JPS63262551A - 電気泳動用媒体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体に関するものであり、さらに
詳しくは、特にＤＮＡの塩基配列決定操作に用いるのに
適した電気泳動用媒体に関するものである。

［発明の背景］ ボストラベル法に基づ＜ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列決定
法においては、ポリアクリルアミドゲル膜を用いたスラ
ブ電気泳動操作が必須の操作となっている。特に近年に
おいて遺伝子関連の研究が進むにつれて、ＤＮＡ塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。

従来のポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミドの
ような単量体を触媒の存在下にて、Ｎ。

Ｎ゛−メチレンビスアクリルアミドのような二官能性の
架橋剤を用い架橋重合させることにより得られている。

なお、このＤＮＡ塩基配列決定のための電気泳動用媒体
として用いるポリアクリルアミドゲル膜の形成に際して
は通常、尿素あるいはホルムアミドのような変性剤を含
有させる。

上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸素の影響
により反応が阻害されるため、ポリアクリルアミドゲル
膜は酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この理
由から、現在では一般に、ポリアクリルアミドゲル膜は
二枚のガラス板で形成されたセル（一定の空ａ■、たと
えば約０．３〜１ｍｍを有する）の中にゲル形成液を注
入させ、酸素を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を
形成させている。

以上のようにして形成したポリアクリルアミドゲル膜を
用いる電気泳動操作は、たとえば、次のようにして実施
される。

ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだままの状
態で垂直に立てられ、前電気泳動を行なったのち、ゲル
膜上端部に設けられたサンプルスロットに試料（たとえ
ば、マキサム・ギルバート分解した３２　ｐラベル化Ｄ
ＮＡ）を一定量注入し、次いで電気泳動を行なう。そし
て一定時間（例、約６時間〜１２時間）の電気泳動を行
なった後、片面のガラス板を注意深く除去し、その露出
面をポリ塩化ビニリデンフィルムなどの合成樹脂製フィ
ルムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグラフ
ィー処理を行なう。

すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆しているフ
ィルムの上にＸ線フィルム、増感スクリーンを順次のせ
て、低温（たとえば、−８０℃）で一定時間（たとえば
、約１０〜２０時間）露光を行なう。そして露光終了後
、Ｘ線フィルムを現像し、ＤＮＡの分離泳動パターンを
読みとることからなるオートラジオグラフィー処理によ
り、ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。

［発明の目的］ ＤＮＡの電気泳動分析に使用するのに適した解像力が向
上した電気泳動用媒体は特開昭６１−１８８５２号公報
に開示されているが、ＤＮＡの電気泳動分析を更に高精
度に行なうためには、更に向上した解像力を示すゲル媒
体の開発が望まれる。本発明の目的はＤＮＡ塩基配列決
定のため電気泳動用媒体として、高精度の解像力を示す
ゲル媒体を提供することにある。

［発明の要旨］ 本発明は、下記一般式（１）および（２）のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するメタクリルアミ
ド系コポリマー： Ｒ１１は、水素原子または１から６個の炭素原子を有す
るアルキル基であり： ■ Ｑｌは−０００−１−ＣＯＮ−５または６から１０個の
炭素原子を有するアリーレン基であり：Ｒ” Ｌｌは、−０００−あるいは−〇〇Ｎ−の結合のいずれ
かを少なくとも一個含み、かつ３から１５個の炭素原子
を有する二価の基、または、一〇−１−Ｎ−１−ＣＯ−
１−３Ｏ−１一５Ｏ２−１−ＳＯ３−１−３Ｏ２Ｎ−１
ずれかを少なくとも一個含み、かつｌから１２個の炭素
原子を有する二価の基（ただしＲ”は前述と同義である
）であり； Ｒ１２バーＣＨ＝　ＣＨ２又４ｆ　−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ　
’（ただし　Ｘｉは求核基により置換され得る基、ある
いは塩基によってＨＸＩの形で脱離し得る基を表わす）
のいずれかであり； Ａ１はその左側に示した各千ツマ一単位と共重合可能な
エチレン性不飽和モノマーから誘導された二価の基であ
り： ｘｌ、ｙｌおよびｚｌはモル百分率を表わし、Ｘｉは５
０〜９９、ｙｌは１〜５０、ｚｌは残余の値をとる、た
だし２！はＯであってもよい］Ｒ２１は水素原子または
１から６個の炭素原子を有するアルキル基であり： Ｒ２２は−ＣＨ＝ＣＨ２又は−ＣＨ２ＣＨ２ｘ２（ただ
し、ｘ２は求核基により置換され得る基、あるいは塩基
によってＨＸ２の形で脱離し得る基を表わす）であり： Ｌ２は、１から６個の炭素原子を有するアルキレン基、
６から１２個の炭素原子を有するアリーレン基、−ＣＯ
Ｚ　２−で表わされる基、および−ＣＯＺ２Ｒ３”−で
表わされる基（ただし、Ｒ３５は１から６個の炭素原子
を有するアルキレン基、あるいは６から１２個の炭素原
子を有するアリーレン基であり、そしてＺ２は酸素原子
あるいはＮＨである）から選ばれる二価の基であり：Ａ
２はその左側に示した各モノマ一単位と共重合可能なエ
チレン性不飽和七ツマ−から誘導された二価の基であり
： ｘ２、ｙ２およびｚ２はモル百分率を表わし、ｘ２は５
０〜９９、ｙ２は１〜５０、ｚ２は残余の値をとる、た
だしｚ２はＯであってもよい］とアクリルアミド系化合
物とが水の存在下で架橋重合してなるポリアクリルアミ
ド系水性ゲル、および変性剤として少なくとも１個のカ
ルバモイル基を有する化合物を含む電気泳動用媒体を提
供するものである。

