JPH0244393B2

JPH0244393B2 -

Info

Publication number: JPH0244393B2
Application number: JP58087967A
Authority: JP
Inventors: Masashi Ogawa; Hisashi Shiraishi; Tetsupei Ikeda
Original assignee: KAGAKU GIJUTSUCHO
Current assignee: KAGAKU GIJUTSUCHO
Priority date: 1983-05-19
Filing date: 1983-05-19
Publication date: 1990-10-03
Also published as: EP0126639A3; EP0126639B1; US4579783A; DE3470957D1; EP0126639A2; JPS59212753A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、電気泳動用媒体材料に関するもので
あり、さらに詳しくは、特にDNAの塩基配列決
定操作において用いられる水性ゲル電気泳動用媒
体材料として適した電気泳動用媒体材料に関する
ものである。ポストラベル法に基づくDNAやRNAの塩基配
列決定法においては、ポリアクリルアミドゲル膜
を用いたスラブ電気泳動操作が必須の操作となつ
ている。特に近年において遺伝子関連の研究が進
むにつれて、DNA塩基配列決定の操作の迅速化
が急務となつている。ポリアクリルアミドゲル膜は、アクリルアミド
のような単量体を触媒の存在下にてＮ，N′−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性の架
橋剤を用い架橋重合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際
して通常は、尿素あるいはホルムアミドのような
変性剤を含有させる。上記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸
素の影響により反応が阻害されるため、ゲル膜は
酸素を遮断した状態で作成する必要がある。この
理由から、現在では一般に、ポリアクリルアミド
ゲル膜は２枚のガラス板で形成されたセル（一定
の空間、たとえば0.3mm〜１mmを有する）の中に
ゲル形成液を注入させ、酸素を遮断した状態で架
橋重合させてゲル膜を形成させている。この方法は２枚のガラス板の間でゲル膜を形成
するために、取り扱い性が悪く、かつ量産化が困
難であるといつた大きな欠点を有している。以上のようにして形成したポリアクリルアミド
ゲル膜を用いる電気泳動は、たとえば、次のよう
にして実施される。ポリアクリルアミドゲル膜は、ガラス板に挟ん
だままの状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行
なつたのち、サンプルスロツトに試料（マキサ
ム・ギルバート分解した ³²Pラベル化DNA）を
一定量注入し、電気泳動を行なう。そして、一定
時間（例、約６時間〜12時間）の電気泳動を行な
つた後、片面のガラス板を注意深く除去し、ポリ
塩化ビニリデンフイルムなどの合成樹脂製フイル
ムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグ
ラフイー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被覆
しているフイルムの上にＸ線フイルム、増感紙を
順次のせて、低温（たとえば、−80℃）で一定時
間（たとえば、約10〜20時間）露光を行なう。そ
して露光終了後、Ｘ線フイルムを現像し、DNA
の分離泳動パターンを読みとることにより、
DNAの塩基配列を決定することができる。オートラジオグラフイー処理は以上のように長
時間を必要とするとめ、その迅速化が望まれ、更
に読みとりの高分解能化も望まれている。高分解能化を達成する手段としては、オートラ
ジオグラフイー処理に際してゲル膜を乾燥状態と
する方法が知られている。すなわち、電気泳動終
了後にゲル膜を10％酢酸水溶液中に浸漬して、
DNAを固定化しつつ尿素などの変性剤を除去す
る。ガラス板とゲル膜の接着力は極めて弱いか、
または実質的に接着力がないため、この浸漬工程
において、ゲル膜はガラス板から剥離し、液中に
浮遊する。このゲル膜を注意深く取出し、濾紙上
にのせた後、減圧下で乾燥することにより濾紙上
に固定する。このようにして乾燥したゲル膜を使
つてオートラジオグラフイー処理を実施した場合
には分解能が大きく上昇する。しかし、上記のよ
うなゲル膜の分離および乾燥工程は、ゲル膜が極
めてもろいため、高度の熟練と注意を必要とし、
また、実際にこの工程においてゲル膜の破損が発
生することも多い。そこで本発明の目的は、湿潤状態でのゲル膜と
支持体との接着性を高く（接着力を大きく）する
ための接着層形成用の塗布液を提供し、さらにゲ
ル膜の脱変性剤（尿素等）処理後の乾燥工程にお
いても、支持体から剥離しないゲル膜を提供する
ことにある。本発明者は、以上のような従来使用
されている電気泳動用媒体材料の欠点の克服を目
的として鋭意研究を行なつた結果、本発明に到達
した。本発明は、 [] 支持体層； [] 特定の一般式により表わされる構成繰返し
単位を有するポリマーを含有する接着層；および、 [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
水性ゲル、および変性剤として尿素またはホル
ムアミドを含む電気泳動用媒体層、が順次積層されてなる三層構造を含む電気泳動用
媒体材料にある。本発明の電気泳動用媒体材料は上記のように支
持体層と電気泳動用媒体層とを特定の接着層によ
り接合してなる三層構造を含むものであり、前述
の電気泳動用媒体層（ゲル膜）の乾燥工程におけ
る各種の操作によつても、その三層構造が分離し
にくいため、電気泳動用媒体層の破損が発生する
ことは殆どなく、また濾紙などを使用する必要が
ない。さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は水平に
置いた支持体の上に接着層を形成し、次いで電気
泳動用媒体層をその上に形成する方法によつても
製造することが可能であるため、電気泳動用媒体
材料の量産化にも大きく寄与するものである。次に本発明を詳しく説明する。本発明の電気泳動用媒体材料の支持体として
は、ガラス板、紙あるいは各種のプラスチツク製
シートなどを用いることができるが、本発明によ
る利点を生かすためには、支持体としてプラスチ
ツク製シートを用いることが好ましい。このプラ
スチツク製シートとしては、任意のプラスチツク
から形成したものを用いることができるが、特に
ポリエチレンテレフタレートから形成されたシー
トを用いることが好ましい。本発明において支持体の上には接着層が形成さ
れる。接着層は、下記の一般式(1)乃至(3)のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するポリマー
を含有する層である。一般式(1) ［一般式(1)において、 R¹¹は水素原子または１から６個の炭素原子を
有するアルキル基である； Q¹は−COO−、

