JPH0660885B2 - 電気泳動用媒体の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は蛋白等の生体高分子成分，又はその他の高分子
物質の分離分画分析に用いられるポリアクリルアミド系
水性ゲルからなる膜(層)状，柱状(角柱状又は円柱(カラ
ム)状)の電気泳動用ゲル媒体（以下，ゲル媒体又はゲル
ということがある）の製造方法に関するものであり，さ
らに詳しくは，電気泳動方向にポリアクリルアミド系水
性ゲルの濃度勾配を有する膜状又は柱状のポリアクリル
アミド系水性ゲル(グラジエントゲル)をアクリルアミド
系化合物(単量体)と架橋剤の濃度の異なる２種類のゲル
形成液相互の混合比率を漸次変化させながら混合して製
造する方法において，混合される２種類の濃度のゲル形
成液の粘度を実質的に等しくした膜状又は柱状の電気泳
動用ゲル媒体の製造方法に関するものである。

［従来の技術］ 近年において，電気泳動分離分画法は生体成分の分離分
画分析に多用されており，特に蛋白の分離分画分析は疾
病診断のための生化学検査において頻繁に用いられてい
る。

膜又はシート状の電気泳動用媒体としては古くから瀘紙
が用いられていたが，最近では分離分画性能の良好なア
ガロース水性ゲル電気泳動用媒体膜やポリアクリルアミ
ド系水性ゲル電気泳動用媒体膜が用いられるようにな
り，特に分子篩効果を有するポリアクリルアミドゲル膜
は現在最も多く利用されている。そして蛋白等の生体成
分の高分子量部分まで精度よく分離分画できるポリアク
リルアミドゲル膜の要請が高まってきた。

一方，蛋白をその分子量の違いにより１回の電気泳動操
作で分離分画分析する場合，通常の濃度一定のポリアク
リルアミドゲル膜では，分離分画した蛋白のバンドの間
隔が低分子量部分では広く，高分子量部分では狭くな
る。このため蛋白の高分子量部分の分離が悪くなる。そ
こで低分子量部分から高分子量部分まで広い分子量範囲
にわたって均等に良好な分離分画性能を得るために，電
気泳動方向にポリアクリルアミドゲル濃度又は緩衝液濃
度に勾配をもたせたポリアクリルアミドゲル膜(グラジ
エントゲル膜)が使用されている。例えば特開昭60−235
819(EP 0 159 694A)にはポリアクリルアミド濃度(ゲル
濃度又は孔径サイズ）勾配を有するポリアクリルアミド
ゲル電気泳動用媒体膜を，アクリルアミドと架橋剤を含
む水溶液の薄層を支持体の表面で電子ビーム等の電離放
射線を用いて架橋重合させて製造する方法及び装置が記
載されている。この方法に用いられる装置及び濃度勾配
をゲル膜中に発現させるための電子ビーム等のコントロ
ール法はきわめて複雑である。また特願昭62−129924
(特開昭63-295955)に記載の方法等に従ってゲル濃度勾
配をもたせたポリアクリルアミドゲル膜（濃度グラジエ
ントゲル膜）を流延塗布して製造する場合には，塗布用
水溶液の濃度変化にともなって流延塗布する方向に膜厚
の変動を生じたり，泳動像又は泳動パターンの乱れが発
生するという欠点があることが判明した。

［発明の目的］ 本発明の目的は蛋白等の生体高分子成分又はその他の高
分子成分の低分子量部分から高分子量部分までほぼ同等
な良好な高分離性能を持ち，泳動像又は泳動パターンの
乱れの排除されたあるいは乱れの極めて少ないポリアク
リルアミド系水性ゲル濃度グラジエントを有する膜状又
は柱状（角柱状又は円柱状）のゲル媒体の改良された製
造方法を提供することである。

本発明の他の目的は蛋白等の生体高分子成分又はその他
の高分子成分の分離分画分析に用いられる膜(層)状のポ
リアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体(以下，ゲ
ル媒体膜又はゲル膜という)において，ポリアクリルア
ミド系水性ゲルの濃度の漸次変化(濃度勾配)に伴う不規
則なあるいはコントロールされざる膜厚の変動が排除さ
れたあるいは膜厚の変動が極めて少ないポリアクリルア
ミド系水性ゲル濃度グラジエントを有するゲル媒体の改
良された製造方法を提供することである。