本発明の電気泳動用媒体は、これまでに知られている同
種の電気泳動用媒体に比較して、特に高い解像力を示し
、また加工性が良い、すなわち長尺状に製造した電気泳
動用媒体の切断作業あるいはサンプルスロットの付設作
業などの刃物によるポリアクリルアミドゲル膜の切断加
工がゲル膜の破壊や切断面付近の形状の変化を伴なうこ
となく容易かつ確実にできるため、得られる電気泳動用
媒体は優れた性能を示し、また大量生産により製造する
ことが容易となる。

なお電気泳動用媒体を大量生産する場合には、これをプ
ラスチック材料製支持体の上に付設した形状とするのが
有利である。このような形状とすることにより本発明の
電気泳動用媒体の大量生産が容易となり、また支持体が
軽量で、壊れにくいため、電気泳動用媒体の保存、輸送
等が容易となる。従って、ポリアクリルアミドゲル膜（
電気泳動用媒体）を集中的に製造し、必要に応じてＤＮ
Ａ分析のための電気泳動操作担当者に供給するようなゲ
ル膜製造・使用システムの実現に極めて有効である。

［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体の支持体としては、ガラス板、
ポリマーコート紙、プラスチック材料製シートなどの任
意の耐水性シート状支持体を用いることができる。ただ
し、本発明の電気泳動用媒体の利点を生かすためには、
支持体としてプラスチック材料製シートを用いることが
望ましい。

電気泳動用媒体のプラスチックシート支持体としては各
種のプラスチックシートを用いることができる。好まし
いプラスチックシートの例としては、親木性ポリマーま
たは公知の表面処理により表面を親水化したポリマー（
例、ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールＡの
ポリカルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・
塩化ビニルコポリマー、ポリメチルメタアクリレート、
ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート
類、セルロースアセテートプロピオネート等）のシート
（フィルム、板状物も含む）等を挙げることができる。

特に好ましい支持体はポリエチレンテレフタレートでア
ル。

次に電気泳動用媒体層（以下においてゲル媒体層、ポリ
アクリルアミドゲル膜あるいは単にゲル膜ともいう）に
ついて説明する。

ポリアクリルアミドゲル膜は、前述のように、一般には
アクリルアミド系化合物と架橋剤とを、水溶液または水
分散液として水中に溶解または分散させてゲル形成液を
調製したのち、液中で両者を架橋重合させて架橋重合し
た水性ゲル膜として形成することにより得ることができ
る。なお、本明細書においては、特にことわらない限り
、（水中に）溶解と（水中に）分散の両者を含めて単に
（水中に）溶解といい、水溶液と水分散液の両者を含め
て単に水溶液という。また溶媒または分散媒としては、
所望により加えられる有機溶媒と水の混合物をも包含す
る。

これに対して本発明においては、ポリアクリルアミドゲ
ル膜を、特定のポリメタクリルアミド系コポリマーとア
クリルアミド系化合物とを水の存在下で架橋重合して製
造する。なお、この架橋重合の実施に際して多官爺性架
橋剤（特に三官能性架橋剤）を関与させると、得られる
ポリアクリルアミドゲル膜の解像力と加工性は更に向上
する。

本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物の
例としては、アクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミ
ド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキ
シメチル）アクリルアミド、ジアセトンアクリルアミド
等のアクリルアミドホモログや、メタクリルアミド系化
合物、例えばメタクリルアミドがあげられ、これらの化
合物は単独で、あるいは二種以上を併用して用いること
ができる。これらのアクリルアミド系化合物のうちでは
アクリルアミドが最も好ましく、またアクリルアミドと
他゛のアクリルアミド系化合物の一種以上の併用も好ま
しい。

本発明のポリアクリルアミドゲル膜の製造に関与させる
特定のポリメタクリルアミド系コポリマーは下記一般式
（１）および（２）のいずれかにより表わされる構成繰
返し単位を有するメタクリルアミド系コポリマーである
。

個の炭素原子を有するアルキル基であり、その例にはメ
チル基、エチル基、ブチル基、ｎ−ヘキシル基などが含
まれる。

Ｑｌは−ＣＯＯ−１−ＣＯＮ−１または６から１０個の
炭素原子を有するアリーレン基であり、その例には次の
ような基が含まれる。

ＣＨ３ −ＣＯＯ−１−ＣＯＮＨ−１−ＣＯＮ−１Ｒ” Ｌｌは、−ＣＯＯ−あるいは−〇〇Ｎ−の結合のいずれ
かを少なくとも一個含み、かつ３から１５個の炭素原子
を有する二価の基、または、Ｒ” −０−１−Ｎ−５−ＣＯ−１−５Ｏ−１Ｒ” 一５Ｏ２−１−３Ｏ３−１−３Ｏ２Ｎ−１ずれかを少な
くとも一個含み、かつｌから１２個の炭素原子を有する
二価の基（ただしＲ”は前述と同義である）であり、そ
の例には次のような基が含まれる。なお、これらの二価
の基の一般式ＣＩ）における結合の方向は、ＱｌとＳ０
２との結合が可能なかぎり、いずれの方向をもとること
ができる。

