DE3032069C2

DE3032069C2 - Lackartige Haftvermittler für wäßrige Polyacrylamid-Gele auf glatten Polyester-Folien, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung für die Elektrophorese

Info

Publication number: DE3032069C2
Application number: DE19803032069
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Dr. 6900 Heidelberg Grubhofer
Original assignee: Individual
Current assignee: Serva Feinbiochemica & Co Kg 69115 Heidelber GmbH
Priority date: 1980-08-26
Filing date: 1980-08-26
Publication date: 1982-06-16
Also published as: DE3032069A1

Description

Die Erfindung betrifft lackartige Haftvermittler für wäßrige Polyacrylamid-Gele auf glatten Polyester-Folien, insbesondere für die Elektrophorese von Proteinen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Die Elektrophorese von Gemischen in wäßriger Lösung befindlicher Makromoleküle, also deren Trennung auf Grund verschiedenen Beweglichkeitsverhaltens im elektrischen Gleichspannungsfeld, hat auf dem Gebiet der Biochemie und der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung erlangt.

Unter den verschiedenen methodischen Verfahren dieses Trennverfahrens nimmt die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese einen besonderen Rang ein. Ihr Kennzeichen ist, daß die wäßrige Lösung, in weicher die Makromoleküle der Trennung unterworfen werden, durch ein darin polymerisiertes Netzwerk aus quervernetztem Polyacrylamid zur physikalischen Konsistenz einer geleeartigen Masse verfestigt ist. Das bringt den Vorteil mit sich, daß die elektrophoretische Trennung nunmehr nicht mehr in engen Rohren oder Küvetten vor sich gehen muß, sondern in einer formstabilen Masse, z. B. in Glasröhren von 6 mm Durchmesser oder in einer 0,1—5 mm dicken Flachschicht, ohne daß die Zerstörung der Trennwirkung durch Konvektion oder Strömung während des Trennvorganges oder nach dessen Beendigung befürchtet werden muß.

Bei der sogenannten Flachbett-Elektrophorese polymerisiert man üblicherweise das Polyacrylamid-Gel auf Glasplatten, an welchen es recht befriedigend haften bleibt, wenn die Glasplatten sorgfältig gereinigt wurden. Dieses Haften ist von großer Bedeutung. Anschließend an die Elektrophorese müssen nämlich die Proteine gekennzeichnet, daß sie aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren von Maleinsäureanhydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen mit ungesättigten aliphatischen Aminen bestehen.

5. Verwendung der Haftvermittler nach Anspruch 1 bis 4 zur Behandlung von Polyester-Folien, dadurch gekennzeichnet, daß man die gelösten Haftvermittler als gleichmäßigen Film von der Folie abrinnen läßt.

6. Verwendung der Haftvermittler nach Anspruch 1 bis 5 zur Herstellung von festhaftenden Schichten der wäßrigen Gele von kopolymerisiertem Acrylamid und Methylenbisacrylamid als Quervernetzer an einej nach Anspruch I bis 5 mit Haftvermittler belegten Folienoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acrylamid-Monomeren in Gegenwart von Katalysatoren in Kontakt mit der so behandelten Folie polymerisiert.

7. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 6 hergestellten Schichten aus wäßrigen Polyacrylamid-Gelen für die Elektrophorese von hochmulekularen Naturstoffen.

oder andere getrennte Makromoleküle durch Behandlung mit starken Säuren immobilisiert werden, um die erzielte Trennung dadurch zu perpetuieren. Dann wird

■to die Säure wieder herausgewaschen und die Schicht durch Behandlung mit Farbreagenzien in Lösungsmitteln wie Alkohol, Essigsäure etc. behandelt, so daß die aufgetrennten Substanzen als direkte Zonen sichtbar nachgewiesen werden können.