［発明の構成］ 本発明は，アクリルアミド系化合物と架橋剤を異なる濃
度で含有する２種類の水溶液を，相互の混合比率を漸次
変化させながら混合し，前記アクリルアミド化合物と前
記架橋剤の濃度の予め定められた漸次的変化を形成しつ
つ重合開始剤の存在下に架橋重合させて，予め定められ
たアクリルアミド化合物と架橋剤の濃度勾配（ポリアク
リルアミド系水性ゲル濃度グラジエント）を有する電気
泳動用媒体の製造方法において，前記異なる濃度の２種
類の水溶液の混合前の相互の粘度差が，混合する２種類
の液の粘度の平均(算術平均)値を基準にして，その上下
12％以内であることを特徴とする膜状又は柱状（角柱状
又は円柱状）の電気泳動用媒体の製造方法である。

［発明の構成の詳細な説明］ 本発明のポリアクリルアミド系水性ゲル電気泳動用媒体
の製造方法は，膜(又は層)状のゲル媒体と柱状(角柱状
又は円柱(又はカラム)状)のゲル媒体にほぼ同じく適用
できるので，以下においては膜(又は層)状のゲル媒体
(ゲル媒体膜)を主にして説明する。

ゲル媒体に用いることができるアクリルアミド系化合物
(単量体)の例としては，アクリルアミド，N-メチルアク
リルアミド，N,N-ジメチルアクリルアミド，N-(ヒドロ
キシメチル)アクリルアミド，ジアセトンアクリルアミ
ド等のアクリルアミドホモログがある。これらの化合物
は単独で，または２種以上を組合せて用いることができ
る。これらの化合物のうちではアクリルアミドが好まし
く，またアクリルアミドと他のアクリルアミド系化合物
の１種以上との併用も好ましい。

架橋剤としては「エレクトロフォレシス(Electrophoresi
s)」,2(4),213−219(1981),同誌2(4),220−228(1981)等
に記載の二官能性架橋剤化合物，特開昭61−2058等に記
載の三官能性以上の架橋剤化合物を用いることができ
る。二官能性架橋剤の具体例として,N,N′-メチレンビ
スアクリルアミド(BIS)；N,N′-プロピレンビスアクリ
ルアミド（PBA）；ジアクリルアミドジメチルエーテル
（DAE）；1,2-ジアクリルアミドエチレングリコール（D
EG）；エチレンウレアビスアクリルアミド（EUB）；エ
チレンジアクリレート(EDA)；N,N′−ジアリルタルタル
ジアミド(DATD)；N,N′-ビスアクリリルシスタミン(BA
C)がある。三官能性架橋剤の具体例として，1,3,5-トリ
アクリロイルヘキサヒドロ-s- トリアジン（TAHT）；ト
リアリルシアヌレート（TAC）；トリアリルイソシアヌ
レート（TAIC）等がある。これらの架橋剤のうちで BIS
とTAHTが好ましい。架橋剤は２種以上を組合わせて用い
ることもできる。

架橋剤の量は，単量体と架橋剤の合計重量に対して約0.
5w％から約30w％,好ましくは約1.0w％から10w％の範囲
で用いられる。

ゲル媒体には液の粘度を調整する目的および他の諸目的
でアガロース，水溶性ポリマー(例，水溶性セルロース
誘導体，ポリアクリルアミド) の１種類又は２種類以上
を添加することができる。

アガロースとしては，特開昭55−5730，特開昭55−1109
46,特表昭57−502098，特開昭59−126236等に記載の低
電気浸透性アガロース，中電気浸透性アガロース，高電
気浸透性アガロースのいずれも用いることができる。ア
ガロースの添加量は単量体と架橋剤を含む水性ゲルの容
積に対して，約0.1w/v％から約2.0w/v％，好ましくは約
0.2w/v％から約1.2w/v％の範囲である。

