JPS6291849A - 電気泳動用媒体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体
の製造方法に間するものであり、さらに詳しくは特に核
酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）の塩基配列決定のために用いる
のに適したポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒
体の製造方法にｌするものである。

［従来技術］ 化学分解法（Ｍａｙａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等）、ジデ
オキシ法等による核酸（ＤＮＡ、　ＲＮＡ）の塩基配列
決定法においては通常変性剤として尿素またはホルムア
ミドを大量に含有させたポリアクリルアミド水性ゲル膜
（以下、ゲル膜ということがある）を用いたスラブ電気
泳動が必須の操作になっている。近年遺伝子関連技術の
研究開発が進むにつれて核酸塩基配列決定のための高分
解能を有するポリアクリルアミド水性ゲルの開発が熱望
されている。この目的に用いられるゲル膜は１通常アク
リルアミドのような単量体約９５重量部とＮ、Ｎ’−メ
チレンビスアクリルアミドのような二官能性または多官
能性の架橋剤約５重量部の混合物と重合開始剤を含む約
３讐％〜約３０−％水溶液中で（変性剤も共存させる）
単量体と架橋剤を架橋重合させることにより形成してお
り、塩基フラグメントの分離能を向上させるためにゲル
膜の薄層化が行われている。

従来重合開始手段として、過酸化物−還元剤の組合せ、
あるいは過酸化物−還元剤一光増感剤一励起光の組合せ
、が採用されており、還元剤は必須と考えられていた。

従来採用されてきた重合開始手段の具体例として、β−
ジメチルアミノプロピオニトリル（ＤＭＡＰＮ）−ペル
オクソニ硫酸アンモニウムの組合せ、　Ｎ、Ｎ、Ｎ’、
Ｎ’−テトラメチルエチレンシアミン（ＴＥＭＥＤ）−
ベルオクソニ硫酸アンモニウムの組合せ、ＴＥＭＥＤ−
過酸化水素−リボフラビンに紫外線照射の組合せ等があ
り、　ＤＭＡＰＮやＴＥＭＥＤは還元剤である。

しかしながら、アクリルアミド系化合物と架橋剤の混合
物水溶液に上記のような重合開始剤を加えると、すくに
アクリルアミド系化合物と架橋剤の重合が始まり、水溶
液の粘度が増し始め、数分から数時間、多くの場合１５
〜２０分経過するとゲル化してしまう。すなわち、モノ
マー（アクリルアミド系化合物と架橋剤の混合物）に重
合開始剤を加えた水溶液（以下、ゲル形成液ということ
がある）は経時安定性が極めて低く、ゲル膜作成操作に
は、迅速さと熟練とを必要としていた。また。

特開昭５９−１２６２３６．特願昭５９−１２２６６２
明′Ｓ書等に記載のモノマー（アクリルアミド系化合物
と架橋剤の混合物）にアガロース（必要に応じてさらに
ボリアクルアミド等の非イオン性水溶性ポリマーを加え
る）９重合開始剤を加えた水溶液（以下。

これらの水溶液もゲル形成液ということがある）を長尺
ポリマー支持体に連続塗布してゲル膜を形成する場合に
は、ゲル形成液が時間の経過につれて粘度が高まるので
、ゲル膜厚の不均一、電気泳動による核酸塩基フラグメ
ントの泳動像の歪、核酸塩基フラグメントの読み取り可
能数の低下等の諸種の欠陥が生じ、ゲル膜の連続大量生
産において大きな問題点であった。

［発明の目的］ 本発明の目的は、支持体への塗布前に生ずるゲル形成液
の粘度増大とゲル化を防止して、高分解能ポリアクリル
アミド系水性ゲル膜を容易に大量に製造する方法を提供
することにある。

［発明の構成］ 本発明は、アクリルアミド系単漬体、架矯剤、水。

分子中に少なくとも１個のカルバモイル基をもつ変性剤
、および重合開始手段の存在下に架橋重合させて、電気
泳動による核酸塩基配列決定に使用するポリアクリルア
ミド系水性ゲルを製造する方法において、前記重合開始
手段が過酸化物、光増感剤および励起光の組合せからな
り還元剤を含まない方法である。

