボフラ
ビン混合物、TEMED−リボフラビン−過酞化氎
玠混合物ず玫倖線照射の組合せ等が挙げられる。
ラゞカル重合開始剀の含有量は、単量䜓ず架橋剀
の合蚈重量に察しお玄0.01重量から玄重量
、そしお奜たしくは玄0.1重量から玄重量
の範囲である。 ポリアクリルアミドゲル膜には、必芁に応じお
抗酞化剀などの他の添加剀を含有させるこずがで
きる。抗酞化剀ずしおは、ゲル膜に配合しうるこ
ずが知られおいる皮々の化合物を甚いるこずがで
きる。抗酞化剀の具䜓䟋ずしおはゞチオスレむト
ヌル、−メルカプト゚タノヌルが挙げられる。 その他の添加剀ずしおは湿最剀があり、ポリア
クリルアミドゲル膜にはグリセリン、゚チレング
リコヌル等のポリオヌル化合物を含有させるこず
もできる。ポリオヌル化合物の含有量は、ゲル膜
の容積に察しお玄5wから玄40wの
範囲から遞ばれる。ポリオヌル化合物のうちでは
グリセリンが特に奜たしい。湿最剀を配合するこ
ずによりゲル膜の保存時の極端な氎分の蒞発によ
り也燥を防ぐこずが可胜ずなり、たた極端な也燥
に起因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲ
ル膜の物性を改善されるずの利点がある。 ゲル媒䜓局は、平滑衚面を有する支持䜓に蚭け
られた前述の接着局の䞊にゲル圢成液を公知の方
法により塗垃したのち、ゲル圢成液を架橋重合さ
せるこずにより、局状に成圢するこずができる。 支持䜓衚面に塗垃されたゲル圢成液は、そのた
た、あるいはゲル圢成液塗垃局をプラスチツクカ
バヌフむルムシヌト、板状物も含むで芆぀た
のち架橋重合させる。この目的に䜿甚されるプラ
スチツクカバヌフむルムずしおは前蚘のプラスチ
ツク支持䜓ず同様のものを甚いるこずができる。
このプラスチツクカバヌフむルムの厚さは300ÎŒm
以䞋であり、実甚的に奜たしい範囲ずしおは玄10
〜200ÎŒmである。 以䞊のようにしお、プラスチツク支持䜓局、ス
ルフむン酞基含有ポリマヌを含有する接着局、電
気泳動媒䜓局、およびプラスチツクカバヌフむル
ム局の四局を含む電気泳動媒䜓材料を補造するこ
ずができる。 なお、䞊蚘のプラスチツクカバヌフむルムず電
気泳動媒䜓局ずの間には、䞊蚘ず同様なスルフむ
ン酞基含有ポリマヌを含有する接着局を蚭けるこ
ずができる。その接着局は、たずえば、プラスチ
ツクカバヌフむルムの片面電気泳動媒䜓局に接
觊させる偎の面に予め接着局を、前蚘の支持䜓
ぞの接着局の付蚭ず同様な方法で付蚭しおおき、
これを電気泳動媒䜓局の衚面に重ねる方法などに
より圢成するこずができる。 たた、本発明の第二の態様は、プラスチツク支
持䜓局、電気泳動媒䜓局、スルフむン酞基含有ポ
リマヌを含有する接着局、およびプラスチツクカ
バヌフむルム局の四局を含む電気泳動媒䜓材料か
らなるものである。この四局構造は、たずえば、
前蚘の第䞀の態様の電気泳動媒䜓材料の補造法に
おいお、支持䜓局をカバヌフむルム局に、そしお
カバヌフむルム局を支持䜓局に眮き換えた方法、
すなわち、たずカバヌフむルム局にスルフむン酞
基含有ポリマヌを含有する接着局を圢成したの
ち、その䞊にゲル圢成液を塗垃し、次いでゲル化
埌にその䞊に支持䜓を付蚭する方法により補造す
るこずができる。 あるいは、本発明の第二の態様の電気泳動甚媒
䜓材料は、たず支持䜓の衚面に盎接、あるいは所
望により本発明で芏定した接着局以倖の接着局を
付蚭したのち、ゲル圢成液を塗垃し、次いでゲル
化埌にその䞊にスルフむン酞基含有ポリマヌを含
有する接着局を有するガバヌフむルムを付蚭する
方法によ぀おも補造するこずができる。 本発明の電気泳動甚媒䜓材料は、前述の諞文献
等に蚘茉の公知の方法に埓぀お、氎平型および垂