Alle diese Behandlungen verträgt die auf den Glasplatten aufgebrachte Schicht in der Regel ohne sich abzulösen. Wenn man aber das Polyacrylamid-Gel zur Aufbewahrung trocknen will, schrumpft es sehr beträchtlich und löst sich auf jeden Fall vom Glas ab.

Um diesem Übels'.and abzuhelfen, t'ird das Glas mit einem Silan-Derivat (z. B. Methacryloxypropyl-Trimethoxysilan) behandelt, welches also ungesättigte Restgruppen enthä!s. Solche Derivate reagieren einerseits mit den Siliciumatomen der Glasoberfläche unter Ausbildung fester kovalenter Verbindungen, andererseits auch mit dem Polyacrylamid-Monomer, so daß das Acrylamid nunmehr durch feste kovalente Bindung am Glas verankert ist (Radola, B. J:, 1980, Electrophoresis I, 43-56).

bo Was die Glasplatten betrifft, so ist also das Problem der Haftung von Geschichten befriedigend gelöst. Glasplatten selbst sind aber in der Elektrophorese als Unterlage für das Gel wenig befriedigend wegen ihrer Starrheit, Zerbrechlichkeit und der Schwierigkeit, sie zu

si Dokumentationszwecken aufzubwahren, Sehr viel besser würden sich zu diesem Zweck durchsichtige Kunststoff-Folien eignen. Als solche kommen wegen einer Reihe mit der experimentellen Technik zusam-

menhängender Krieterien heute ausschließlich Polyesterfolien in Betracht, also Folien aus einem Material, welches aus aliphatischen Diolen und Dicarbonsäuren durch Polymerisation aufgebaut ist

Auch bei Polyester-Folien als Unterlage ist das gute Haften der Schicht des Elektrophorese-Gels Voraussetzung. Alle Passagen durch Lösungsmittel und das anschließende Eintrocknen muß die Schicht Oberstehen ohne sich abzulösen. Bis jetzt wurde nur ein Verfahren bekannt, diese Haftfähgikeit herbeizuführen, nämlich eine Anlehnung an die oben für Glasplatten beschriebene Methode. Dazu muß allerdings erst die Polyesterfolie durch Behandeln mit Natronlauge oberflächlich angeätzt werden, d. k, es müssen aus dem im Polymer enthaltenen Diol Hydroxylgruppen freigelegt werden. Man kann dann mit Hilfe von C=C-Doppelbindungen enthaltenden Silanverbindungen in der Tat ein einigermaßen befriedigendes Haften von Polyacrylamid-Gel erzielen (B. J. Radola, ibid.).

Ein derartiges Verfahren ist für labormäßige Präparierung einiger Folienstücke akzeptabel, eignet sich aber wenig für die Herstellung größerer Mengen im kontinuierlichen Verfahren, und zwar hauptsächlich aus folgenden Gründen:

a) Die Einwirkungsdauer der hochkonzentrierten Natronlauge muß mindestens 15 Minuten betragen. Für diesen Zeitraum müssen also die Folien in der gefährlichen und schwierig zu handhabenden Flüssigkeit bleiben.

b) Anschließend muß die Lauge sorgfältig abgewaschen und c:e Folie rückstandsfrei getrocknet werden.

c) Die anschließende Behandlung mit der Silanlösung muß sich ebenfalls auf längere Zeit erstrecken, zudem ist das ungesättigte Silan auch wieder eine die Atemwege sehr stark irritierende Substanz, die sorgfätlig abgesaugt und weggetrocknet werden muß.

d) Die Haftfähigkeit von Polyacrylamid-Gel an einer derartig behandelten Folie ist immer noch als höchstens einigermaßen befriedigend zu bezeichnen, denn besonders beim Trocknen der GeI-ϊ Schicht springt diese noch teilweise von der Folie ab, was die Dokumentation fertiger Elektrophoresen schwierig oder fast unmöglich macht