【式】または６から10個の炭素原子を有するアリーレン基、 L¹は、−COO−あるいは

【式】の結合のいずれかを少なくとも１個含み、かつ３から15個の
炭素原子を有する二価の基、または、−Ｏ−、

【式】−CO−、−SO−、−SO₂−、−SO₃−、

【式】

【式】あるいは

【式】の結合のいずれかを少なくとも１個含み、かつ１
から12個の炭素原子を有する二価の基である（た
だしR¹¹は前述と同義である）； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹のいずれ
かである（ただし、X¹は求核基により置換され
る基、あるいは塩基によつてHX¹の形で脱離し
うる基を表わす）； A¹はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基である； x¹、y¹およびz¹はモル百分率を表わし、x¹は０
〜99、y¹は１〜99、z¹は１〜99の値をとる］上記の一般式(1)において、 R¹¹の例にはメチル基、エチル基、ブチル基、
ｎ−ヘキシル基が含まれる。 Q¹の例には次のような基が含まれる。 −COO−、−CONH、

【式】

【式】【式】

【式】

【式】 L¹の例には次のような基が含まれる。なお、
これらの二価の基の一般式（）における結合の
方向は、Q¹とSO₂との結合が可能なかぎり、いず
れの方向をもとることができる。 −CH₂COOCH₂− −CH₂COOCH₂CH₂− −CH₂CH₂COOCH₂− （−CH₂）−₅COOCH₂CH₂− （−CH₂）−₁₀COOCH₂CH₂− −CH₂NHCOCH₂− −CH₂NHCOCH₂CH₂− （−CH₂）−₃NHCOCH₂CH₂− （−CH₂）−₅NHCOCH₂CH₂− （−CH₂）−₁₀NHCOCH₂CH₂− −CH₂OCH₂− −CH₂CH₂OCH₂CH₂CH₂−

【式】

【式】 −COCH₂CH₂− −CH₂COCH₂CH₂−

【式】 −SOCH₂CH₂− −CH₂SOCH₂CH₂− −SO₂CH₂CH₂− −SO₂CH₂CH₂SO₂CH₂CH₂− −SO₃CH₂COOCH₂CH₂− −SO₃CH₂CH₂COOCH₂CH₂− −SO₂NHCH₂COOCH₂CH₂− −SO₂NHCH₂CH₂COOCH₂CH₂− −NHCONHCH₂CH₂− −CH₂NHCONHCH₂CH₂− −NHCOOCH₂CH₂− −CH₂NHCOOCH₂CH₂− R¹²は前記のように、−CH＝CH₂あるいは−
CH₂CH₂X¹のいずれかであるが、この−X¹の例
には、次のような基が含まれる。ハロゲン原子（塩素、臭素など）；ヒドロキシ
ル基；アルキルスルホニルオキシ（例、メチルス
ルホニルオキシ

