JPH0477868B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体に関するものであ
り、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決定
操作に用いるのに適した電気泳動用媒体に関する
ものである。 ［発明の背景］ ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。 従来のポリアクリルアミドゲル膜は、アクリル
アミドのような単量体を触媒の存在下にて、Ｎ，
N′−メチレンビスアクリルアミドのような二官
能性の架橋剤を用い架橋重合させることにより得
られている。なお、このDNA塩基配列決定のた
めの電気泳動媒体として用いるポリアクリルアミ
ドゲル膜の形成に際しては通常、尿素あるいはホ
ルムアミドのような変性剤を含有させる。 上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応が阻害されるため、ポリアク
リルアミドゲル膜は酸素を遮断した状態で作成す
る必要がある。この理由から、現在では一般に、
ポリアクリルアミドゲル膜は二枚のガラス板で形
成されたセル（一定の空間、たとえば約0.3〜１
mmを有する）の中にゲル形成液を注入させ、酸素
を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形成さ
せている。 以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動操作は、たとえば、次の
ようにして実施される。 ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだ
ままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行な
つたのち、ゲル膜上端部に設けられたサンプルス
ロツトに試料（たとえば、マキサム・ギルバート
分解した³²Pラベル化DNA）を一定量注入し、次
いで電気泳動を行なう。そして一定時間（例、約
６時間〜12時間）の電気泳動を行なつた後、片面
のガラス板を注意深く除去し、その露出面をポリ
塩化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグ
ラフイー処理を行なう。 すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆し
ているフイルムの上にＸ線フイルム、増感スクリ
ーンを順次のせて、低温（たとえば、−80℃）で
一定時間（たとえば、約10〜20時間）露光を行な
う。そして露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、
DNAの分離泳動パターンを読みとることからな
るオートラジオグラフイー処理により、DNAの
塩基配列を決定することができる。 上記のようにして製造した従来のポリアクリル
アミドゲル膜は非常に壊れやすいため、このよう
なポリアクリルアミドゲル膜を集中的に製造し
て、必要に応じて電気泳動操作担当者に供給する
ようなゲル膜製造・使用システムを実現すること
は実際に不可能であつた。 しかしながら、前述のように、近年では電気泳
動分析を利用したDNAの塩基配列決定操作が頻
繁に利用されるようになつており、これに応じて
ポリアクリルアミドゲル膜の需要も飛躍的に高ま
つている。従つて電気泳動の実施に適したポリア
クリルアミドゲル膜を短時間に多数製造、すなわ
ち大量生産し、それを電気泳動操作担当者に供給
するシステムの確立が望まれている。 ポリアクリルアミドゲル膜の大量生産を可能に
する一つの方法としては、長尺状のプラスチツク
フイルムを一定速度で連続的に移動させ、そのフ
イルム上に架橋重合しうるゲル形成液を塗布し、
不活性ガス中（例えば窒素）で塗布層をラジカル
重合させる方法が有効である。ただし、この方法
が効率良く実施されるためには、用いるゲル形成
液のゲル化速度が充分高い必要がある。しかしな
がら、従来においてポリアクリルアミドゲル膜の
製造に利用されてきた架橋剤はそのような要求を
充分満足させるということができない。 ［発明の目的］ 本発明の第一の目的は、DNAの電気泳動分析
に使用するのに適した電気泳動媒体を提供するこ
とにある。 本発明の第二の目的は、大量生産が可能な
DNAの電気泳動分析に適した電気泳動媒体を提
供することにある。 本発明の第三の目的は、保存、輸送等が容易な
軽量かつ壊れにくいDNAの電気泳動分析に適し
た電気泳動媒体を提供することにある。 ［発明の要旨］ 本発明は、アクリルアミド系化合物と三個以上
の反応性架橋基を有する架橋剤とが水の存在下で
架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲ
ル、および変性剤として少なくとも１個のカルバ