［発明の構成の詳細な説明コ 本発明においてアクリルアミド系化合物（単量体）と架
橋剤は、水溶液または水分散液として水に溶解または分
散させておき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合
した水性ゲル媒体を形成させる。本明細書においては特
にことわらないかぎり、（水に）溶解とく水に）分散の
両者を含めて単に（水に）溶解といい、水溶液と水分散
液の両者を含めて単に水溶液という。溶媒または分散媒
としては、水だけでなく、所望により加えられる有機溶
媒を含む水−有機溶媒混合物をも包含する。

本発明に用いることができるアクリルアミド系化合物（
単量体）の例としては、アクリルアミド。

Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド。

ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログ
；メタクリルアミドがある。これらの化合物は単独で、
または２種以上を組合せて用いることができる。これら
の化合物のうちではアクリルアミドが好ましく、またア
クリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の１種以上
との併用も好ましい。

架橋剤としてはｒ　Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ｊ２（４）、２１３−２１９（１９８１）、同誌２（４
）、２２０−２２）１（１９８１）等に記載の二官能性
架橋剤化合物、特願昭５９−１２２６６２等に記載の三
官能性以上の架橋剤化合物を用いることができる。三官
能性架橋剤の具体例として、　Ｎ、Ｎ’−メチレンビス
アクリルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ）　；Ｎ、Ｎ’−プロピレ
ンビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；ジアクリルアミドジ
メチルエーテル（Ｄ　Ａ　Ｅ）　；　１．２−ジアクリ
ルアミドエチレングリコール（Ｄ　Ｅ　Ｇ）　；エチレ
ンウレアビスアクリルアミド（Ｅ　Ｕ　Ｂ）　；エチレ
ンジアクリレ−）（ＥＤＡ）；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタル
タルジアミド（Ｄ　Ａ　Ｔ　Ｄ）：ＩＪ、Ｎ−ビスアク
リリルシスタミン（Ｂ　Ａ　Ｃ）がある。三官能性架橋
剤の具体例として、Ｉ、３．５−　）リアクリロイルへ
キサヒドロ−Ｓ−トリアジン（ＴＡＨＴ）；　）リアリ
ルシアヌレート（ＴＡＣ）；　）リアリルイソシアヌレ
ート（ＴＡ■Ｃ）等がある。これらの架橋剤のうちては
ＢＩＳとＴＡＨＴが好ましい。架橋剤は２種以上を組合
わせて用いることもできる。

架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約Ｉ
Ｗ％から約３０ｗ％、好ましくは約２ｗ％から約１０ｗ
％の範囲で用いられる。

本発明の方法で製造する電気泳動媒体にはアガロースを
添加することができる。アガロースとしては特開昭５５
−５７３０　、特開昭５５−１１０９４６　、特表昭５
７−５０２０９８　、特開昭５９−１２［３２３６等に
記載の低電気浸透性アガロース、中電気浸透性アガロー
ス、高電気浸透性アガロースのいずれも用いることがで
きる。アガロースの添加量は’１ｆｆｉ体と架橋剤を含
む水性ゲルの容積に対して約０．２ｗ／ｖ％から約２．
Ｏｗ／ｖ％、好ましくは約０．九／■％から約１．２ｗ
／ｖ％の範囲である。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体には水溶性ポリ
マーを添加することができる。水溶性ポリマーとしては
特開昭５９−１２６２３６．特開昭６０−６０５４８等
に記載の分子量約１万から約１００万の範囲の付加重合
型または縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマーを用い
ることができる。付加重合型の水溶性の非イオン性ポリ
マーの例としてポリアクリルアミド、ポリビニルアルコ
ール、ポリビニルピロリドンがある。縮重合型の水溶性
の非イオン性ポリマーの例としてポリエチレングリコー
ル、ポリプロピレングリコールがある。これらの水溶性
ポリマーのうちではポリアクリルアミドとポリエチレン
グリコールが好ましい。水溶性ポリマーの添加量は単量
体と架橋剤の合計重量に対して約２ｗ％から約１００−
％、好ましくは約５讐％から約５０ｗ％の範囲である。