水溶性ポリマーとしては，特開昭59−126236，特開昭60
−60548等に記載の分子量約1万〜約100万の範囲の付加
重合型または縮重合型の水溶性の非イオン性ポリマー,
特開昭61−18852等に記載のビニルスルホニル基等含有
の架橋性アクリルアミド系コポリマー，特願昭61−2148
78(特開昭63-70156)に記載の水溶性セルロース誘導体等
を用いることができる。付加重合型の水溶性の非イオン
性ポリマーの例としてポリアクリルアミド，ポリビニル
アルコール，ポリビニルピロリドンがある。縮重合型の
水溶性の非イオン性ポリマーの例としてポリエチレング
リコール，ポリプロピレングリコール，ポリ−N-ビニル
ピロリドンがある。架橋性アクリルアミド系コポリマー
の例として,N-[[3-(ビニルスルホニル)プロパンアミド]
メチル]アクリルアミド−アクリルアミドコポリマー；N
-[[3-(2-クロロエチルスルホニル)プロパンアミド]メチ
ル]アクリルアミド−アクリルアミド−N-(1,1-ジメチル
-3-オキソブチル）アクリルアミドコポリマーがある。
水溶性セルロース誘導体の例としてメチルセルロース，
エチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，ヒド
ロキシプロピルメチルセルロース，ヒドロキシブチルメ
チルセルロース等の水溶性セルロースエーテルがある。
これらの水溶性ポリマーのうちではポリアクリルアミ
ド，ポリエチレングリコール，N-[[3-(ビニルスルホニ
ル)プロパンアミド]メチル]アクリルアミド−アクリル
アミドコポリマーが好ましい。水溶性ポリマーの添加量
は，付加重合型または縮重合型の水溶性の非イオン性ポ
リマーの場合，単量体と架橋剤の合計重量に対して約2w
％から約100w％，好ましくは約5w％から約50w％の範
囲，架橋性アクリルアミド系コポリマーの場合，アクリ
ルアミド系化合物の重量に対して約1w％から約50w％，
好ましくは約5w％から約40w％の範囲である。

ゲル媒体には湿潤剤として，グリセロール，エチレング
リコール等のポリオール化合物を添加することができ
る。その添加量は水性ゲル媒体の容積に対して約1w％か
ら約40w％の範囲である。

アガロース及び／又は水溶性ポリマーはゲル形成液を調
製する時から濃度の異なる２種類のゲル形成液を混合す
る前までに添加することが好ましい。グリセロール，エ
チレングリコール等のポリオール化合物をゲル媒体に添
加する時期は通常単量体と架橋剤を水に溶解する時から
ポリアクリルアミド系水性ゲルの形成時(又は管に充填
時)までの間何時でもよいが，単量体と架橋剤を水に溶
解する時から濃度の異なる２種類のゲル形成液を混合し
流延塗布する前(又は管に充填する前)までの間が好まし
い。

ゲル媒体を蛋白質又は複合蛋白質(例えば，リポプロテ
イン，グリコプロテイン等)の分離分画分析に用いる場
合には，変性剤として陰イオン性界面活性剤を含有させ
ることが好ましいが，又は必須であることが多い。陰イ
オン性界面活性剤を電気泳動媒体に含有させることによ
り蛋白質又は複合蛋白質の効率的な分離分画とそれらの
分子量測定が可能になる。ゲル媒体を核酸フラグメント
の分離または分取の目的に用いる場合には陰イオン性界
面活性剤の添加は不要である。

変性剤としての陰イオン性界面活性剤の例としてはアル
キル硫酸塩をあげることができ，殊に炭素原子数10以上
の長鎖アルキル基を有するアルキル硫酸塩が好ましく用
いられる。塩を形成する陽イオンとしては，ナトリウム
イオン，カリウムイオン，リチウムイオン等のアルカリ
金属イオンが一般的であり，これらのうちではナトリウ
ムイオンが用いやすい。アルキル硫酸塩のうちではドデ
シル硫酸塩（ナトリウム塩，カリウム塩，リチウム塩
等）が好ましく，なかでもドデシル硫酸ナトリウム(SD
S)が最も好ましい。

変性剤としての陰イオン性界面活性剤の添加量は単量体
と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約2.0w/v％以
下，好ましくは約0.1w/v％から約1.5w/v％の範囲であ
る。変性剤の添加時期は通常単量体と架橋剤を含む諸成
分を水に溶解する時から水性ゲルの形成時までの間が好
ましい。

