JPS59212753A - 電気泳動用媒体材料 - Google Patents

電気泳動用媒体材料

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JPS59212753A
JPS59212753A JP58087967A JP8796783A JPS59212753A JP S59212753 A JPS59212753 A JP S59212753A JP 58087967 A JP58087967 A JP 58087967A JP 8796783 A JP8796783 A JP 8796783A JP S59212753 A JPS59212753 A JP S59212753A
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雅司 小川
Hisashi Shiraishi
白石 久司
Teppei Ikeda
池田 鉄平
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    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44747Composition of gel or of carrier mixture
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10T428/31504Composite [nonstructural laminate]
    • Y10T428/31786Of polyester [e.g., alkyd, etc.]
    • Y10T428/31797Next to addition polymer from unsaturated monomers

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、電気泳動用媒体材料に関するものであり、さ
らに詳しくは、特にDNAC7)塩基配列決定操作にお
いて用いられる水性ケル電気泳動用媒体材料として適し
た電気泳動用媒体材料に関するものである。
ポスI・ラベル法に基づ(DNAやRNAの塩基配列決
定法においては、ポリアクリルアミドゲル11りを用い
たスラブ電気泳動操作が必須の操作となっている。特に
近年において遺伝子関連の研究が進むにつれて、DNA
塩基配列決定の操作の迅速化が急務となっている。
ポリアクリルアミドゲル11りは、アクリルアミドのよ
うな中量体を触媒の存在下にてN、N’−メチレンビス
アクリルアミドのような二官能性の架橋剤を用い架橋重
合させることにより得られる。
なお、このポリアクリルアミドゲル膜の形成に際して通
常は、尿素あるいはホルムアミドのような変ti剤を含
イ1させる。
I−記の重合反応はラジカル架橋重合であり、酸素のI
#響により反応が阻害されるため、ゲル11シは酸素を
遮断した状態で作成する必要がある。この理由から、現
在では一般に、ポリアクリルアミドゲル11りは2枚の
ガラス板で形成されたセル(一定の゛空間、たとえば0
.3mm−1mmを有する)の中にゲル形成液を11−
人させ、酸素を遮断した状態で架橋重合させてゲルI+
!、!を形成させている。
この方法は2枚のガラス板の間でゲル膜を形成するため
に、取り扱い性が悪く、かつ量産化か困難であるといっ
た大きな欠点を有している。
以上のようにして形成したポリアクリルアミドゲル膜を
用いる電気泳動は、たとえば1次のようにして実施され
る。
ポリアクリルアミドゲル膜は、カラス板に挟んだままの
状態で垂直に立てられ、前電気泳動を行なったのち、サ
ンプルスロットに試料(マキサム・ギルバート分解した
32Fラベル化DNA)を一定量注入し、電気泳動を行
なう。そして、一定時間(例、約6時間〜12時間)の
電気泳動を行なった後、片面のガラス板を注意深く除去
し、ポリ塩化ビニリデンフィルムなどの合成樹脂製フィ
ルムでゲル膜を覆い、これを用いてオートラジオグラフ
ィー処理を行なう。すなわち、ゲル膜を被覆しているフ
ィルムの上にX線フィルム、増感紙’e順次のせて、低
温(たとえば、−80°C)で−・定時間(たとえば、
約10〜2011.’1lfl )露光をイ)なう。そ
して露光終了後、X線フィルムを現像し、DNAの分離
泳動パターンを読みとることにより、DNAの塩基配列
を決定することができる。
オートラジオグラフィー処理は以上のように長時間を必
要とするため、その迅速化が望まれ、更に読みとりの高
分解能化も望まれている。
高分解能化を達成する手段としては、オートラジオグラ
フィー処理に際してゲルI模を乾燥状態とする方法が知
られている。すなわち、電気泳動路r後にゲル膜を10
%酢酸水溶液中に浸漬して、DNAを固定化しつつ尿素
なとの変性剤を除去する。ガラス板とゲル11りの接着
力は極めて弱いか、または実質的に接着力がないため、
この浸漬工程において、ゲル膜はカラス板から剥離し、
液中に浮遊する。このグル11ジを−t」:、 、Q:
深く取出し、濾紙」二にのせた後、減圧下で乾燥するこ
とにより濾紙上に固定する。このようにして乾燥したゲ
ル1112を使ってオー)・ラジオグラフィー処理を実
施した場合には分解能が大さくJ二yIする。しかし、
14記のようなゲル)1シの分離および乾燥工程は、ゲ
ル膜が極めてもろいため、高度の熟練と往意を必要とし
、また、実際にこの工程においてゲル膜の破損が発生す
ることも多い。
そこで本発明の目的は、湿潤状態でのグル膜と支持体と
の接着性を高く(接着力を大きく)するだめの接着層形
成用の塗布液を提供し、さらにゲル膜の脱変性剤(尿素
等)処理後の乾燥工程においても、支持体から剥離しな
いゲル膜を提供することにある。 本発明者は、以上の
ような従来使用されている電気泳動用媒体材料の欠点の
克服を目的として鋭意研究を行な”った結果1本発明に
到達した。
本発明は、 [I]支持体層; [II]特定の一般式により表わされる構成繰返し単位
を有するポリマーを含有する接着層;および、 [1111アクリルアミド系化合物と架橋剤か水の存在
下で架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、