アガロースおよび／または水溶性ポリマーをゲル媒体に
添加する場合には、その添加時期は通常単量体と架橋剤
を水に溶解する時からポリアクリルアミド系水性ゲルの
形成時までの間が好ましい。

変性剤としては少なくとも１個のカルバモイル基をもつ
化合物が用いられる。その具体例として尿素、ホルムア
ミド等がある。変性剤の添加量は単量体と架橋剤を含む
水性ゲルの容積に対して約４０ｗ／ｖ％から約６０ｗ／
ｖ％の範囲である。変性剤として尿素を用いる場合には
、単量体と架橋剤を含む水性ゲル１１に対し約６モル（
約３６０８）から飽和溶解量（約４２０ｇ）まで、好ま
しくは約７モルから飽和溶解量までの範囲で用いられる
。変性剤は添加量が多いので、その添加時期は通常単量
体と架橋剤を含む諸成分を水に溶解する時が好ましい。

本発明の方法で製造されるポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体には湿潤剤としてグリセロール、エチレ
ングリコール等のポリオール化合物を添加することがで
きる。その添加量は水性ゲル媒体の容積に対して約１ｗ
％から約４０讐％の範囲である。

本発明の方法で製造されるポリアクリルアミド系水性ゲ
ル電気泳動媒体には核酸の高分子量フラグメント部分で
の泳動像バンド幅の広がりと個々の泳動像（フラグメン
ト像）の歪曲を防止または減少させる目的でグリセロー
ルを添加することができる。この目的でのグリセロール
の添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲル媒体の容積に
対して約０、Ｉｗ／ｖ％から約１．Ｏｖ／ｖ％、好まし
くは約０．３ｗ／ｖ％から約０．８讐／Ｖ％までの範囲
である。グリセロールの添加時期は通常単量体、架橋剤
を水に溶解する時から水性ゲルの形成時までの間が好ま
しい。

本発明の方法で製造される電気泳動用ゲル媒体には公知
のｐｉ緩衝剤を含有させて電気泳動実施時のｐＨ値を８
．０から９．０の範囲に調節することがてきる。用いう
る緩衝剤としては９日本化学会編「化学便覧　基礎編」
（東京、丸善■、１９（３６年発行）　＋３１２−１３
２０頁、　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ絹ｒ
Ｄａｔａ　ｆｏｒＢ　１ｏｃｈｅ＋１ｉｃａｌ　Ｒｅ５
ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣＩ
ａｒｅｎｄｏｎＰ　ｒｅｓｓ、１９６９年発行）　４７
６−５０８頁。

ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　５．４６７頁以降（１
９６６年Ｌ’Ａしａ−Ｉｙｔｉｃａｌ　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｇｉｓｔｒｙＪ　　ＪＪ１３１．　３００−３１０　頁
（１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系がある。ｐＨ緩
衝剤の具体例として、トリス（ヒドロキシメチル〉アミ
ノメタン（Ｔｒｉｓ）　；　Ｎ、Ｎ−ビスく２−ヒドロ
キシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）　；　Ｎ−２−
ヒドロキシピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン
−３−スルホン酸Ｎａ塩またはに塩等；Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ′−３−スルホン酸Ｎａ塩ま
たはＩ（塩等；　Ｎ−［）リス（ヒドロキシメチル）メ
チル］−３−アミノプロパンスルホン酸Ｎａ塩またはに
塩等；およびこれらのいずれかと必要により組合せられ
る酸、アルカリまたは塩がある。好ましいｐＨ緩衝剤系
の例としてＴｒｉｓ−硼酸−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩（ｐＨ
８，２〜８．３用組成）がある。