ゲル媒体には変性剤と異なる種類のノニオン性，アニオ
ン性又は両性界面活性剤を添加することができる。界面
活性剤の例として， 等のノニオン性界面活性剤， 等のアニオン性界面活性剤， 等の両性界面活性剤がある。界面活性剤の添加量は，単
量体と架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して，ノニオン
性又はカチオン性界面活性剤の場合，約 1×10^-4から約
5×10^-1w/v％，好ましくは約1×10^-3から約 1×10^-2w/
v％の範囲，アニオン性界面活性剤の場合，約 1×10^-4
から約 5×10^-2w/v％，好ましくは約 1×10^-3から約 5
×10^-2w/v％の範囲である。

ゲル媒体には電気泳動される試料に応じて電気泳動実施
時のpH値を 2.5から10.0の範囲内の所望の値に緩衝でき
る公知のpH緩衝剤から適宜選択して含有させることがで
きる。ゲル媒体を核酸フラグメントの分離又は分取に用
いる場合には pH8.0から10.0,好ましくは 8.0から9.0の
範囲内の所望のpH値に緩衝できる公知のpH緩衝剤から適
宜選択して含有させることができる。

用いうるpH緩衝剤としては，日本化学会編「化学便覧
基礎編」(丸善(株),1966年発行)1312−1320頁；Ｒ．Ｍ．
Ｃ．ドーソン他(R.M.C.Dawson et al)編「データ・フォ
ア・バイオケミカル・リサーチ(Data for Biochemical
Research)」第２版(オックスフォード・アト・ザ・クラ
レンドン・プレス(Oxford at the Clalendon Press.),1
969年発行)476−508頁；「バイオケミストリ(Biochemis
try )」 ５，467−477頁(1966年);「アナリティカル・
バイオケミストリ(Analytical Biochemistry)」104,300
−310頁(1980年)等に記載のpH緩衝剤組成物がある。

pH2.5〜10.0の範囲のpH緩衝剤の具体例として，バルビ
タールを含む緩衝剤；トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン(Tris)を含む緩衝剤；燐酸塩を含む緩衝剤；硼
酸塩を含む緩衝剤；酢酸又は酢酸塩を含む緩衝剤；枸櫞
酸又は枸櫞酸塩を含む緩衝剤；乳酸又は乳酸塩を含む緩
衝剤；グリシンを含む緩衝剤；N,N-ビス(2-ヒドロキシ
エチル)グリシン(Bicine)； 4-(2-ヒドロキシエチル)-1
-ピペラジンプロパンスルホン酸(HEPPS),Na塩又はK塩
等；β-ヒドロキシ-4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラ
ジンプロパンスルホン酸(HEPPSO),Na塩又はK塩等；3-
[[2-ヒドロキシ-1,1-ビス(ヒドロキシメチル)エチル]ア
ミノ]-1-プロパンスルホン酸(TAPS),Na塩又はK塩等；3-
(シクロヘキシルアミノ)-1-プロパンスルホン酸(CAPS),
Na塩又はK塩等；及びこれらのいずれかと必要により組
合せられる酸，アルカリ又は塩がある。好ましい緩衝剤
の具体例として，燐酸二水素カリウム−燐酸水素二ナト
リウム；Tris−塩酸；Tris−硼酸ナトリウム；Tris−硼
酸ナトリウム−EDTA・2Na塩；Tris−枸櫞酸；バルビター
ルナトリウム−酢酸ナトリウム；バルビタールナトリウ
ム−塩酸；バルビタール−バルビタールナトリウム；酢
酸−酢酸ナトリウム；乳酸−乳酸ナトリウム；枸櫞酸−
燐酸二水素ナトリウム；Bicine；HEPPS；HEPPS・Na塩；H
EPPSO；HEPPSO・Na塩；TAPS；TAPS・Na塩；CAPS；CAPS・Na
塩等がある。

pH8.0〜10.0の範囲のpH緩衝剤の具体例として，Tris；B
icine；HEPPS,Na塩又はK塩等；HEPPSO,Na塩又はK塩等；
TAPS,Na塩又はK塩等；CAPS,Na塩又はK塩等；及びこれら
のいずれかと必要により組合せられる酸，アルカリ又は
塩がある。好ましい緩衝剤系の例としてTris−硼酸−ED
TA・2Na塩(pH8.2〜8.3用組成)；Tris−塩酸（pH8.9用組
成）；CAPS・Na塩（pH8.9用組成），Tris−グリシン等が
ある。