【式】エチルスルホニルオキシ、プロピルスルホニルオキシなど）；ア
リールスルホニルオキシ（例、フエニルスルホニ
ルオキシ

【式】ｐ−トリルスルホニルオキシなど）；アルキルカルボニルオキシ（例、
アセトキシ、プロピオニルオキシ、トルフルオロ
メチルカルボニルオキシ、ジクロロメチルカルボ
ニルオキシなど）従つて、R¹²の例には、次のような基が含まれ
る。 −CH＝CH₂、−CH₂CH₂Cl、 −CH₂CH₂Br、 −CH₂CH₂OH、 −CH₂CH₂OOCCH₃、 −CH₂CH₂OOCCF₃、 −CH₂CH₂OOCCHCl₃、 A¹で表わされる二価の基の例としては、下記
のようなエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た基を挙げることができる。エチレン、プロピレン、１−ブテン、イソブテ
ン、スチレン、クロロメチルスチレン、ヒドロキ
シメチルスチレン、ビニルベンゼンスルホン酸ナ
トリウム、ビニルベンジルスルホン酸ナトリウ
ム、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−ビニルベンジ
ルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ
−ベンジル−Ｎ−ビニルベンジルアンモニウムク
ロリド、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、
４−ビニルピリジン、２−ビニルピリジン、ベン
ジルビニルピリジニウムクロリド、Ｎ−ビニルア
セトアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、１−ビニル
−２−メチルイミダゾール、脂肪族酸のモノエチ
レン性不飽和エステル（例えば酢酸ビニル、酢酸
アリル）、エチレン性不飽和のモノカルボン酸も
しくはジカルボン酸およびその塩（例えばアクリ
ル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、
アクリル酸ナトリウム、アクリル酸カリウム、メ
タクリル酸ナトリウム）、無水マレイン酸、エチ
レン性不飽和のモノカルボン酸もしくはジカルボ
ン酸のエステル（例えばｎ−ブチルアクリレー
ト、ｎ−ヘキシルアクリレート、ヒドロキシエチ
ルアクリレート、シアノエチルアクリレート、
（ジエチルアミノ）エチルアクリレート、メチル
メタクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ベ
ンジルメタクリレート、ヒドロキシエチルメタク
リレート、クロロエチルメタクリレート、メトキ
シエチルメタクリレート、（ジエチルアミノ）エ
チルメタクリレート、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチル−
Ｎ−メタクリロイルオキシエチルアンモニウムｐ
−トルエンスルホナート、Ｎ，Ｎ−ジエチル−Ｎ
−メチル−Ｎ−メタクリロイルオキシエチルアン
モニウムｐ−トルエンスルホナート、イタコン酸
ジメチル、マレイン酸モノベンジルエステル）、
エチレン性不飽和のモノカルボン酸もしくはジカ
ルボン酸のアミド（例えばＮ，Ｎ−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ
−［（ジメチルアミノ）プロピル］アクリルアミ
ド、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｎ−（アクリロイ
ルプロピル）アンモニウム、ｐ−トルエンスルホ
ナート、２−アクリルアミド−２−メチルプロパ
ンスルホン酸ナトリウム、アクリロイルモルホリ
ン、メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
N′−アクリロイルプロパンジアミンプロピオナ
ートベタイン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−N′−メタク
リロイルプロパンジアミンアセテートベタイン。また本発明の重合体を架橋されたラテツクスと
して用いる場合には、A¹として、上記のエチレ
ン性不飽和モノマーから誘導された基のほかに、
少なくとも共重合可能なエチレン性不飽和基を２
個以上もつモノマー（例えばジビニルベンゼン、
メチレンビスアクリルアミド、エチレングリコー
ルジアクリレート、トリメチレングリコールジア
クリレート、エチレングリコールジメタクリレー
ト、トリメチレングリコールジメタクリレート、
ネオペンチルグリコールジメタクリレート等）か
ら誘導された基を用いることができる。一般式(2) ［一般式(2)において、 R²¹は水素原子または１から６個の炭素原子を
有するアルキル基である； R²²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²である
（ただし、X²は求核基によつて置換されうる基、
または塩基によつてHX²の形で脱離しうる基を
表わす）； L²は、１から６個の炭素原子を有するアルキ
レン基（例、メチレン、エチレン、イソブチレ
ン）、６から12個の炭素原子を有するアリーレン
基（例、フエニレン、トリレン、ナフタレン）、−
COZ²−で表わされる基、および−COZ²R²³−で
表わされる基（ただし、R²³は１から６個の炭素
原子を有するアルキレン基、あるいは６から12個
の炭素原子を有するアリーレン基であり、そして
Z²は酸素原子あるいはNHである）から選ばれる
二価の基である； A²はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基である； x²、y²およびz²はモル百分率を表わし、x²は０
〜99、y²は１〜99、z²は１〜99の値をとる］なお、上記一般式(2)のR²¹、R²²、およびA²の
例には、それぞれ前記一般式(1)のR¹¹、R¹²およ
びA¹と同じ例が含まれる。一般式(3) ［一般式(3)において、 R³¹は水素原子、または１から６個の炭素原子
を有するアルキル基である； L³は１から20個の炭素原子を有する二価の連
結基（さらに好ましくは、−CONH−又は−CO
−結合のうち少なくとも一つを含む炭素数１〜２
の二価の基）である； X³は活性エステル基である； A³はその左側に示した各モノマー単位と共重
合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導され
た二価の基である； x³、y³およびz³はモル百分率を表わし、x³は０
〜99、y³は１〜99、z³は１〜99の値をとる；ｍは０あるいは１である］上記一般式(3)のR³¹およびA³にはそれぞれ、前
記一般式(1)のR¹¹およびA¹の例と同じものが含ま
れる。一般式(3)のL³には次のような基が含まれる。−
COCH₂− −COCH₂CH₂OCOCH₂CH₂− −CONHCH₂− −CONHCH₂CH₂− −CONHCH₂CH₂CH₂− −CONHCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂− −CONHCH₂CONHCH₂− −CONHCH₂CONHCH₂CONHCH₂− −CONHCH₂NHCOCH₂CH₂CH₂SCH₂CH₂− −CONHCH₂OCOCH₂CH₂−など一般式(3)のX³には次のような基が含まれる。

