JPS60194349A - 電気泳動用媒体材料 - Google Patents

電気泳動用媒体材料

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JPS60194349A
JPS60194349A JP59050294A JP5029484A JPS60194349A JP S60194349 A JPS60194349 A JP S60194349A JP 59050294 A JP59050294 A JP 59050294A JP 5029484 A JP5029484 A JP 5029484A JP S60194349 A JPS60194349 A JP S60194349A
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JP59050294A
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Masashi Ogawa
雅司 小川
Masakazu Hashiue
梯上 雅和
Yuzo Mizobuchi
溝淵 裕三
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Fujifilm Holdings Corp
Original Assignee
Fuji Photo Film Co Ltd
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44747Composition of gel or of carrier mixture

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [発明の分野] 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するものであり、さ
らに詳しくは、特にDNAの塩基配列決定操作に用いる
のに適した電気泳動用媒体材料に関するものである。
U発明の背景コ ボストラベル法に基づ<DNAやRNAの塩基配列決定
法においては、ポリアクリルアミドゲル膜を用いたスラ
ブ電気泳動操作が必須の操作となっている。特に近年に
おいて遺伝子関連の研究が進むにつれて、DNA塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。
ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミドのような
単量体を触媒の存在下にてN、N’−メチレンビスアク
リルアミドのような二官能性の架橋剤を用い架橋重合さ
せることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際して通
常は、尿素あるいはポルムアミドのような変性剤を含有
させる。
上記の重合図応はラジカル架橋重合であり、酸素の影響
により反応が阻害されるため、ポリアクリルアミドゲル
膜は酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この理
由から、現在では一般に、ポリアクリルアミドゲル膜は
2枚のガラス板で形成されたセル(一定の空間、たとえ
ば約0.3〜1mmを有する)の中にゲル形成液を注入
させ、酸素を遮断した状態で架橋重合させてゲル膜を形
成させている。
この方法は二枚のガラス板の間でゲル膜を形成するため
に、取り扱い性が悪く、かつゲル膜の量産化が困難であ
るといった大きな欠点を有している。
以上のようにして形成したポリアクリルアミドゲル膜を
用いる電気泳動操作は、たとえば、次のようにして実施
される。
ポリアクリルアミドゲル膜はガラス板に挟んだままの状
態で垂直に立てられ、前電気泳動を行なったのち、ゲル
膜上端部に設けられたサンプルスロットに試料(たどえ
ば、マキサム・ギルバート分解した32Fラベル化DN
A)を一定量注入し、次いで電気泳動を行なう。そして
一定時間(例、約6時間〜12時間)の電気泳動を行な
った後、片面のガラス板を注意深く除去し、その露出面
をポリ塩化ビニリデンフィルムなどの合成樹脂製フィル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグラフィ
ー処理を行なう。
すなわち、ポリアクリルアミドゲル膜を被覆しているフ
ィルムの上にX線フィルム、増感スクリーンを順次のせ
て、低温(たとえば、−80℃)で一定時間(たとえば
、約10〜20時間)露光を行なう。そして露光終了後
、X線フィルムを現像し、DNAの分離泳動パターンを
読みとることからなるオートラジオグラフィー処理によ
り、DNAの塩基配列を決定することができる。
オートラジオグラフィー処理は以上のように長時間を必
要とするため、その迅速化が望まれ、更に読みとりの高
分解能化も望まれている。
従来のアクリルアミドゲル膜を用いた電気泳動媒体材料
は上記のようにガラス板を用いるために取り扱い性に問
題があり、しばしばガラスを割ったりして実験を失敗す
ることがある。更に、オートラジオグラフィーに際し、
上記のように片面のガラスを除く必要があり、この時に
ゲル膜を破損したりする事もあり、この操作は非常に熟