および変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基を
もつ化合物を含む電気泳動用媒体層、 かl1ll−1吹精層されてなる三層構造を含む電気泳
動用媒体材料にある。
本発明の電気泳動用媒体材料は上記のように支打体層と
電気泳動用媒体層とを特定の接着層により接合してなる
三層構造を含むものであり、前述の電気泳動用媒体層(
ゲル膜)の乾燥工程における各種の操作によっても、そ
の三層構造が分離しにくいため、電気泳動用媒体層の破
損が発生することは殆どなく、また濾紙などを使用する
必要がない。
さらに、本発明の電気泳動用媒体材料は、水平に1ヒ1
いた支持体の上に接着層を形成し、次いで電気泳動用媒
体層をその」二に形成する方法によっても製造すること
が可能であるため、電気泳動用媒体材ネ゛]の酸産化に
も大きく寄与するものである。
次に本発明の詳細な説明する。
本発明の’itt気泳動川媒体用料の支持体としては、
カラス板、紙あるいは各種のプラスチック製シートなと
を用いることができるが、本発明による利点を生かすた
めには、支持体としてプラスチック製シートを用いるこ
とが好ましい。このプラスチック製シートとしては、任
意のプラスチックから形成したものを用いることができ
るが、特−にポリエチレンテレフタフタレートから形成
されたシートを用いることが好ましい。
本発明において支持体の上には接着層が形成される。
接着層は、下記の一般式(1)乃至(3)のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するポリマーを含有
する層である。
[−・般式(1)において、 R11は水素原子または1から6個の炭素原子を有する
アルキル基である; R1! Qlは−COO−1−CON−1または6がら10個の
炭素原子を有するアリーレン基、II ■ Llは、−000−あるいは−CON−の結合のいずれ
かを少なくとも1個含み、かつ3から″   15個の
炭素原子を有する二価の基、または、1(II −0−1−N−1−CO−1−SO,、11 −302−1−SO3−1−SO3X−1ずれかを少な
くとも1個含み、かっ1から12個の炭素原r−を有す
る二価の基である(ただしl(11は前述と同義である
); R12は−CH−CH2又は−cH2cH2Xlのいず
れかである(ただし、Xlは求核基により置換される基
、あるいは塩基によってHXIの形で脱離しうる基を表
わす); A1はその左側に示した各千ツマ一単位と共重合+17
能なエチレン性不飽和千ツマ−から誘導された二価の基
である; x 1 、  y !およびZlはモル百分率を表わし
XlはO〜99、ylは1〜99、Zlは1〜99の仙
をとる] 上記の一般式(1)において、 RI+の例にはメチル基、エチル基、ブチル基、n−ヘ
キシル基が含まれる。
Qlの例には次のような基が含まれる。
CH3 −COO−1−CONH−1−CON−1Llの例には
次のような基が含まれる。なお。
これらの二価の基の−nh式(I)における結合の方向
は、QlとSO□との結合が可能なかぎり、いずれの方
向をもとることができる。
−CH2COOCH2− CHz COOCH2CHz− CHz CH2COOCH2− (−CH2升s COOCH2CHz−+ CHz +
−Io COOCH2CH2−CH2N HCQ (:
 H2− CH2N HCOCHz  CHz  −+CHz←2
  N HCOCH2CH2−−+CH2→−5N H
COCH2CH2−−(:CH2ラー、。NHCOCH
2CH2−CHz  OCR2− CH2CH20CH2CH2CH2− N CH2CH2CHz N CH2CHz  −−C
OCH2CH2− CH2COCH2CH2− −3OCH2CH2− CH2S OCH2CHz − −S O□ CR2CH2− −SO。CH2CH2S O2CH2CHz  −3O
2CH2CH2S Oz CH2CHCH2−H −S  −0−CHz  CH2CH2−1 −S O3CH2COOCHz CHz  −3O3C
H2CHz  COOCH2CH2−−S O2N H
CHz  COOCH2CHz  −502N HCH
2CH2COOCH2CHz  −−NHCONHCH
2CH2− CH2N HCON HCH2CH2−N HC00C
)(2CH2− CH2N HCOOCHz  CHz  −R12は前
記のように、−CH=CH2あるいは−CH2CH2X
”のいずれかであるが、この−XIの例には1次のよう
な基が含まれる。
ハロゲン原イ(塩素、臭素など):ヒドロキシル基;ア
ルキルスルホニルオキシ(例、メチルス1 ルホニルオキシH3C−3−0−、エチルスルホ1 ニルオキシ、プρピルスルホニルオキシなど);アリー
ルスルホニルオキシ(例、フェニルスルホスルホニルオ
キシなと)、アルキルカルボニルオキシ(例、アヤトキ
シ、プロピオニルオキシ、トルフルオロメチルカルボニ
ルオキシ、ジクロロメチルカルボニルオキシなど) 従って、R12の例には、次のような基力\含まれる。
一CH=CH2、−CH=CH2C文。
C )( 2 C H 2 B r、 1 一CH2CH2   0−S   CH3 、1 一CH 2 CH 2 0H、 C H z  C H 2 0 0 ’C C H 3
 、− C H 2 C H 2 0 0 C C F
 s 、−CH2CH200CCHC文3、 A1で表わされる二価の基の例としては、下記のような
エチレン性不飽和モノマーから誘導された基を挙げるこ
とができる。
エチレン、プロピレン、l−ブテン、インブテン、スチ
レン、クロロメチルスチレン、ヒドロキシメチルスチレ
ン、ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ビニルベン
ジルスルホン酸すトリウム、N,N,N−)リフチル−
N−ビニルヘンシルアンモニウムクロリド、N,N−ジ
メチル−N−ベンジル−N−ビニルベンジルアンモニウ
ムクロリド、α−メチルスチレン、ビニルトルエン、4
−ビニルピリジン、2−ビニルピリジン、ベンジルビニ
ルピリジニウムクロリド、N−ビニルアセトアミド、N
−ビニルピロリドン、l−ビニル−2−メチルイミダゾ
ール、脂肪族酸のモノエチレン性不飽和エステル(例.