ＣＨ２Ｃ００ＣＨ２− ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２− −ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２− ＋ＣＨ２廿６　ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２− ｆＣＨ２テ丁Ｃ００ＣＨ２ＣＨ２− −ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２− −ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２− −ｆ−ＣＨ２つ−３Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−−ｆ−Ｃ
Ｈ２−Ｙｌ−Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−ｆＣＨ２→　ｔ
ｏ　Ｎ　ＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−−ＣＨ２０ＣＨ２− −ＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−−ＣＯＣＨ２Ｃ
Ｈ２− ＣＨ２Ｓ　ＯＣＨ２ＣＨ２− −ＳＯ□ＣＨ２ＣＨ２− −３Ｏ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ　　　Ｏ
ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２− Ｓ　Ｏ３ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２− ３Ｏ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−−ＳＯ□ＮＨ
ＣＨ２Ｃ００ＣＨ２ＣＨ２−５Ｏ２Ｎ　ＨＣＨ２ＣＨ２
ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨ２− ＣＨ２Ｎ　ＨＣＯＮ　ＨＣＨ２ＣＨ２−Ｎ　ＨＣＯＯＣ
Ｈ２ＣＨ２− −ＣＨ２ＮＨＣＯＯＣＨ２ＣＨ２− Ｒ１２４ｆ　　ＣＨ＝　ＣＨ２又（ｔ　−ＣＨ２ＣＨ２
Ｘ　’（ただし、Ｘ！は求核基により置換され得る基、
あるいは塩基によってＨＸＩの形で脱離し得る基を表わ
す）のいずれかであり、このｘｌの例には次のような基
が含まれる。

ハロゲン原子（塩素、臭素など）：ヒドロキシル基：ア
ルキルスルホニルオキシ（例、メチルスルホニルオキシ
Ｈ，Ｃ−３−０−、エチルスルホニルオキシ、プロピル
スルホニルオキシなど）ニアリールスルホニルオキシ（
例、フェニルスルホホニルオキシなど）；アルキルカル
ボニルオキシ（例、アセトキシ、プロピオニルオキシ、
トルフルオロメチルカルボニルオキシ、ジクロロメチル
カルボニルオキシなど） 従って、Ｒ１２の例には、次のような基が含まれる。

−ＣＨ−ＣＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２Ｃ１、−ＣＨ２ＣＨ２
Ｂｒ、 Ｉ ＣＨ２ＣＨ２０Ｓ　　ＣＨｓ、 〇 −ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ。

−　ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＨ３、 −ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＦ　３　、 ＣＨ２ＣＨ２００ＣＣＣ文　。。

Ａ１はその左側に示した各モノマ一単位と共重合可能な
エチレン性不飽和モノマーから誘導された二価の基であ
り、その例としては、下記のようなエチレン性不飽和モ
ノマーから誘導された基を挙げることができる。

エチレン、プロピレン、１−ブテン、イソブチン、スチ
レン、クロロメチルスチレン、ヒドロキシメチルスチレ
ン、ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ビニルベン
ジルスルホン酸ナトリウム、Ｎ、Ｎ、Ｎ−）ウメチル−
Ｎ−ビニルベンジルアンモニウムクロリド、Ｎ、Ｎ−ジ
メチル−Ｎ−ベンジル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウ
ムクロリド、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、４
−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ベンジルビニ
ルピリジニウムクロリド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ
−ビニルピロリドン、１−ビニル−２−メチルイミダゾ
ール、脂肪酸のモノエチレン性不飽和エステル（例えば
酢酸ビニル、酢酸アリル）、エチレン性不飽和のモノカ
ルボン酸もしくはジカルボン酸およびその塩（例えば、
アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、
アクリル酸ナトリウム、アクリル酸カリウム、メタクリ
ル酸ナトリウム）、無水マレイン酸、エチレン性不飽和
のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸のエステル（例
えば、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−へキシルアクリレ
ート、ヒドロキシエチルアクリレート、シアンエチルア
クリレート、（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、
メチルメタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ベ
ンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレー
ト、クロロエチルメタクリレート、メトキシエチルメタ
クリレート、（ジエチルアミノ）エチルメタクリレ−）
、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリエチル−Ｎ−メタクリロイルオキシ
エチルアンモニウムｐ−）シアンスルホナート、Ｎ、Ｎ
−ジエチル−Ｎ−メチル−Ｎ−メタクリロイルオキシエ
チルアンモニウムＰ−１ルエンスルホナート、イタコン
酸ジメチル、マレイン酸モノベンジルエステル）、エチ
レン性不飽和のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸の
アミド（例えばＮ、Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−
メチロールアクリルアミド、Ｎ−［（ジメチルアミノ）
プロピル］アクリルアミド、Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リメチルー
Ｎ−（アクリロイルプロピル）アンモニウム、ｐ−）ル
エンスルホナート、２−アクリルアミド−２−メチルプ
ロパンスルホン酸ナトリウム、アクリロイルモルホリン
、メタクリルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ”−アクリ
ロイルプロパンジアミンプロピオナートベタイン、Ｎ、
Ｎ−ジメチル−Ｎ′−メタクリロイルプロパンジアミン
アセテートベタイン。

また一般式（１）のコポリマーを架橋されたラテックス
として用いる場合には、Ａ１として、上記のエチレン性
不飽和モノマーから誘導された基のほかに、少なくとも
共重合可能なエチレン性不飽和基を２個以上もつ千ツマ
−（例、ジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミ
ド、エチレングリコールジアクリレート、トリメチレン
グリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタ
クリレート、トリメチレングリコールジメタクリレート
、ネオペンチルグリコールジメタクリレート等）から誘
導された基を用いることができる。

