JPH0471178B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

［発明の分野］ 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するもので
あり、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決
定操作に用いるのに適した電気泳動用媒体材料に
関するものである。 ［発明の背景］ ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
のような単量体を触媒の存在下にてＮ，N′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性の架
橋剤を用い架橋重合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際
して通常は、尿素あるいはホルムアミドのような
変性剤を含有させる。 上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応が阻害されるため、ポリアク
リルアミドゲル膜は酸素を遮断した状態で作成す
る必要がある。この理由から、現在では一般に、
ポリアクリルアミドゲル膜は２枚のガラス板で形
成されたセル（一定の空間、たとえば約0.3〜１
mmを有する）の中にゲル形成液を注入させ、酸素
を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形成さ
せている。 この方法は二枚のガラス板の間でゲル膜を形成
するために、取り扱い性が悪く、かつゲル膜の量
産化が困難であるといつた大きな欠点を有してい
る。 以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動操作は、たとえば、次の
ようにして実施される。 ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に狭んだ
ままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行な
つたのち、ゲル膜上端部に設けられたサンプルス
ロツトに試料（たとえば、マキサム・ギルバート
分解した³²Pラベル化DNA）を一定量注入し、次
いで電気泳動を行なう。そして一定時間（例、約
６時間〜12時間）の電気泳動を行なつた後、片面
のガラス板を注意深く除去し、その露出面をポリ
塩化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグ
ラフイー処理を行なう。 すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆し
ているフィルムと上にＸ線フイルム、増感スクリ
ーンを順次のせて、低温（たとえば、−80℃）で
一定時間（たとえば、約10〜20時間）露光を行な
う。そして露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、
DNAの分離泳動パターンを読みとることからな
るオートラジオグラフイー処理により、DNAの
塩基配列を決定することができる。 オートラジオグラフイー処理は以上のように長
時間を必要とするため、その迅速化が望まれ、更
に読みとりの高分解能化も望まれている。 従来のアクリルアミドゲル膜を用いた電気泳動
媒体材料は上記のようにガラス板を用いるために
取り扱い性に問題があり、しばしばガラスを割つ
たりして実験を失敗することがある。更に、オー
トラジオグラフイーに際し、上記のように片面の
ガラスを除く必要があり、この時にゲル膜を破損
したりする事もあり、この操作は非常に熟練を必
要とする。したがつて、この様な欠点を改良した
取り扱い性の良好なポリアクリルアミドゲル膜の
開発が熱望されている。 ［発明の要旨］ 本発明の目的は、ガラス板の代りにプラスチツ
クフイルム（あるいはシート）を支持体として用
い、かつ支持体と電気泳動用媒体層（ポリアクリ
ルアミドゲル膜）との間の接着性が向上した電気
泳動媒体材料を提供することにある。 本発明は、下記の各層が順次積層されてなる三
層構造を含む電気泳動用媒体材料からなるもので
ある： [] プラスチツク支持体層； [] セルロース誘導体を含有する接着層； および、 [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
水性ゲルで、変性剤として尿素またはホルムア
ミドをもつ化合物を含む電気泳動用媒体層。 本発明の電気泳動用媒体材料は、上記のように
支持体層と電気泳動用媒体層（ポリアクリルアミ
ドゲル膜）とをセルロース誘導体を含む接着層に
より接合してある三層構造を含むものであり、前
述の電気泳動後の電気泳動用媒体層の乾燥工程に
おける各種の操作によつてその三層構造が分離し
にくいため、電気泳動用媒体層の破損が発生する
ことは殆どなく、従つて濾紙などの補助支持具を
使用する必要がないとの利点がある。 さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平
に置いた支持体の上にセルロース誘導体を含む接
着層を形成し、次いで電気泳動用媒体層をその上
に形成する方法によつても製造することが可能で
あるため、電気泳動用媒体材料の量産化にも大き
く寄与するものである。 ［発明の詳細な記述］ 本発明の電気泳動用媒体材料の支持体は、プラ
スチツクシート（あるいはフイルム）を用いるこ