えば酢酸ビニル、酩酊アリル)、エチレン性不飽和のモ
ノカルボン酸もしくはジカルボン酸およびその塩(例え
ばアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイン酸
、アクリル酸すトリウム、アクリル酸カリウム、メタク
リル酸すi・リウム)、無水マレイン酸、エチレン性不
飽和のモノカルボン酸もしくはジカルボン酸のエステル
(例えばn−ブチルアクリレ−1・、n−へキシルアク
リレート、ヒドロキシエチルアクリレート、シアンエチ
ルアクリレート、(ジエチルアミノ)エチルアクリレー
ト、メチルメタクリレ−1・、n−ブチルアクリレート
、ペンシルメタクリレ−1・、ヒドロキシエチルメタク
リレ−1・、クロロエチルメタクリレ−1・。
メトキシエチルメタクリレ−1・、(ジエチルアミノ)
エチルメタクリレート、N、N、N−トリエチル−N−
メタクリロイルオキシエチルアンモニウムp−トルエン
スルホナ−1・、N、N−ジエチル−N−メチル−N−
メタクリロイルオキシエチルアンモニウムp−トルエン
スルホナート、イタコン酩ジメチル、マレイン酎モノベ
ンジルエステル)、エチレン性不飽和のモノカルボン酸
もしくはジカルボン酸のアミド(例えばN、N−ジメチ
ルアクリルアミド、N−メチロールアクリルアミド、N
−[(ジメチルアミノ)プロピルコアクリルアミド、N
、N、N−トリメチル−N−(アク、根すロイルプロビ
ル)アンモニウム、P−トルエンスルホナート、2−ア
クリルアミド−2−メチルプロパンスルホン酸ナトリウ
ム、アクリロイルモルホリン、メタクリルアミド、N、
N−ジメチル−No−アクリロイルプロパンジアミンプ
ロピオナートヘタイン、N、N−ジメチル−No−メタ
クリロイルプロパンジアミンアセテートベタイン。
また本発明の重合体を架橋されたラテックスとして用い
る場合には、A1として、1−記のエチレン性不飽和モ
ノマーから誘導された基のほかに、少なくとも共重合可
能なエチレン性不飽和基を2個以上もつモノマー(例え
ばジビニルベンゼン、メチレンビスアクリルアミド、エ
チレングリコールジアクリレート、トリメチレングリコ
ールジアクリレート、エチレングリコールジアクリレー
トム、トリメチレングリコールジメタクリレート、ネオ
ペンチルグリコールジメタクリレート等)から、1f5
導された基を用いることができる。
[−・般式(2)において、 R21は水素原子または1から6個の炭素原子を41す
るアルキル基である; R22は−CH=CH2又は−CH2CH2x2である
(ただし、X2は求核基によって16換されうる基、ま
たは用人(によってHx2の形で脱離しうる基を表わす
); L2は、lから6個の炭素原子を有するアルキレン基(
例、メチレン、エチレン、インブチレ −ン)、6から
12個の炭素原子を有するアリーレン基(例、フェニレ
ン、トリレン、ナフタレン)、−coz2−で表わされ
る基、および−COZ2R23−で表わされる基(ただ
し、R23は1から6個の炭素原子を有するアルキレン
基、あるいは6から12個の炭素原子を有するアリーレ
ン基であり、そしてZ2は酸素原子あるいはNHである
)から選ばれる二価の基である;A2はその左側に示し
た各千ツマ一単位と共重合可能なエチレン性不飽和モノ
マーから誘導された二価の基である; X2、y2およびz2はモル百分率を表わし、X2は0
〜99.y2は1〜99、z2は1〜99の値をとる] なお、上記一般式(2)のR21、R22、およびA2
の例には、それぞれ前記一般式(1)のRII 、  
R12およびA1と同じ例が含まれる。
[−・般式(3)において、 R31は水素原子、または1から6個の炭素原子を有す
るアルキル基である: L3は1から20個の炭素原子を有する二価の連結基(
さらに好ましくは、−CONH−又は−C〇−結合のう
ち少なくとも一つを含む炭素数1〜2の二価の基)であ
る; x3は活性エステル基である; A3はその左側に示した各モノマ一単位と共重合i+)
能なエチレン性不飽和モノマーから誘導されたこ価の基
である; X3、y3およびZ3はモル百分率を表わし、X3はO
〜99、y3は1〜99、Z3は1〜99の値をとる; mはOあるいはlである] 」:記一般式(3)の1(31およびA3にはそれぞれ
、前記一般式(1)のRIIおよびA1の例と同じもの
が含まれる。
一般式(3)のL3には次のような基が含まれる。−C
OCH2− COCHz CH20COCH2CH2−−CON H
CH2− −CONHCH2CHz  − CON HCH2CH−2CH2− CON HCH2CH2CH2CH2CH2−CON 
HCH2CON HCH2− CONHCH2C0NHCH2C0NH(ld12 −
CONH[1l(z NHCOCH2GHz GHz 
S  CH2C)12  =(j]NH(J120CO
CH2CH2−など一般式(3)のx3には次のような
基が含まれ−COOCH2CN −C00CH2COOC2Hs COOCHz  CON H2 COOCH2COCH3 C00CH2COOCH= CH2 COON = CHCH3 −〇 〇 〇 N = C(CH3)  2− C00
C=  CHCOCH3 H3 −COOCH2CH2B  r COOCH2CH2CN Jフ、十°余白 以丁に、」−記の一般式(1)乃至(3)のいずれかに
より表わされる構成繰返し単位を有するポリマーの合成
に用いることができる代表的なビニルスルホニル基ある
いはその前駆体となる官能基をイーするエチレン性不飽
和七ツマ−の合成法を具体的に示す。
[合成例!]   2−[3−(2−クロロエチルスル
ホニル)プロピオニルオキシ]エチルアクリレ−I・の
合成 CH=CH2 C=0 ■ 反応容器にテI・ラヒドロフラン600 m l、ヒI
