JPS63210654A

JPS63210654A - 電気泳動用媒体膜

Info

Publication number: JPS63210654A
Application number: JP62043703A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Sugihara; 充杉原; Masashi Ogawa; 雅司小川
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-02-26
Filing date: 1987-02-26
Publication date: 1988-09-01

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は蛋白等の生体高分子成分、又はその他の高分子
の分離分画分析ために用いられるポリアクリルアミド系
水性ゲルからなる電気泳動用ゲル媒体に間するものであ
り、さらに詳しくは、蛋白等の低分子量部分から高分子
量部分まで広い分子量範囲にわたって良好な分離分画性
能を有するように予め定められ制御されたゲル媒体の膜
厚勾配（膜厚グラジェント）を有する電気泳動用媒体膜
に間するものである。

［従来の技術］近年において、電気泳動分離分画法は生体成分の分離分
画分析に多用されており、特に蛋白の分離分画分析は疾
病診断のための生化学検査において頻繁に用いられてい
る。

膜又はシート状の電気泳動用媒体としては古くから濾紙
が用いられていたが、最近では分離分画性能の良好なア
ガロース水性ゲル電気泳動用媒体膜やポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体膜（以下、ポリアクリルア
ミドゲル膜又はゲル膜ということがある）が用いられる
ようになり。

特に分子篩効果を有するポリアクリルアミドゲル膜は現
在量も多く利用されている。そして蛋白等の生体成分の
高分子量部分まで精度よく分離分画できるポリアクリル
アミドゲル膜の要請が高まってきた。

一方、蛋白をその分子量の違いにより１回の電気泳動操
作で分離分画分析する場合９通常の厚さ一定のポリアク
リルアミドゲル膜では９分離分画した蛋白のバンドの間
隔が低分子量部分では広く。

高分子量部分では狭くなる。このため蛋白の高分子量部
分の分離が悪くなる。そこで低分子量部分から高分子量
部分まで広い分子量範囲にわたって均等に良好な分離分
画性能を得るために、電気泳動方向にポリアクリルアミ
ドゲル濃度又は緩衝液濃度に勾配をもたせたポリアクリ
ルアミドゲル膜（グラジェントゲル膜）が使用されてい
る。例えば特開昭６Ｏ−２３５８１９（ＥＰ　Ｏ１５９
６９４Ａ）にはポリアクリルアミド濃度（ゲル濃度又は
孔径サイズ）勾配を有するポリアクリルアミドゲル電気
泳動用媒体膜を、アクリルアミドと架橋剤を含む水溶液
の薄層を支持体の表面で電子ビーム等の電離放射線を用
いて架橋重合させて製造する方法及び装置が記載されて
いる。この方法に用いられる装置及び濃度勾配をゲル膜
中に発現させるための電子ビーム等のコントロール法は
きわめて複雑である。一般にグラジェントゲル膜は製造
するのに手数がかかり。

濃度勾配の再現性が悪く、製造に失敗することが多く、
均一なグラジェントを有する多数のゲル膜を製造し難い
という欠点があった。さらに、ポリアクリルアミドゲル
濃度の違いによって膨潤率が異なるので１分離分画像を
可視化するための染色操作時にゲル膜が変形するという
欠点もあった。

一方２通常ゲル膜を作製する場合、２枚の平面ガラスの
間にゲル膜を形成するため、望みの漸次的変化の勾配を
もたせることが難しかったので。

膜厚勾配ゲル膜は従来使用されていなかった。

［発明の目的］本発明の目的は蛋白等の生体高分子成分又はその他の高
分子成分の分離分画分析に用いられるポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体（以下、ゲル媒体というこ
とがある）において、高分子成分の低分子量部分から高
分子量部分までほぼ同等な良好な高分離分画性能を持つ
ように厚さグラジェントを有するゲル媒体膜を提供する
ことである。

本発明の他の目的は濃度グラジェントゲル膜に比べて膨
潤による変形の少ない厚さグラジェントを有するゲル媒
体膜を提供することである。

［発明の構成コ本発明は、アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在
下に架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲルを
含む電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状支持体と平
面状カバーシートとの間に設けてなる電気泳動用媒体膜
において、前記ゲル媒体層が予め定められた漸次的な厚
さの変化（層厚勾配）を有する電気泳動用媒体膜である
。