練を必要とする。したがって、この様な欠点を改良した
取り扱い性の良好なポリアクリルアミドゲル膜の開発が
熱望されている。
[発明の要旨] 本発明の目的は、ガラス板の代りにプラスチックフィル
ム(あるいはシート)を支持体として用い、かつ支持体
と電気泳動用媒体層(ポリアクリルアミドゲル膜)との
間の接着性が向上した電気泳動媒体材料を提供すること
にある。
本発明は、下記の各層が順次積層されてなる三層構造を
含む電気泳動用媒体材料からなるものである: [I]プラスチック支持体層; [II]支持体層に蒸着された非導電性の金属酸化物層
;および、 [団]アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下で
架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲルで、変
性剤として少なくとも1個のカルバモイル基をもつ化合
物を含む電気泳動用媒体層。
本発明の電気泳動用媒体材料は、上記のように支持体層
と電気泳動用媒体層(ポリアクリルアミドゲル1lI)
とを接着層として機能する特定の金属酸化物により接合
してなる三層構造を含むものであり、前述の電気泳動後
の電気泳動用媒体層の乾燥工程における各種の操作によ
ってもその三層構造が分離しにくいため、電気泳動用媒
体層の破損が発生することは殆どなく、従って濾紙など
の補助支持具を使用する必要がないとの利点がある。
さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平に置いた
支持体の上に金属酸化物を形成し、次いで電気泳動用媒
体層をその上に形成する方法によっても製造することが
可能であるため、電気泳動用媒体材料の量産化にも大き
く寄与するものである。
[発明の詳細な記述] 本発明の電気泳動用媒体材料の支持体は、プラスチック
シート(あるいはフィルム)を用いることが好ましい。
このプラスチック製シートとしては、任意のプラスチッ
クから形成したものを用いることができる。好ましいプ
ラスチックシートの例としては、親木性ポリマーまたは
公知の表面処理により表面を親水化したポリマー(例、
ポリエチレンテレフタレート、ビスフェノールAのポリ
カルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデン・塩化
ビニルコポリマー、ポリメチルメタアクリレート、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、セルロースアセテート類、
セルロースアセテートプロピオネート等)のフィルム、
板またはシート等の成形物をあげることができる。特に
ポリエチレンテレフタフタレートから形成されたシート
を用いることが好ましい。
これらのポリマー成形物の表面を親水化するための処理
のためには、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電
処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング、電
解エツチング等の公知の方法を適用することができる。
支持体は一般に厚さが、約50pm〜約500ルm、好
ましくは約70ルm〜約300pmのものが用いられる
本発明において支持体の上には接着層として機能する非
導電性の金属酸化物層を蒸着により形成される。用いう
ろことのできる金属酸化物は非導電性である限り特に制
限はないが、たとえば、5502、Tie□、MgO,
AJlzOs、BeO,ZrO2、WO2およびTa2
o3を挙げることができる。好ましい金属酸化物として
はS i02とTiO2を挙げることができる。金属酸
化物をプラスチック支持体表面に蒸着する方法としては
、たとえば、電子ビーム法、スパッタリング法を利用す
ることができる。これらの蒸着法は既に一般的に利用さ
れている技術を適用できるので、ここで特に触れること
はしない。
蒸着層の厚さは約0.05pmから約3pm、好ましく
は約0.1μmから約2pLmの範囲である。
なお、蒸着層は必要に応じてビニルシランのよ蒸着層の
上にカップリング剤を塗布する処理)してもよい。
次に電気泳動用媒体層(以下において、ゲル媒体層、ポ
リアクリルアミドゲル膜あるいは単にゲル膜ともいう)
について説明する。
ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド系化合物
と架橋剤とを、水溶液または水分散液として水中に溶解
または分散させてゲル形成液を調製したのち、液中で両
者を架橋重合させて架橋重合した水性ゲル膜として形成
することにより得ることができる。本明細書においては
、特にことわらない限り、(水中に)溶解と(水中に)
分散の両者を含めて単に(水中に)溶解といい、水溶液
と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。また、溶
媒または分散媒として、所望により加えられる有機溶媒
と水の混合物をも包含する。
ポリアクリルアミドゲル膜の形成に用いることができる
アクリルアミド系化合物としては、アクリルアミド、N
−メチルアクリルアミド、N、Nチル)アクリルアミド
、ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミド系化合
物やメタクリルアミドの様なメタクリルアミド系化合物
が挙げられ、これらの化合物は単独で、あるいは二種以
上を併用して用いることができる。これらのアクリルア
ミド系化合物のうちではアクリルアミドが最も好ましく
、またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物、
メタクリルアミド系化合物の一種以上の併用も好ましい
架橋剤としてはr EIectrophoresisJ
 19B1.2゜220−228等に記載の公知の化合
物(一種または二種以上の組合せ)を用いることができ
る。架橋剤の具体例としては、N、N’−メチレンビス
アクリルアミド(BIS);N、N’−プロピレンビス
アクリルアミド(PBA)、ジ(アクリルアミドジメチ
ル)エーテル(DAE)、1.2−ジアクリルアミドエ
チレングリコール(DEC)、エチレンウレアビスアク
リルアミド(EUB)、エチレンジアクリレ−1(ED
A) ;N、N’−ジアリルタータルジアミド(N、N
’−diallyltartardiaIIlide 
: D A T D ) ;およびN、N’−ビスアク
リリルシスタミン(N、N’−bisacrylylc
ystamine。
BAC)等の二官能性化合物が挙げられる。
架橋剤の量は、単量体と架橋剤の総重量に対して約2w
t%から約30wt%、好ましくは約3wt%から約1
0wt%の範囲で用いることができる。
ゲル濃度としては、S、 Hjerten: r Ar
ch。
Biochem、 Biophys、 J I (5u
pp1. )、 147(19B2)に記載の定義に従
って表示して、単量体、架橋剤および水からなるゲル膜
の容積に対して、単量体と架橋剤の量が約3 w / 
v%から約30 w / v%の範囲で好ましく用いら
れる。
ポリアクリルアミドゲル膜に含有させる変性剤としては
、少なくとも1個のカルバモイル基を持つ化合物を挙げ
ることができ、その具体例としては、尿素、ホルムアミ
ド等が挙げられる。これらのうちで尿素が特に好ましく
用いられる。変性剤の量は単″量体と架橋剤とを含む水
性ゲルの容積に対し、約40 w t / V%から約
60 w t / v%の範囲で用いられる。尿素を用
いる場合には、単量体と架橋剤とを含む水性ゲル1見に
対し約6モル(約360 g)から飽和溶解量まで、好
ましくは約7モル(約420g)から飽和溶解量までの
範囲で用いることができる。
ポリアクリルアミドゲル膜には水溶性ポリマーを含有さ
せることができる。
水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮重合型の
水溶性ポリマーを用いることができる。
付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等
の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。縮重合型ポ
リマーの具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアルキレ
ングリコールが挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は
、約1万から約100万の範囲のものが好ましい。これ
らの水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリルアミドが特に好ましい。
素広惜ポリマーt−1−蛍薔葎ン馨旙翔1の合計舌長に
対して約2wt%から約100wt%の範囲、好ましく
は約5wt%から約50wt%の範囲で用いられる。水
溶性ポリマーを誹加することにより、ポリアクリルアミ
ドゲル膜は可塑性を有するようになるため、裁断加工時
に壊れることがなくなり、またゲル膜は乾燥時にも可塑
性を有するようになり、もろさが改良され壊れにくくな
るとの利点がある。また、水溶性ポリマーの分子量およ
び添加量を選択することにより、ゲル膜の粘度をコント
ロールすることもできる。
ポリアクリルアミドゲル膜にはアガロースを含有させる
ことができる。アガロースは公知のアガロースであれば
特に制限はなく、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気
浸透性アガロースのいずれをも用いることができる。用
いることのできるアガロースの例としては特開昭55−
5730号、特開昭55−110946号、特表昭57
−502098号等の公報に開示されているアガロース
等がある。
アガロースの添加量は、単量体と架橋剤とを含むゲル組
成液の容積に対して約0.2w/v%から約2w/v%
、好iしくは約0.3w/v%から約1 、.2 w 
/ v%の割合で用いられる。ゲル膜にアガロースを添
加することにより、ゲル形成用溶液温度を変化させるこ
とにより、適当な溶液粘度にコントロールすることが可
能となり、その流動性を止めることができ、またゲル膜
を成形する時には成形しやすくなるとの利点がある。
ポリアクリルアミドゲル膜にはPH緩衝剤を含有させる
ことができる。緩衝剤としては、pH8,0から1O0