【式】

【式】 −COOCH₂CN −COOCH₂COOC₂H₅ −COOCH₂CONH₂ −COOCH₂COCH₃ −COOCH₂COOCH＝CH₂ −COON＝CHCH₃ −COON＝Ｃ（CH₃）₂ −COOCH₂CH₂Br −COOCH₂CH₂CN 以下に、上記の一般式(1)乃至(3)のいずれかによ
り表わされる構成繰返し単位を有するポリマーの
合成に用いることができる代表的なビニルスルホ
ニル基あるいはその前駆体となる官能基を有する
エチレン性不飽和モノマーの合成法を具体的に示
す。合成例１２−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロ
ピオニルオキシ］エチルアクリレートの合成反応容器にテトラヒドロフラン600ml、ヒドロ
キシエチルアクリレート45.8ｇおよび３−（２−
クロロエチルスルホニル）プロピオン酸クロリド
72ｇを加え、氷水により冷却しながら、５℃以下
で、ピリジン31.2ｇをテトラヒドロフラン100ml
に溶解したものを1.75時間で滴下した。その後室
温で２時間撹拌を続け、反応試料を2.5の氷水
中に注ぎ込み、クロロホルム300mlにより４回抽
出した。有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥後、
濃縮して、２−［３−（２−クロロエチルスルホニ
ル）プロピオニルオキシ］エチルアクリレート87
ｇを得た（収率88％）。合成例２Ｎ−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロ
パンアミドメチル］アクリルアミドの合成２の反応容器に蒸留水1400ml、亜硫酸ナトリ
ウム244ｇおよび炭酸水素ナトリウム220ｇを加
え、撹拌して溶解させた後、氷水により冷却しな
がら約５℃で、クロロエタンスルホニルクロリド
260ｇを1.5時間で滴下した。その後49％硫酸160
ｇを約15分で滴下し、５℃で１時間ほど撹拌を続
けて、析出した結晶を濾過した後、結晶を400ml
の蒸留水で洗浄し、濾液と洗浄液とを一緒にして
３の反応容器に入れた。その中にメチレンビス
アクリルアミド246ｇを蒸留水480ml、エタノール
1480mlに溶解させたものを、氷冷しながら約５℃
で、30分間で滴下した後、全体を冷蔵庫に５日間
放置して反応を完結させた。析出した結晶を濾取
した後、冷却した蒸留水800mlで洗浄し、2000
の50％エタノール水溶液から再結晶して、219ｇ
のモノマーを得た。収率は49％であつた。（分析
結果、Ｈ：5.17、Ｃ：37.90、Ｎ：9.48、Cl：
12.58）合成例３［３−（２−クロロエチルスルホニル）プロパ
ンアミド］メチルスチレンの合成反応容器にテトラヒドロフラン100ml、ビニル
ベンジルアミン20.1ｇ、トリエチルアミン16.7ｇ
およびヒドロキノン0.1ｇを入れ、氷水により冷
却しながらβ−クロロエチルスルホニルプロピオ
ン酸クロリド36.1ｇを200mlのテトラヒドロフラ
ンに溶解させたものを30分で滴下した。その後室
温で一夜放置し、反応試料を濃硫酸16.5ｇを氷水
1.5で希釈した溶液中に注ぎ込み、生成する沈
澱を濾取した。この沈澱をエタノール200ml、水
200mlの混合溶媒から再結晶することにより、
26.8ｇの［３−（２−クロロエチルスルホニル）
プロパンアミド］メチルスチレンを得た。収率は
57％であつた。（分析結果、Ｈ：5.74、Ｃ：
53.47、Ｎ：4.83、Cl：10.99、Ｓ：10.49）合成例４１−［２−（４−ビニルフエニルスルホニル）エ
チルスルホニル］−３−（２−クロロエチル）ス
ルホニル−２−プロパノールの合成反応容器に１，３−ビス（２−クロロエチル）
スルホニル−２−プロパノール157ｇ（特開昭53
−57257公報に開示の方法により合成した化合
物）、メタノール１および蒸留水１を加え、
46℃に加熱しながらビニルベンゼンスルフイン酸
カリウム52ｇをメタノール100mlと蒸留水100mlに
溶解させたものを１時間で滴下した。その後46℃
に保つたまま5.5時間撹拌を続け、生成する沈澱
を濾取して55ｇの１−［２−（４−ビニルフエニル
スルホニル）エチルスルホニル］−３−（２−クロ
ロエチル）スルホニル−２−プロパノールを得
た。収率は49％であつた。（分析結果、Ｈ：4.67、
Ｃ：39.89、Ｓ：21.43）本発明のゲル媒体を形成するために好ましいポ
リマーとして、次に示す構成繰返し単位を有する
ポリマーを挙げることができる。ここで、ｘ、ｙ、ｚはモル百分率であり、Ｒと
R′は下記の置換基を示す。Ｐ−１ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｒ＝COO CH₂CH₂OCO CH₂CH₂SO₂CH＝CH₂ R′＝CONHC（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−２ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH＝CH₂ R′＝CONHC（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−３ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 Ｒ＝CONHCH₂NHCOCH₂CH₂SO₂CH₂CH₂Cl R′＝CONHC（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−４ｘ＝80、ｙ＝８、ｚ＝12 R′＝CONHCH₂OH Ｐ−５ｘ＝70、ｙ＝５、ｚ＝25 R′＝CON（CH₃）₂ Ｐ−６ｘ＝70、ｙ＝５、ｚ＝25 R′＝CON（CH₃）₂ Ｐ−７ｘ＝50、ｙ＝５、ｚ＝45 次に前記ポリマーのうちでも特に好ましいポリ
