JPS6266153A - 電気泳動用媒体 - Google Patents

電気泳動用媒体

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JPS6266153A
JPS6266153A JP60206090A JP20609085A JPS6266153A JP S6266153 A JPS6266153 A JP S6266153A JP 60206090 A JP60206090 A JP 60206090A JP 20609085 A JP20609085 A JP 20609085A JP S6266153 A JPS6266153 A JP S6266153A
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electrophoresis
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充 杉原
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    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C08ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08FMACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52Amides or imides
    • C08F220/54Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/56Acrylamide; Methacrylamide

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野コ 本発明は核M(DNA、 RNA)塩基配列決定のため
に用いられるポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用
媒体に関するものであり、特にゲル媒体の核酸塩基フラ
グメントの分離性能および泳動像の読取り易さを改善し
たポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体の組成
に関するものである。
[従来技術] 化学分解法、ジデオキシ法等による核酸(DNA 。
RNA)の塩基配列決定法においてはポリアクリルアミ
ド水性ゲル膜を用いたスラブ電気泳動が必須の操作にな
っている。この目的に用いられるポリアクリルアミド水
性ゲル膜は2通常アクリルアミドのような単量体約95
重量部とN、N’−メチレンビスアクリルアミドのよう
な二官能性または多官能性の架橋剤約5重量部の混合物
と重合開始剤を含む約3−%〜約30w%水溶液中で単
量体と架橋剤を架橋重合させることにより形成しており
、核酸フラグメントの分離能を向上させるためにゲル膜
の薄層化が行われている。
しかしながら、現在用いられているポリアクリルアミド
ゲル膜は薄層化すると、第2図に模式的に示すように、
核酸フラグメントの高分子量部分の泳動像バンドが、泳
動方向に垂直な方向(バンドの幅方向)に広がり、かつ
個々の分離像に歪を生じるので、オートラジオグラム上
での泳動像の読取りが困難という問題がある。
一方、特開昭60−60548明細書等にゲル膜の湿潤
剤としてグリセロールをゲル媒体の容積に対して約1 
w/v%から約40讐/V%の範囲で添加しうろことが
記載されている。グリセロールは、その添加量が下限値
の近傍では湿潤効果が小さすぎて不十分であるために注
目されていなかった。また、添加量を多くするとゲル媒
体が柔らかくなり、伸びが大きくなり、殊にゲル膜とし
て用いる場合に取扱い性が悪くなる傾向が見出されてい
た。ところがグリセロールを、湿潤効果はないと考えら
れる少量添加することにより前述の泳動像バンド幅の広
がりと分離像の歪が解消することが見出され9本発明に
到達した。
[発明の目的コ 本発明の目的はポリアクリルアミド系水性ゲル膜(以下
、ゲル膜ということがある)の核酸(DNA 。
RNA)フラグメントの高分子量部分の泳動像バンド幅
(泳動方向に垂直な方向)の広がりおよび分離像(個々
のフラグメント像)の歪が解消され1分離能が向上した
ポリアクリルアミド系水性ゲル膜を提供することである
本発明の他の目的は7![層のゲル膜においても泳動像
バンド幅の広がりと分離像(個々のフラグメント像)の
歪が解消され2分離能が向上したポリアクリルアミド系
水性ゲル膜を提供することである。
本発明の他の目的はゲル膜の伸びが少なく取扱いが容易
なポリアクリルアミド系水性ゲル膜を提供することであ
る。
[発明の構成] 本発明は、アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、