・ロキシエチルアクリレート45.8gおよび3−(2
−クロロエチルスルホニル)フロピオン酸クロリド72
gを加え、氷水により冷却しながら、5℃以下で、ピリ
ジン31.2gをテトラヒI・ロフラン100m文に溶
解したものを1.75時間で滴下した。その後室温で2
時間攪拌を続け、反応試料を2.5文の氷水中に注ぎ込
み、クロロホルム300m文により4回抽出した。有機
層を硫酸ナトリウムにより乾燥後、濃縮して、2− [
3−(2−クロロエチルスルホニル)プロピオニルオキ
シ]エチルアクリレート87gを得た(収率88%)。
[合成例2]  N−[3−(2−クロロエチルスルホ
ニル)プロパンアミドメチルコアクリルアミドの合成 CH=CH2 菅 C=0 2Mの反応容器に蒸留水1.400mJL、亜硫酸ナト
リウム244gおよび炭酸水素ナトリウム220gを加
え、撹拌して溶解させた後、氷水により冷却しながら約
5℃で、クロロエチルスルホニルクロリI” 260 
gを1.5時間で滴下した。
その後49%硫酸160gを約15分で滴下し。
5°Cで1時間はど撹拌を続けて、析出した結晶を濾過
した後、結晶を400m文の蒸留水で洗詐し、訣液と洗
浄液とを一緒にして3文の反応容器に入れた。この中に
メチレンヒスアクリルアミド246gを蒸留水480 
m l、エタノール1,480m文に溶解させたものを
、水冷しながら約5°Cで、30分間で滴下した後、全
体を冷蔵庫番j11間放置して反応を完結させた。析出
した結晶を濾取した後、冷却した蒸留水800m文で洗
浄し、2.00031の50%エタノール水溶液から1
1)結晶して、219gの千ツマ−を得た。収率は49
%であった。(分析結果、H:5.17、C・37.9
0、N:9.48.0文:12.58) [合成例31   [3−(2−クロロエチルスルホニ
ル)プロパンアミドコメチルスチレンの合成CH2NH
CC:H2CH2−SO□−C)12 CH2CI反応
容器にテトラヒドロフラン100mJ1、ビニルベンジ
ルアミン20.1g、トリエチルアミン16.7gおよ
びヒドロキノン0.1gを入れ、氷水により冷却しなが
らβ−クロロエチルスルホニルプロピオン酸クりリI:
’ 36’、 1 gを200mMのテトラヒドロフラ
ンに溶解させたものを30分で滴下した。その後室温で
一夜放置し、反応試料を濃硫酸16.5gを氷水1.5
J1で希釈した溶液中に注ぎ込み、生成する沈殿を濾取
した。この沈殿をエタノール200m1、水200m文
の混合溶媒から再結晶することにより、26.8gの[
3−(2−クロロエチルスルホニル)プロパンアミドコ
メチルスチレンを得た。収率は57%であった。(分析
結果、H:5.74、C:53.47、N:4.83.
0文:10.99、S:10.49) 以下全白 [合成例4]  1− [2−(4−ビニルフェニルス
ルホニル)エチルスルホニル] −3−(2−クロロエ
チル)スルホニル−2−プロパツールの合成2OH 反応容器に1.3−ビス(2−クロロエチル)スルホニ
ル−2−プロパツール157 g (特開昭53−57
257公報に開示の方法により合成した化合物)、メタ
ノール1!lおよび蒸留水IJIを加え、46℃に加熱
しながらビニルベンゼンスルフィン酸カリウム52gを
メタノール100m1と蒸留水100m5Lに溶解させ
たものを1時間で滴丁した。その後46°Cに保ったま
ま5.5時間攪拌を続け、生成する沈澱を濾取して55
gの1− [2−(4−ビニルフェニルスルホニル)エ
チルスルホニル]−3−(2−クロロエチル)スルホニ
ル−2−プロパツールを得た。収率は49%であった。
(分析結果、H:4.67、C:39.89、 S:2
1.43) 本発明のゲル媒体を形成するために好ましいポリマーと
して、次に示す構成繰返し単位を有するポリマーを挙げ
ることができる。
ここで、X、y、zはモル百分率であり、RとR゛は下
記の置換基を示す。
P−1x=80、y=8  、z=12R= COO0
H2CH20GD C)I20H2SO□GH=CH2
R’ = GONHC(OH3) 2 GHz 000
)13P−2x−80、y=a、2=12 R= C0N)1(1;H2NHCOC:H2CH2S
O3C■=CH2R”= C0NHC(C:)I3) 
z GHz C0CHzP−3x=80、V=8、z=
12 R= C0NHCH2NHC;0CHz GHz S0
2 CH2CH2CIR’ = (:0NHC(CHs
 ) 2 C;H2C0CHaP−4x=80 、 y
=a 、 z=12R’  =   GONHCH20
H P−5x=70 、 V=5、 Z −25R“ = 
  C0N(OH3)  2P−B     x=70
 、 Y=5、 z = 25R” =   C0N(
OH3)  2P−7x=50 、 y=5 、 z’
=45R= 次に、前記のポリマーのうちでも特に好ましいポリマー
であるP−1、P−3の合成例を示す。
[合成例5] コポリ−2−(3−(ビニルスルホニル
)プロピオニルオキシ]エチルアクリレート−アクリル
アミド−N−(1,1−ジメチル−3−オキツブチル)
アクリルアミド(P−1)の合成 反応容器にN、N−ジメチルホルムアミド80m1.2
− [3−(2−クロロエチルスルホニル)プロピオニ
ルオキシ]エチルアクリレ−)14.5g、アクリルア
ミド34.5g、N−(1,l−ジメチル−3−オキツ
ブチル)アクリルアミl” 12 、3 gを入れ、窒
素ガスで脱気後、60℃に加熱して2,2′−アゾビス
(2,4−ジメチルバレロニトリル)  [CAS  
RegistryNo 4419−11−8 ] 0 
、40 gを加え、2時間加熱攪拌を続けた。その後さ