Eine verbesserte Haftfähigkeit von Schichten aus

in Polyacrylamid-Gel auf Trägerfolien aus Polyester sollte dadurch erreicht werden können, daß man eine mit Acrylamid reagierende Verbindungskomponente als lackartigen Haftvermittler auf die Folie aufträgt. An einen solchen haftvermittelnden Lack wären folgende

ti Anforderungen zu stellen:

a) Festes Haften an der Trägerfolie.

b) Unlöslichkeit in Wasser

c) Unlöslichkeit in den Reagenzien, mit welchen die in Schicht aus Polyacrylamid-Gel üblicherweise behandelt wird, also Methanol, Essigsäure, 15%ige Trichioressigsäure und Mischungen daraus.

d) Es muß sich ein gleichmäßiger und vollkommen transparenter Überzug auf die Folie aufbringen

2; lassen, der vermöge der zahlreichen vorhandenen

ungesättigten Reste kräftig mit monomeren! Acrylamid reagiert.

Es wurde nun gefunden, daß diese Anforderungen κι von Umsetzungsprodukten erfüllt werden, die entstehen, wenn man polymere cyclische Säureanhydride in Reaktion bringt mit ungesättigten Alkoholen, mit ungesättigten primären oder sekundären aliphatischen Aminen oder schließlich mit C = C-Doppelbindungen enthaltenden Epoxiden. Die so erhaltenen Produkte sind also hochpolymere Substanzen, welche eine Vielzahl vjn ungesättigten Resten enthalten, wie im nachfolgenden Formelschema I, II und HI gezeigt.

C-C = O

O + nHO — CH₂-CH = CH₂
C-C = O

CH₂
CH-R

C-CO-CH₂-CH = CH₂

C — COOH

CH-R

(D

C-C = O

0 + «ΗΝ—(CH₂-CH = CH₂)J
C-C = O

CH₂
CH-R

, 1

C-CO-N(CH₂-CH = CHj)₂

Q	CO	OH
CH₂
CH-	-R

(Π)

¹ I ^ c—c=o

-C = O
CH₂
CH-R

J /I

Π '

C-CO O CH₂- CH(OH)- CH₂O- CH₂-CH = CH₂ C-COO- CH₂- CH(OH)- CH₂O · CH₂- CH = CH₂ CH₂
CH-R

Die als Ausgangsmatearial benützten polymeren cyclischen Säureanhydride sind in verschiedenen Handelsformen verfügbar, vor allem als Kopolymere von Maleinsäureanhydrid mit ungesättigten aliphatischen Verbindungen vom Typ CH₂ = CH-R, wobei bei den drei genannten Produkten der Rest R gemäß Formel I bis III gestaltet ist.

R = OCOCH₃

R = Cl6H3l

R = OCH₃

JO

Die erhaltenen Umsetzungsprodukte dieser Kopolymeren von Maleinsäureanhydrid mit ungesättigten Alkoholen, Aminen oder Epoxiden sind nur in Flüssigkeiten wie Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid löslich. Zur Herstellung von Lack-Konzentraten werden die Reaktionspartner daher als Lösungen in Dimethylformamid zusammengebracht, in welchem sie bei Zimmertemperatur schon in kurzer Zeit reagieren, was am Anstieg der Viskosität und am Verschwinden der freien OH- oder NH-Gruppen zu verfolgen ist. Die Lösung des so gebildeten Lackes wird anschließend mit Aceton soweit verdünnt, daß der Dimethylformamid-Gehalt noch ausreicht, ihn in Lösung zu halten, daß so andererseits aber die Lösung aufgrund ihres Acetongehalts günstigere Eigenschaften aufweist, nämlich niedrige Viskosität und leichte Verdunstbarkeit.

Die Beschichtung der Polyesterfolien erfolgt durch einfaches Durchziehen in Tauchbädern und anschiießendes Festbrennen bei 11O⁰C.