予め定められた厚さのゲル媒体膜は実質的に無色透明で
あることが泳動像又は泳動パターンの検出又は読取りに
一般的に好ましい。

ゲル媒体膜は，実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平
滑な表面のシート状（フィルム状，又は平板状）支持体
又はカバーシートの上に予め定められた厚さを有する膜
又は層として設けられる。実質的に電気不伝導性で水不
浸透性の平滑な表面のシート状支持体又はカバーシート
として公知のガラス板，有機ポリマーシート等を用いる
ことができる。有機ポリマーシートの具体例としてポリ
エチレンテレフタレート，ビスフェノールＡのポリカル
ボネート，ポリスチレン，セルロースエステル(例，セ
ルロースジアセテート，セルローストリアセテート，セ
ルロースアセテートプロピオネート等）等のポリマーか
らなる厚さ約50μｍから約２mm,好ましくは約80μｍか
ら約500μｍの範囲の透明な，すなわち波長約200ｎｍか
ら約900ｎｍの範囲内の少なくとも一部の範囲の波長の
電磁輻射線を透過させる平滑な表面を有するシート状物
又は平板状物がある。有機ポリマー支持体又はカバーシ
ートを用いる場合にはその表面を親水化しゲル膜との接
着を良好にするために，紫外線照射，グロー放電処理，
コロナ放電処理，火焔処理，電子線照射，ケミカルエッ
チング，電解エッチング等の公知の表面処理方法を適用
することができる。有機ポリマー支持体又はカバーシー
トの表面には必要に応じて特開昭59−164950,特開昭59
−212753,特開昭60−194349,特開昭60−239658,特開昭6
0−244850,特開昭61−14557等に記載の下塗層又は接着
層を設けてその上に設けられるゲル媒体層と支持体又は
カバーシートとの接着を強固にすることができる。

濃度の異なる２種類のゲル形成水溶液の混合比率を連続
して漸次変化させる方法は，公知の諸種の方法に従って
実施することができる。その例として,堀尾,山下編「蛋
白質・酵素の基礎実験法」(南江堂,1981年発行)304〜308
頁,特開昭54−43881に記載されているように,単量体(ア
クリルアミド系化合物),架橋剤，重合開始剤の含有量の
異なる高低濃度の２種類のゲル形成液をそれぞれ収容す
る２個の容器を底面のすぐ上部を導管で連結し，さらに
一方の容器底面のすぐ上部から混合液送出導管を結合
し，混合液送出導管の接続されている側の容器（低濃度
液側又は高濃度液側のいずれか一方）の中の液を攪拌し
ながら混合液送出導管の途中に設けられているポンプで
混合液を送り出す方法；特開昭62−167459に記載されて
いるように，高低濃度の２種類のゲル形成液をそれぞれ
収容する２個のゲル形成液収容容器，２種類のゲル形成
液を受け入れて混合攪拌する１個の混合攪拌容器，２個
のゲル形成液収容容器それぞれから１個の混合攪拌容器
に液を輸送する液輸送導管，各液輸送導管の途中に設け
られている液輸送流速設定手段，各液輸送流速設定手段
を予め定めた流速の漸次変化函数に対応した信号(情報)
に従って各液輸送流速に設定するためのコントロール手
段，混合攪拌容器から出ている１個の液輸送導管とその
先端部に接続されている流延塗布手段を有する装置を用
いる方法等がある。また，特願昭62−129924(特開昭63-
295955)に記載されているように，高低濃度の２種類の
ゲル形成液の流量比を予め定めた漸次変化に対応する函
数に従って液送出手段(ポンプ)で送り出し，スタティッ
クミキサー中で混合する方法を用いることもできる。

ゲル形成液の粘度調整の方法として，ゲル形成液中のア
ガロース，水溶性ポリマー(例,水溶性セルロース誘導
体,ポリアクリルアミド)の１種類又は２種類以上を所望
の粘度になるような含有量で添加する方法が好ましい。
この方法によりアクリルアミド系化合物の含有量の広い
範囲にわたってゲル形成液の粘度を実質的に所望の一定
値にすることができる。