Ｘｌ、ｙｌおよびｚｌはモル百分率を表わし、ｘｔは５
０〜９９、ｙｌは１〜５０、ｚｌは残余の値をとる、た
だしｚｌはＯであってもよい。

ぞれ前記一般式（１）の１ｌｉｌｌ、Ｒ１２およびＡ１
と同義であり、それらの例も同様である。

Ｌ２は、１から６個の炭素原子を有するアルキレン基（
例、メチレン、エチレン、イソブチレンなど）、６から
１２個の炭素原子を有するアリーレン基１１．　フェニ
レン、トリレン、ナフタレンなど）、−ＣＯＺ２−で表
わされる基、および−ＣＯＺ２Ｒ”−で表わされる基（
ただし、Ｒ３５は１から６個の炭素原子を有するアルキ
レン基、あるいは６から１２個の炭素原子を有するアリ
ーレン基であり、そして２２は酸素原子あるいはＮＨで
ある）から選ばれる二価の基である。

Ｘ２、ｙ２およびｚ２はモル百分率を表わし、ｘ２は５
０〜９９、ｙ２は１〜５０．２２は残余の値をとる、た
だしｚ２は０であってもよい。

上記の一般式（，１）もしくは（２）のいずれかにより
表わされる構成繰返し単位を有するポリマーの合成に用
いることができる代表的なビニルスルホニル基あるいは
その前駆体となる官能基を有するエチレン性不飽和モノ
マーの合成法については、特開昭６１−１８８５２号公
報に具体的に記載されている。

本発明で用いるアクリルアミド系コポリマーとして好ま
しいコポリマーは次に挙げる式で表わされるものである
。

Ｒ゛は下記の置換基を示す。

Ａ−１ｘ＝９２．７＝８．２＝０ Ｒ＝Ｃ０Ｄ　ＣＩ２　ＣＩ２００００Ｈ２ＯＨ２ＳＯ２
ＣＩ＝　ＣＨ２Ａ−２ｘ＝９０、ｙ＝１０．ｚ＝０ Ｒ＝　Ｃ０ＮＨＧＨ２ＮＨＣＯＣＩ　２ＣＨ２ＳＯ２Ｃ
Ｉ＝　ＯＨ２Ａ−３ｘ＝８０．ｙ＝８、ｚ＝１２ Ｒ”　Ｃ０ＮＨＣＨ２ＮＨＧＯＣＨ２ＧＨ２ＳＯ２ＣＨ
＝　ＯＨ２Ｒ’　−Ｃ０ＮＨ２Ｇ（ＯＨ３）　２　ＯＨ
２ＣＯＣＨ３Ａ−６ｘ＝９２、　Ｙ＝８、２＝０ Ｕ Ａ−？　　　　ｘ＝９２、　Ｖ＝８、　ｚ＝ＯＲ＝　Ｃ
０ＮＨＣＨ２ＮＨＧＯＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＩ２　ＣＩ
２　ＣＩＡ−８ｘ＝８０、　Ｖ＝８、　ｚ＝１２Ｒ＝　
ＧＯＮＨＧＨ２ＮＨＣＯＩＩＩ：Ｉ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ
２ＣＨ２ＣＩＲ’　＝　ＣＯＮＨ２に（ＣＨ３）　　２
　ＣＩ２　Ｃ０ＣＨｓＲ’　　＝　　　Ｃ０ＮＨＣ：Ｈ
２０ＨＲ’　　＝　　　Ｃ０Ｎ（ＣＨ３）　　２Ａ−１
２ｘ　＝　　９　２、　ｙ＝８　　　、　　ｚ＝ＯＲ−
０００ＣＩ２　ＣＨ２０００ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ＝　ＣＨ
２ところで、特開昭６１−１８８５２号公報には、本発
明のメタクリルアミド成分のかわりにアクリルアミド成
分を用いたポリマーが出願されている。具体的には Ｒ′は下記の置換基を示す。

Ｂ−１ｘ＝９２、Ｖ＝８．２＝０ Ｒ冨０００１：）Ｉ２ＣＨ２０ＣＯＣＨ２ＣＨ２５Ｏ２
ＣＨ＝　ＣＨ２Ｂ−２ｘ＝９０、ｙ＝ｌＯ，ｚ＝０ Ｒ＝Ｃ０ＮＨＣＨｔ　ＮＨＧＯＣＨ２ＣＨ２Ｓ０２　Ｃ
Ｈ＝ＣＨ２Ｂ−３ｘ＝８０．ｙ＝８、ｚ＝１２ Ｒ＝　Ｃ０ＮＨＣＨ２ＮＨＧＯＣＨ２ＣＨ２Ｓｏ□ＧＨ
＝ＧＨ２Ｒ’　＝　ＣＯＮＨ２ＣＣＣＨ３）　２　ＣＨ
２Ｃ０ＣＨｚＢ−４ｘ＝９２、Ｙ＝８．２＝０ Ｂ−５ｘ＝９２、　Ｆ＝８．２＝０ Ｂ−６ｘ＝９２、　ｙ＝８．ｚ＝０ Ｂ−７ｘ＝９２．ｙ＝８、ｚ＝Ｏ Ｒ＝　Ｃ０ＮＨＣＨ２ＮＨ（ＯＣＲ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ
２ＣＨ２ＣＩＢ−８ｘ＝８０、Ｙ＝８、ｚ＝１２ Ｒ＝　ＧＯＮＨＧＨ２ＮＨＣＯＧＨ２ｃｏ　２ＳＯ２Ｃ
Ｈ２０Ｈ２［ＩＲ”　＝　Ｃ０ＮＨ２Ｃ（ＣＨ３）　　
２　ＣＨ２Ｃ０ＧＨｓＲ”　＝　　（ＯＮＨＧＨ２０Ｈ Ｂ−１１ｘ＝８０．　　：Ｆ＝８、　ｚ　＝　１２Ｒ’
　　＝　　　Ｃ０Ｎ（ＣＨ３）　　２Ｂ−１２ｘ　＝　
　９２、　ｙ＝８　　　、ｚ＝０Ｒ＝　Ｃｏｎ　　０Ｈ
２ＣＨ２００００Ｈ２ＳＯ２ＣＨ＝　ＣＨ２次に、前記
のコポリマーのうちＡ−２およびＡ−８と名付けられた
コポリマーの合成例を示す。