とが好ましい。このプラスチツク製シートとして
は、任意のプラスチツクから形成したものを用い
ることができる。好ましいプラスチツクシートの
例としては、親水性ポリマーまたは公知の表面処
理により表面を親水化したポリマー（例、ポリエ
チレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポリ
カルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン・塩化ビニルポリマー、ポリメチルメタアクリ
レート、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロ
ースアセテート類、セルロースアセテートプロピ
オネート等）のフイルム、板またはシート等の成
形物をあげることができる。特にポリエチレンテ
レフタフタレートから形成されたシートを用いる
ことが好ましい。 これらのポリマー成形物の表面を親水化するた
めの処理のためには、紫外線照射、グロー放電処
理、コロナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケ
ミカルエツチング、電解エツチング等の公知の方
法を適用することができる。 支持体は一般に厚さが、約50μｍ〜500μｍ、好
ましくは約70μｍ〜約30μｍのものが用いられる。 本発明において支持体の上にはセルロース誘導
体を含有する接着層が設けられる。セルロース誘
導体としては、ジアセチルセルロース、トリアセ
チルセルロース、ニトロセルロースなどが好まし
いが、他のセルロース誘導体も膜形成性である限
り用いることが可能である。これらのセルロース
誘導体は単独で使用しても、併用してもよい。ま
た、層形成成分の50重量％以内である限り他の高
分子物質や添加剤を含むことができる。このよう
な高分子物質および添加剤の例としては、ゼラチ
ン、デキストラン、ポリメチルメタクリレート、
ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリビニ
ルアルコール、ｐ−クロロフエノール、レゾルシ
ン、グリセリン、エチレングリコール等を挙げる
ことができる。 セルロース誘導体を含有する接着層はセルロー
ス誘導体を80重量％以上含むことが望ましく、特
に実質的にセルロース誘導体のみからなる層であ
ることが望ましい。また、この接着層は単一層で
あつても複合層であつてもよく、複合層の場合に
は、そのセルロース誘導体を含む層以外は他の重
合体層であつてもよい。そのような他の重合体層
の例としては、ゼラチン、ポリメチルメタクリレ
ート、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコー
ル、ポリ塩化ビニリデンなどからなる層を挙げる
ことができ、これらの重合体層はセルロース誘導
体を含む層の下側に設けることができる。 次に電気泳動用媒体層（以下において、ゲル媒
体層、ポリアクリルアミドゲル膜あるいは単にゲ
ル膜ともいう）について説明する。 ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
系化合物と架橋剤とを、水溶液または水分散液と
して水中に溶解または分解させてゲル形成液を調
製したのち、液中で両者を架橋重合させて架橋重
合した水性ゲル膜として形成することにより得る
ことができる。本明細書においては、特にことわ
らない限り、（水中に）溶解と（水中に）分散の
両者を含めて単に（水中に）溶解といい、水溶液
と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。ま
た、溶媒または分散媒として、所望により加えら
れる有機溶媒と水の混合物をも包含する。 ポリアクリルアミドゲル膜の形成に用いること
ができるアクリルアミド系化合物としては、アク
リルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ
−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメ
チル）アクリルアミド、ジアセトンアクリルアミ
ド等のアクリルアミド系化合物やメタクリルアミ
ドの様なメタクリルアミド系化合物が挙げられ、
これらの化合物は単独で、あるいは二種以上を併
用して用いることができる。これらのアクリルア
ミド系化合物のうちではアクリルアミドが最も好
ましく、またアクリルアミドと他のアクリルアミ
ド系化合物、メタクリルアミド系化合物の一種以
上の併用も好ましい。 架橋剤としては「Electrophoresis」1981、２、
220−228等に記載の公知の化合物（一種または二
種以上の組合せ）を用いることができる。架橋剤
の具体例としては、Ｎ，N′−メチレンビスアク
リルアミド（BIS）；Ｎ，N′−プロピレンビスア
クリルアミド（PBA）；ジ（アクリルアミドジメ
チル）エーテル（DAE）；１，２−ジアクリルア
ミドエチレングリコール（DEG）；エチレンウレ
アビスアクリルアミド（EUB）；エチレンジアク
リレート（EDA）；Ｎ，N′−ジアリルタータルジ
アミド（Ｎ，N′−diallyltartardiamide：
DATD）；およびＮ，N′−ビスアクリリルシスタ
ミン（Ｎ，N′−bisacrylylcystamine、BAC）等
の二官能性化合物が挙げられる。 架橋剤の量は、単量体と架橋剤の総重量に対し
て約2wt％から約30wt％、好ましくは約3wt％か
ら約10wt％の範囲で用いることができる。 ゲル濃度としては、S.Hjerten：「Arch.