モイル基を有する化合物を含む電気泳動用媒体を
提供するものである。 また、本発明は、プラスチツク材料製支持体層
と、その上に積層されたアクリルアミド系化合物
と三個以上の架橋反応性基を有する架橋剤が水の
存在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
水性ゲルで、変性剤として少なくとも１個のカル
バモイル基を有する化合物を含有する電気泳動媒
体層とを含む電気泳動用媒体を提供するものであ
る。 本発明における電気泳動媒体もしくは電気泳動
媒体層を形成するためのポリアクリルアミド系水
性ゲル形成液、すなわち、アクリルアミド系化合
物と三個以上の架橋反応性基を有する架橋剤（す
なわち、架橋反応に寄与する反応性基が三個以上
ある架橋剤、例えば、公知の三官能性架橋剤）と
を含むゲル形成液は、水の存在下で架橋重合する
際の重合速度が顕著に速いため、電気泳動媒体の
工業的な生産に好適である。そして、特に長尺状
のプラスチツク材料製支持体を一定速度で連続的
に移動させて、その支持体上にゲル形成液を塗布
し、次いで不活性ガス中（例えば窒素）でラジカ
ル重合させる方法を利用する製造方法において製
造される電気泳動用媒体として本発明の電気泳動
用媒体は特に有効である。 本発明の電気泳動用媒体は大量生産により製造
することが可能で、保存、輸送等が容易な軽量か
つ壊れにくい電気泳動媒体であるため、ポリアク
リルアミドゲル膜（電気泳動媒体）を集中的に製
造し、必要に応じてDNA分析のための電気泳動
操作担当者に供給するようなゲル膜製造・使用シ
ステムの実現に極めて有効である。 ［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体は、支持体上で製造さ
れ、一般にその支持体に載置したまま、保存、輸
送および使用が行なわれる。ただし、製造時に用
いる支持体と保存、輸送時の支持体あるいは使用
時の支持体は必ずしも同一である必要はない。 本発明の電気泳動用媒体の支持体としては、ガ
ラス板、ポリマーコート紙、プラスチツクシート
などの任意の耐水性シート状支持体を用いること
ができる。ただし、本発明の電気泳動用媒体の利
点を生かすためには、支持体としてプラスチツク
シートを用いることが望ましい。電気泳動用媒体
のプラスチツクシート支持体としては各種のプラ
スチツクシートを用いることができる。好ましい
プラスチツクシートの例としては、親水性ポリマ
ーまたは公知の表面処理により表面を親水化した
ポリマー（例、ポリエチレンテレフタレート、ビ
スフエノールＡのポリカルボネート、ポリ塩化ビ
ニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマー、
ポリメチルメタアクリレート、ポリエチレン、ポ
リプロピレン、セルロースアセテート類、セルロ
ースアセテートプロピオネート等）のシート（フ
イルム、板状物も含む）等を挙げることができ
る。特に好ましい支持体はポリエチレンテレフタ
レートである。 次に電気泳動用媒体層（以下においてゲル媒体
層、ポリアクリルアミドゲル膜あるいは単にゲル
膜ともいう）について説明する。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
系化合物と架橋剤とを、水溶液または水分散液と
して水中に溶解または分散させてゲル形成液を調
製したのち、液中で両者を架橋重合させて架橋重
合した水性ゲル膜として形成することにより得る
ことができる。本明細書においては、特にことわ
らない限り、（水中に）溶解と（水中に）分散の
両者を含めて単に（水中に）溶解といい、水溶液
と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。ま
た溶媒または分散媒としては、所望により加えら
れる有機溶媒と水の混合物をも包含する。 本発明に用いることができるアクリルアミド系
化合物の例としては、アクリルアミド、Ｎ−メチ
ルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルア
ミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホ
モログや、メタクリルアミド系化合物、例えばメ
タクリルアミドがあげられ、これらの化合物は単
独で、あるいは二種以上を併用して用いることが
できる。これらのアクリルアミド系化合物のうち
ではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリ
ルアミドと他のアクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。 本発明では、架橋剤として三個以上の架橋反応
性基を有する化合物を用いる。本発明の電気泳動
用媒体の製造において用いられる三個以上の架橋