［発明の構成の詳細な説明］ゲル媒体に用いることができるアクリルアミド系化合物
（単量体）の例としては、アクリルアミド。

Ｎ−メチルアクリルアミド、　Ｎ、Ｎ−ジメチルアクリ
ルアミド、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド。

ジアセトンアクリルアミド等のアクリルアミドホモログ
がある。これらの化合物は単独で、または２種以上を組
合せて用いることができる。これらの化合物のうちでは
アクリルアミドが好ましく。

またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物の１
種以上との併用も好ましい。

架橋剤としてはｒ　Ｅ　１ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
Ｊｌ（４）　＋２１３−２ｌ９（１９８１）、同誌Ｚ（
４）、２２０−２２８（１９８１）等に記載の二官能性
架橋剤化合物、特開昭６１−２０５８等に記載の三官能
性以上の架橋剤化合物を用いることができる。二官能性
架橋剤の具体例として、　Ｎ、Ｎ’−メチレンビスアク
リルアミド（Ｂ　Ｉ　Ｓ’）　；Ｎ、Ｎ’−プロピレン
ビスアクリルアミド（ＰＢＡ）；ジアクリルアミドジメ
チルエーテル（ＤＡＥ）；１，２−ジアクリルアミドエ
チレングリコール（Ｄ　Ｅ　Ｃ）　；エチレンウレアビ
スアクリルアミド（ＥＵＢ）；エチレンジアクリレート
（ＥＤＡ）；Ｎ、Ｎ’−ジアリルタルタルジアミド（Ｄ
ＡＴＤ）；Ｎ、Ｎ’−、ビスアクリリルシスタミン（Ｂ
ＡＣ）がある、三官能性架橋剤の具体例として、　１，
３．５−トリアクリロイルへキサヒドロ−８−トリアジ
ン（ＴＡＨＴ）；）リアリルシアヌレート（ＴＡＣ）；
）リアリルイソシアヌレート（ＴＡｒＣ）等がある。こ
れらの架橋剤のうちではＢＩＳとＴＡＨＴが好ましい。

架橋剤は２種以上を組合わせて用いることもできる。

架橋剤の量は、単量体と架橋剤の合計重量に対して約１
ｗ％から約３０ｗ％、好ましくは約２ｗ％から約１０ｗ
％の範囲で用いられる。

ゲル媒体にはアガロースを添加することができる。アガ
ロースとしては、特開昭５５−５７３０　、特開昭５５
−１１０９４６　、特表昭５７−５０２０９８　、特開
昭５９−１２６２３６等に記載の低電気浸透性アガロー
ス、中電気浸透性アガロース、高電気浸透性アガロース
のいずれも用いることができる。アガロースの添加量は
単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約０．２
ｗ／ｖ％から約２．０ν／Ｖ％、好ましくは約０．３ｗ
／Ｖ％から約１．２ｗ／ｖ％の範囲である。

ゲル媒体には水溶性ポリマーを添加することができる。

水溶性ポリマーとしては、特開昭５９−１３６６４８　
、特開昭ｓｏ　−Ｌ　６０５４９等に記載の分子量約１
万から約１００万の範囲の付加重合型または縮重合型の
水溶性の非イオン性ポリマー、特開昭６１−１８８５３
等に記載のビニルスルホニル基等含有の架橋性アクリル
アミド系コポリマー、特願昭６１−２１４８７９に記載
の水溶性セルロース誘導体を用いることができる。付加
重合型の水溶性の非イオン性ポリマーの例としてポリア
クリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロ
リドンがある。縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマー
の例としてポリエチレングリコール、ポリプロピレング
リコール。

ポリ−Ｎ−ビニルピロリドンがある。架橋性アクリルア
ミド系コポリマーの例として、Ｎ−［［３−（ビニルス
ルホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド−
アクリルアミドコポリマー；　Ｎ（［３−（２−りＯｒ
：１エチルスルホニル）プロパンアミドコメチルコアク
リルアミド−アクリルアミド−Ｎ−（１，１−ジメチル
−３−オキソブチル）アクリルアミドコポリマーがある
。水溶性セルロース誘導体の例としてメチルセルロース
、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチル
メチルセルロース等の水溶性セルロースエーテルがある
。これらの水溶性ポリマーのうちではポリアクリルアミ
ド、ポリエチレングリコール、　Ｎ−［［３−（ビニル
スルホニル）プロパンアミドコメチルコアクリルアミド
−アクリルアミドコポリマーが好ましい。水溶性ポリマ
ーの添加量は、付加重合型または縮重合型の水溶性の非
イオン性ポリマーの場合、単量体と架橋剤の合計重量に
対して約ｈ％から約１００−％、好ましくは約５ｗ％か
ら約５０誓％の範囲、架橋性アクリルアミド系コポリマ
ーの場合、アクリルアミド系化合物の重量に対して約１
ｗ％から約５０ｗ％、好ましくは約５ｗ％から約４０ｗ
％の範囲である。