［合成例１］コーポリ−Ｎ−（［３−（ビニルスルホこ
ル）プロパンアミドコメチル）アクリルアミド−メタク
リルアミド（Ａ−２）の合成２００　ｍ　ｌの反応容器
に、Ｎ−［−３−（クロエチルスルホニル）プロパンア
ミドエチルコアクリルアミド５．６５ｇ、メタクリルア
ミド１５．３ｇおよび５０％メタノール水溶液８０ｍ１
を加え、攪拌しながら６０℃に加熱し、２゜２′−アゾ
ビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）０．１ｇを加
え、さらに３０分後にも同じものをＯ，Ｉｇ加えて、２
時間加熱攪拌を続けた。

その後、氷水により約１０℃に冷却して、トリエチルア
ミン２．５ｇを８０　ｍ　ｌのメタノールに溶解させた
ものを加え、２時間攪拌を続けてから、反応液を攪拌し
なから１４１のアセトンに注ぎ込み、生成した沈澱を濾
取して、１６．３ｇの白色ポリマー（前記Ａ−２に該当
）を得た（収率は８０％）。このポリマーのスルホニル
基含量は０　、９０　Ｘ　Ｉ　Ｏ−３当量／　ｇ　テあ
ツタ。

［合成例２］コーポリ−Ｎ−（［３−（２−クロロエチ
ルスルホニル）プロパンアミドコメチル）アクリルアミ
ド−メタクリルアミド−Ｎ−（１，１−ジメチル−３−
オキツブチル）アクリルアミド（Ａ−８）の合成 ５００　ｍ　ｆＬの反応容器に、Ｎ−［３−（２−クロ
ロエチルスルホニル）プロパンアミドメチルコアクリル
アミド１０．３ｇ、メタクリルアミド３５．０ｇ、Ｎ−
（１，１−ジメチル−３−オキツブチル）アクリルアミ
ド（ジアセトンアミド）１１３ｇおよび５０％メタノー
ル水溶液１６０ｍＪｌを加え、攪拌しながら６０℃に加
熱し、２゜２゛−７ゾビスー（２，４−ジメチルバレロ
ニトリル）０．２ｇを加え、１時間後更に同じものを０
．２ｇ加えて２時間加熱攪拌を続けた。反応液をセルロ
ースチューブに入れて２日間透析し、凍結乾燥により４
５．０ｇの白色のポリマー（前記Ａ−８に該当）を得た
。（収率８０％）このポリマーのクロロエチルスルホニ
ル基金量ハｏ　、　ｓ　ｘｌＯ−３当量／ｇであった。

本発明において好ましく用いられるメタクリルアミド系
コポリマーの分子量は約１万から約１００万の範囲にあ
る。

架橋重合反応に用いられるアクリルアミド化合物とメタ
クリルアミド系コポリマーとの比率は、アクリルアミド
系化合物に対して該コポリマーが通常は約１〜５０重量
％であり、好ましくは約５〜４０重量％である。

前述のように本発明のポリアクリルアミドゲル膜の製造
に際しては架橋剤を併用してもよい。架橋剤としては、
たとえば、ｒ　ＥＩｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓＪ１９
８１．２．２１３−２２８等に記載の公知の化合物を用
いることができる。架橋剤の例としては、Ｎ、Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミド（ＢＩＳ）；Ｎ。

Ｎ”−プロピレンビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；ジ（
アクリルアミドジメチル）エーテル（ＤＡＥ）；１，２
−ジアクリルアミドエチレングリコール（ＤＥＣ）、エ
チレンウレアビスアクリルアミド（ＥＵＢ）；エチレン
ジアクリレート（ＥＤＡ）；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタータ
ルジアミド　　（Ｎ、Ｎ’−ｄｉａｌｌｙｌｔａｒｔａ
ｒｄｉａｍｉｄｅ　　　：　　Ｄ　　Ａ　　Ｔ　　Ｄ　
　）　　　；Ｎ、Ｎ’−ビスアクリリルシスタミン（Ｎ
、Ｎ’−ｂｉｓａｃｒｙｌｙｌｃｙｓｔａｍｉｎｅ、　
Ｂ　Ａ　Ｃ）などの二官能性化合物、およびトリアリル
シアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、１，３．
５−トリアクリロイルへキサヒドロ−５−）リアジンな
どの三官能性化合物が挙げられる。架橋剤は単独で使用
してもよく、あるいは二種以上を併用してもよい。