反応性基を有する架橋剤の例としては、トリアリ
ルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、
１，３，５−トリアクリロイルヘキサヒドロ−ｓ
−トリアジンなどの三官能性化合物が挙げること
ができる。更に「Electrophoresis」1981，２，
213−228等に記載の公知のＮ，N′−メチレンビ
スアクリルアミド等の二官能性架橋剤の一種また
は二種以上を併用してもよい。 架橋剤の量は、単量体（アクリルアミド系化合
物）と架橋剤の総重量に対して約１重量％から約
30重量％、好ましくは約３重量％から約10重量％
の範囲の量で用いることができる。 本発明の電気泳動用媒体の製造において用いら
れるポリアクリルアミドゲルのゲル濃度として
は、S.Hjerten：「Arch.Biochem.Biophys.」１
（Suppl.），147（1962）に記載の定義に従つて表示
して、単量体、架橋剤および水からなるゲル媒体
の容積に対して、単量体と架橋剤の量が約3w／
ｖ％から約30w／ｖ％の範囲が好ましく用いられ
る。 本発明のDNAの電気泳動分析に適した電気泳
動用媒体（ポリアクリルアミドゲル膜）には変性
剤が添加される。添加される変性剤としては、少
なくとも１個のカルバモイル基を持つ化合物を挙
げることができ、その具体例としては、尿素、ホ
ルムアミド等が挙げられる。これらのうちで尿素
が特に好ましく用いられる。変性剤の量は単量体
と架橋剤とを含む水性ゲルの容積に対し、約
40wt／ｖ％から約60wt／ｖ％の範囲で用いられ
る。尿素を用いる場合には、単量体と架橋剤を含
む水性ゲル１に対し約６モル（約360ｇ）から
飽和溶解量まで、好ましくは約７モル（約420ｇ）
から飽和溶解量までの範囲で用いることができ
る。 本発明の電気泳動用媒体層には、場合によつて
水溶性ポリマーが添加される。水溶性ポリマーと
しては、付加重合型または縮重合型の水溶性ポリ
マーを用いることができる。付加重合型ポリマー
の例としては、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、ポリアクリルアミド等の非イオン
性水溶性ポリマーが挙げられる。また縮重合型ポ
リマーの例としては、ポリエチレングリコール、
ポリプロピレングリコール等の非イオン性水溶性
ポリアルキレングリコールが挙げられる。これら
の水溶性ポリマーのうちでは、ポリアクリルアミ
ドとポリエチレングリコールが好ましい。水溶性
ポリマーの分子量は約１万から約100万の範囲の
ものが好ましい。水溶性ポリマーは単量体と架橋
剤の合計重量に対して、約２重量％から約100重
量％の範囲、そして好ましくは約５重量％から約
50重量％の範囲で用いられる。 水溶性ポリマーの添加によりポリアクリルアミ
ドゲル膜が可塑性を有するようになり、裁断加工
時に壊れることがなくなり、またゲル膜な乾燥時
にも可塑性を有するようになり、もろさが改良さ
れ壊れにくくなるとの利点がある。また、水溶性
ポリマーの分子量および添加量を選択することに
より、ゲル膜の粘度をコントロールすることもで
きる。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、さらに
アガロースを含有することが好ましい。アガロー
スとしては任意のものを使用することができ、低
電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロ
ースのいずれをも用いることができる。用いるこ
とができるアガロースの例としては、特開昭55−
5730号、特開昭55−110946号、特表昭57−502098
号等の各公報に開示のアガロース等がある。アガ
ロースは、単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積
に対して約0.2w／ｖ％から約2w／ｖ％、好まし
くは約0.3w／ｖ％から約1.2w／ｖ％の割合で用
いられる。 ポリアクリルアミドゲル膜がアガロースを含有
する場合には、ゲル形成液の温度を変化させるこ
とによつて適当な液粘度にコントロールすること
が可能となるため、その流動性を止めることがで
き、またゲル膜を成形する操作において成形しや
すくなるとの利点がある。 本発明の電気泳動用媒体層にはPH緩衝剤を含有
させることができる。緩衝剤としては、PH8.0か
ら10.0（好ましくはPH8.0から9.0）の範囲内のPH値
に緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して用い
ることができる。 用いうる緩衝剤としては、日本化学会編「化学
便覧 基礎編」（東京、丸善(株)1966年発行）1312
−1320ページ；青木、永井編「最新電気泳動法」
（東京、広川書店、1973年発行320−322ページ；
「Data for Biochemical Research」（R.M.C.