本発明の方法で製造される電気泳動用媒体は実質的に無
色透明であることが泳動像の検出または読取りに一般的
に好ましい。

本発明の方法で製造される電気泳動用媒体を電気泳動媒
体膜として用いる場合には、実質的に電気不伝導性で水
不浸透性の平滑な表面のシート状（フィルム状、または
平板状）支持体の上に設けるのが好ましい。実質的に電
気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面のシート状支持体
としては公知のガラス板、有機ポリマーシート等を用い
ることができる。有機ポリマーシートの具体例としてポ
リエチレンテレフタレート、ビスフェノールへのポリカ
ルボネート、ポリスチレン、セルロースエステル（例、
セルロースジアセテート、セルローストリアセテート、
セルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマー
からなる厚さ約５０μｍから約１ｍｍ、好ましくは約８
０−から約５００μｍの範囲の透明な、すなわち波長的
２００ｒｕｗから約９００ｎｏ＋の範囲内の少なくとも
一部の範囲の波長の電磁輻射線を透過させる平滑な表面
を有するシート状または平板状の支持体がある。有機ポ
リマー支持体を用いる場合にはその表面を親水化してゲ
ル媒体膜との接着を良好にするために、紫外線照射、グ
ロー放電処理、コロナ放電処理、火焔処理、電子線照射
。

ケミカルエツチング、電解エツチング等の公知の表面処
理方法を適用することができる。有機ポリマー支持体の
表面には必要に応じて特開昭５９−１６４９５０、特開
昭５９−２１２７５２．特願昭５９−５０２９４．特願
昭５９−９６１５２．特願昭５９−１３６２４７．特願
昭５９−１０３３０７等に記載の下塗層または接着層を
設けて支持体の上に設けられる水性ゲル媒体膜と支持体
との接着を強固にすることができる。

本発明のＭ、電泳動用媒体の製造方法においては前述の
諸成分とラジカル重合開始剤組成物を含む水溶液（以下
、ゲル形成液ということがある）を調製し９次いで平面
状支持体の上に層状に流延または塗布し２分子状酸素の
不存在下で紫外線照射して、単量体くアクリルアミド系
化合物）と架橋剤とを架橋重合させてポリアクリルアミ
ド系））”ル媒体膜を製造する。

本発明の電気泳動用媒体の製造方法に適用されるラジカ
ル重合開始手段は、　ｒ　Ｅ　１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ
ｓｉｓＪλ（４）、２１３−２１９（＋９８１）、同誌
　２（４）、２２０−２２８（＋９８１）。

特開昭５９−１２６２３６　、青水、永井編「最新電気
泳動法」（１９７３年発行）等に記載の低温ラジカル重
合開始剤組成物に用いられる過酸化物と光増感剤の組合
せにさらに励起光を組合せからなる。過酸化物の具体例
として、ベルオクソニ硫酸アンモニウム、ベルオクソニ
硫酸アルカリ金属塩（アルカリ金属の例、ナトリウム、
カリウム等）、過酸化水素等がある。光増感剤の具体例
として、リボフラビン等がある。ラジカル重合開始剤組
成物の例としてリボフラビンーベルオクソニ硫酸アンモ
ニウＡ　Ｃ合物、リボフラビン−過酸化水素混合物等が
ある。

ラジカル重合剤組成物の添加量は、単量体と架橋剤の合
計重量に対して約０．３−％から約５．０讐％、好まし
くは約０．５−％から約３．０ｗ％の範囲である。

励起光としては光増感剤の励起に有効な波長約２００ｎ
ａ＋〜約９００ｎｍの範囲（近紫外線から可視光の範囲
）を含む光であれば制限なく用いることができる。励起
光の強さと照射時間はゲル形成液が層の厚さ方向に実質
的に均一にゲル化するように適宜に選択すればよい。励
起光の光源の具体例としては、高圧水銀灯、超高圧水銀
灯、低圧水銀灯、ハロゲンランプ、メタルハライドラン
プ、タングステンランプ、重水素ランプ、キセノン放電
灯等がある。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体はゲル濃度とし
て、　Ｓ　、　Ｈｊｅｒｔｅｒｌ：ｒＡｒｃｈｉｖｅｓ
　ｏｆ　Ｂ　１ｏ−ｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂ
ｉｏｐｈｙｓｉｃｓ」１．（Ｓｕｐｐｌ、）＋１４７−
１５１（１９６２）に記載の定義に従って表示して、単
量体、架橋剤および水からなるゲル媒体の容積に対して
、単量体と架橋剤の合計量が約３ｗ／ｖ％から約３０ｗ
／ｖ％の範囲で用いられる。