架橋剤は、アクリルアミド系化合物、メタクリルアミド
系コポリマーそして架橋剤の総重量に対して約３０重量
％以下、好ましくは約１０重量％以下の範囲の量で用い
る。

本発明の電気泳動用媒体の製造において用いられるポリ
アクリルアミドゲルのゲル濃度メしては、Ｓ−Ｈｊｅｒ
ｔｅｎ：　ｒ　Ａｒｃｈ−Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ｊｌ　（５ｕｐｐ１．）、　１４７　（１９６
２）に記載の定義に従って表示して、アクリルアミド系
化合物、メタクリルアミド系コポリマー、および水、そ
して場合により架橋剤、からなるゲル媒体の容積に対し
て、アクリルアミド系化合物およびメタクリルアミドに
コポリマー（そして場合により架橋剤）の量が約３　ｗ
　／　ｖ％から約３０　ｗ　／　ｖ％の範囲が好ましく
用いられる。

本発明のＤＮＡの電気泳動分析に適した電気泳動用媒体
（ポリアクリルアミドゲル膜）には変性剤が添加される
。添加される変性剤としては、少なくとも１個のカルバ
モイル基を持つ化合物を挙げることができ、その具体例
としては、尿素、ホルムアミド等が挙げられる。これら
のうちで尿素が特に好ましく用いられる。変性剤は水性
ゲルの容積に対し、約４０　ｗ　ｔ　／　ｖ％から約６
０ｗｔ／７％の範囲の量で用いられる。尿素を用いる場
合には、水性ゲルｔｉに対し約６モル（約３６０ｇ）か
ら飽和溶解量まで、好ましくは約７モル（約４２０　ｇ
）から飽和溶解量までの範囲で用いることができる。

本発明の電気泳動用媒体層には、場合によって水溶性ポ
リマーが添加される。水溶性ポリマーとしては、付加重
合型または縮重合型の水溶性ポリマーを用いることがで
きる。付加重合型ポリマーの例としては、ポリビニルア
ルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド
等の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。また縮重
合型ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリア
ルキレンゲリコールが挙げられる。これらの水溶性ポリ
マーのうちでは、ポリアクリルアミドとポリエチレング
リコールが好ましい。

水溶性ポリマーの分子量は約１万から約１００万の範囲
のものが好ましい。水溶性ポリマーは単量体と架橋剤の
合計重量に対して、約２重量％から約１００重量％の範
囲、そして好ましくは約５重量％から約５０重量％の範
囲で用いられる。

水溶性ポリマーの添加によりポリアクリルアミドゲル膜
が可塑性を有するようになり、裁断加工時に壊れること
がなくなり、またゲル膜は乾燥時にも可塑性を有するよ
うになり、もろさが改良され壊れにくくなるとの利点が
ある。また、水溶性ポリマーの分子量および添加量を選
択することにより、ゲル膜の粘度をコントロールするこ
ともできる。

本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、さらにアガロー
スを含有することが好ましい。アガロースとしては任意
のものを使用することができ、低電気浸透性、中電気浸
透性、高電気浸透性アガロースのいずれをも用いること
ができる。用いることができるアガロースの例としては
、特開昭５５−５７３０号、特開昭５５−１１０９４６
号、特表昭５７−５０２０９８号等の各公報に開示のア
ガロース等がある。アガロースは、単量体と架橋剤を含
む水性ゲルの容積に対して約０　、２　ｗ／　Ｖ％から
約２ｗ／ｖ％、好ましくは約０．３ｗ／ｖ％から約１　
、２　ｗ／　７％の割合で用いられる。

ポリアクリルアミドゲル膜がアガロースを含有する場合
には、ゲル形成液の温度を変化させることによって適当
な液粘度にコントロールすることが可能となるため、そ
の流動性を止めることができ、またゲル膜を成形する操
作において成形しやすくなるとの利点がある。

本発明の電気泳動用媒体層にはｐＨ緩衝剤を含有させる
ことができる。緩衝剤としては、ｐＨ８，０から１０．
０　（好ましくはｐＨ８，０から９．０）の範囲内のｐ
Ｈ値に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して用いる
ことができる。

用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学便覧　基
礎編」（東京、丸首■１９６６年発行）１３１２−１３
２０ページ：青水、永井編「最新電気泳動法」　（東京
、床用書店、１９７３年発行３２０−３２２ページ；　
ｒ　Ｄａｔａ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＪ　（Ｒ＋Ｍ。

Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、編、第２版、０ｘｆｏ
ｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣｌａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、
　１９６９年発行）　　４７Ｇ−５０８頁；ｒ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉＳｔｒｙ　Ｊ　　５．４６７　（１９６６
）、　ｒ　　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙＪ　１０４．３００−３１０（１９８０）等に
記載の緩衝剤が挙げられる。

緩衝剤の例としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン（Ｔｒｉｓ）　　［ＣＡＳ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ
　Ｎｏ７７−８６−１１　、　Ｎ　、　Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　、　Ｎ
　−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ”−２−ヒド
ロキシプロパン−３−スルホン酸のＮａ塩またはに塩等
、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−プ
ロパンスルホン酸のＮａ塩またはに塩等、Ｎ−［トリス
（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンス
ルホン酸のＮａ塩またはに塩および、これらのいずれか
と必要により組合せられる酸、アルカリまたは塩等をあ
げることができる。特に好ましい緩衝剤の例としてはＴ
ｒｉｓ、ホウ酸およびＥＤＴＡ・２Ｎａ塩の組合せ（ｐ
Ｈ８，３）がある。