アガロース及び／又は水溶性ポリマーをゲル媒体に添加
する時期は通常単量体と架橋剤を水に溶解する時からポ
リアクリルアミド系水性ゲルの形成時までの間が好まし
い。

ゲル媒体を蛋白質又は複合蛋白質（例えば、リボプロテ
ィン、グリコプロティン等）の分離分画分析に用いる場
合には、変性剤として陰イオン性界面活性剤を含有させ
ることが好ましいか、又は必須であることが多い。陰イ
オン性界面活性剤を電気泳動媒体に含有させることによ
り蛋白質または複合蛋白質の効率的な分離分画とそれら
の分子量測定が可能になる。ゲル媒体を核酸フラグメン
トの゛分離または分取の目的に用いる場合には陰イオン
性界面活性剤の添加は不要である。

変性剤としての陰イオン性界面活性剤の例としてはアル
キル硫酸塩をあげることができ、殊に炭素原子数１０以
上の長鎖アルキル基を有するアルキル硫酸塩が好ましく
用いられる。塩を形成する陽イオンとしては、ナトリウ
ムイオン、カリウムイオン、リチウムイオン等のアルカ
リ金属イオンが一般的であり、これらのうちではナトリ
ウムイオンが用いやすい。アルキル硫酸塩のうちではド
デシル硫酸塩（ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩
等）が好ましく、なかでもドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
　Ｄ　Ｓ）が最も好ましい。

変性剤としての陰イオン性界面活性剤の添加量は単量体
と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約２．Ｏｗ／ｖ
％以下、好ましくは約０．１ｗ／ｖ％から約１．５−八
％の範囲である。変性剤の添加時期は通常単量体と架橋
剤を含む諸成分を水に溶解する時から水性ゲルの形成時
までの間が好ましい。

ゲル媒体には変性剤と異なる種類のノニオン性。

アニオン性又は両性界面活性剤を添加することができる
。界面活性剤の例として。

等のノニオン性界面活性剤。

等のアニオン性界面活性剤。

ｅＣ１１Ｈ２３ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｎ”−ＣＨ２Ｃ
０Ｏ−ｅ等の両性界面活性剤がある。界面活性剤の添加量は、単
量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して、ノニオン
性又はカチオン性界面活性剤の場合。

約Ｉ　Ｘ　１０−’から約５Ｘ１０−１讐／Ｖ％、好ま
しくは約ｌＸｌ０”から約Ｉ　Ｘ　１０−２讐／Ｖ％の
範囲、アニオン性界面活性剤の場合、約Ｉ　Ｘ　１０−
’から約５　Ｘ　１０−２讐／Ｖ％、好ましくは約ｌＸ
ｌ０−３から約５　Ｘ　ｔｏ−２讐／Ｖ％の範囲である
。

ゲル媒体には湿潤剤としてグリセロール、エチレングリ
コール等のポリオール化合物を添加することができる。

その添加量は水性ゲル媒体の容積に対して約１ｖ％から
約４０ｗ％の範囲である。

ゲル媒体には電気泳動される試料に応じて電気泳動実施
時のｐＨ値を２．５からｌ０００の範囲内の所望の値に
緩衝できる公知の緩衝剤から適宜選択して含有させるこ
とができる。ゲル媒体を核酸フラグメントの分離または
分取に用いる場合には８．Ｏｈ）ら１０．０．好ましく
は８．０から９．０の範囲内の所望の値に緩衝できる公
知の緩衝剤から適宜選択して含有させることができる。

用いうる緩衝剤としては９日本化学会編「化学便覧　基
礎編」（東京、丸善■、１９６６年発行）　１３１２−
１３２０頁、　Ｒ，Ｍ、Ｃ，Ｄａｗｓｏｎ　ｅｔ　ａ１
編ｒＤａｔａ　ｆｏｒＢ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈＪ第５ｅａｒｃｈＪｒｄ　ａｔ　ｔｈｅＣ
Ｉａｒｅｎｄｏｎ　Ｐ　ｒｅｓｓ、　１９６９年発行）
　４７６−５０８頁。