本発明の方法で製造される電気泳動媒体ゲル膜の厚さは
約５０μｍから約５ｍａ＋、好ましくは約８０μｍから
約５００ｕｍの範囲である。

ゲル形成液を平面状の支持体の表面上で架橋重合させる
場合には、ゲル形成液の流延塗布とその後の架橋重合を
窒素ガス雰囲気中等の分子状Ｗ！Ｌ素の不存在下で実施
するか、あるいは流延塗布したゲル形成液の表面上に直
ちにカバー用フィルム。

シートまたは板等の被覆材料で覆い架橋重合させること
が好ましい。この目的に使用される被覆材料としては前
述の平面状支持体と同様な素材からなるものを用いるこ
とができる。カバーフィルムが有機ポリマーフィルムで
ある場合、その厚さは約３００μｍ以下であり、実用的
な範囲としては約４μｍから約２００μｍ、好ましくは
約約４μｍから約１００　ｕｍである。被覆材料がガラ
ス板の場合、その厚さは平面状ガラス板と同様な厚さで
あればよい。

本発明の方法で製造される電気泳動用媒体ゲル膜は前述
の諸文献や特許明細書等に記載の公知の方法に従って、
水平型および垂直型スラブ電気泳動法等に用いることが
できる。

（以下余白） 実施例１および比較例１ 第１表に記載の組成の本発明のゲル形成液試料Ａおよび
従来技術による比較用ゲル形成液試料Ｂを調製した。２
種のゲル形成液を窒素雰囲気下２５℃暗所に５時間放置
し、第２表に記載の各時間経過時点てゲル膜塗布のため
にゲル形成液を取り出し、その一部の液でゲル形成液の
粘度を測定して第２表に記載の結果を得た。

試料Ａでは調製後３００分経過までゲル形成液調製時と
同じ粘度値で粘度上昇が全く生じなかったのに対し、試
料Ｂでは調製後の時間経過とともに顕著な粘度の上昇が
生じ、２０分以上の放置ではゲル化した。

他方で、平滑表面の厚さ２ｍｍ、サイズ２０ｃｍ　Ｘ　
４０ｃｍの長方の平面状ガラス板２枚を、縁辺部に厚さ
５００ｕｍ、幅１０ｗ１１１のスペーサー板を固定して
対向させてガラスモールドを形成し、ガラスモールドの
中に第２表の各時間経過した２種の形成液を流し込んだ
。周囲温度２５℃で各ゲル形成液に１００Ｗ高圧水銀灯
をｌ０ｃｎ＋の距離から照射しつつ１０分静置し２枚の
ガラス板の間で架橋重合させて厚さ５００ｕｍのポリア
クリルアミド水性ゲル膜を形成した。

ガラスモールドの中にゲル形成液を流し込む際に試Ｆ４
Ａではいずれの時間経過のゲル形成液でも全く気泡が混
入せず均一なゲル膜が形成したが。

試料Ｂでは放置時間の長いゲル形成液はど気泡の混入が
多くて不均一なゲル膜が形成した。

上記のようにして得られた２種のゲル膜を用いてＤＮＡ
塩基配列決定用の泳動像の読取り実験をジデオキシ法に
より調製された試料を用い常法に従い実施した。その結
果１本発明の方法で調製したゲル膜Ａでは、オートラジ
オグラムの各泳動像バンドは正常で２個々の泳動像の歪
は実質的になく、塩基配列解読数はゲル形成液の調製後
の経過時間に関係なく６５個であった。一方、従来技術
の方法で調製したゲル膜Ｂでは、ゲル形成液の調製後の
経過時間が長くなるにつれて各泳動像バンドと個々の泳
動像の歪が大きくなり、塩基配列解読数はゲル形成液調
製直後６５個、５分経過時６１個。