マーであるＰ−１、Ｐ−３の合成例を示す。合成例５コポリ−２−［３−（ビニルスルホニル）プロピ
オニルオキシ］エチルアクリレート−アクリル
アミド−Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オキソ
ブチル）アクリルアミド（Ｐ−１）の合成反応容器にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド80
ml、２−［３−（２−クロロエチルスルホニル）プ
ロピオニルオキシ］エチルアクリレート14.5ｇ、
アクリルアミド34.5ｇ、Ｎ−（１，１−ジメチル
−３−オキソブチル）アクリルアミド12.3ｇを入
れ、窒素ガスで脱気後、60℃に加熱して２，2′−
アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）
［CAS Registry No.4419−11−８］0.40ｇを加
え、２時間加熱撹拌を続けた。その後さらに２，
2′−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリ
ル）0.20ｇを加え、22時間加熱、撹拌を続けた
後、５℃に冷却して炭酸ナトリウム12ｇ、トリエ
チルアミン4.9ｇを加え、１時間撹拌を行なつた。
さらに室温で１時間撹拌を続けた後、反応試料を
セルロースチユーブに入れて２日間透析し、凍結
乾燥によつて56ｇの白色ポリマー（前記Ｐ−１に
該当）を得た（収率95％）。このコポリマーのビ
ニルスルホニル基含量は0.8×10^-3当量／ｇであ
つた。合成例６コポリ−Ｎ−（［３−（ビニルスルホニル）プロ
パンアミド］メチル）アクリルアミド−アクリ
ルアミド−Ｎ−（１，１−ジメチル−３−オキ
ソブチル）アクリルアミド（Ｐ−３）の合成 500mlの反応容器に、合成例２で得られたモノ
マー10.3ｇ、アクリルアミド25.9ｇ、Ｎ−（１，
１−ジメチル−３−オキソブチル）アクリルアミ
ド9.3ｇ、50％メタノール水溶液160mlを加え、撹
拌しながら60℃に加熱し、２，2′−アゾビス
（２，４−ジメチルバレロニトリル）0.2ｇを加
え、さらに30分後にも同じものを0.2ｇ加えて、
１時間加熱撹拌を続けた。反応試料をセルロース
チユーブに入れて２日間透析し、凍結乾燥によつ
て41ｇの白色ポリマー（前記Ｐ−３に該当）を得
た（収率90％）。このコポリマーのビニルスルホ
ニル基含量は0.7×10^-3当量／ｇであつた。次に本発明のゲル媒体層について述べる。本発明において、アクリルアミド系化合物と架
橋剤は、水溶液または水分散液として水中に溶解
または分散させておき、水中で両者を架橋重合さ
せて、架橋重合した水性ゲル媒体層を形成する。
本明細書においては、特にことわらない限り、
（水中に）溶解と（水中に）分散の両者を含めて
単に（水中に）溶解といい、水溶液と水分散液の
両者を含めて単に水溶液という。また、溶媒また
は分散媒として、所望により加えられる有機溶媒
と水との混合物をも包含する。本発明の媒体層の形成に用いることができるア
クリルアミド系化合物としては、アクリルアミ
ド、Ｎ−メチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアクリルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）ア
クリルアミド、ジアセトンアクリルアミド等のア
クリルアミド系化合物が挙げられ、これらの化合
物は単独で、あるいは二種以上を併用して用いる
ことができる。これらのアクリルアミド系化合物
のうちではアクリルアミドが最も好ましく、また
アクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の
一種以上の併用も好ましい。架橋剤としては「Electrophoresis」1981、２、
212−228等に記載の公知の化合物（一種または二
種以上の組合せ）を用いることができる。架橋剤
の具体例としては、Ｎ，N′−メチレンビスアク
リルアミド（BIS）；Ｎ，N′−プロピレンビスア
クリルアミド（PBA）；ジ（アクリルアミドジメ
チル）エーテル（DAE）；１，２−ジアクリルア
ミドエチレングリコール（DEG）；エチレンウレ
アビスアクリルアミド（EUB）；エチレンジアク
リレート（EDA）；Ｎ，N′−ジアリルタータルジ
アミド（Ｎ，N′−diallyltartar diamide：
DATD）；Ｎ，N′−ビスアクリリルシスタミン
（Ｎ，N′−bisacrylylcystamine、BAC）等の二
官能性化合物が挙げられる。架橋剤の量は、単量体と架橋剤の総重量に対し
て約2wt％から約30wt％、好ましくは約3wt％か
ら約10wt％の範囲で用いることができる。ゲル濃度としては、S.Hjerten：「Arch.