Biochem.Biophys.」１（Suppl.）、147（1962）に
記載の定義に従つて表示して、単量体、架橋剤お
よび水からなるゲル膜の容積に対して、単量体と
架橋剤の量が約3w／ｖ％から約30w／ｖ％の範
囲で好ましく用いられる。 ポリアクリルアミドゲル膜に含有させる変性剤
としては、尿素またはホルムアミドが用いられ
る。これらのうちで尿素が特に好ましく用いられ
る。変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性ゲ
ルの容積に対し、約40wt／ｖ％から約60wt／ｖ
％の範囲で用いられる。尿素を用いる場合には、
単量体と架橋剤とを含む水性ゲル１に対し約６
モル（約360ｇ）から飽和溶解量まで、好ましく
は約７モル（約420ｇ）から飽和溶解量までの範
囲で用いることができる。 ポリアクリルアミドゲル膜には水溶性ポリマー
を含有させることができる。 水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮
重合型の水溶性ポリマーを用いることができる。
付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアク
リルアミド等の非イオン性水溶性ポリマーが挙げ
られる。縮重合型ポリマーの具体例としてポリエ
チレングリコール、ポリプロピレングリコール等
の非イオン性水溶性ポリアルキレングリコールが
挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は、約１万
から約100万の範囲のものが好ましい。これらの
水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコ
ール、ポリアクリルアミドが特に好ましい。 水溶性ポリマーは、単量体と架橋剤の合計重量
に対して約2wt％から約100wt％の範囲、好まし
くは約5wt％から約50wt％の範囲で用いられる。
水溶性ポリマーを添加することにより、ポリアク
リルアミドゲル膜は可塑性を有するようになるた
め、裁断加工時に壊れることがなくなり、またゲ
ル膜は乾燥時にも可塑性を有するようになり、も
ろさが改良され壊れにくくなるとの利点がある。
また、水溶性ポリマーの分子量および添加量を選
択することにより、ゲル膜の粘度をコントロール
することもできる。 ポリアクリルアミドゲル膜にはアガロースを含
有させることができる。アガロースは公知のアガ
ロースであれば特に制限はなく、低電気浸透性、
中電気浸透性、高電気浸透性アガロースのいずれ
をも用いることができる。用いることのできるア
ガロースの例としては特開昭55−5730号、特開昭
55−110946号、特表昭57−502098号等の公報に開
示されているアガロース等がある。 アガロースの添加量は、単量体と架橋剤とを含
むゲル組成液の容積に対して約0.2w／ｖ％から
約2w／ｔ％、好ましくは約0.3w／ｖ％から約
1.2w／ｖ％の割合で用いられる。ゲル膜にアガ
ロースを添加することにより、ゲル形成用溶液温
度を変化させることにより、適当な溶液粘度にコ
ントロールすることが可能となり、その流動性を
止めることができ、まだゲル膜の成形する時には
成形しやすくなるとの利点がある。 ポリアクリルアミドゲル膜にはPH緩衝剤を含有
させることができる。緩衝剤としては、PH8.0か
ら10.0、好ましくはPH8.0から9.0の範囲内のPH値
に緩衝できる緩衝剤であれば、いずれも用いるこ
とができる。用いうる緩衝剤としては、日本化学
会編『化学便覧 基礎編』（東京、丸善(株)1966年
発行）1312−1320頁；『Data for Biochemical
Research』（R.M.C.Dawson et al編 第２版、
Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ； 『Biochemistry』、５、467（1966）； 『Analytical Biochemistry』104、300−310
（1980）等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。
そして、その具体例としてはトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン（Tris）［CAS Registry
No77−86−１］、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）グリシン（Bicine）、Ｎ−２−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N′−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ
−２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−
プロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩等、Ｎ−
［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミ
ノプロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩および、
これらのいずれかと必要により組合せられる酸、
アルカリまたは塩等をあげることができる。特に
好ましい緩衝剤の例としてはTris、ホウ酸およ
びEDTA・2Na塩の組合せ（PH8.3）がある。 本発明においてポリアクリルアミドゲル膜はア
クリルアミドに代表される単量体、二官能性のア
リル（allyl）化合物またはアクリル化合物（架
橋剤）、水溶性ポリマー、およびアガロースを実
質的に均一に溶解させた水溶液中で単量体と架橋
剤とをラジカル架橋重合させて得られるものであ
り、単量体と架橋剤から形成された三次元架橋重
合体に水溶性ポリマーとアガロースが実質的に分
散されて、後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合
体とからみあつている構造を有すると推定され、
この構造が特徴をなすゲル媒体である。 上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の
不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線
照射等の公知の方法により発生させることができ
る。この反応を加熱および紫外線照射により加速
することもできる。 ラジカル架橋重合用触媒としては、「Electro
phoresis」1981、２、213−219、同1981、２、
220−228；青木、永井編「最新電気泳動法」
（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重
合開始剤のうちから適宜選択して用いることがで
きる。好ましいラジカル重合開始剤の具体例とし
ては、β−ジメチルアミノプロピオニトリル
（DMAPN）−ペルオクソ二硫酸アンモニウム混
合物、Ｎ，Ｎ，N′、N′−テロラメチルエチレン
ジアミン（TEMED）−ペルオクソ二硫酸アンモ
ニウム混合物、TEMED−リボフラビン混合物、
TEMED−リボフラビン−過酸化水素混合物と紫
外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合
開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約0.3重量％から約５重量％、そして好ま
しくは約0.5重量％から約３重量％の範囲である。 ゲル媒体層は、平滑表面を有する支持体の上に
設けられた前述の接着層の上にゲル形成液を公知
の方法により塗布して設けたのち、ゲル形成液を
架橋重合させることにより、層状に成形すること
ができる。 ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上をさらにカバーフイル
ム、シートまたは板などの被覆材料でおおうこと
ができる。この目的に使用されるカバーフイル
ム、シート、または板としては前記支持体と同様
な素材からなるものを用いることができる。この
被覆材料の厚さは300μｍ以下であり、実用的に
好ましい範囲としては約4μｍ〜約200μｍ、特に
好ましい範囲としては約4μｍ〜約100μｍである。 ポリアクリルアミドゲル膜には、必要に応じて
抗酸化剤などの他の添加剤を含有させることがで
きる。抗酸化剤としては、ゲル膜に配合しうるこ
とが知られている種々の化合物を用いることがで
きる。抗酸化剤の具体例としてはジチオスレイト
ール、２−メルカプトエタノールを挙げることが
できる。 その他の添加剤としては湿潤剤があり、ポリア
クリルアミドゲル膜にはグリセリン、エチレング
リコール等のポリオール化合物を含有させること
もできる。ポリオール化合物の含有量は、ゲル膜
の容積し対して約5w／ｖ％から約40w／ｖ％の
範囲から選ばれる。ポリオール化合物のうちでは
グリセリンが特に好ましい。湿潤剤を配合するこ
とによりゲル膜の保存時に極端な水分の蒸発によ
る乾燥を防ぐことが可能となり、また極端な乾燥
に起因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲ
ル膜の物性が改善されるとの利点がある。 本発明の電気泳動用媒体材料は、前述の諸文献
等に記載の公知の方法に従つて、水平型および垂
直型平板電気泳動法、デイスク電気泳動泳動法等
のいずれにも用いることができる。 以下に本発明の実施例を記載するが、これらは
本発明の範囲を限定するものではない。 実施例 １ 紫外線照射処理により表面を親水性にした厚さ
180μｍのポリエチレンテレフタレート（PET）
シート（支持体）上に約0.5μｍの厚み（固形分）
になるように第１表記載のセルロース誘導体をア
セトンに溶解して得た塗布液を塗布し、約110℃
で乾燥してセルロース誘導体接着層を形成した。

【表】 まず、PETシート（支持体）と接着層との間
の接着性をクロスカツト法により評価した。その
結果、試料１〜３（本発明に従う試料）は接着性
が良好であつた。 支持体上に設けられた各接着層の上に、アクリ
ルアミド11.87ｇ、BIS630mg、尿素42ｇ、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン［CAS