高低濃度の２種類のゲル形成液の粘度は,約0℃から約80
℃,通常約5℃から約50℃の温度範囲で，約1cP〜約50c
P，好ましくは約2cP〜約20cPの範囲である。２種類のゲ
ル形成液の粘度が実質的に等しい(又は実質的に一致す
る)とは，２種類の液の相互の粘度差が，混合する２種
類の液の粘度の平均(算術平均)値を基準にして，その上
下約12％以内，好ましくは約10％以内であることを意味
する。ゲル形成液の粘度の測定方法としては，細管粘度
計,落球粘度計,回転粘度計等公知のいずれの粘度計によ
る測定方法を採用してもよい。粘度測定の際のゲル形成
液の温度は約0℃から約80℃,通常約5℃から約50℃の温
度範囲で,２種類の液の混合部分及び／又はゲル形成部
分での温度と実質的に同じ温度である。

ゲル媒体膜は，前述のようにして高低濃度の２種類のゲ
ル形成液を混合して予め定められた漸次の濃度（アクリ
ルアミド系化合物と架橋剤の含有量）の変化を有するゲ
ル形成液を平面状支持体又はカバーシートの上に膜状又
は層状に流延又は塗布し，分子状酸素の不存在下で，必
要により紫外線又は可視光の照射及び／又は加熱して，
単量体(アクリルアミド系化合物)と架橋剤とが架橋重合
したポリアクリルアミド系水性ゲル媒体膜又は層として
製造され用いられる。

角柱状又は円柱状(カラム状)のゲル媒体は，前述のよう
にして混合され予め定められた漸次の濃度の変化を有す
るゲル形成液を実質的に電気不伝導性で水不浸透性の平
滑な内側表面のガラス管又は有機ポリマー管に充填し，
分子状酸素の不存在下で，必要により紫外線又は可視光
の照射及び／又は加熱して，単量体(アクリルアミド系
化合物）と架橋剤とが架橋重合したポリアクリルアミド
系水性ゲル媒体として製造され用いられる。

アクリルアミド系化合物(単量体)と架橋剤は，水溶液又
は水分散液として水に溶解又は分散させておき，水中で
両者を架橋重合させて，架橋重合した水性ゲル媒体を形
成させる。本明細書においては特にことわらないかぎ
り，(水に)溶解と(水に)分散の両者を含めて単に(水に)
溶解といい，水溶液と水分散液の両者を含めて単に水溶
液という。溶媒又は分散媒としては，水だけでなく，所
望により加えられる有機溶媒を含む水−有機溶媒混合物
をも包含する。

ラジカル重合開始剤組成物としては「エレクトロフォレ
シス(Electrophoresis)」2(4),213−219(1981),同誌2
(4),220−228(1981),特開昭59−126236，青木,永井編
「最新電気泳動法」(1973年発行) 等に記載の低温ラジカ
ル重合開始剤組成物のうちから適宜に選択して用いるこ
とができる。ラジカル重合開始剤組成物の例として,β-
(ジメチルアミノ)プロピオニトリル(DMDPN)−ペルオク
ソ二硫酸アンモニウム混合物；N,N,N′,N′-テトラメチ
ルエチレンジアミン(TEMED)−ペルオクソ二硫酸アンモ
ニウム混合物；TEMED−リボフラビン混合物；TEMED−リ
ボフラビン−過酸化水素混合物；リボフラビン−ペルオ
クソ二硫酸アンモニウム混合物；リボフラビン−過酸化
水素混合物（リボフラビン等の光増感剤併用の場合には
紫外線又は可視光の照射を併用する）等がある。ラジカ
ル重合開始剤組成物の添加量は，単量体と架橋剤の合計
重量に対して約0.3w％から約5.0w％，好ましくは約0.5w
％から約3.0w％の範囲である。

ゲル濃度としてはＳ．ヒェルテン(S.Hjerten):「アーカ
イヴズ・オヴ・バイオケミストリ・アンド・バイオフィジク
ス(Archives of Biochemistry and Biophysics)」1(補冊
(Suppl.)),147−151頁(1962年)に記載の定義に従って表
示して,単量体,架橋剤および水からなるゲル媒体の容積
に対して単量体と架橋剤の合計量が約3w/v％から約30w/
v％の範囲で用いられる。