盎型平板電気泳動法、デむスク電気泳動法等のい
ずれにも甚いるこずができる。 本発明の電気泳動媒䜓材料は、特にプラスチツ
ク補シヌト支持䜓あるいはカバヌフむルムず
電気泳動甚媒䜓局ずの間に接着に顕著な有効性を
瀺す特定の接着局を付蚭したため、その補造工
皋、あるいは電気泳動工皋およびそれに附随する
工皋においお、そしお也燥時および湿最時のいず
れの時でも、各局の分離が発生しにくいずの顕著
な利点がある。たたその接着局が高い接着性を瀺
すこずから、各局間の密着性も向䞊し、このため
電気泳動の分解胜も向䞊する。 以䞋に本発明の実斜䟋を蚘茉するが、これらは
本発明の範囲を限定するものではない。 実斜䟋  玫倖線照射凊理により衚面を芪氎性にした厚さ
180ÎŒmのポリ゚チレンテレフタレヌトPET
シヌト支持䜓䞊に玄0.5ÎŒmの厚み固圢分
になるように、第衚蚘茉の接着局圢成甚塗垃液
を塗垃し、玄110℃で也燥しおスルフむン酞基含
有ポリマヌを含む接着局を圢成した。 【衚】 支持䜓䞊に蚭けられた各接着局の䞊に、アクリ
ルアミド11.87、BIS630mg、尿玠42、トリス
ヒドロキシメチルアミノメタンCAS
Registry No.77−86−1.08、ホり酞0.55
およびEDTA・2Na塩93mgを含有する100mlの溶
液に重合開始剀ずしおペルオク゜二硫酞アンモニ
りム重量1.3ml、TEMED33ÎŒlを加えた
ものを0.5mmの厚みで成圢し、ポリアクリルアミ
ドゲル膜詊料番号〜を埗た。 たた、PETシヌト䞊に接着局を付蚭しなか぀
た以倖は同様にしおゲル膜を圢成しお比范詊料ず
した。 埗られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜ず支持䜓
間の接着性を評䟡した。詊料番号〜本発明
に埓う詊料における支持䜓ずゲル膜ずの間の接
着性は優れおいたが、䞀方、比范詊料に぀いおは
その接着性が劣぀おいた。 実斜䟋  実斜䟋の第衚ず同じ塗垃液を甚いお接着局
付きPETシヌト支持䜓を補造し、この接着
局の䞊にアクリルアミド系11.87、BIS630mg、
アガロヌス䜎電気浞透性、ゲル䜎枩床36℃
0.3、ポリアクリルアミド2.5、トリスヒド
ロキシメチルアミノメタン1.08、ホり酞0.55
、およびEDTA・2Naå¡©93mgからなる100mlの
溶液に重合開始剀ずしおペルオク゜二硫酞アンモ
ニりム重量1.3ml、TEMED33ÎŒlを加え
たものを0.5mmの厚みで成圢し、ポリアクリルア
ミドゲル膜詊料番号〜を埗た。 たた、PETシヌト䞊に接着剀を付蚭しなか぀
た以倖は同様にしおゲル膜を圢成しお比范詊料ず
した。 埗られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜ず支持䜓
間の接着性を評䟡した。詊料番号〜本発明
に埓う詊料における支持䜓ずゲル膜ずの間の接
着性は優れおいたが、䞀方、比范詊料に぀いおは
その接着性が劣぀おいた。 実斜䟋  玫倖線照射しお衚面を芪氎性にしたPETシヌ
ト支持䜓のその衚面䞊に、アクリルアミド
11.87、−トリアクリロむル−ヘキ
サヒドロ−−トリアゞン630mg、アガロヌス0.3
、ポリアクリルアミド2.5、尿玠42、トリ
スヒドロキシメチルアミノメタン1.08、ホ
ã‚Šé…ž0.55およびEDTA2Naå¡©93mgからなる100
ml溶液に重合開始剀ずしおベルオク゜二硫酞アン
モニりム重量1.3ml、TEMED33ÎŒlを
加えたものを0.5mmの厚みで成圢し、ポリアクリ
ルアミドゲル膜を埗た。次いで、このゲル膜に垞
法によりサンプル泚入甚のスロツトを成圢した。 別に実斜䟋の第衚ず同じ塗垃液を甚いお接