また１本発明の電気泳動用媒体層には、湿潤剤としてグ
リセリン、エチレングリコール等のポリオール化合物を
含有させることもできる。ポリオール化合物の含有量は
、電気泳動用媒体層の容積に対して約０　、１　ｗ／　
Ｖ％から約４０　ｗ　／　ｖ％の範囲から選ばれる。こ
れらの化合物のうちではグリセリンが特に好ましい。湿
潤剤を配合することによりポリアクリルアミドゲル膜の
保存時の極端な水分の蒸発による乾燥を防ぐことが可能
となり、また極端な乾燥に起因するもろさの発生を防ぎ
、ひびわれを防ぐ等のゲル膜の物性が改善されるとの利
点がある。

本発明の電気泳動用媒体層には、必要に応じて抗酸化剤
を含有させることができる。抗酸化剤としては、ポリア
クリルアミドゲル膜に配合しうろことが知られている種
々の化合物を用いることができる。抗酸化剤の例として
は、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノールな
どを挙げることができる。

本発明の電気泳動用媒体における電気泳動用媒体層（ポ
リアクリルアミドゲル膜）の代表的なものは、上記のよ
うにアクリルアミドに代表される単量体、二官能性のア
リル（ａｌｌｙ＋　）化合物またはアクリル化合物（架
橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースなどを、実
質的に均一な水溶液中でアクリルアミド系化合物および
メタクリルアミド系コポリマー（そして場合により架橋
剤）とをラジカル架橋重合させて得られるものであり、
アクリルアミド系化合物およびメタクリルアミド系コポ
リマー（そして場合により架橋剤）から形成された三次
元架橋重合体に水溶性ポリマーとアガロースが実質的に
分散されて、後二者のポリマー鎖と三次元架橋重合体と
がからみあっている構造を有すると推定される。

本発明で利用されるラジカル架橋重合反応は分子状酸素
の不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線照射
等公知の方法により発生させることができる。さらに、
この架橋重合反応は加熱または紫外線照射により加速す
ることもできる。

ラジカル架橋重合用触媒としては、ｒ　Ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓＪ　１９８１．２．２１３−２１９．
同１９Ｂ１．２．２２０−２２８：青水、永井編「最新
電気泳動法Ｊ　　（１９７３年発行）等に記載の公知の
低温ラジカル重合開始剤のうちから適宜選択して用いる
ことができる。好ましいラジカル重合開始剤の具体例と
しては、β−ジメチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＡ
ＰＮ）−ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物、Ｎ、Ｎ
、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥ
ＭＥＤ）・ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物、ＴＥ
ＭＥＤ・リボフラビン混合物、ＴＥＭＥＤ・リボフラビ
ン・過酸化水素混合物と紫外線照射の組合せ等が挙げら
れる。ラジカル重合開始剤の含有量は、アクリルアミド
系化合物およびメタクリルアミド系コポリマー（そして
場合により架橋剤）の合計重量に対して約０．３重量％
から約５重量％、そして好ましくは約０．５重量％から
約３重量％の範囲である。

本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、平滑表面を有す
る支持体の上にゲル形成液を公知の方法により塗布して
塗布層を形成させたのち、その塗布層を架橋重合させて
製造する。ただし、ゲル形成液を支持体に塗布するに際
しては、電気泳動用媒体層と支持体との接着性を向上さ
せるために、予め支持体表面に接着層を設け、この上に
ゲル形成液を塗布し、ゲル化させる方法を利用すること
もできる。接着層の付設は、プラスチック製支持体シー
トを用いた際に特に有利となる。

ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合には、
ゲル形成液の上を更にカバーフィルム、シートまたは板
などの被覆材料でおおうことができる。この目的に使用
されるカバーフィルム等としては前記支持体と同様な素
材からなるものを用いることができる。この被覆材料の
厚さは３００ＩＬｍ以下であり、実用的に好ましい範囲
としては約４〜２００ＩＬｍである。

なお、本発明の電気泳動媒体を製造するに際して、カバ
ーフィルム等の上に電気泳動媒体を形成させたのち、そ
の上に支持体を付設する方法を利用することも可能であ
る。

本発明の電気泳動用媒体は、前述の諸文献等に記載の公
知の方法に従って、水平型および垂直型平板電気泳動法
、ディスク電気泳動泳動法等のいずれにも用いることが
できる。

電気泳動媒体層の製造に際してカバーフィルムが付設さ
れた電気泳動媒体は電気泳動に付されたのちカバーフィ
ルムを除き、あるいはカバーフィルムを除去することな
くオートラジオグラフィー処理性なうことにより、泳動
結果の解析が行なわれる。

次に本発明の実施例を示す。

［実施例１及び比較例１］ 表面を親水性にした厚さｌ　８０　ＪＬｍのポリエチレ
ンテレフタレート（ＰＥＴ）シート（支持体）の上に約
３００　ｇｍの厚さになるように第１表記載のゲル形成
液を塗布し、窒素雰囲気中で架橋重合させてポリアクリ
ルアミドゲル膜を製造した。

これにカッターを用いてサンプル注入口を形成した。次
に、表面を親水性にしたＰＥＴシート（カバーフィルム
、厚さ１００ｇｍ）をこのゲル膜の表面に置いて被覆し
、電気泳動媒体材料を得た。