0、好ましくはPH8,0から9.0の範囲内のpH値
に緩衝できる緩衝剤であれば、いずれをも用いることが
できる。用いうる緩衝剤としては、日本化学会編r化学
便覧 基礎編j (東京、丸蓋■1886年発行) 1
312−1320頁;rData for Bioch
emical Re5earch J (R,H,C。
Dawson et at fi 第2版、 0xfo
rd at the C1arendon Press
、1888年発行) 47B−508ページ;r Bi
ochemistry j 、 54B?(19θθ)
;rAnalytical Biochemistry
 J 104300−310(1980)等の刊行物に
記載の緩衝剤があげられる。そして、その具体例として
はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris
) [CAS Registry N。
77−H−1] 、N 、 N−ビス(2−ヒドロキシ
エチル)グリシン(Bicine) 、N −2−ヒド
ロキシエチルピペラジン−N’−2−ヒドロキシプロパ
ン−3−スルホン酸のNa塩またはに塩等、N−2−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−No−3−プロパンスルホ
ン酸のNa塩またはに塩等、N−[トリス(ヒドロキシ
メチル)メチル]−3−アミノプロパンスルホン酸のN
a塩またはに塩および、これらのいずれかと必要により
組合せられる酸、アルカリまたは塩等をあげることがで
きる。
特に好ましい緩衝剤の例としてはTris、ホウ酸およ
びEDTA−2Na塩の組合せ(pH8−3)がある。
本発明においてポリアクリルアミドゲル膜はアクリルア
ミドに代表される単量体、二官能性のアリル(ally
l )化合物またはアクリル化合物(架橋剤)、水溶性
ポリマー、およびアガロースを実質的に均一に溶解させ
た水溶液中で単量体と架橋剤とをラジカル架橋重合させ
て得られるものであり、単量体と架橋剤から形成された
三次元架橋重合体に水溶性ポリマーとアガロースが実質
的に分散されて、後二者のポリマー鎖が三次元架橋重合
体とからみあっている構造を有すると推定され、この構
造が特徴をなすゲル媒体である。
上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の不存在下
で過酸化物の存在および/または紫外線照射等の公知の
方法により発生させることができる。この反応を加熱お
よび紫外線照射により加速することもできる。
ラジカル架橋重合用触媒としては、r Electr。
phoresis J 1981.2.213−219
.同11181. ?、220−228 、青水、水弁
編「最新電気泳動法J (11373年発行)等に記載
の公知の低温ラジカル重合開始剤のうちから適宜選択し
て用いることができる。
好ましいラジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジ
メチルアミノプロピオニトリル(DMA PN)−ベル
オクソニ硫酸アンモニウム混合物、N、N、N’ 、N
’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED) ”
<ルオクソニ硫酸アンモニウム混合物、TEMED−リ
ボフラビン混合物、TEMED−リボフラビン−過酸化
水素混合物と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジ
カル重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量
に対して約0.3重量%から約5重量%、そして好まし
くは約0.5重量%から約3重量%の範囲である。
ゲル媒体層は、平滑表面を有する支持体の上に設けられ
た前述の接着層(金属酸化物層)の上にゲル形成液を公
知の方法により塗布して設けたのち、ゲル形成液を架橋
重合させることにより、層状に成形することができる。
ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合には、
ゲル形成液の上をさらにカバーフィルム、シートまたは
板などの被覆材料でおおうことができる。この目的に使
用されるカバーフィルム、シート、または板としては前
記支持体と同様な素材からなるものを用いることができ
る。この被覆材料の厚さは300 gm以下であり、実
用的に好ましい範囲としては約471m〜約200pm
、特に好ましい範囲としては約41Lm〜約1100p
である。
ポリアクリルアミドゲル膜には、必要に応じて抗酸化剤
などの他の添加剤を含有させることができる。抗酸化剤
としては、ゲル膜に配合しうることが知られている種々
の化合物を用いることができる。抗酸化剤の具体例とし
てはジチオスレイトール、2−メルカプトエタノールを
挙げることができる。
その他の添加剤としては湿潤剤があり、ポリアクリルア
ミドゲル膜にはグリセリン、エチレングリコール等のポ
リオール化合物を含有させることもできる。ポリオール
化合物の含有量は、ゲル膜の容積に対して約5w/v%
から約40w/v%の範囲から選ばれる。ポリオール化
合物のうちではグリセリンが特に好ましい。湿潤剤を配