Biochem.Biophys.」１（Suppl.）、147（1962）に
記載の定義に従つて表示して、単量体、架橋剤お
よび水からなるゲル媒体の容積に対して、単量体
と架橋剤の量が約3w／ｖ％から約30w／ｖ％の
範囲で好ましく用いられる。変性剤としては、尿素、ホルムアミド等が挙げ
られる。これらのうちで尿素が特に好ましく用い
られる。変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水
性ゲルの容積に対し、約40wt／ｖ％から約
60wt／ｖ％の範囲で用いられる。尿素を用いる
場合には、単量体と架橋剤とを含む水性ゲル媒体
１に対し約６モル（約360ｇ）から飽和溶解量
まで、好ましくは約７モル（約420ｇ）から飽和
溶解量までの範囲で用いることができる。本発明において、ポリアクリルアミド系水性ゲ
ル媒体層には、水溶性ポリマーを含有させること
ができる。水溶性ポリマーとしては、付加重合型または縮
重合型の水溶性ポリマーを用いることができる。
付加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアク
リルアミド等の非イオン性不溶性ポリマーが挙げ
られる。縮重合型ポリマーの具体例としてポリエ
チレングリコール、ポリプロピレングリコール等
の非イオン性水溶性ポリアルキレングリコールが
挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は、約１万
から約100万の範囲のものが好ましい。これらの
水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコ
ール、ポリアクリルアミドが特に好ましい。水溶性ポリマーは、単量体と架橋剤の合計重量
に対して約2wt％から約100wt％の範囲、好まし
くは約5wt％から約50wt％の範囲で用いられる。本発明においては、水溶性ポリマーを添加する
ことにより、ゲル媒体層は可塑性を有するように
なり、裁断加工時に壊れることがなくなり、また
ゲル媒体層は乾燥時にも可塑性を有するようにな
り、もろさが改良され壊れにくくなるとの利点が
ある。また、水溶性ポリマーの分子量および添加
量を選択することにより、ゲル媒体の粘度をコン
トロールすることもできる。本発明において、ゲル媒体層にはアガロースを
含有させることができる。アガロースは、公知の
アガロースであれば特に制限はなく、低電気浸透
性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロースのい
ずれをも用いることができる。用いることのでき
るアガロースの例としては特開昭55−5730号、特
開昭55−110946号、特表昭57−502098号等の公報
に開示されているアガロース等がある。アガロースの添加量は、単量体と架橋剤とを含
むゲル組成後の容積に対して約0.2w／ｖ％から
約2w／ｖ％、好ましくは約0.3w／ｖ％から約
1.2w／ｖ％の割合で用いられる。本発明においては、ゲル媒体層にアガロースが
添加されているため、ゲル形成用溶液温度を変化
させることにより、適当な溶液粘度にコントロー
ルすることが可能となり、その流動性を止めるこ
とができ、またゲル媒体層を成形する時には成形
しやすくなるとの利点がある。本発明のゲル媒体層にはPH緩衝剤を含有させる
ことができる。緩衝剤としては、PH8.0から10.0、
好ましくはPH8.0から9.0の範囲内のPH値に緩衝で
きる緩衝剤であれば、いずれをも用いることがで
きる。用いうる緩衝剤としては、日本化学会編
『化学便覧基礎編』（東京、丸善(株)（1966年発
行）1312−1320ページ；『Data for Biochemical
Research』（R.M.C.Dawson et al編第２版、
Oxford at the Clarendon Press、1969年発行）
476−508ページ；『Biochemistry』、５、467
（1966）；『Analytical Biochemistry』104、300
−310（1980）等の刊行物に記載の緩衝剤があげら
れる。そして、その具体例としてはトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタン（Tris）［CAS
Registry No 77−86−１］、Ｎ，Ｎ−ビス（２−
ヒドロキシエチル）グリシン（Bicine）、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−２−ヒド
ロキシプロパン−３−スルホン酸のNa塩または
Ｋ塩等、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
N′−３−プロパンスルホン酸のNa塩またはＫ塩
等、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−
３−アミノプロパンスルホン酸のNa塩またはＫ
塩および、これらのいずれかと必要により組合せ
られる酸、アルカリまたは塩等をあげることがで
きる。特に好ましい緩衝剤の例としては、Tris、
ホウ酸およびEDTA・2Na塩の組合せ（PH8.3）
がある。本発明においてゲル媒体層はアクリルアミドに