Dawson et al.編、第２版、Oxford at the
Clarendon Press，1969年発行）476−508頁；
「Biochemistry」５，467（1966）、「Analytical
Biochemistry」104，300−310（1980）等に記載
の緩衝剤が挙げられる。 緩衝剤の例としては、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（Tris）［CAS Registry No.
77−86−１］、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン（Bicine）、Ｎ−２−ヒドロキシ
エチルピペラジン−N′−２−ヒドロキシプロパ
ン−３−スルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−プ
ロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−［ト
リス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ
プロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩および、
これらのいずれかと必要により組合せられる酸、
アルカリまたは塩等をあげることができる。特に
好ましい緩衝剤の例としてはTris、ホウ酸およ
びEDTA・2Na塩の組合せ（PH8.3）がある。 また、本発明の電気泳動用媒体層には、湿潤剤
としてグリセリン、エチレングリコール等のポリ
オール化合物を含有させることもできる。ポリオ
ール化合物の含有量は、電気泳動用媒体層の容積
に対して約5w／ｖ％から約40w／ｖ％の範囲か
ら選ばれる。これらの化合物のうちではグリセリ
ンが特に好ましい。湿潤剤を配合することにより
ポリアクリルアミドゲル膜の保存時の極端な水分
の蒸発による乾燥を防ぐことが可能となり、また
極端な乾燥に起因するもろさの発生を防ぎ、ひび
われを防ぐ等のゲル膜の物性が改善されるとの利
点がある。 本発明の電気泳動用媒体層には、必要に応じて
抗酸化剤を含有させることができる。抗酸化剤と
しては、ポリアクリルアミドゲル膜に配合しうる
ことが知られている種々の化合物を用いることが
できる。抗酸化剤の例としては、ジチオスレイト
ール、２−メルカプトエタノールなどを挙げるこ
とができる。 本発明の電気泳動用媒体における電気泳動用媒
体層（ポリアクリルアミドゲル膜）の代表的なも
のは、上記のようにアクリルアミドに代表される
単量体、三官能性化合物（架橋剤）、水溶性ポリ
マー、およびアガロースなどを、実質的に均一な
水溶液中で単量体と架橋剤とをラジカル架橋重合
させて得られるものであり、単量体と架橋剤から
形成された三次元架橋重合体に水溶性ポリマーと
アガロースが実質的に分散されて、後二者のポリ
マー鎖と三次元架橋重合体とがからみあつて構造
を有すると推定される。 上記のラジカル架橋重合反応は分子状酸素の不
存在下で過酸化物の存在および／または紫外線照
射等公知の方法により発生させることができる。
さらに、この架橋重合反応は加熱または紫外線照
射により加速することもできる。 ラジカル架橋重合用触媒としては、
「Electrophoresis」1981，２，213−219，同
1981，２，220−228；青木、永井編「最新電気泳
動法」（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジ
カル重合開始剤のうちから適宜選択して用いるこ
とができる。好ましいラジカル重合開始剤の具体
例としては、β−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル（DMAPN）・ペルオクソ二硫酸アンモニウム
混合物、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレ
ンジアミン（TEMED）・ペルオクソ二硫酸アン
モニウム混合物、TEMED・リボフラビン混合
物、TEMED・リボフラビン・過酸化水素混合物
と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル
重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重
量に対して約0.3重量％から約５重量％、そして
好ましくは約0.5重量％から約３重量％の範囲で
ある。 本発明のポリアクリルアミドゲル膜は、平滑表