ｒ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＪ　Ｌ　４６７頁以降
（１９６６年）　＋　’Ａｎａ−Ｉｙｔｉｃａｌ　Ｂｉ
ｏｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙＪ　ＬＱｉ、　３００−３１０
頁（１９８０年）等に記載のｐＨ緩衝剤系がある。

ｐＨ２，５〜１０．０の範囲のｐＨ１ｔ衝剤の具体例と
して。

バルビツールを含む緩衝剤；トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン（Ｔ　ｒｉｓ）を含む緩衝剤；燐酸塩を
含む緩衝剤硼酸塩を含む緩衝剤；酢酸または酢酸塩を含
む緩衝剤；杓備酸又は杓漏酸塩を含む緩衝剤；乳酸又は
乳酸塩を含む緩衝剤；グリシンを含む緩衝剤；　Ｎ、Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎ
ｅ）　；　Ｎ−２−ヒドロキシピペラジン−Ｎ′−２−
ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸Ｎａ塩又はに塩等
；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−３−ス
ルホン酸Ｎａ塩又はに塩等；　Ｎ−［）リス（ヒドロキ
シメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸Ｎ
ａ塩又はに塩等；及びこれらのいずれかと必要により組
合せられる酸、アルカリ又は塩がある。好ましい緩衝剤
の具体例として、燐酸二水素カリウム−燐酸水素二ナト
リウム；Ｔｒｉｓ−塩酸；Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム；
Ｔｒｉｓ−硼酸ナトリウム−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩；Ｔｒ
ｉｓ−杓備酸；パルビタールナトリウムー酢酸ナトリウ
ム；パルビタールナトリウム−塩酸；パルビタールーバ
ルビタールナトリウム；酢酸−酢酸ナトリウム；乳酸−
乳酸ナトリウム；杓甫酸−燐酸二水素ナトリウム；　Ｂ
ｉｃｉｎｅ　；　ＨＥＰＰＳＯ；ＨＥＰＰＳＯナトリウ
ム塩；　ＥＰＰＳ　；　ＥＰＰＳナトリウム塩；ＴＡＰ
ＰＳ　；　ＴＡＰＰＳナトリウム塩等がある。

ｐＨ８，０〜１０．０の範囲のｐＨ緩衝剤の具体例とし
て。

Ｔｒｉｓ　；　Ｂｉｃｉｎｅ　；　Ｎ−２−ヒドロキシ
ピペラジン−Ｎ’−２−ヒドロキシプロパン−３−スル
ホン酸Ｎａ塩又はに塩等；Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎａ３−スルホン酸Ｎａ塩又はに塩等；　Ｎ
−［）リス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノ
プロパンスルホン酸Ｎａ塩又はに塩等；及びこれらのい
ずれかと必要により組合せられる酸、アルカリ又は塩が
ある。好ましいｐｎ緩衝剤系の例としてＴｒｉｓ−硼酸
−ＥＤＴＡ・２Ｎａ塩（ｐＨ８，２〜８．３用組成）；
Ｔｒｉｓ−塩酸（ｐｔ１８．９用組成）等がある。

ゲル媒体は予め定められた厚さの膜において実質的に無
色透明であることが泳動像の検出又は読取りに一般的に
好ましい。

ゲル媒体は、実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑
な表面のシート状（フィルム状、又は平板状）支持体又
はカバーシートの上に予め定められた。制御された漸次
的な厚さの変化を有する層又は膜として設けられる。実
質的に電気不伝導性で水不浸透性の平滑な表面のシート
状支持体又はカバーシートとして公知のガラス板、有機
ポリマーシート等を用いることができる。有機ポリマー
シートの具体例としてポリエチレンテレフタレート、ビ
スフェノールＡのポリカルボネート、ポリスチレン、セ
ルロースエステル（例、セルロースジアセテート、セル
ローストリアセテート、セルロースアセテートプロピオ
ネート等）等のポリマーからなる厚さ約５０ｕｍから約
２＋ｕ＋　、好ましくは約８０ｕｍから約５００ｕｍの
範囲の透明な−２すなわち波長的２００ｎｍから約９０
０ｎｍの範囲内の少なくとも一部の範囲の波長の電磁輻
射線を透過させる平滑な表面を有するシート状物又は平
板状物がある。有機ポリマー支持体又はカバーシートを
用いる場合にはその表面を親水化しゲル膜との接着を良
好にするために、紫外線照射、グロー放電処理、コロナ
放電処理、火焔処理、電子線照射、ケミカルエツチング
。