らに2,2゛−アゾビス(2,4−ジメチルバレロニト
リル)0.20gを加え、2時間加熱、攪拌を続けた後
、5°Cに冷、A+ して炭酸ナトリウム12g、トリ
エチルアミン4.9gを加え、1時間攪拌を行なった。
さらに室温で1時間攪拌を続けた後、反応試料をセルロ
ースチューブに入れて21」間透析し、凍結乾燥によっ
て56gの白色ポリマー(前記P−1に該当)を11)
た(収率95%)。このコポリマーのビニルスルホニル
基含量は0.8X10−3当&/gであった・ [合成例6] コポリ−N−([3−(ヒニルスルホニ
ル)プtパンアミド]メチル)アクリルアミド−アクリ
ルアミド−N−’(1,1−ジメチル−3−オキソブチ
ル)アクリルアミド(P−3)の合成 500 m lの反応容器に1合成例2で得られた七ツ
マ−10,3g、アクリルアミド25.9gN−(1,
1−ジメチル−3−オキツブチル)アクリルアミド9.
3g、50%メタノール水溶液160 m Mを加え、
攪拌しなから60℃に加熱し、2,2°−アゾビス(2
,4−ジメチルバレロニトリル)0.2gを加え、さら
に30分後にも回しものを0.2g加えて、1時間加熱
攪拌を続けた。反応試料をセルロースチューブに入れて
2日間透析し、凍結乾燥によって41gの白色ポリマー
(前記P−3に該当)を得た(収率90%)。このコポ
リマーのビニルスルホニル基含量は0.7X10−3当
量/gであった。
次に本発明のゲル媒体層について述べる。
本発明において、アクリルアミド系化合物と架橋剤は、
水溶液または水分散液として水中に溶解または分散させ
ておき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した水
性ゲル媒体層を形成する。
本明細出においては、特にことわらない限り、(水中に
)溶解と(水中に)分散の両者を含めて単に(水中に)
溶解といい、水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶
液という。また、溶媒または分散媒として、所望により
加えられる有機溶媒と水との混合物をも包含する。
本発明の媒体層の形成に用いることができるアクリルア
ミド系化合物としては、アクリルアミド、N−メチルア
クリルアミド、N、N−ジメチルアクリルアミド、N−
(ヒドロキシメチル)アクリルアミド、ジアセトンアク
リルアミド等のアクリルアミド系化合物が挙げられ、こ
れらの化合物は単独で、あるいは二種以上を併用して用
いることができる。これらのアクリルアミド系化合物の
うちではアクリルアミドが最も好ましく、またアクリル
アミI・と他のアクリルアミド系化合物の一種以上の4
31川も好ましい。
架橋剤としてはr Electrophoresis 
 J  1981゜2、213−228等に記載の公知
の化合物(一種または二種以−にの組合せ)を用いるこ
とができる。架橋剤の具体例としては、N、N’−メチ
レンビスアクリルアミド(BIS)、N、N’−プロピ
レンヒスアクリルアミド(PBA)、ジ(アクリルアミ
ドジメチル)エーテル(DAE)、l 、2−ジアクリ
ルアミドエチレングリコール(DEC)。
エチレンウレアビスアクリルアミド(EUB)。
エチレンジアクリレート(EDA)、N、N’−ジアリ
ルタータルジアミド(N、N’−diallyltar
tardiamide  : DATD)  ; N 
、 N ’−ビスアクリリルシスタミン(N、N’−b
isacrylylcystamine、 B AC)
fの二官能性化合物が挙げられる。
架橋剤の量は、単量体と架橋剤の総重量に対して約2w
’t%から約30wt%、好ましくは約3wt%から約
10wt%の範囲で用いることができる。
ケル濃度としては、S、 Hjerten:  r A
rch。
Biochem、  Biophys、  J  1 
 (5upp1.  )、  147(+982)に記
載の定義に従って表示して、単量体、架橋剤および水か
らなるゲル媒体の容積に対して、単量体と架橋剤の量が
約3 w / v%から約30 w / v%の範囲で
好ましく用いられる。
変性剤としては、少なくとも1個のカル/ヘモイル基を
持つ化合物を用いることができ、その具体例として、尿
素、ホルムアミド等が挙げられる。
これらのうちで尿素が特に好ましく用いられる。
変性剤の量は単量体と架橋剤とを含む水性ゲルの容積に
対し、約40 w t / v%から約60wt/V%
の範囲で用いられる。尿素を用いる場合には、単量体と
架橋剤とを含む水性ゲル媒体1交に対し約6モル(約3
60 g)から飽和溶解量まで、好ましくは約7モル(
約420g)から飽和溶解量までの範囲で用いることが
できる。
本発明において、ポリアクリルアミド系水性ゲル媒体層
には、水溶性ポリマーを含有させることができる。
水溶性ポリマーとしては、伺加重合型または縮重合型の
水溶性ポリマーを用いることができる。
伺加重合型ポリマーの具体例としては、ポリビニルアル
コール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド等
の非イオン性水溶性ポリマーが挙げられる。縮重合型ポ
リマーの具体例としてポリエチレングリコール、ポリプ
ロピレングリコール等の非イオン性水溶性ポリアルキレ
ングリコールが挙げられる。水溶性ポリマーの分子量は
、約1万から約lOO万の範囲のものが好ましい。これ
らの水溶性ポリマーのうちでは、ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリルアミドが特に好ましい。
水溶性ポリマーは、単量体と架橋剤の合計重量に対して
約2wt%から約100wt%の範囲、好ましくは約5
wt%から約50wt%の範囲で用いられる。