着局぀きPETシヌトカバヌフむルムを調補
しお、このカバヌフむルムで䞊蚘のゲル膜衚面を
被芆し、電気泳動媒䜓材料を埗た。 この電気泳動媒䜓材料を䜿甚し、32P−DNAを
マキサム・ギルバヌト分解しお埗た詊料を電気泳
動にかけ、DNA塩基配列決定の実隓を行な぀た。 電気泳動終了埌、支持䜓PETシヌトのみをゲ
ル膜から陀いた。ゲル膜はいずれもカバヌフむル
ムによく接着しおいた。このゲル膜を10酢酞氎
溶液に浞挬し、脱尿玠したのち、ろ玙におカバヌ
し、これを枛圧䞋で也燥した。なお、䞊蚘の酢酞
氎溶液浞挬時においお、カバヌフむルムからゲル
膜がはがれる事がなか぀た。也燥終了埌オヌトラ
ゞオグラフむヌ凊理を垞法に埓぀お行な぀た。性
胜はいずれも良奜だ぀た。 比范詊料ずしお、接着局のないPETフむルム
をカバヌフむルムずしお甚い電気泳動甚媒䜓材料
を埗た。この比范詊料を甚いお同様の実隓を行な
぀たが、この堎合は支持䜓PETシヌトのみを陀
くこずができず、以埌の操䜜は䞍可胜であ぀た。 実斜䟋  実斜䟋の第衚の詊料番号の塗垃液を、玫
倖線照射しお衚面を芪氎性にしたPETシヌト
支持䜓の䞊に塗垃しお接着局を圢成した。 別に、カバヌフむルムずしお、実斜䟋の第
衚の詊料番号の塗垃液をPETフむルムの䞊に
塗垃しお接着局を圢成したものを準備した。 䞊蚘の支持䜓の䞊に実斜䟋ず同様にしおゲル
膜を圢成し、スロツトを圢成し、このゲル膜の䞊
に䞊蚘のカバヌフむルムを被芆した。実斜䟋ず
同様に電気泳動埌、脱尿玠、也燥を行な぀た。こ
れらの操䜜は特に支障なく行なわれ、このこずか
らも明らかなように、䞊蚘カバヌフむルムはゲル
膜に高い接着力で接着しおいた。たた、この詊料
を甚いおオヌトラゞオグラフむヌ凊理を行な぀た
ずころ、良奜な性胜を瀺した。

Claims (1)

  1. 【特蚱請求の範囲】  䞋蚘の各局が順次積局されおなる電気泳動甚
    媒䜓材料  プラスチツク支持䜓局  スルフむン酞基含有ポリマヌを含有する
    接着局  アクリルアミド系化合物ず架橋剀が氎の
    存圚䞋で架橋重合しおなるポリアクリルアミド
    系氎性ゲル、および倉性剀ずしお少なくずも
    個のカルバモむル基をも぀化合物を含む電気泳
    動甚媒䜓局および  プラスチツクカバヌフむルム局。  電気泳動甚媒䜓局がさらに氎溶性ポリマヌお
    よびアガロヌスを含むこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  倉性剀が尿玠たたはホルムアルデヒドである
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項もしくは
    第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  プラスチツク支持䜓局がポリ゚チレンテレフ
    タレヌトシヌトからなるこずを特城ずする特蚱請
    求の範囲第項もしくは第項蚘茉の電気泳動甚
    媒䜓材料。  スルフむン酞基含有ポリマヌが䞋蚘䞀般匏
    によ぀お衚されるくり返し単䜍を有するポ
    リマヌであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項もしくは第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。 ただし䞊蚘䞀般匏においお、 は氎玠原子、炭玠数〜のアルキル基、
    たたはハロゲン原子であり、は氎玠原子、アル
    カリ金属原子、アルカリ土金属原子たたは有機塩
    基であり、はたたはであり、そしお、