代表される単量体、二官能性のアリル（allyl）
化合物またはアクリル化合物（架橋剤）、水溶性
ポリマー、およびアガロースを実質的に均一に溶
解させた水溶液中で単量体と架橋剤とをラジカル
架橋重合させて得られるものであり、単量体と架
橋剤から形成された三次元架橋重合体に水溶性ポ
リマーとアガロースが実質的に分散されて、後二
者のポリマー鎖が三次元架橋重合体とからみあつ
ている構造を有すると推定され、この構造が特徴
をなすゲル媒体層である。上記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の
不存在下で過酸化物の存在および／または紫外線
照射等の公知の方法により発生させることができ
る。この反応を加熱および紫外線照射により加速
することもできる。ラジカル架橋重合用触媒としては、「Electro
phoresis」1981、２、236−219、同1981、２、
220−228；青木、永井編「最新電気泳動法」
（1973年発行）等に記載の公知の低温ラジカル重
合開始剤のうちから適宜選択して用いることがで
きる。好ましいラジカル重合開始剤の具体例とし
ては、β−ジメチルアミノプロピオニトリル
（DMAPN）−ペルオクソ二硫酸アンモニウム混
合物、Ｎ，Ｎ，N′，N′−テトラメチルエチレン
ジアミン（TEMED）−ペルオクソ二硫酸アンモ
ニウム混合物、TEMED−リボフラビン混合物、
TEMED−リボフラビン−過酸化水素混合物と紫
外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル重合
開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約0.3重量％から約５重量％、そして好ま
しくは約0.5重量％から約３重量％の範囲である。本発明においてゲル媒体層は、平滑な親水性表
面を有する電気絶縁性支持体の上に設けられた前
述の接着層の上にゲル形成液を公知の方法により
塗布して設けたのち、ゲル形成液を架橋重合させ
ることにより、ゲル層に成形することができる。支持体については前述したが、さらに具体的に
は、ガラス板、親水性ポリマーまたは公知の表面
処理により表面を親水化したポリマー（例、ポリ
エチレンテレフタレート、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリ塩化ビニル、塩化ビニリデ
ン・塩化ビニルコポリマー、ポリメチルメタアク
リレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、セル
ロースアセテート類、セルロースアセテートプロ
ピオネート等）のフイルム、板またはシート等の
成形物をあげることができる。これらのポリマー
成形物の表面を親水化するための処理としては、
紫外線照射、グロー放電処理、コロナ放電処理、
火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング、電
解エツチング等の公知の方法を適用することがで
きる。ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場
合には、ゲル形成液の上をさらにカバーフイル
ム、シートまたは板などの被覆材料でおおうこと
ができる。この目的に使用されるカバーフイル
ム、シート、または板としては前記支持体と同様
な素材からなるものを用いることができる。この
被覆材料の厚さは300μｍ以下であり、実用的に
好ましい範囲としては約4μｍ〜約200μｍである。被覆材料が厚い（例えば、約70μｍ〜約300μ
ｍ）場合には、被覆材料の上にゲル形成液を塗布
し、架橋重合によりゲル媒体層を形成し、その後
に本発明の接着層を設けた支持体をラミネートし
て三層構造を形成する方法を利用することもでき
る。ゲル媒体層には、必要に応じて抗酸化剤を含有
させることができる。抗酸化剤としては、ゲル電
気泳動媒体に配合しうることが知られている種々
の化合物を用いることができる。抗酸化剤の具体
例としては、ジチオスレイトール、２−メルカプ
トエタノールを挙げることができる。その他の添加剤としては湿潤剤があり、ゲル媒
体層にはグリセリン、エチレングリコール等のポ
リオール化合物を含有させることもできる。ポリ
オール化合物の含有量は、ゲル媒体の容積に対し
て約5w／ｖ％から約40w／ｖ％の範囲から選ば
れる。ポリオール化合物のうちではグリセリンが
特に好ましい。湿潤剤を配合することによりゲル
媒体層の保存時の極端な水分の蒸発による乾燥を
防ぐことが可能となり、また極端な乾燥に起因す
るもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル媒体層
の物性が改善されるとの利点がある。本発明のゲル媒体材料は、前述の諸文献等に記
載の公知の方法に従つて、水平型および垂直型平
板電気泳動法、デイスク電気泳動泳動法等のいず
れにも用いることができる。以下に本発明の実施例を記載するが、これらは
本発明の範囲を限定するものではない。実施例１紫外線照射処理により表面を親水性にしたポリ
エチレンテレフタレート（PET）シート（支持
体）上に約0.5μｍの厚み（固形分）になるように
第１表記載のポリマーを塗布し、約110℃で乾燥
して、接着層つき支持体を製造した。