本発明においては、水溶性ポリマーを添加することによ
り、ゲル媒体層は可塑性を有するようになり、裁断加工
時に壊れることがなくなり、またゲル媒体層は乾燥時に
も可塑性を有するようになり、もろさが改良され壊れに
くくなるとの利点がある。また、水溶性ポリマーの分子
量および添加量を選択することにより、ゲル媒体の粘度
をコントロールすることもできる。
本発明において、ゲル媒体層にはアガロースを含有させ
ることができる。アガロースは、公知のアガロースであ
れば特に制限はなく、低電気浸透性、1中電気浸透性、
高電気浸透性アガロースのいずれをも用いることができ
る。用いることのできるアガロースの例としては特開昭
55−5730号、特開昭55−110946号、特表
昭57−502098号等の公報に開示されているアガ
ロース等がある。
アガロースの添加量は、単量体と架橋剤とを含むゲル組
成液の容積に対して約Q 、 2 w / v%から約
2 w / v%、jlfましくは約0.3w/v%か
ら約1.2w/v%の割合で用いられる。
本発明においては、ゲル媒体層にアガロースが添加され
ているため、ゲル形成用溶液温度を変化させることによ
り、適当な溶液粘度にコントロールすることが+jJ能
となり、その流動性を止めることができ、またゲル媒体
層を成形する特番こは成形しやすくなるとの利点がある
本発明のゲル媒体層にはPH緩衝剤を含有させることが
できる。緩衝剤としては、pH8,0から10.0、好
ましくはpH8,0から9.0の範囲内のpH値に緩衝
できる緩衝剤fあれば、I、Xずれをも用いることがで
きる。用いうる緩衝剤としては、日本化学全編「化学便
覧 基礎編1 (東京、入着■ 1866年発行) 1
312−1320ベージ;lr[1ata for B
ioche;1cal Re5earch U  (R
,M、C。
Dawson  et al 1g  第2版、 0x
ford at the C1arendon Pre
ss、1989年発行) 47B−508ページ;11
  Biochemistry j  、  5,46
7(1986)  ;tl’Analytical B
iochemistry j 104300−310(
1!380)等の刊行物に記載の緩衝剤があげられる。
そして、その具体例としてはトリス(ヒドロキシメチル
)アミノメタン(Tris)  [CAS Regis
try N。
77−88−1 ] 、 N 、 N−ビス(2−ヒド
ロキシエチル)グリシン、(Bicirre) 、 N
 −2−ヒドロキシエチルピペラジンーN′−2−ヒド
ロキシエチルくソー3−スルホン酸のNa塩また4よに
塩等、N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N“−3
−プロパンスルホン酸のNa塩またはに塩等、N−[ト
リス(ヒドロキシメチル)メチル]−3−アミノプロパ
ンスルホン酸のNa塩またはに塩および、これらのいず
れかと必要により組合せられる酪、アルカリまたは塩等
をあげることができる。
特に好ましい緩衝剤の例としては、Tris、ホウ酸お
よびEDTA・2Na塩の組合せ(pH8,3)かある
本発明においてゲル媒体層はアクリルアミドに代表され
る単量体、二官能性のアリル(allyl )化合物ま
たはアクリル化合物(架橋剤)、水溶性ポリマー、およ
び7カロースを実質的に均一に溶解させた水溶液中で単
量体と架橋剤とをラジカル架橋重合させて得られるもの
であり、単量体と架橋剤から形成された三次元架橋重合
体に水溶性ポリマーとアガロースが実質的に分散されて
、後二者のポリマー釦が三次元架橋重合体とからみあっ
ている構造を有すると推定され、この構造が特徴をなす
ゲル媒体層である。
」二記のラジカル架橋重合反応は、分子状酸素の不存在
下で過酸化物の存在および/または紫外線照射等の公知
の方法により発生させることができる。この反応を加熱
および紫外線照射により加速することもできる。
ラジカル架橋重合用触媒としては、r Electr。
phoresis J 1981.2L213−211
11.同1+381. g、 220−228 ;古木
、水弁編「最新電気泳動法J  (1973年発行)等
に記載の公知の低温ラジカル重合開始剤のうちから適宜
選択して用いることができる。
好ましいラジカル重合開始剤の具体例としては、β−ジ
メチルアミノプロピオニトリル(DMAPN)−ペルオ
クソニ硫酸アンモニウム混合物、N、N、N’ 、N″
−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)−ペル
オクソニ硫酸アンモニウム混合物、TEMED−リボフ
ラビン混合物、TEMED−リボフラビン−過酸化水素
混合物と紫外線照射の組合せ等が挙げられる。ラジカル
重合開始剤の含有量は、単量体と架橋剤の合計重量に対
して約0.3重量%から約5重量%、そして好ましくは
約0.5重量%から約3重量%の範囲である。
本発明においてゲル媒体層は、平滑な親木性表面を有す
る電気絶縁性支持体の上に設けられた前述の接着層の上
にゲル形成液を公知の方法により塗布して設けたのち、
ゲル形成液を架橋重合させることにより、ゲル層に成形
することができる。
支持体については前述したが、さらに具体的には、ガラ
ス板、親木性ポリマーまたは公知の表面処理により表面
を親水化したポリマー(例、ポリエチレンテレフタレー
ト、ビスフェノールAのポリカルポネー!・、ポリ塩化
ビニル、塩化ビニリデン・塩化ビニルコポリマー、ポリ
メチルメタアクリレ−1・、ポリエチレン、ポリプロピ
レン、セルロースアセテート類、セルロースアセテート
フロビオネート等)のフィルム、板またはシート等の成