合することによりゲル膜の保存時の極端な水分の蒸発に
よる乾燥を防ぐことが可能となり、また極端な乾燥に起
因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル膜の物性
が改善されるとの利点がある。
本発明の電気泳動用ル媒体材料は、前述の諸文献等に記
載の公知の方法に従って、水平型および垂直型平板電気
泳動法、ディスク電気泳動泳動法等のいずれにも用いる
ことができる。
以下に本発明の実施例を記載するが、これらは亀 本発明の範囲を限定するものではない。
[実施例1] 紫外線照射処理により表面を親水性にした厚さ1807
imの無色透明ポリエチレンテレフタレート(PET)
シート(支持体)上に電子ビーム蒸着機で5i02ペレ
ツトを用いて5i02蒸着膜厚が約0.5pmになるよ
うに5i02を蒸着させた。この膜厚は水晶振動式膜厚
ヘッドモニターを用いて測定した。
支持体上に設けられたS i02蒸着層の上に、次いで
、アクリルアミド11.87g、BIS630 m g
、尿素42g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタ
ン[CA S Registry No、 77−88
−1 ] 1 、08 g、ホウ酸0.55gおよびE
DTA−2Na塩93 m gを含有する100m1の
溶液に重合開始剤としてベルオクソニ硫酸アンモニウム
(5wt%)1.3ml、TEMED33p−1を加え
たものを0.5mmの厚みで成形し、ポリアクリルアミ
ドゲル膜を得た。このゲルBりにサンプル注入口を形成
し、次いでゲル膜に厚さiooルmのPETシー・ト(
カバーシート)をかぶせた。
このポリアクリルアミドゲル膜を使用して、ηP−DN
Aをマキサム・ギルバート分解した試料を電気泳動にか
け、DNA塩基配列決定の実験を行なった。電気泳動後
に、ゲル膜を−go’cでオートラジオグラフィー処理
を常法に従って行なった。
上記のポリアクリルアミドゲル膜は、電気泳動後そのま
まの形態でオートラジオグラフィー処理が可能であり、
かつ操作性がすぐれていた。
また、オートラジオグラフィー処理を行なった結果、通
常のガラス板を利用して調製したポリアクリルアミドゲ
ル膜と同等の性能を示すことが確認された。
[実施例2] 支持体表面のSiO□蒸着層の厚さを約1.OILmと
した以外は実施例1と同様にして、その支持体上にポリ
アクリルアミドゲル膜を形成した。
このポリアクリルアミドゲル膜を使用して、実施例1と
同様にして32P−DNAをマキサム−ギルバート分解
した試料を電気泳動にかけ、DNA塩基配列決定の実験
を行なった。
上記のポリアクリルアミドゲル膜は、電気泳動後そのま
まの形態でオートラジオグラフィー処理が可能であり、
かつ操作性がすぐれていた。
また、オートラジオグラフィー処理を行なった結果、通
常のガラス板を利用して調製したゲル膜と同等の性能を
示すことが確認された。
特許出願人 富士写真フィルム株式会社代 理 人 弁
理士 柳 川 泰 男

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 l。下記の各層が順次積層されてなる三層構造を含9電
    気泳動用媒体材料: [I]プラスチック支持体層; [II]支持体層に蒸着された非導電性の金属酸化物層
    ;および、 [1[]アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下
    で架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲルで、
    変性剤として少なくと゛も1個のカルバモイル基をもつ
    化合物を含む電気泳動用媒体層。 2゜」二記媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびアガロ
    ースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項記載
    の電気泳動用媒体材料。 3゜上記変性剤が尿素またはポルムアミドである特許請
    求の範囲第1項または第2項記載の電気泳動用媒体材料
    。 4゜支持体層がプラスチックシートからなることを特徴
    とする特許請求の範囲第1項もしくは第2項記載の電気
    泳動用媒体材料。 5゜プラスチックシートがポリエチレンテレフタレート
    からなることを特徴とする特許請求の範囲第4項記載の
    電気泳動用媒体材料。 6゜金属酸化物が、5i02、TiO2、MgO1Af
    L203、Bed、ZrO2、WO2およびTa2O3
    からなる群より選ばれたものであることを特徴とする特
    許請求の範囲第1項記載の電気泳動用媒体材料。 7゜金属酸化物が、5i02とTiO□からなる群より
    選ばれたものであることを特徴とする特許請求の範囲第
    6項記載の電気泳動用媒体材料。 8゜金属酸化物層がビニルシランで処理されていること
    を特徴とする特許請求の範囲第1項記載の電気泳動用媒
    体材料。
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