および変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基を
もつ化合物を含む電気泳動用媒体において、さらにグリ
セロールな少量含む電気泳動用媒体である。
[発明の構成の詳細な説明] 本発明においてアクリルアミド系化合物(単量体)と架
橋剤は、水溶液または水分散液として水に溶解または分
散させておき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合
した水性ゲル媒体を形成させる。本明細書においては特
にことわらないかぎり、(水に)溶解とぐ水に)分散の
両名を含めて単に(水に)溶解といい、水溶液と水分散
液の両者を含めて単に水溶液という。溶媒または分散媒
としては、水だけでなく、所望により加えられる有機溶
媒を含む水−有機溶媒混合物をも包含する。
本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物(
単量体)の例としては、アクリルアミド。
N−メチルアクリルアミド、 N、N−ジメチルアクリ
ルアミド、N−(ヒドロキシメチル)アクリルアミド。
ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログ
がある。これらの化合物は単独で、または2種以上を組
合せて用いることができる。これらの化合物のうちでは
アクリルアミドが好ましく。
またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の1
種以上との併用も好ましい。
架橋剤としてはr E Iectrophoresis
J 2(4)+213−219(193+)、同誌2(
4)、220−228(1981)等に記載の二官能性
架橋剤化合物、特願昭59−1.22662等に記載の
三官能性以上の架橋剤化合物を用いることができる。二
官能性架橋剤の具体例として、 N、N’−メチレンビ
スアクリルアミド(B I S)、 N、N’−プロピ
レンビスアクリルアミド(PBA、)、ジアクリルアミ
ドジメチルエーテル(DA、E)、 1.2−ジアクリ
ルアミドエチレングリコール(D E C)、エチレン
ウレアビスアクリルアミド(E U B)、エチレンジ
アクリレート(E D A)、 N、N’−ジアリルタ
ルタルジアミド(D A T D )、N、N’−ビス
アクリリルシスタミン(BAC)がある。二官能性架橋
剤の具体例として、1,3.5− )リアクリロイルヘ
キサヒトローS−トリアジン(TAHT)、)リアリル
シアヌレート(TAC)、)リアリルイソシアヌレー)
(TAIC)等がある。これらの架橋剤の、うちではB
ISとTAHTが好ましい。架橋剤は2種以上を刊合わ
せて用いることもてきる。
架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重塁に対して約1
w%から約30w%、好ましくは約2w%から約10w
%の範囲で用いられる。
本発明の電気泳動媒体にはアガロースを添加することか
できる。アガロースとしては特開昭55−5730 、
特開昭55−110946 、特表昭57−50209
8 、特開昭59−126236等に記載の低電気浸透
性アガロース、中電気浸透性アガロース、高電気浸透性
アガロースのいずれも用いることができる。アガロース
の添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対し
て約0.2讐/V%から約2.0讐/V%、好ましくは
約0.3讐/V%から約1.2讐/V%の範囲である。
本発明の電気泳動媒体には水溶性ポリマーを添加するこ
とができる。水溶性ポリマーとしては特開昭59−12
6236 、特開昭60−60548等に記載の分子量
約1万から約100万の範囲の付加重合型または縮重合
型の水溶性の非イオン性ポリマーを用いることができる
。付加重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの例として
ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドンがある。縮重合型の水溶性の非イオン性ポ
リマーの例としてポリエチレングリコール、ポリプロピ
レングリコールがある。これらの水溶性ポリマーのうち
ではポリアクリルアミドとポリエチレングリコールが好
ましい。水溶性ポリマーの添加量は単量体と架橋剤の合
計重量に対して約2−%から約100w%、好ましくは
約9%から約50−%の範、囲である。アガロースおよ
び/または水溶性ポリマーをゲル媒体に添加する場合に
は、その添加時期は通常単量体と架橋剤を水に溶解する
時からポリアクリルアミド系水性ゲルの形成時までの間
が好ましい。
変性剤としては少なくとも1個のカルバモイル基をもつ
化合物が用いられる。その具体例として尿素、ホルムア
ミド等がある。変性剤の添加量は単量体と架橋剤を含む
水性ゲルの容積に対して約40w/v%から約60w/