【表】

ここで、ｘ、ｙはモル百分率であり、R″は下
記の置換基を示す。Ｐ−Ａｘ＝80、ｙ＝20 R″＝CONHC（CH₃）₂CH₂COCH₃ Ｐ−ＢＸ＝87、ｙ＝13 R″＝CONHC（CH₃）₂CH₂COCH₃ BISは、Ｎ，N′−メチレンビスアクリルアミド
を、そしてＰ−１、Ｐ−３、およびＰ−６は前述
を該当する式により表わされる三元コポリマーを
意味する。まず、接着層つきPETシート（支持体）につ
いて、支持体と接着層との間の接着性をクロスカ
ツト法により評価した。その結果、試料番号３、
４および５（本発明に従う試料）の接着層は接着
性が良好であつたが、試料番号１および２（比較
試料）については、かなりの部分でシートと接着
層間に剥離がみられた。支持体上に設けられた各接着層の上に、アクリ
ルアミド11.87ｇ、BIS630mg、尿素42ｇ、トリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン［CAS
Registry No.77−86−１］1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇ
およびEDTA・2Na塩93mgを含有する100mlの溶
液に重合開始剤として過硫酸アンモニウム（5wt
％）1.3ml、TEMED33μを加えたものを0.5mm
の厚みで成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を得
た。得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体
間の接着性を評価した。その結果、試料番号３、
４および５（本発明に従う試料）を接着層とした
場合、接着性が優れていたが、試料番号１および
２（比較試料）については接着性が劣つていた。実施例２実施例１の第１表と同じポリマーを用いて接着
層つきPETシート（支持体）を製造し、この接
着層の上にアクリルアミド11.87ｇ、BIS630mg、
アガロース1600（和光純薬(株)製）0.3ｇ、ポリアク
リルアミド2.5ｇ、トリス（ヒドロキシメチル）
アミノメタン1.08ｇ、ホウ酸0.55ｇ、尿素42ｇお
よびEDTA・2Na塩93mgからなる100mlの溶液に
重合開始剤として過硫酸アンモニウム（5wt％）
1.3ml、TEMED33μを加えたものを0.5mmの厚
みで成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を得た。このゲル膜を使用して、 ³²P−DNAをマキサ
ム・ギルバート分解した試料について電気泳動に
かけ、DNA塩基配列決定の実験を行なつた。電
気泳動後にゲル膜を、脱尿素とDNA固定のため
に、10％酢酸水溶液中に１時間浸漬した。このゲ
ル膜を乾燥し、次いでオートラジオグラフイー処
理を常法にしたがつて行なつた。 10％酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持
体とゲル膜の接着状態を観察した。試料番号１（比較試料）の接着層の上に形成さ
れたゲル膜は支持体から完全に剥離し、また、試
料番号２（比較試料）については、ゲル膜は一部
支持体に接着した部分があるものの、その大部分
は支持体から剥離していた。一方、試料番号３〜５（本発明に従う試料）の
接着層の上に形成されたゲル膜は、いずれも支持
体上に完全に接着していた。更にゲル膜を乾燥さ
せた後、それと支持体との間の接着状態を観察し
たところ、ゲル膜はいずれも支持体によく接着し
ていた。またオートラジオグラフイー処理した後
も、接着性に問題はなく良好な結果を示した。実施例３実施例２と同様にして接着層つきPETシート
の接着層の上にポリアクリルアミドゲル膜を形成
した。このゲル膜を支持体ごと裁断加工したの
ち、ゲル膜の切口を観察したところ、試料番号１
〜２（比較試料）の接着層の上に形成されたゲル
膜についてはゲル膜の剥離が一部観察されたのに
対して、試料番号３〜５（本発明に従う試料）に
ついてはいずれも裁断口の接着性は良好で、支持
体ごと裁断加工できることがわかつた。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の各層が順次積層されてなる三層構造を
含む電気泳動用媒体材料： [] 支持体層； [] 一般式(1)乃至(3)のいずれかにより表わされ
る構成繰返し単位を有するポリマーを含有する
接着層；一般式(1) ［一般式(1)において、 R¹¹は水素原子または１から６個の炭素原子
を有するアルキル基である； Q¹は−COO−、【式】または６から 10個の炭素原子を有するアリーレン基のいずれ
かである二価の基、 L¹は、−COO−あるいは【式】の結合のいずれかを少なくとも１個含み、かつ３から15
個の炭素原子を有する二価の基、または、 −Ｏ−、【式】−CO−、−SO−、−SO₂ −、−SO₃−、【式】【式】あるいは【式】の結合のいずれかを少なくとも１個含み、かつ１から12個の炭素原子を有
する二価の基である（ただしR¹¹は前述と同義
である）； R¹²は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X¹のいず
れかである（ただし、X¹は求核基により置換
される基、あるいは塩基によつてHX¹の形で
脱離しうる基を表わす）； A¹はその左側に示した各モノマー単位と共
重合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導
された二価の基である； x¹、y¹およびz¹はモル百分率を表わし、x¹は
０〜99、y¹は１〜99、z¹は１〜99の値をとる］一般式(2) ［一般式(2)において、 R²¹は水素原子または１から６個の炭素原子
を有するアルキル基である； R²¹は−CH＝CH₂又は−CH₂CH₂X²である
（ただし、X²は求核基によつて置換されうる
基、または塩基によつてHX²の形で脱離しう
る基を表わす）； L²は、１から６個の炭素原子を有するアル
キレン基、６から12個の炭素原子を有するアリ
ーレン基、−COZ²−で表わされる基、および−
COZ²R²³−で表わされる基（ただし、R²³は１
から６個の炭素原子を有するアルキレン基、あ
るいは６から12個の炭素原子を有するアリーレ
ン基であり、そしてZ²は酸素原子あるいはNH
である）から選ばれる二価の基である； A²はその左側に示した各モノマー単位と共
重合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導
された二価の基である； x²、y²およびz²はモル百分率を表わし、x²は
０〜99、y²は１〜99、z²は１〜99の値をとる］一般式(3) ［一般式(3)において、 R³¹は水素原子、または１から６個の炭素原
子を有するアルキル基である； L³は１から20個の炭素原子を有する二価の
連結基である； X³は【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】【式】 −COOCH₂CN −COOCH₂COOC₂H₅ −COOCH₂CONH₂ −COOCH₂COCH₃ 【式】 −COOCH₂COOCH＝CH₂ −COON＝CHCH₃ −COON＝Ｃ（CH₃）₂ 【式】 −COOCH₂CH₂Br −COOCH₂CH₂CN のうちのいずれかの基である； A³はその左側に示した各モノマー単位と共
重合可能なエチレン性不飽和モノマーから誘導
された二価の基である； x³、y³およびz³はモル百分率を表わし、x³は
０〜99、y³は１〜99、z³は１〜99の値をとる；ｍは０あるいは１である］ [] アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存
在下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系
水性ゲル、および変性剤として尿素またはホル
ムアミドを含む電気泳動用媒体層。２電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーお
よびアガロースを含むことを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材料。３支持体層がプラスチツクシートからなること
を特徴とする特許請求の範囲第１項もしくは第２
項記載の電気泳動用媒体材料。４プラスチツクシートがポリエチレンテレフタ
レートからなることを特徴とする特許請求の範囲
第３項記載の電気泳動用媒体材料。５接着層が、一般式(1)の構成繰返し単位を有す
るポリマーを含有するものであることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の電気泳動用媒体材
料。