ゲル形成液を平面状支持体(又はカバーシート)の表面上
で架橋重合させる際には，ゲル形成液の流延塗布とその
後の架橋重合を窒素ガス雰囲気中等の分子状酸素の不存
在下で実施するか，あるいは流延塗布したゲル形成液の
表面上に直ちにカバー用フィルム，シート又は板等の被
覆材料で覆い架橋重合させることが好ましい。この目的
に使用される被覆材料としては前述の平面状支持体と同
様な素材からなるものを用いることができる。カバー用
フィルムが有機ポリマーフィルムである場合，その厚さ
は約300μｍ以下であり,実用的な範囲としては約4μｍ
から約200μｍ,好ましくは約4μｍから約100μｍであ
る。被覆材料がガラス板の場合，その厚さは支持体とし
て用いる平面状ガラス板と同様な厚さのものを用いるこ
とができる。また，サンプル注入部分の形状は，長方形
状,正方形状,三角形状(シャークスティース状),円形状
等公知の形状から選択して設けることができる。

ゲル媒体膜の厚さは，一般に約50μｍから約5mm,好まし
くは約80μｍから約1mmの範囲である。DNA等の核酸フラ
グメント分取に用いる場合には，厚さは約300μｍから
約3mmの範囲が好ましい。

円柱状のゲル媒体の直径は,一般に約3mmから約30mm,好
ましくは約5mmから約20mmの範囲である。

本発明の方法で製造されるゲル媒体膜又は柱状のゲル媒
体は前述の諸文献や特許明細書等に記載の公知の方法に
従って，水平型及び垂直型スラブ電気泳動法，カラム電
気泳動法，ディスク電気泳動法等に用いることができ
る。

実施例１及び比較例１ 表面を紫外線照射処理で親水性にした平滑表面の厚さ18
0μｍ,幅20cmの無色透明ポリエチレンテレフタレート(P
ET)シート(支持体)の長辺に沿った両縁辺部に一定厚さ8
00μｍ,幅10mmのスペーサー板を接着固定した。

一方，第1表Aに記載の組成の粘度をほぼ一致させ（相互
の粘度値の差が２液の粘度値の算術平均値からそれぞれ
1.8％),濃度(アクリルアミドと架橋剤の含有量) の異な
る２種類のゲル形成液を調製した。

２種類のゲル形成液(重合開始剤組成物未添加)を，特願
昭62−129924(特開昭63−295955)に記載の方法に従い，
第１図に示した塗布方向に20cmの長さにわたってゲル濃
度6.0％から20％まで直接状の濃度勾配になるように漸
次流量比を変化させながら（始に低濃度ゲル形成液の比
率を大きくし，徐々に高濃度ゲル形成液の比率を大きく
した），重合開始剤を添加しつつ，スタティックミキサ
ーで２液を混合し，一定流量で流延塗布ヘッドに混合液
を供給した。この混合液を一定流量で窒素ガス雰囲気中
で前記のPET支持体の上に流延塗布し,ゲル形成液膜に50
0Wキセノン放電灯を照射して架橋重合させ，ついで形成
されたゲル膜の上に厚さ63μｍ,幅20cmの無色透明PETシ
ートをカバーシートとして密着積層して，一定膜厚800
μｍで第１図に示したゲル濃度変化を有する濃度グラジ
エントポリアクリルアミド水性ゲル膜(本発明)を調製
した。

別に，第1表Bに記載の組成の粘度を一致させていない
（相互の粘度値の差が２液の粘度値の算術平均値からそ
れぞれ20.7％）２種類のゲル形成液を調製したほかは実
施例１と同様にして一定膜厚800μｍで第１図に示した
ゲル濃度変化を有する濃度グラジエントポリアクリルア
ミド水性ゲル膜(比較例)を調製した。

ゲル膜の濃度勾配(第１図)： ゲル濃度最小(流延塗布始端側)6.0％からほぼ直線状に
増加して最大(流延塗布終端側)20％． 得られた２種のゲル膜の膜厚を流延方向に沿って測定し
たところ，本発明の粘度を一致させた２種類のゲル形成
液を混合して調製した濃度グラジエントを有する膜厚一
定のゲル膜では，第2図Aに示したようにゲル濃度の増
大に対して膜厚の変動範囲は予め定めた膜厚に対して最
大約＋1.0％,最小約−0.8％の範囲に収まっており，厚
さの均一性は極めてすぐれていたが，粘度を一致させて
いない比較例のゲル膜では，ゲル濃度の増大に対して
膜厚の変動範囲は予め定めた膜厚に対して最大約＋5.5
％,最小約−1.3％の範囲に及んでおり，かつゲル濃度の
増大につれて膜厚が増大する部分があり，厚さの均一性
が悪いことが明らかになった。すなわち，本発明のゲル
膜の膜厚の変動範囲は従来技術である比較例のゲル膜の
膜厚の変動範囲の約1／4である。