v%の範囲である。変性剤として尿素を用いる場合には
、単量体と架橋剤を含む水性ゲル11に対し約6モル(
約360g)から飽和溶解ff1(約420g)まで、
好ましくは約7モルから飽和溶解量までの範囲で用いら
れる。変性剤は添加量が多いので、その添加時期は通常
単量体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解する時が好まし
い。
本発明のポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体の
特徴をなすグリセロールの添加量は単量体と架橋剤を含
む水性ゲル媒体の容積に対して約0.1讐/V%から約
1.0讐/V%、好ましくは約0.3讐/V%から約帆
8w/v%までの範囲である。グリセロールの添加時期
は通常単量体、架橋剤を水に溶解する時から水性ゲルの
形成時までの間が好ましい。
本発明の電気泳動用ゲル媒体には公知のpH緩衝剤を含
有させて電気泳動実施時のpt+値を8.0から9.0
の範囲に調節することができる。用いうる塑衝剤として
は2日本化学会編「化学便覧 基礎編」(東京、丸善■
、1966年発行) 1312−1320頁、RlM、
 C、D awson et a1編rData fo
r BiochemicalResearchJ第2版
(Oxford at the C1arendonP
 ress、 1969年発行)476−508頁、r
 B iochemistryJ5.467頁以降’(
1966年)、 rAnalytical  Bioc
hem−istryJ LLL、 300−310頁(
,1980年)等に記載のpi+緩衝剤系がある。pH
1illF衝剤の具体例として、トリス(ヒドロキシメ
チル)アミノメタン(Tris)、 N、N−ビス(2
−ヒドロキシエチル)グリシン(Bicine)、 N
−2−ヒドロキシピペラジン−N’−2−ヒドロキシプ
ロパン−3−スルホン酸Na塩またはに塩等、N−2−
ヒドロキシエチルピペラジン−N′−3−スルホン酸N
a塩またはに塩等、N−[: )リス(ヒドロキシメチ
ル)メチルコー3−アミノプロパンスルホン酸Na塩ま
たはに塩等、およびこれらのいずれかと必要により組合
せられる酸。
アルカリまたは塩がある。好ましいpH緩衝剤系の例と
してTris−(11酸−EDTA−2Na塩(pH8
,2〜8.3用組成)がある。
本発明の電気泳動用媒体は実質的に無色透明であること
が泳動像の検出または読取りに一般的に好ましい。
本発明の電気泳動用媒体を電気泳動媒体膜として用いる
場合には、実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な
表面のシート状(フィルム状、または平板状)支持体の
上に設けるのが好ましい。実質的に電気不伝導性で水不
浸透性の平滑な表面のシート状支持体としては公知のガ
ラス板、有機ポリマーシート等を用いることができる。
有機ポリマーシート・の具体例としてポリエチレンテレ
フタレート、ビスフェノールAのポリカルボネート、ポ
リスチレン、セルロースエステル(例、セルロースジア
セテート、セルローストリアセテート、セルロースアセ
テートプロピオネート等)等のポリマーからなる厚さ約
50μmから約1mm 、好ましくは約80umから約
500μmの範囲の透明な、すなわち波長約200nu
nから約900止の範囲内の少なくとも一部の範囲の波
長の電磁輻射線を透過させる平滑な表面を有するシート
状または平板状の支持体がある。有機ポリマー支持体を
用いる場合にはその表面を親水化しゲル媒体膜との接着
を良好にするために、紫外線照射、グロー放電処理、コ
ロナ放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチ
ング、電解エツチング等の公知の表面処理方法を適用す
ることができる。有機ポリマー支持体の表面には必要に
応じて特開昭59−164950 、特開昭59−21
2752 、特願昭59−50294.特願昭59−9
6152.特願昭59−136247゜特願昭59−1
03307等に記載の下塗層または接着層を設けて支持
体の上に設けられる水性ゲル媒体膜と支持体との接着を
強固にすることができる。
本発明の電気泳動用媒体は前述の諸成分とラジカル重合
開始剤組成物を含む水溶液(以下、ゲル形成液というこ
とがある)を平面状支持体の上に層状に流延または塗布
し1分子状酸素の不存在下で、必要により紫外線照射お
よび/または加熱して、単量体(アクリルアミド系化合
物)と架橋剤とが架橋重合したポリアクリルアミド系ゲ
ル媒体膜として製造され用いられる。
ラジカル重合開始剤組成物としてはr E 1ectr
o−phoresisJi(4)、213−219(1
981)、同誌2(4)、220−228(1981)
、特開昭59−126236 、青水、永井編「最新電
気泳動法J(1973年発行)等に記載の低温ラジカル
重合開始剤組成物のうちから適宜に選択して用いること