    はたたはである  䞋蚘の各局が順次積局されおなる電気泳動甚
    媒䜓材料  プラスチツク支持䜓局  アクリルアミド系化合物ず架橋剀が氎の
    存圚䞋で架橋重合しおなるポリアクリルアミド
    系氎性ゲル、および倉性剀ずしお少なくずも
    個のカルバモむル基をも぀化合物を含む電気泳
    動甚媒䜓局  スルフむン酞基含有ポリマヌを含有する
    接着局および  プラスチツクカバヌフむルム局。  電気泳動甚媒䜓局がさらに氎溶性ポリマヌお
    よびアガロヌスを含むこずを特城ずする特蚱請求
    の範囲第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  倉性剀が尿玠たたはホルムアルデヒドである
    こずを特城ずする特蚱請求の範囲第項もしくは
    第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  プラスチツク支持䜓局がポリ゚チレンテレフ
    タレヌトシヌトからなるこずを特城ずする特蚱請
    求の範囲第項もしくは第項蚘茉の電気泳動甚
    媒䜓材料。  スルフむン酞基含有ポリマヌが䞋蚘䞀般匏
    によ぀お衚されるくり返し単䜍を有するポ
    リマヌであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項もしくは第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。 ただし䞊蚘䞀般匏においお、 は氎玠原子、炭玠数〜のアルキル基、
    たたはハロゲン原子であり、は氎玠原子、アル
    カリ金属原子、アルカリ土金属原子たたは有機塩
    基であり、はたたはであり、そしお、
    はたたはである  䞋蚘の各局が順次積局されおなる電気泳動
    甚媒䜓材料  プラスチツク支持䜓局  スルフむン酞基含有ポリマヌを含有する
    接着局  アクリルアミド系化合物ず架橋剀が氎の
    存圚䞋で架橋重合しおなるポリアクリルアミド
    系氎性ゲル、および倉性剀ずしお少なくずも
    個のカルバモむル基をも぀化合物を含む電気泳
    動甚媒䜓局  スルフむン酞基含有ポリマヌを含有する
    接着局および  プラスチツクカバヌフむルム局。  電気泳動甚媒䜓局がさらに氎溶性ポリマヌ
    およびアガロヌスを含むこずを特城ずする特蚱請
    求の範囲第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  倉性剀が尿玠たたはホルムアルデヒドであ
    るこずを特城ずする特蚱請求の範囲第項もし
    くは第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材料。  プラスチツク支持䜓局がポリ゚チレンテレ
    フタレヌトシヌトからなるこずを特城ずする特蚱
    請求の範囲第項もしくは第項蚘茉の電気
    泳動甚媒䜓材料。  スルフむン酞基含有ポリマヌが䞋蚘䞀般匏
    によ぀お衚されるくり返し単䜍を有するポ
    リマヌであるこずを特城ずする特蚱請求の範囲第
    項もしくは第項蚘茉の電気泳動甚媒䜓材
    料。 ただし䞊蚘䞀般匏においお、 は氎玠原子、炭玠数〜のアルキル基、
    たたはハロゲン原子であり、は氎玠原子、アル
    カリ金属原子、アルカリ土金属原子たたは有機塩
    基であり、はたたはであり、そしお、
    はたたはである
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