電解エツチング等の公知の表面処理方法を適用すること
ができる。有機ポリマー支持体又はカバーシートの表面
には必要に応じて特開昭５９−１６６８５０　。

特開昭５９−２１２７５３．特開昭６０−１９４３４８
．特開昭６０−２３９６５９　、特開昭６０−２４４８
４９　、特開昭６１−１４５５８等に記載の下塗層また
は接着層を設けてその上に設けられるゲル媒体層と支持
体又はカバーシートとの接着を強固にすることができる
。また、後述するように、予め定められた漸次的な厚さ
変化を有する平面状支持体又はカバーシートを用いるこ
ともできる。

ゲル媒体は前述の諸成分とラジカル重合開始剤組成物を
含む水溶液（以下、ゲル形成液ということがある）を平
面状支持体又はカバーシートの上に層状又は膜状に流延
または塗布し２分子状酸素の不存在下で、必要により紫
外線又は可視光の照射及び／又は加熱して、単量体（ア
クリルアミド系化合物）と架橋剤とが架橋重合したポリ
アクリルアミド系水性ゲル媒体層又は膜として製造され
用いられる。

アクリルアミド系化合物（単量体）と架橋剤は。

水溶液または水分散液として水に溶解または分散させて
おき、水中で両者を架橋重合させて、架橋重合した水性
ゲル媒体を形成させる。本明細書においては特にことわ
らないかぎり、（水に）溶解とく水に）分散の両者を含
めて単に（水に）溶解といい。

水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶液という。溶
媒または分散媒としては、水だけでなく。

所望により加えられる有機溶媒を含む水−有機溶媒混合
物をも包含する。

ラジカル重合開始剤組成物としてはｒ　Ｅ　１ｅＣｔｒ
Ｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓＪＫ（４）、２１３−２１９（１
９８１）＋同誌１（４）、２２ｏ−２２８（１９８１）
、特開昭５９−１２６２３６　、青水、永井編「最新電
気泳動法Ｊ（１９７３年発行）１等に記載の低温ラジカ
ル重合開始剤組成物のうちから適宜に選択して用いるこ
とができる。ラジカル重合開始剤組成物の例として、β
−（ジメチルアミノ）プロピオニトリル（ＤＭＤＰＮ）
−ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物；　Ｎ、Ｎ、Ｎ
’　、Ｎξテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ
）−ペルオクソニ硫酸アンモニウム混合物；ＴＥＭＥＤ
−リボフラビン混合物；ＴＥＭＥＤ−リボフラビン−過
酸化水素混合物：リボフラビンーベルオクソニ硫酸アン
モニウム混合物；リボフラビン−過酸化水素混合物（リ
ボフラビン等の光増感剤併用の場合には紫外線又は可視
光の照射を併用する）等がある。ラジカル重合剤組成物
の添加量は単量体と架橋剤の合計重量に対して約０．３
ν％から約５．０ｗ％、好ましくは約０．５ν％から約
３．０％、１％の範囲である。

ゲル媒体はゲル濃度としてＳ、Ｈｊｅｒｔｅｎ　：　ｒ
Ａｒ−ｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅ＋１ｉｓｔｒ
ｙ　ａｎｄ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓＪ　ｌ、（Ｓｕｐｐ
！、）、１４？−１３１（１，９６２）に記載の定義に
従って表示して、単量体、架橋剤および水からなるゲル
媒体の容積に対して、単量体と架橋剤の合計量が約３ｗ
／ｖ％から約３０ｗ／ｖ％の範囲で用いられる。

ゲル形成液を平面状支持体（又はカバーシート）の表面
上で架橋重合させる際には、ゲル形成液の流延塗布とそ
の後の架ＩＩ！重合を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素
の不存在下で実施するか、あるいは流延塗布したゲル形
成液の表面上に直ちにカバー用フィルム、シートまたは
板等の被覆材料で覆い架橋重合させることが好ましい。