形物をあげることができる。これらのポリマー成形物の
表面を親水化するための処理としては、紫外線照射、グ
ロー放電処理、コロナ放電処理、火焔処理、電子線照射
、ケミカルエツチング、電解エツチング等の公知の方法
を適用することができる。
ゲル形成液を支持体の表面で架橋重合させる場合には、
ゲル形成液の上をさらに力へ−フィルム、シートまたは
板などの被覆材料でおおうことができる。この目的に使
用されるカバーフィルム、シート、または板としては前
記支持体と同様な素材からなるものを用いることができ
る。この被覆材料の厚さは300yLm以下であり、実
用的に好ましい範囲としては約4pm〜約2007t’
m;尋で ある。
被覆材ネ4が厚い(例えば、約70gm〜約300pm
)場合には、被覆材料の上にゲル形成液を塗布し、架橋
重合によりゲル媒体層を形成し、その後に本発明の接着
層を設けた支持体をラミネートして三層構造を形成する
方法を利用することもできる。
ゲル媒体層には、必要に応じて抗酸化剤を含有させるこ
とができる。抗酸化剤としては、ゲル電気泳動媒体に配
合しうることが知られている種々の化合物を用いること
ができる。抗酸化剤の具体例としては、ジチオスレイト
ール、2−メルカプトエタノールを挙げることができる
その他の添加剤としては湿潤剤があり、ゲル媒体層には
グリセリン、エチレングリコール等のポリオール化合物
を含有させることもできる。ポリオール化合物の含有量
は、ゲル媒体の容積#ご対して約5 w / v%から
約40w/v%の範囲から選ばれる。ポリオール化合物
のうちではグリセリンか特に好ましい。湿潤剤を配合す
ることによりゲル媒体層の保存時の極端な水分の蒸発に
よる乾燥を防ぐことがti)能となり、また極端な乾燥
に起因するもろさを防ぎ、ひびわれを防ぐ等のゲル媒体
層の物性が改善されるとの利点がある。
本発明のゲル媒体材料は、前述の諸文献等に記載の公知
の方法に従って、水平型および垂直型平板電気泳動法、
ディスク電気泳動泳動法等のいずれにも用いることかで
きる。
以下に本発明の実施例を記載するが、これらは本発明の
範囲を限定するものではない。
[実施例1] 紫外線照射処理により表面を親水性にしたポリエチレン
テレフタレー1−CPET)シート(支持体)」、に約
0.5gmの厚み(固形分)になるように第1表記載の
ポリマーを塗布し、約110 ’0で乾燥して、接着層
つき支持体を製造した。
第1表 接着層形成用塗布液の組成 試料    ポリマー     ポリマー濃度I   
  P−A         5 g2P−B4.5g BIS         0.5g 3     F−15g 4     P−35g 5     F−65g 訂)ポリマー濃度は上記の量のポリマーに水を加えて塗
布液の容積を100mJJとしたことを意味する。P−
AとP−Bは、次に示す構成繰返し単位を右する二元コ
ポリマーである。
ここで、X、yはモル百分率であり、R”は下記の置換
基を示す。
P−A   x=80.7==20 R”  = C0NHC(CH3)  2 GHz C
0CH5P−B     x=87 、 y = 13
R”  = GONHC(C)13 )  2 GH2
GOCH3BISはN、 N−メチレンビスアクリルア
ミドを、そしてP−1,P−3、およびP−6は前述の
該当する式により表わされる三元コポリマーを意味する
まず、接着層つきPETシート(支持体)について、支
持体と接着層との間の接着性をクロスカット法によりB
t価した。その結果、試料番号3.4および5(本発明
に従う試料)の接着層は接着性が良好であったが、試料
番号lおよび2(比較試料)については、かなりの部分
でシートと接着層間に剥離がみられた。
支持体−Lに設けられた各接着層の」二に、アクリルア
ミドl l 、87g、BI3630mg、尿素42g
、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタy [CA’
S  Registry No 7?−86−1] 1
 、08 gホウ酸0.55gおよびEDTA−2Na
塩93 m gを含有する100mMの溶液に重合開始
剤として過硫酸アンモニウム(5wt%)1.3mm、
TEMED33pJ1を加えたものを0.5mmの厚み
で成形し、ポリアクリルアミドゲル膜を得た。
得られたゲル膜を指でおさえ、ゲル膜と支持体間の接着
性を評価した。その結果、試料番号3.4および5(本
発明に従う試料)を接着層とした場合、接着性が優れて
いたが、試料番号lおよび2(比較試料)については接
着性が劣っていた。
[実施例2] 実施例1の第1表と同しポリマーを用いて接着層つきP
ETシート (支持体)を製造し、この接着層の上にア
クリルアミド11.87g、BIS630 m g、ア
ガロース1600(和光紬薬■製)0.3g、ポリアク
リルアミド2.5g、トリス(ヒドロキシメチル)アミ
ノメタン1.08g、ホウ酸0.55g、およびEDT
A−2Na塩93mgからなる100m文の溶液に重合
開始*IIし・lプシ、ル1L功融7”/!コ【:、−
+41/c++Ao/z+□mfL、TEMED33I
Luを加えたものを0.5mmの厚みで成形し、ポリア
クリルアミドゲル膜を得り。
このゲル11りを使用して、32P−DNAをマキサム
・ギルバート分解した試料について電気泳動にかけ、D
NA塩基配列決定の実験を行なった。電気泳動後にゲル
膜を、脱尿素とDNA固定のために、10%酢酸水溶液
中に1時間浸漬した。このゲル膜を乾燥し、次いでオー
トラジオグラフィー処理を常法にしたがって行なった。
10%酢酸水溶液中にゲル膜を浸漬した時の支持体とケ
ル膜の接着状態を観察した。
試料番号1(比較試料)の接着層の上に形成されたゲル