ができる。ラジカル重合開始剤組成物の例として、β−
(ジメチルアミノ)プロピオニトリル(DMDPN’)
−ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物; N、N、N
’、N’−テトラメチルエチレンジアミン(TEMED
)−ベルオクソニ硫酸アンモニウム混合物;TEMED
−リボフラビン混合物;TEMED−リボフラビン−過
酸化水素混合物(この系の場合には紫外線照射する)等
がある。ラジカル重合剤組成物の添加量は、単量体と架
橋剤の合計重量に対して約0.3w%から約5.0讐%
、好ましくは約0.5w%から約3.0w%の範囲であ
る。
本発明の電気泳動媒体はゲル濃度として、S。
Hjerten : rArchives of B 
iochemistry andB 1ophysic
s」l、(5upp1.)、147−151(1962
)に記載の定義に従って表示して、単量体、架橋剤およ
び水からなるゲル媒体の容積に対して、単量体と架橋剤
の合計量が約3 w/v%から約30w/v%の範囲で
用いられる。
本発明の電気泳動媒体ゲル膜の厚さは約50pmから約
5mm、好ましくは約80μmから約500μmの範囲
である。本発明のゲル膜は薄層化しても泳動像バンド幅
の広がりと分離像(個々のフラグメント像)の歪の発生
が実質的にないので、ゲル膜の厚さを約50umから約
300μmのNNにして泳動像の解像度を高めることが
できる。
ゲル形成液を平面状の支持体の表面上で架橋重合させる
場合には、ゲル形成液の流延塗布とその後の架橋重合を
窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存在下で実施する
か、あるいは流延塗布したゲル形成液の表面上に直ちに
カバー用フィルム。
シートまたは板等の被覆材料で覆い架橋重合させること
が好ましい。この目的に使用される被覆材料としては前
述の平面状支持体と同様な素材からなるものを用いるこ
とができる。カバーフィルムが有機ポリマーフィルムで
ある場合、その厚さは約300pm以下であり、実用的
な範囲としては約4μmから約200um+好ましくは
約約4μmから約1100uである。被覆材料がガラス
板の場合、その厚さは平面状ガラス板と同様な厚さであ
ればよい。
本発明の電気泳動用媒体は公知のポリアクリルアミド系
水性ゲル媒体と同様にして調製することができる。また
1本発明の電気泳動用媒体はゲル膜にして前述の諸文献
や特許明細書等に記載の公知の方法に従って、水平型お
よび垂直型スラブ電気泳動法等に用いることができる。
(以下余白) 実施例1および比較例1 平滑表面の厚さ2mm、サイズ20cm X 40cm
の長方形の平面状ガラス板(支持体)を水平におき、縁
辺部に厚さ200μm、輻10mmのスペーサー板を固
定し。
ガラス支持体の上に第1表に示す組成のゲル形成液を流
延し、液層の上に支持体と同じガラス板を重ね合せ静置
し2枚のガラス板の間で架橋重合させて厚さ200μm
のポリアクリルアミド水性ゲル膜を形成した。
得られた2種のゲル膜を用いてDNA塩基配列決定用の
泳動像の読取り実験をジデオキシ法により調製された試
料を用い常法に従い実施した。その結果、グリセロール
を0.5w/v%含む本発明のゲル膜lでは、オートラ
ジオグラムの各泳動像とも高分子量フラグメント部分の
バンド幅WHと低分子量フラグメント側部分のバンド幅
W L (第1図参照)との比WH/WLが平均1.0
5で高分子量フラグメント部分でバンド幅広がりと個々
の泳動像の歪は実質的になく、その部分で泳動像の読取
りが容易にかつ正確にできた。一方、従来技術であるグ
リセロール不含の比較ゲル膜2では全泳動像の高分子量
フラグメント部分て比WH/WLが平均1.13でバン
ド幅広がりと個々の泳動像の歪があり、その部分で泳動
像の読み取りが困難であった。
本発明のゲル膜はDNAの高分子量フラグメント部分の
解像度の向上が明らかである。
(以下余白) 第1表 Q  Tris: トリス(ヒドロキシメチル)アミノ
メタンTEMED 二N、N、N’ 、N’−テトラメ
チルエチレンジアミン実施例2および比較例2 紫外線照射処理で表面を親水性にした平滑表面の厚さ1
80μm、サイズ20cm X 40cmの長方形のポ
リエチレンテレフタレート(PET)シート(支持体)
を水平におき、縁辺部に厚さ200L1m1幅10mm
のスペーサー板を固定し、支持体の上に第2表に示す組
成のゲル形成液を流延し、窒素雰囲気下で架橋重合させ
て厚さ200umのポリアクリルアミド水性ゲル膜を形
成した。
得られた3種のゲル膜を用いてDNAの塩基配列決定の
ための泳動像の読取り実験を実施例1と同様に常法に従
い実施した。その結果、グリセロールを0.5w/v%
含む本発明のゲル膜3では、オートラジオグラムの各泳
動像とも比WH/wLが平均1.18と高分子量フラグ
メント部分でバンド幅広がりは軽減しており2個々の泳
動像の歪はなく、その部分で泳動像の読取りが容易にか