この目的に使用される被覆材料としては前述の平面状支
持体と同様な素材からなるものを用いることができる。

カバー用フィルムが有機ポリマーフィルムである場合、
その厚さは約３００ｕｍ以下であり、実用的な範囲とし
ては約４ｕｍから約２５０ＩＪｎ、好ましくは約約５０
−から約２００ｕｍである。被覆材料がガラス板の場合
、その厚さは支持体として用いる平面状ガラス板と同様
な厚さのものを用いることができる。

一般的にゲル媒体膜の厚さ勾配は、電気泳動実施後にサ
ンプルの高分子成分又は高分子フラグメント側に厚く、
低分子成分又は低分子フラグメント側に薄くなるような
勾配を設けるのが原則であるが、目的により他の勾配配
置を採用することができることはいうまでもない。本発
明のゲル媒体膜の特徴をなすゲル膜の厚さ勾配（曲線又
は直線）は、サンプル注入端部からの距離に対して、直
線。

ゆるく折れた直線、指数間数、対数関数、懸垂線。

追跡線、放物線、双曲線、楕円、３次曲線等の関数で表
される漸次的変化の曲線の一部分、その他の任意の漸次
的変化の曲線又は曲線と直線の組合せ等で表される勾配
をもたせることができるが。

電気泳動方向に沿って距離とともに漸次的に単調に増加
させる。途中から増加させる。あるいは一度減少させた
後増加させるように設けるのが好ましい。変化させる厚
さの範囲は約５０ＩＪＩＩ＋から約５ｍｍ　。

好ましくは約８０−から約２１１Ｉｆｆｉの範囲である
。ＤＮＡ等の核酸フラグメント分取に用いる場合には約
３００ｕｍから約３ｍｍの範囲が好ましい。なお、サン
プル注入部分の形状は、長方形状、正方形状、三角形状
（シャークスティース状）９円形状等公知の形状から選
択して設けることができる。

ゲル媒体に膜厚勾配を設ける方法としては、平面状支持
体に予め定められた。制御された漸次的な厚さ変化（層
厚勾配又は膜厚勾配）にほぼ相当する厚さ変化を有する
スペーサ板を固定し、スペーサ板にそってカバー用被覆
材料（シート状物）で覆ったモールド内部にゲル形成液
を流し込み架橋重合させる方法、予め定められた漸次的
な厚さ変化に相当する厚さ変化を有する平面状支持体（
又はカバーシート）の表面に一定厚さのスペーサー板を
固定し、スペーサ板にそってカバー用被覆材料（支持体
）で覆ったモールド内部にゲル形成液を流し込み架！重
合させる方法、予め定められた漸次的な厚さ変化に相当
する厚さ変化を有する平面状支持体（又はカバーシート
）の表面にゲル形成液を流延し、窒素ガス雰囲気中等の
分子状酸素の不存在下で架橋重合させる方法、予め定め
られた漸次的な厚さ変化に対応するように、単位時間当
りの流量を制御（ゲル膜厚さの薄い領域では流量を少く
、厚さの厚い領域では流量を多くする）しながら、平面
状支持体（又はカバーシート）の表面にゲル形成液を流
延塗布し、窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存在下
で架橋重合させる方法等を適用することができる。予め
定められた漸次的厚さ変化を有する平面状支持体は、モ
ールドカスティング法、ケミカルエツチング法、切削法
等の公知の技術により調製されたものを用いることがで
きる。流量を制御しながら支持体（又はカバーシート）
に流延塗布する場合には、スペーサー板の厚さ変化は必
ずしもゲル膜の予め定められた漸次的な厚さ変化に相当
していなくともよい。また、ゲル媒体の膜厚勾配をゲル
膜の幅全体に設けずに。

サンプルを電気泳動させるレーンの領域より僅かに広い
幅の領域にだけレーンの数に対応させて設け、残余の領
域は実質的に厚さ一定にすることもできる。この態様は
漸次的厚さ変化を有する平面状支持体又はカバーシート
を用いる態様において有利に実施できる。

本発明のゲル媒体膜は公知のポリアクリルアミド系水性
ゲル媒体膜と同様にして調製することができる。また９
本発明のゲル媒体膜は前述の諸文献や特許明細書等に記
載の公知の方法に従って。