性能評価試験 前記の２種類のゲル膜にサンプル注入口を設け，標準蛋
白質として α-ラクトアルブミン（分子量14400） 大豆トリプシン インヒビター（分子量20100） カルボニック アンヒドラーゼ（分子量30000） オバルブミン（分子量43000） 牛アルブミン（分子量67000） ホスホリラーゼ b（分子量94000） を用いて常法に従い電気泳動分離分画を実施し，クーマ
シーブルー(Coomassie Blue)R−250で泳動像を染色し
た。

その結果本発明のゲル濃度グラジエントを有するゲル膜
の分画パターンは正常の一直線状でかつ分画パターン
に乱れはなかった。これに対して従来技術である比較例
のゲル濃度グラジエントを有するゲル膜の分画パター
ンはＷ型の大きなうねり状で分画パターンに乱れがあっ
た。

この結果から，本発明の粘度を実質的に一致させた濃度
の異なる２種類のゲル形成液を混合する方法で調製した
濃度グラジエントを有する膜厚一定のポリアクリルアミ
ド水性ゲル電気泳動用媒体膜は，膜厚がきわめて一定
で，かつ分画パターンに乱れのないすぐれた電気泳動媒
体膜であることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】 第１図は実施例１及び比較例１のゲル濃度グラジエント
を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜の流延塗布方向
(電気泳動方向でもある)に沿う漸次的なゲル濃度変化
（濃度勾配又は濃度グラジエント）を示す断面模式図で
ある。 第２図は実施例１及び比較例１のゲル濃度グラジエント
を有するポリアクリルアミド水性ゲル膜の流延塗布方向
に沿う厚さ変動の測定値を予め定めた膜厚(800μｍ)に
対する変動パーセンテージで示した模式図である。Aは
本発明のゲル膜，Bは従来技術である比較例のゲル膜
の厚さ変動パーセンテージ曲線である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アクリルアミド系化合物と架橋剤を異なる
   濃度で含有する２種類の水溶液を相互の混合比率を漸次
   変化させながら混合し，前記アクリルアミド系化合物と
   前記架橋剤の濃度の予め定められた漸次的変化を形成し
   つつ重合開始剤の存在下に架橋重合させて，予め定めら
   れたアクリルアミド化合物と架橋剤の濃度勾配を有する
   電気泳動用媒体の製造方法において，前記異なる濃度の
   ２種類の水溶液の混合前の相互の粘度差が，混合する２
   種類の液の粘度の算術平均値を基準にして，その上下12
   ％以内であることを特徴とする電気泳動用媒体の製造方
   法。
2. 【請求項２】前記水溶液の少なくとも一方に水溶性ポリ
   マーが含まれる特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動
   用媒体の製造方法。
3. 【請求項３】前記水溶液の少なくとも一方に変性剤とし
   て陰イオン界面活性剤が含まれる特許請求の範囲第１項
   または第２項に記載の電気泳動用媒体の製造方法。
4. 【請求項４】前記陰イオン界面活性剤がアルキル硫酸塩
   である特許請求の範囲第３項に記載の電気泳動用媒体の
   製造方法。
5. 【請求項５】前記アルキル硫酸塩がドデシル硫酸のナト
   リウム塩又はカリウム塩である特許請求の範囲第４項に
   記載の電気泳動用媒体の製造方法。
6. 【請求項６】前記電気泳動用媒体が平面状支持体と平面
   状カバーシートとの間に層状の電気泳動用媒体膜として
   設けられる特許請求の範囲第１項ないし第５項のいずれ
   かに記載の電気泳動用媒体の製造方法。
7. 【請求項７】前記支持体と前記カバーシートがいずれも
   ポリエチレンテレフタレートからなるシート状物である
   特許請求の範囲第６項に記載の電気泳動用媒体の製造方
   法。
8. 【請求項８】前記電気泳動用媒体が管状支持体の内部に
   柱状の電気泳動用媒体として設けられる特許請求の範囲
   第１項ないし第５項のいずれかに記載の電気泳動用媒体
   の製造方法。