Registry No 77−86−１］1.08ｇ、ホウ酸0.55
ｇ、およびEDTA・2Na塩93mgを含有する100ml
の溶液に重合開始剤としてペルオクソ二硫酸アン
モニウム（５重量％）1.3ml、TEMED33μlを加
けたものを0.5mmの厚みで成形し、ポリアクリル
アミドゲル膜の形成させた。 なお、別にセルロース誘導体接着層を設けなか
つた以外は同様にしてPETシート上にポリアク
リルアミドゲル膜を形成させて比較試料を調製し
た。 得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体
間の接着性を評価した。その結果、試料１〜３
（本発明に従う試料）を接着層としたものは接着
性が優れていたが、比較試料は接着性が劣つてい
た。 実施例 ２ 実施例１の第１表と同じセルロース誘導体接着
層が形成されたPETシートを作成し、この接着
層の上にアクリルアミド11.87ｇ、BIS630mg、ア
ガロース1600（和光純薬(株)製）0.3ｇポリアクリル
アミド2.5ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇおよびEDTA・
2Na塩93mgからなる100mlの溶液に重合開始剤と
して過流酸アンモニウム（５重量％）1.3ml、
TEMEDE33μlを加えたものを0.5mmの厚みで整形
し、ポリアクリルアミドゲル膜を形成させて三種
類の試料（試料１〜３）を得た。 また、PETシートの上に直接上記のポリアク
リルアミドゲル膜を形成させることにより比較試
料も調製した。 このゲル膜を使用して、³²P−DNAをマキサ
ム・ギルバート分解した試料について電気泳動に
かけ、DNA塩基配列決定の実験を行なつた。電
気泳動後にゲル膜を、脱尿素とDNA固定のため
に、10％酢酸水溶液中に１時間浸漬した。このゲ
ル膜を乾燥し、次いでオートラジオグラフイー処
理を常法にしたがつて行なつた。 10％酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持
体のゲル膜の接着状態を観察した。 比較試料のゲル膜は支持体から完全に剥離し
た。 一方、試料１〜３（本発明に従う試料）のセル
ロース誘導体を含む接着層の上に形成されたゲル
膜は、いずれも支持体上に完全に接着していた。
更にゲル膜を乾燥させた後、それと支持体との間
の接着状態を観察したところ、これらの試料のゲ
ル膜はいずれも支持体によく接着していた。また
オートラジオグラフイー処理した後も、接着性に
問題はなく良好な結果を示した。 実施例 ３ 実施例１の第１表と同じセルロース誘導体接着
層が形成されたPETシートを作成し、この接着
層の上に実施例２と同様にしてポリアクリルアミ
ドゲル膜を形成させて三種類の試料（試料１〜
３）を得た。 またPETシートの上に直接上記のポリアクリ
ルアミドゲル膜を形成させることにより比較試料
も調製した。 このゲル膜を支持体ごと裁断加工したのち、ゲ
ル膜の切口を観察したところ、比較試料の接着層
の上に形成されたゲル膜についてはゲル膜の剥離
が一部観察されたのに対して、試料１〜３（本発
明に従う試料）についてはいずれも裁断口の接着
性は良好で、支持体ごとに裁断加工できることが
わかつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の各層が順次積層されてなる三層構造を
   含む電気泳動用媒体材料： [] プラスチツク支持体層； [] セルロース誘導体を含有する接着層； および、 [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
   在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
   水性ゲルで、変性剤として尿素またはホルムア
   ミドを含む電気泳動用媒体層。 ２ 上記媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびア
   ガロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲
   第１項記載の電気泳動用媒体材料。 ３ 支持体層がプラスチツクシートからなること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
   項記載の電気泳動用媒体材料。 ４ プラスチツクシートがポリエチレンテレフタ
   レートからなることを特徴とする特許請求の範囲
   第３項記載の電気泳動用媒体材料。 ５ セルロース誘導体を含有する接着層が、実質
   的にセルロース誘導体のみからなる層であること
   特徴とする特許請求の範囲第１項記載の電気泳動
   用媒体材料。 ６ セルロース誘導体が、ジアセチルセルロー
   ス、トリアセチルセルロースおよびニトロセルロ
   ースからなる群より選ばれたものであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第５項記
   載の電気泳動用媒体材料。