水平型および垂直型スラブ電気泳動法等に用いることが
できる。

昭］コ［口実施例１及び比較例１表面を紫外線照射処理した厚さ＋８０ＬＩＩＩ＋、サイ
ズ２０ＣＩ　Ｘ　２０ｃｍの正方形の無色透明ポリエチ
レンテレフタレー）（Ｐ　Ｅ　Ｔ）シート（支持体）の
対向する２辺に沿った両縁辺部に第１〜３図の電気泳動
方向に沿う断面模式図に示す３種の漸次的な厚さ変化を
有する幅１０開のスペーサー板（本発明）及び同じ幅で
一定厚さ０．８ｍ−のスペーサー板（比較例）をそれぞ
れ固定し、スペーサー板に沿って厚さ１００ＬＩｒＩＩ
のＰＥＴシート（カバーシート）で覆い、さらにカバー
シートの外側を２０ｃｍ　Ｘ　２０ｃｏの正方形のアル
ミニウム板でスペーサーの厚さ変化に応するように固定
してポリアクリルアミド水性ゲル電気泳動用媒体層ｒＡ
ｌｌ用モールドを形成した。

各モールドの中に第１表記載組成のアクリルアミドゲル
形成用水溶液を流し込み２周囲温度２５℃で各ゲル形成
液膜に１００Ｗ高圧水銀灯を１０ｃｍの距離から照射し
つつ１０分静置し２枚のＰＥＴシートの間で架橋重合さ
せて厚さグラジェントを有する本発明のポリアクリルア
ミド水性ゲル電気泳動用媒体膜３種■、■、■と厚さ一
定の比較用ゲル膜■を調製した。

■第１図の超偏平■字形断面、厚さ最大（泳動方向始端
部と終端部）１．６ｆｆｕＩ＋、最小（泳動方向中央部
）０．８ｍｍ ■第２図の超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部
）０．８ｍｍから直線状に増加して最大（泳動方向終端
部）１．６ｍｍ ■第３図の超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部
）０．８ｍｍから指数関数状に増加して最大（泳動方向
終端部）１．６問 ■一定の厚さ０．８問得られた４種のゲル膜を用い、サンプルとして人血清蛋
白質標準蛋白質（人アルブミン、分子量６７０００）乳酸脱
水素酵素サブユニット（分子１１３６０００）カタラー
ゼサブユニット（分子量６万）フェリチンサブユニット
（分子量１８５００）フェリチンハーフユニット（分子
量２２万）チログロブリンサブユニット（分子量３３万
）を用いて常法に従い電気泳動分離分画を実施し。

クーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ
−２５０で染色した。その結果９本発明の厚さグラジェ
ントゲル膜■、■、■では分離分画可能な分子量の範囲
はｌ万から３３万以上であった。一方、従来技術である
厚さ一定の比較例のゲル膜■ではその読み取り範囲は１
万から２２万と３３万の中間までであった。

この結果から本発明の厚さグラジェントを有するポリア
クリルアミド水性ゲル電気泳動用媒体膜は蛋白等の高分
子成分の低分子量部分から高分子量部分まで広い分子量
範囲にわたって良好な分離分画分析が可能であることが
明らかになった。

第　１　表　ゲル形成液の成分囲Ｔｒｉｓ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
実施例２及び比較例２本発明の厚さグラジェントゲル膜としては実施例１のゲ
ル膜■（第２図の超偏平楔形断面）を用いた。

一方、比較例のゲル膜として、比較例１のゲル膜■を調
製したのとと同じ厚さ一定０．８ｍｍのモールドを用い
、ゲル成分だけを第２表ＡＢに示す組成のゲル形成液を
公知の方法に従って混合比率を徐々に変化させながらモ
ールドに静かに流しこみポリアクリルアミドゲル濃度グ
ラジェントゲル膜■を調製した。

ついで、２種のゲル膜■と■をクーマシープル−Ｒ−２
５０での染色と脱色工程後の変形を調べた。

本発明の厚さグラジェントゲル膜■では全体に膨潤率が
一定で変形が生じなかった。一方、比較例の濃度グラジ
ェントゲル膜■では、ポリアクリルアミドゲル低濃度領
域で小さく、高濃度領域で大きく、全体としてゲル膜の
変形が生じた。