１０分経過時５１個と時間経過につれて減少した。

第１表 第２表 木ニゲル化したため粘度測定不可能 実施例２および比較例２ 第３表に記載の組成の本発明のゲル形成液試料Ｃおよび
従来技術による比較用ゲル形成１夜試料りを調製し、そ
れぞれをすぐに特願昭５９−６１６６７明細書記載の連
続塗布装置と同様な装置ζこ接続されている２５℃の恒
温貯蔵タンクにいれ、すぐに連続塗布を始めた。塗布方
法は、上記明細書に記載の方法に従い、紫外線照射処理
で表面を親水性にした厚さ１８０１ｍの平滑表面の無色
透明ポリエチレンテレフタレー）　（ＰＥＴ）フィルム
の上に２種のゲル形成液それぞれをゲル膜の厚さが２０
０μｍになるようにして長尺連続塗布し、　５００　Ｗ
キセノン放電灯照射下窒素雰囲気中でポリアクリルアミ
ド水性ゲル膜を形成した。

一方第４表に記載の経過時間にタンク内からゲル形成液
を少量抜き取りすぐにその粘度を測定して第４表に記載
の結果を得た。

試料Ｃでは調製後３００分経過までゲル形成液調製時と
同じ粘度値で粘度上昇が全く生じなかったのに対し、試
料りでは調製後時間の経過とともに顕著な粘度の上昇が
生じ、　１５分以上の放置ではゲル化して粘度の測定は
不可能であった。

ゲル膜の塗布形成の際に試料Ｃではいずれの時間経過の
ゲル形成液でも５時間余にわたる連続塗布でいずれも膜
厚の局所的な不均一は発生せず。

均一な膜厚の長尺のゲル膜が得られた。

試ｔＩＤでは塗布開始後約５分（ゲル形成液調製後５分
）経過以後はゲル膜に乱れが発生し、膜厚の局所的な不
均一が多数個所で発生した。その上。

塗布開始後約１５分経過時点てゲル形成液がタンク内で
ゲル化してしまい、塗布不可能になった。

得られた２種のゲル膜それぞれについて第４表に記載の
経過時間の部分を２０ｃｍ　８４０ｃｍのサイズに裁断
し、厚さ１００μｍの無色透明ＰＥＴフィルムをり゛ル
膜の表面に重ねて軽く圧力を全面に均一にかけてカバー
フィルムを設けた。これらのゲル膜を用いてＤＮＡ塩基
配列決定用の泳動像の読取り実験を３２Ｐ−ＤＮＡをＭ
ａｘａｍ　　Ｇ１１ｂｅｒｔの方法に従って分解して調
製された試料を用い常法に従い電気泳動Ｊ６よびその後
のオートラジオグラフィ操作を実施した。

その結果１本発明の方法で調製したゲル膜Ｃては、５時
間余にわたる連続塗布で得られたゲル膜全てについてオ
ートラジオグラムの各泳動像バンドは正常で９個々の泳
動像の歪は実質的になく。

塩基配列解読数はゲル形成液の調製後の経過時間に関係
なく６５〜悶個であった。一方、従来技術の方法で調製
したゲル膜りては、ゲル形成液の調製後の経過時間が約
５分以後のゲル膜については。

各泳動像バンドと個々の泳動像の歪が大きくなり。

塩基配列解読数はゲル形成液：Ａ製置後６５個、５分経
過時６０個、１０分経過時４１個と時間経過屯こつれて
減少した。

このように９本発明の方法により調製後の経時によるゲ
ル形成液の粘度変化（ｉ全く認められず。

高分解能を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜を長時
間にわろ連続塗布で大量の製造が可能なことが明らかで
ある。一方従来技術の方法では調製後の経時によるゲル
形成液の粘度変化（粘度増大）が著しく、ゲル形成液の
短時間でのゲル化によりポリアクリルアミド水性ゲル膜
を長時間にねる連続塗布で大量の製造は不可能なことが
明らかである。また、粘度の増大したゲル形成）αから
形成したゲル膜では泳動像の歪と核酸の塩基配列解読数
の著しい減少が明らかである。