面を有する支持体の上にゲル形成液を公知の方法
により塗布して塗布層を設けたのち、その塗布層
を架橋重合させて電気泳動用媒体層として形成す
る。ただし、ゲル形成液を支持体に塗布するに際
しては、電気泳動用媒体層と支持体との接着性を
向上させるために、予め支持体表面に接着層を設
け、この上にゲル形成液を塗布し、ゲル化させる
方法を利用することもできる。このような接着層
の付設は、支持体としてプラスチツクシートを用
いた際に特に有利となる。すなわち、プラスチツ
クシート製支持体、接着層および電気泳動用媒体
層の三層構造からなる電気泳動用媒体は、その製
造、保存、輸送および電気泳動操作などにおいて
耐分離性が優れ、取り扱いが容易であるところか
ら、実用性に好ましい。 ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上を更にカバーフイルム、
シートまたは板などの被覆材料でおおうことがで
きる。この目的に使用されるカバーフイルム等と
しては前記支持体と同様な素材からなるものを用
いることができる。この被覆材料の厚さは300μm
以下であり、実用的に好ましい範囲としては約
4μm〜約200μm、特に好ましい範囲としては約
4μm〜約100μmである。 なお、本発明の電気泳動媒体を製造するに際し
て、カバーフイルム等の上に電気泳動媒体を形成
させたのち、その上に支持体を付設する方法を利
用することも可能である。 本発明の電気泳動用媒体は、前述の諸文献等に
記載の公知の方法に従つて、水平型および垂直型
平板電気泳動法、デイスク電気泳動泳動法等のい
ずれにも用いることができる。 電気泳動媒体層の製造際してカバーフイルムが
付設された電気泳動媒体は電気泳動に付されたの
ちカバーフイルムを除き、あるいはカバーフイル
ムを除去することなくオートラジオグラフイー処
理行なうことにより、泳動結果の解析が行なわれ
る。 本発明の電気泳動用媒体における電気泳動用媒
体層（ポリアクリルアミドゲル膜）は支持体との
接着性が高い（接着力が大きい）ため、通常の工
程においては電気泳動用媒体と支持体とは常に一
体として処理することができる。従つて、本発明
の電気泳動用媒体を用いることにより、従来の
DNA解析のための電気泳動操作において必要と
されていた複雑な操作工程の省略が可能になり、
また支持体上に電気泳動用媒体層（ポリアクリル
アミドゲル膜）をのせたままで、電気泳動操作お
よびオートラジオグラフイー操作などを実施する
ことが可能となる。 次に本発明の実施例を示す。 ［実施例 １］ 表面を親水性にした厚さ180μmのポリエチレン
テレフタレート（PET）シート（支持体）の上
に約500μmの厚さになるように、第１表記載のゲ
ル形成液にペルオクソ二硫酸アンモニウム66mg、
TEMED66μlリボフラビン燐酸エステル１mgを加
えたゲル形成液を塗布し、窒素雰囲気中で紫外線
を照射させゲル化させてポリアクリルアミドゲル
膜を形成させた。塗布した後、ゲル化するまでの
時間を25℃で測定してゲル化速度を求めた。

【表】

【表】 試料番号 １ ２ ３ ４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクリルアミド系化合物と三個以上の架橋反
   応性基を有する架橋剤とが水の存在下で架橋重合
   してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、および
   変性剤として少なくとも１個のカルバモイル基を
   有する化合物を含む電気泳動用媒体。 ２ 電気泳動用媒体がさらに水溶性ポリマーおよ
   びアガロースを含むことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の電気泳動用媒体。 ３ 前記変性剤が尿素またはホルムアミドである
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の電気泳
   動用媒体。 ４ プラスチツク材料製支持体層と、その上に積
   層されたアクリルアミド系化合物と三個以上の架
   橋反応性基を有する架橋剤が水の存在下で架橋重
   合してなるポリアクリルアミド系水性ゲルで、変
   性剤として少なくとも１個のカルバモイル基を有
   する化合物を含有する電気泳動媒体層とを含む電
   気泳動用媒体。 ５ 電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーお
   よびアガロースを含むことを特徴とする特許請求
   の範囲第４項記載の電気泳動用媒体。