Beispiele

1) Umsetzung des Kopolymers von

Maleinsäureanhydrid und
Hexadecen-1 mit Allylalkohol

35Og (Mn mol, η — Zahl der Monomeren im Kopolymer) Maleinsäureanhydrid-Hexadecen-1 -Kopolymer wurden unter fortgesetztem Rühren in 71 Dimethylformamid gelöst. Dann wurden 12Og (2 r.iol) Allylalkohol zugesetzt und das Gemisch über Nacht stehen gelassen.

60

2) Umsetzen des Kopolymers von

Maleinsäureanhydrid und
Vinylmethylether mit Diallylamin

150 g (Mn mol) Kopolymer von Maleinsäureanhydrid und Vinylmethylether wurden in 3 1 Dimethylformamid unter Rühren aufgelöst. Sodann wurden 100 g (1 mol) Diallylamin zugegeben. Die Reaktionsmischung färbte sich vorübergehend tiefrot. Nach 24 Stunden haben die Komponenten ausreagiert, die Reaktionsmischung ist nunmehr gelblich oder hellrötlich.

3) Umsetzen des Kopolymers von

Maleinsäureanhydrid und
Vinylacetat mit Allylglycidether

195 g (Mn mol) wurden in 51 Dimethylformamid gelöst und so langsam mit 330 g (3 mol) Allylglycidether versetzt, daß die Temperatur nicht über 35°C stieg. Die Reaktionsmischung wurde alsdann 24 Stunden stehen gelassen.

4) Beschichten von Polyesterfolien

mit erfindungsgemäß
hergestellten Haftvermittler-Lackschichten

Eine Folie aus Ethylenglycol-Terephthalsäure-Kopo-'ymerisat wurde mit einer Geschwindigkeit von 2 cm/sek durch eine Haftvermittler-Lösung (gem. Beisp. 1—3) gezogen, welche aus dem I Lenzentrat durch Verdünnen mit Aceton auf eine Konzentration von 0,1 g/l Festsubstanz gebracht worden war. Die aus der Lösung kommende Folie wurde senkrecht nach oben geführt, so Cdß bei der langsamen Durchluftgeschwindigkeii der größte Teil der Lösung Zeit hatte, als zusammenhängender Film von der Folie glatt abzulaufen. Etwa 40 cm über dem Flüssigkeitsspiegel begann ein 1 m langer Tunnel, durch welchen die FoIi? senkrecht nach oben stieg und welcher mittels dampfbeheizter Kupferschlangen auf 110⁰C temperiert war. Das erhaltene Material wurde aufgewickelt und vor der Verwendung mindestens 24 Stunden aufbewahrt.

Anwendungsbeispiele

1) Das Kopolymer wurde gemäß Beispiel 1—4 aufgebracht und die beschichtete Folie auf eine befeuchtete Glasplatte gleicher Größe mittels einer Gummiwalze aufgepreßt, so daß sie völlig glatt am Glase auflag. Es wurde ein Dichtungsrahmen aus 0,5 — 2 mm dickem Silikongummi aufgelegt, darauf eine Glasplatte, welche zur Abweisung des gebildeten wäßrigen Polyacrylamid-Gels mit einem Silikonöl (Polymethylsiloxan) benetzt war. Das Ganze wurde mit Metallklammern zusammengehalten, so daß eine rechteckige Küvette entstand, in welche nunmehr durch eine Öffnung im Dichtungsrahmen die Lösung von monomeren Acrylamiden mittel«; Kanüle eingespritzt wurde und welche folgende Zusammensetzung hatte:

50 g/l Acrylamid

1,7 g/l Methylbisacrylamid

0,8 g/l Ammoniumpersulfat

2,5 g/l Tetramethylethylendiamin

Ammoniumpersulfat und Tetramelhylethylendiamin sind Katalysatoren und wurden kurz vor dem Gießen des Acrylamids zugegeben. Nach 5— 10 Minuten wardie Lösung in der Küvette erstarrt. Die Gießvorrichtung konnte nun auseinandergenommen werden, der PoIyacrylamid-Film ist auf der Folie aufpolymerisiert. Es zeigte sich, daß solche Filme nicht vom Polyester abgelöst werden, wenn man sie jeweils 24 Stunden in Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischung 40 : 10 : 50 schüttelt und auch wenn man sie anschließend eintrocknen läßt. Ein bequemer und schneller Test besteht darin, daß man auf die frisch gebildete Schicht aus Polyacrylamid-Gel ein Blatt Filterpapier auflegt. dieses andrückt und dann abzieht. Bei einem guten Haftvermittler muß die Schicht aus Polyacrylamid-Gel so fest sitzen, daß sie beim Abziehen des Papiers zerrissen wird, ein Teil also noch auf der Polyesterfolie verbleibt und dieser ein rauhes Aussehen gibt. Bei unbefriedigenden Haftvermittlern lassen sich die Schichten glatt von der Polyesterfolie abziehen und geben deren glänzende Oberfläche frei.

2. Eine mit Haftvermittler versehene Folie wird gemäß Anwendungsbeispiel 1 mit einer 0,5 mm dicken Schicht aus Polyacrylamid-Gel beschichtet, welche außerdem 2% (bezogen auf Festgehalt) einer Mischung aus amphoteren Verbindungen gemäß DE-PS 21 37 617 enthält. Sie wird auf die Abmessung 12 χ 12 cm zugeschnitten und auf eine auf 5—1O⁰C gekühlte isolierte Unterlage gelegt. Die Unterlage befindet sich in einer elektrisch isolierten Kammer. Nunmehr werden auf den zwei gegenüberliegenden Seiten des quadratischen Zuschnittes zwei mit verdünnter Säure oder Lauge befeuchtete Streifen aus Filterkarton gelegt, darauf Platinelektroden gebracht und ein in Wasser gelöstes Proteingemisch auf die Schicht aufgetragen. Unter Einwirkung eines von den Platinelektroden ausgehenden elektrischen Gleichspannungsfeldes, wobei die Gleichspannung anfangs 240 V im Laufe von 1 —2 Stunden bis auf 2000 V gesteigert wird, beobachtet man nach einiger Zeit eine Auftrennung der Proteine. Nach Beendigung der Trennung wird die Schicht folgenden Prozeduren unterworfen:

1) Einlegen in 12%ige Trichloressigsäure, mindestens 15 Minuten lang.

2) Waschen mit Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischung gemäß Anwendungsbeispiel I (2 χ 30 Minuten).

3) Färben mit Eiweißfarbstoff (z. B. 0,5 g/l Colour Index Acid Blue 83 im Lösungsmittel) gemäß Anwendungsbeispiel 1.30 Minuten.

4) Waschen mit zwei Passagen Methanol-Essigsäure-Wasser-Mischung gemäß Anwendungsbeispiel 1. 2 χ 60 Minuten.

5) Trocknen an der Luft für eine Stunde.

Als Endergebnis hat man ein Präparat, welches Muster der aufgetrennten Proteine in dunkelblauer Farbe zeigt. Die aufgetrocknete Schicht aus Polyacrylamid-Gel ist jetzt nur noch ca. 5 μ dick.

Claims

Patentansprüche:

1. Lackartige Haftvermittler zur Haftverbesserung von wäßrigen Polyacrylamid-Gelen auf glatten Polyester-Folien, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus polymeren Verbindungen mit ungesättigten Molekülresten bestehen, die zur Addition von Acrylamid in Gegenwart von Katalysatoren befähigt sind.

2. Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren von Maleinsäureanhydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen vom Typ

CH₂ = CH-OCOCH₃, ⁿ

CH₂=CH-C₁₆H₃₁ und
CH₂ = CH-OCH₃

mit ungesättigten Alkoholen, bestehen.

3. Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch 2» gekennzeichnet, daß sie aus Umsetzungsprodukten der Kopolymeren von Maleinsäureanhydrid und ungesättigten aliphatischen Verbindungen mit Allylglycidester bestehen.

4. Haftvermittler nach Anspruch 1, dadurch