３２　Ｐ　−Ｄ　Ｎ　Ａをマキサム・ギルバート分解し
て得た分析試料について、上記の電気泳動用媒体を用い
て塩基配列決定操作のための電気泳動およびオートラジ
オグラフィー処理を行なった。

試料番号１，２（本発明に従う試料）ではいずれも７０
個の塩基配列が解読されたが、これに対して、試料番号
３．４．５（比較試料）で解読された塩基配列は、それ
ぞれ６５個、６５個であった。

［実施例２及び比較例２］ 第２表に示したゲル形成液を用い実施例１と同様にして
電気泳動媒体材料を形成した。

「以下空白」 Ｍ−１３ｅｍｐ−１１・５ＳＤＮＡに対してジデオキシ
法を施して得た分析試料について、上記の電気泳動用媒
体を用いて塩基配列決定操作のための電気泳動およびオ
ートラジオグラフィー処理を行なった。

上記の試料番号６〜８（本発明に従う試料）ではいずれ
も９０個の塩基配列が解読されたが、これに対して、試
料番号９．１０．１１．１２（比較試料）で解読された
塩基配列は、それぞれ８２個、８２個、８２個、５３個
であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記一般式（１）および（２）のいずれかにより表
   わされる構成繰返し単位を有するメタクリルアミド系コ
   ポリマー： 一般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼ ［上式において、 Ｒ＾１＾１は、水素原子または１から６個の炭素原子を
   有するアルキル基であり； Ｑ＾１は−ＣＯＯ−、▲数式、化学式、表等があります
   ▼、または６から１０個の炭素原子を有するアリーレン
   基であり；Ｌ＾１は、−ＣＯＯ−あるいは▲数式、化学
   式、表等があります▼の結合のいずれかを少なくとも一
   個含み、かつ３から１５個の炭素原子を有する二価の基
   、または、−Ｏ−、▲数式、化学式、表等があります▼
   、−ＣＯ−、−ＳＯ−、 −ＳＯ＿２−、−ＳＯ＿３−、▲数式、化学式、表等が
   あります▼、 ▲数式、化学式、表等があります▼、あるいは▲数式、
   化学式、表等があります▼の結合のい ずれかを少なくとも一個含み、かつ１から１２個の炭素
   原子を有する二価の基（ただしＲ＾１＾１は前述と同義
   である）であり； Ｒ＾１＾２は−ＣＨ＝ＣＨ＿２又は−ＣＨ＿２ＣＨ＿２
   Ｘ＾１（ただし、Ｘ＾１は求核基により置換され得る基
   、あるいは塩基によってＨＸ＾１の形で脱離し得る基を
   表わす）のいずれかであり； Ａ＾１はその左側に示した各モノマー単位と共重合可能
   なエチレン性不飽和モノマーから誘導された二価の基で
   あり； ｘ＾１、ｙ＾１およびｚ＾１はモル百分率を表わし、ｘ
   ＾１は５０〜９９、ｙ＾１は１〜５０、ｚ＾１は残余の
   値をとる、ただしｚ＾１は０であってもよい］一般式（
   ２） ▲数式、化学式、表等があります▼ ［上式において、 Ｒ＾２＾１は水素原子または１から６個の炭素原子を有
   するアルキル基であり； Ｒ＾２＾２は−ＣＨ＝ＣＨ＿２又は−ＣＨ＿２ＣＨ＿２
   Ｘ＾２（ただし、Ｘ＾２は求核基により置換され得る基
   、あるいは塩基によってＨＸ＾２の形で脱離し得る基を
   表わす）であり； Ｌ＾２は、１から６個の炭素原子を有するアルキレン基
   、６から１２個の炭素原子を有するアリーレン基、−Ｃ
   ＯＺ＾２−で表わされる基、および−ＣＯＺ＾２Ｒ＾３
   ＾５−で表わされる基（ただし、Ｒ＾３＾５は１から６
   個の炭素原子を有するアルキレン基、あるいは６から１
   ２個の炭素原子を有するアリーレン基であり、そしてＺ
   ＾２は酸素原子あるいはＮＨである）から選ばれる二価
   の基であり；Ａ＾２はその左側に示した各モノマー単位
   と共重合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
   た二価の基であり； ｘ＾２、ｙ＾２およびｚ＾２はモル百分率を表わし、ｘ
   ＾２は５０〜９９、ｙ＾２は１〜５０、ｚ＾２は残余の
   値をとる、ただしｚ＾２は０であってもよい］とアクリ
   ルアミド系化合物とが水の存在下で架橋重合してなるポ
   リアクリルアミド系水性ゲル、および変性剤として少な
   くとも１個のカルバモイル基を有する化合物を含む電気
   泳動用媒体。 ２、上記ポリアクリルアミド系水性ゲルが、上記メタク
   リルアミド系コポリマーとアクリルアミド系化合物そし
   て更に架橋剤が水の存在下で架橋重合してなるものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の電気泳
   動用媒体。 ３、上記架橋剤が三官能性架橋剤であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第２項記載の電気泳動用媒体。 ４、さらに水溶性ポリマーおよびアガロースを含むこと
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の電気泳動用媒
   体。 ５、前記変性剤が尿素またはホルムアミドである特許請
   求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体。 ６、プラスチック材料製支持体に付設された形態にある
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項のい
   ずれかの項記載の電気泳動用媒体。