（以下余白） 第３表 第４表 註　粘度測定値は２５℃での値 木ニゲル化したため粘度測定不可能 実施例３および比較例３ アガロース（低電気浸透性、ゲル化温度３６℃）３．０
ｇを加えたほかは実施例１および比較例１と同様にして
本発明のゲル形成液試ＮＥおよび従来技術による比較泪
ゲル形成液試料Ｆｆｌ−調製した。２種のゲル形成液を
窒素雰囲気下２５℃暗所で第４表に記載の時間放置し、
各時間経過時点でゲル膜塗イσのためにゲル形成液を取
り出し、その一部の液でゲル形成液の粘度を測定して実
施例２および比較例２に類似の結果（第４表の記載に類
似の結果）を得た。

試；科Ｅでは調製後３００分経過までゲル形成液調製時
と同じ粘度値で粘度上昇が全く生じなかったのに対し、
試ＮＦでは調製後の時間の経過とともに顕著な粘度の上
昇が生じ、１５分以上の放置ではゲル化した。

他方、紫外線照射処理で表面を親水性にした厚さ１８０
ｕｍ、サイズ２０ｃｍ　Ｘ　４０ｃｍの長方形の平滑表
面の無色透明ＰＥＴシート（支持体）を水平におき、縁
辺部に厚さ２００ｐｍ、輻１０１のスペーサー板を固定
し、支持体の上にそれぞれ第４表に記載の時間経過した
前記２種のゲル形成液を窒素雰囲気下で流延し。

５００Ｗ　キセノン放電灯照射下で架Ｖ！重合させて厚
さ２００ｐｍのポリアクリルアミド水性ゲル膜を形成し
た。ゲル膜の表面に厚さ１０（ｈｒｍの無色透明ＰＥＴ
フィルムを重ねて軽く圧力を全面に均一にかけてカバー
フィルムを設けた。これらのゲル膜を用いて実施例１お
よび比較例１と同様にしてＤＮＡ塩基配列決定用の泳動
像の読取り実験を実施した。その結果２本発明の方法で
７Ａ製したゲルＨＥでは。

オートラジオグラムの各泳動像バンドは正常で。

個々の泳動像の歪は実質的になく、塩基配列解読数はゲ
ル形成液の調製後の経過時間に関係なく６５〜６６個で
あった。一方、従来技術の方法で調製したゲル膜Ｆては
、ゲル形成液の：Ａ製後の経過時間が約６分以後のゲル
膜については、各泳動像バントの歪と個々の泳動像の歪
が大きくなり、塩基配列解読数はゲル形成液調製直後６
５個、５分経過時６０個、１０分経過時４０個と時間経
過につれて著しく減少した。

［発明の効果］ 本発明のポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体の
製造方法は、励起光の不存在下ではゲル形成液の調製後
の時間経過によるゲル形成液の粘度変化（粘度増大）と
ゲル化が防止されており、高分解能の核酸塩基配列決定
用ポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動媒体膜を容易
に長時間にわたる連続塗布で大量に製造することができ
る。また本発明の製造方法により一時に多量のゲル形成
液を調製し、励起光の不存在下に保存しておき、必要の
都度少量ずつゲル形成液を取出してポリアクリルアミド
系水性ゲル電気泳動媒体膜を製造することも可能である
。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）アクリルアミド系単量体、架橋剤、水、分子中に
   少なくとも１個のカルバモイル基をもつ変性剤、および
   重合開始手段の存在下に架橋重合させて、電気泳動によ
   る核酸塩基配列決定に使用するポリアクリルアミド系水
   性ゲルを製造する方法において、前記重合開始手段が過
   酸化物、光増感剤および励起光の組合せからなり還元剤
   を含まないことを特徴とする方法。
2. （２）変性剤が尿素またはホルムアミドである特許請求
   の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）有機ポリマー支持体の上で架橋重合を行わせる特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。
4. （４）有機ポリマー支持体がポリエチレンテレフタレー
   トシートである特許請求の範囲第３項に記載の方法。
5. （５）光増感剤がリボフラビンである特許請求の範囲第
   １項に記載の方法。
6. （６）過酸化物がペルオクソ二硫酸塩である特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。