膜は支持体から完全に剥離し、また、試料番号2(比較
試料)については、ゲル膜は一部支持体に接着した部分
があるものの、その大部分は支持体から剥離していた。
−・方、試料番号3〜5(本発明に従う試料)の接着層
の上に形成ぎれたゲル膜は、いずれも支持体上に完全に
接着していた。更にゲル膜を乾燥させだ後、それと支持
体との間の接着状態を観察したところ、ゲル膜はいずれ
も支持体によく接着していた。またオートラジオグラフ
ィー処理した後も、接着性に問題はなく良好な結果を示
した。
[実施例3] 実施例2と同様にして接着層つきPETシートの接着層
の上にポリアクリルアミドゲル膜を形成した。このゲル
膜を支持体ごと裁断加工したのち、ゲル膜の切口を観察
したところ、試料番号1〜2(比較試料)の接着層の上
に形成されたゲル膜についてはゲル膜の剥離が一部観察
されたのに対して、試料番号3〜5(本発明に従う試料
)についてはいずれも裁断口の接着性は良好で、支持体
ごと裁断加工できることがわかった。
代理人    弁理士   柳川泰男

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、)記の各層が順次積層されてなる三層構造を含む゛
    1L気泳動川媒用材$4= [I]支持体層; [II]−11U式(1)乃至(3)のいずれかにより
    表わされる構成繰返しC1i位を有するポリマーを含有
    する接箔層: [般式(1)において、 R11は水素原子または1から6個の炭素原子を有する
    アルキル基である:  Il Qlは−COO−1−CON−1または6から10例の
    炭素原子を有する7リーレン基等の二価の基、   Il 1・ Llは、−COO−あるいは−〇〇N−の結合1のいず
    れかを少なくとも1個含み、かつ3から15個の炭素原
    子を有する二価の基、または、 11 −0−−N−1−co−−so−1 II 一5O2−1−SO3−1−3O2N−1ずれかを少な
    くとも1個含み、かつlから12個の炭素原子を有する
    二価の基である(ただしR11は前述と同義である); R12は−CH=CH2又は−CH2CH2K”のいず
    れかである(ただし、Xlは求核基により1δ換される
    基、あるいは塩基によってHX’の形で脱離しうる基を
    表わす); A1はその左側に示した各モノマ一単位とへ重合呵能な
    エチレン性不飽和モノマーから誘導された−価のノルで
    ある。 xl、  ylおよびzlはモル自分率を表わし、Xi
    はO〜99、ylは1〜99、zlは1〜99のイ11
    □(をとる] [般式(2)において、 R”は水素原子または1から6個の炭素原子を不Jする
    アルキル基である; R22は−CH=CH2又は−CH2CH2X2である
    (ただし X2は求核基によって置換されうる基、また
    は塩基によってHX2の形で脱離しうる基を表わす); L2は、lから6個の炭素原子を有するアルキレン基、
    6から12個の炭素原子を有するアリーレン基、−CO
    Z2−で表わされる基、および−COZ2R23−で表
    わされる基(ただし、R23は1から6個の炭素原子を
    有するアルキレン基あるいは6から12個の炭素原子を
    有するアリーレン基であり、そしてZ2は酸素原子ある
    いはNHである)から選はれる二価の基である;A2は
    その左側に示した各千ツマ一単位と共重合Of能なエチ
    レン性不飽和モノマーから誘導された二価の基である; X2、ylおよびz2はモル百分率を表わし、X2はO
    〜99.ylは1〜99、z2は1〜99の値をとる] [−・般式(3)において、 1’(31は水素原子、または1から6個の炭素原子を
    有するアルキル基である; L3は1から20個の炭素原子を有する二価の連結基で
    ある; X3は活性エステル基である; A3はその左側に示した各モノマ一単位と共重合可能な
    エチレン性不飽和モノマーから誘導されたニイ曲の基で
    ある; x3、y3およびZ3はモル百分率を表わし、×3は0
    〜99、y3は1−99、Z3は1〜99のイ直をとる
    ; mはOあるいは1である] [lrl アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の右在
    ドで架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、
    および変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基を
    もつ化合物を含む電気泳動用媒体層。 2゜電気泳動用媒体層がさらに水溶性ポリマーおよびア
    ガロースを含むことを特徴とする特許請求の範囲第1項
    記載の電気泳動用媒体材料。 3゜前記変性剤が尿素またはホルムアミドである特許請
    求の範囲第1項または第2項記載の電気泳動用媒体材料
    。 4゜支持体層がプラスチックシートからなることを特徴
    とする特許請求の範囲第1項もしくは第2項記載の電気
    泳動用媒体材料。 5゜プラスチックシートがポリエチレンテレフタレーI
    ・からなることを特徴とする特許請求の範囲第4項記載
    の電気泳動用媒体材料。 6゜接着層が、一般式(1)の構成繰返し単位を有する
    ポリマーを含有するものであることを特徴とする特許請
    求の範囲第1項記載の電気泳動用媒体材料。
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