このように９本発明の厚さグラジェントゲル膜は染色脱
色工程を実施する際にゲル膜の変形が生じないことが明
らかになった。

圓Ｔ歪■ 第２表［！ｆｉＴｒｉｓ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン実施例３及び比較例３表面を紫外線照射処理した厚さ１８０ｕｍ＋サイズ２０
ｃｒ１１Ｘ　２０ｃｍの正方形の無色透明ＰＥＴシート
（支持体）の対向する２辺に沿った両縁辺部に一定厚さ
１．６１で幅１０ｍｍ　Ｘ長さ２０ｃｍのスペーサー板
を接着固定した。この支持体の上に実施例１の第１表に
記載の組成のゲル形成液を、ゲル形成液膜の厚さが０．
８開から１．６ｍｍになるような範囲で流量を制御して
支持体上のゲル形成液膜の厚さを変化させなから流延塗
布し、各ゲル形成液膜に５００Ｗキセノン放電灯を照射
しつつ窒素ガス雰＠気中で架橋重合させ、ついでゲル膜
の上に厚さ６３１Ｊｍでサイズ２０ｃｍ　Ｘ　２０ｃｍ
の正方形の無色透明ＰＥＴのシートをカバーシートとし
て密着積層して、第１図ないし第３図に示したスペーサ
ー板の断面の厚さ変化にほぼ等しい厚さ変化（膜厚勾配
）を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜３種（本発明
のゲル膜）を調製した。

一方、ゲル形成液の流量を、ゲル形成液膜の厚さが０．
８ｍｍになるように一定にしたほかは上記と同様にして
一定の厚さ０．８ｍｍのゲル膜（比較例３）を調製した
。

得られた４種のゲル膜を用いて実施例１と同様にして７
種の蛋白の分離分画実験を実施したところ、実施例１及
び比較例１と同様の結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は実施例１の本発明の厚さグラジェント
を有するゲル膜１〜３を形成するために用いたスペーサ
ー板の電気泳動方向に沿う漸次的な厚さ変化（膜厚勾配
）を示す断面模式図である。第１図：超偏平■字形断面、厚さ最大（泳動方向始端部
と終端部）１．６ｍｍ、最小（泳動方向中央部）０．８
ａｒｍ、長さ２０ｃｍのスペーサー板（ゲル膜■調製用
）第２図：超偏平楔形断面、厚さ最小く泳動方向始端部
）０．８關から直線状に増加して最大（泳動方向終端部
）１．６ｍ＋ｎ、長さ２０ｃＩＷのスペーサー板（ゲル
膜■調製用）第３図：超偏平楔形断面、厚さ最小（泳動方向始端部）
０．８ｍｎ＋から指数関数状に増加して最大（泳動方向
終端部）１．６ｍｍ、長さ２０ｃｍのスペーサー板（ゲ
ル膜■調製用）特許出願人　富士写真フィルム株式会社第１図厚さ変化：超偏平Ｖ字形第２図厚さ変化＝ＩＩ！線状に増加第３図厚さ変化二指数間数状に増大長さ２０ｃｍ手続補正書（自発）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）アクリルアミド系化合物と架橋剤が水の存在下に
架橋重合してなるポリアクリルアミド系水性ゲルを含む
電気泳動用ゲル媒体からなる層を平面状支持体と平面状
カバーシートとの間に設けてなる電気泳動用媒体膜にお
いて、前記ゲル媒体層が予め定められた漸次的な厚さの
変化（層厚勾配）を有することを特徴とする電気泳動用
媒体膜。
（２）前記支持体と前記カバーシートがいずれも有機ポ
リマーからなるシート状物である特許請求の範囲第１項
に記載の電気泳動用媒体膜。
（３）前記支持体と前記カバーシートがいずれもポリエ
チレンテレフタレートからなるシート状物である特許請
求の範囲第２項に記載の電気泳動用媒体膜。
（４）前記ゲル媒体にさらにアガロースが含まれる特許
請求の範囲第１項に記載の電気泳動用媒体膜。
（５）前記ゲル媒体にさらに水溶性ポリマーが含まれる
特許請求の範囲第４項に記載の電気泳動用媒体膜。
（６）前記ゲル媒体にさらに変性剤として陰イオン界面
活性剤が含まれる特許請求の範囲第１項に記載の電気泳
動用媒体膜。
（７）前記陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩である
特許請求の範囲第６項に記載の電気泳動用媒体膜。
（８）前記アルキル硫酸塩がドデシル硫酸のアルカリ金
属塩又はアンモニウム塩である特許請求の範囲第７項に
記載の電気泳動用媒体膜。
（９）前記ドデシル硫酸のアリカリ金属塩がナトリウム
塩又はカリウム塩である特許請求の範囲第８項に記載の
電気泳動用媒体膜。