つ正確にできた。一方、従来技術であるグリセロールを
2.0%含む比較ゲル膜4では各泳動像とも比WH/w
Lが平均1.10で高分子量フラグメント部分でバンド
幅広がりは軽減しており2個々の泳動像の歪はなく。
その部分で泳動像の読取りが容易にかつ正確にできた。
グリセロール不含の比較ゲル膜5では全泳動像の高分子
量フラグメント部分で比WH/WLが平均1.45で異
常なバンド幅広がりと歪があり、その部分て泳動像の読
み取りが困難であった。
ゲル媒体膜の弾性率を測定した結果は第2表に記載のと
おりで、グリセロールを0.5%含む本発明のゲル膜3
と従来技術であるグリセロール不含のゲル膜5は伸びに
くくて取扱いが容易であった。
グリセロールを2.0%含む従来技術である比較ゲル膜
4は伸びやすいので取扱いを慎重にする必要があった。
本発明のゲル膜はDNAの高分子量フラグメント部分の
解像度の向上と膜の伸びが少なくて取扱いが容易である
ことが明らかである。
(以下余白) 第2表 fJJ  Tris :)リス(ヒドロキシメチル)ア
ミノメタンTAIIT :1.3.5−トリアクリロイ
ルへキサヒドロ−5−)リアジンTEMED:N、N、
N’ 、N’−テトラメチルエチレンジアミン実施例3
および比較例3 アガロースを加え、スペーサーの厚さを150μmに変
えた他は実施例2と同様にしてPET支持体の上に第3
表に示す組成のゲル形成液を流延し、窒素ガス雰囲気下
で架橋重合させて厚さ150umのポリアクリルアミド
水性ゲル膜を形成した。
得られた2種のゲル膜を用いてDNAの塩基配列決定の
ための泳動像の読取り実験を実施例1と同様にして常法
に従って実施した。
その結果、グリセロールを0.5w/v%含む本発明の
ゲル膜6では各泳動像とも実施例2のゲル膜3と同様に
高分子量フラグメント部分でバンド幅広がりは著しく軽
減し、泳動像の歪はなく、その部分の泳動像の読取りが
容易に正確にできた。従来技術のグリセロール不合の比
較ゲル膜7ては各泳動像の高分子量フラグメント部分で
比較例2のゲル膜5と同様に異常なバンド幅広がりと歪
があり。
その部分て泳動像の読み取りが困難であった。
本発明のゲル膜はDNAの高分子量フラグメント部分の
解像度の向上が明らかである。
第3表 註 アガロース:低電気浸透性、ゲル化温度36℃TA
IIT :I、3.5−トリアクリロイルへキサヒドロ
−5−)リアジンTrisニドリス(ヒドロキシメチル
)アミノメタンTEMED:N、N、N’ 、N’−テ
トラメチルエチレンジアミン[発明の効果コ 本発明のグリセロールを少量含むポリアクリルアミド系
水性ゲル電気泳動媒体は、核酸の高分子量フラグメント
部分でバンド幅広がりが実質的にないか、あるいは著し
く軽減しており1個々の分離像の歪はなく、その部分で
泳動像の読取りが容易に正確にできるので、従来公知の
ポリアクリルアミド系水性ゲル膜と比較して核酸の高分
子量フラグメント部分の解像度が著しく向上するという
効果がある。また本発明のポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体は2弾性率が相対的に大きいので、殊に
薄層ゲル膜として用いる場合に、ゲル膜の伸びが少なく
取り扱いが容易という効果がある。
【図面の簡単な説明】
第1図は、DNA塩基配列読取りのために常法に従って
調製されたDNAフラグメント試料をポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動媒体膜を用いて電気泳動させた泳
動像の1バンドの高分子量フラグメント部分から低分子
量フラグメント部分側にかけての泳動像バンドの模式図
である。 第2図は、泳動像においてDNAの高分子量フラグメン
ト部分でバンド幅広がりが生じた場合の個々の分離像(
フラグメント像)の歪を示す模式図である。 1 :個々の分離像 2 :泳動像バンド Wll:高分子量フラグメント部分のバンド幅WL:低
分子量フラグメント部分側のバンド幅特許出願人 富士
写真フィルム株式会社第1図 第2図 、l/H l− 泳動像バンド 部分のバンド幅 泳動像バンド 高分子量フラグメント 部分のバンド幅 個々の分離像 低分子量フラグメント 部分側のバンド幅

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下に
    架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲル、およ
    び変性剤として少なくとも1個のカルバモイル基をもつ
    化合物を含む電気泳動用媒体において、さらにグリセロ
    ールを少量含むことを特徴とする電気泳動用媒体。
  2. (2)グリセロールの含有量がゲル媒体の容積に対して
    0.1w/v%から1.0w/v%の範囲である特許請
    求の範囲第1項に記載の電気泳動用媒体。
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