JPH01173858A

JPH01173858A - 電気泳動用媒体膜及び電気泳動方法

Info

Publication number: JPH01173858A
Application number: JP62335571A
Authority: JP
Inventors: Masashi Ogawa; 雅司小川; Yoshihiko Makino; 快彦牧野
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1987-12-28
Publication date: 1989-07-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の属する技術分野］本発明は電気泳動用媒体及び電気泳動方法に間するもの
で、詳しくは、高分子量の蛋白、巨大ＤＮＡ分子のパル
ス電場印加による″ｆＩｉ気泳動分寵に有用な電気泳動
用媒体及び電気泳動方法に間するものである。

本発明の電気泳動用媒体はパルス電場による巨大ＤＮＡ
の分離分析に有用なアカロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体である。また１本発明の方法は、パルス電場
による巨大［ＩＮＡの分離技術と濃度勾配を有する（濃
度グラジェント）アガロース系水性ゲル電気泳動媒体を
組み合わせることにより。

従来公知の方法では不可能であるか又は充分な分離分析
を実施できなかったような巨大ＤＮＡの分離分析を可能
とする電気泳動方法である。

本発明の電気泳動用媒体及び電気泳動方法の適用可能分
野として、染色体ＤＮＡの分離分析、染色体マツピング
、各種生物の遺伝子ライブラリの作成等がある。

［従来の技術］ゲル電気泳動は、遺伝子工学の分野において蛋白質や核
酸のような高分子物質を分離する手段として極めて重要
である。染色体マツピングなと巨大ＤＮＡ分離分析にお
いて、従来の連続ｉｌｆｌ涼気泳動法十数Ｋｈｐ（ｂｌ
）は１塩基対を表わし、ｌρは１０００塩基対を表わす
）以下の分子量範囲のＤＮＡが分離可能であり、これ以
上の分子量範囲のＤＮＡは分離不可能であった。近年に
おいて遺伝子聞達の研究が進むにつれて、ＤＮＡ塩基配
列決定の操作の迅速化が急務となっている。染色体や巨
大ＤＮＡから目的のＤＮＡ効率よく分離することに時開
がかかり、　ＤＮＡ塩基配列決定の効率を悪くしている
。

１９８２年ＣＡＮＴＯＲらはＰｕ１ｓｅ　Ｇｒａｄｉｅ
ｎｔ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｏｒｅｓｉｓ　（交差する
電界を交互に印加する′Ｒ電気泳動方法を案出し、特表
昭５９−５０２０３７に開示している。その池の現在ま
でに提案された方法として。

（＋ＬＳＯＮらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ
、、［，５６４７（１９８４）に記載のＯＰＡＧＥ（Ｏ
ｒｔｂｏｇｏｎａｌ　Ｆｉｅｌｄ　Ａｌｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎ　ＧｅｌεＩｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）。

ＦＩＧＥ（Ｆｉｅｌｄ　　Ｉ　ｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｇｅ
ｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）か知られている
。

これらの電気泳動方法は、いずれも電界方向をＰ１期的
に変化させることによりＤＮＡの形状を変化させて塩基
数の異なるＤＮＡを相互に分離する方法である。

０ＦＡＧＥ法においては電極を４５度の角度で設置し。

あいだの空間にアガロース濃度１％のゲルを置き。

印加電弊の強度をＩＯＶ／ｃｍ程度に設定し、数十秒の
周期で交互に電界を印加し、約１５時間電気泳動するこ
とにより、約４００ＫｂｐのＤＮＡまで分離することが
できろ。これら方法による分離の問題点は、電界の方向
に角度がついていることに起因して、泳動像が歪むので
、ＤＮＡ分子の分子量を決定する際に誤差が大きくなる
という欠点を有していることである。

ＦＩＧＥ法は電界の方向を１８０度で（正反対向きに）
反転させる方法である。この方法は電場方向が正確に一
定方向に向かっているため分Ｕａが歪むといった問題点
はない。しかし、この方法においては分離するＤＮＡの
分子量の大きさに対応させてパルスの条件を選択設定す
るのではあるが、ゲル膜全体にわたって逆方向と順方向
に一定の電界を印加するので、目的のＤＮＡ分離領域の
分子量の形状を効率良く変形させるには不充分である。

このためＤＮＡの分画可能分子量範囲が狭いという問題
点がある。かかる問題点を解決することは、遺伝子解析
及びＤＮＡシークエンス解析のスピードを上げるために
切望されていることである。

［発明の目的コ本発明の目的はパルスフィールド電気泳動条件こ有用な
改良された７カロース系水性ゲルからなる電気泳動用媒
体を提供することである。

本発明の他の目的は巨大［ＩＮＡ分子を分離するための
電気泳動法におけろ分画可能分子量範囲を広げたパルス
フィールド電気泳動方法に有用なアカロース系水性ゲル
からなる１ｆ′ｊｃ泳動用媒体を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子の分子量に適した電
気泳動条件を容易に設定することができ。

かつ短時間の泳動操作て高い分画性能が達成されるパル
スフィールド電気泳動方法に有用なアカロース系水性ゲ
ルからなろを提供することである。

本発明の目的はアガロース系水性ゲルからなる電気泳動
用媒体を用いろ改良されたパルスフィールド電気泳動法
を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子を分離するための電
気泳動法における分画可能分子量範囲を広げたパルスフ
ィールド電気泳動方法を提供することである。

本発明の他の目的は巨大ＤＮＡ分子の分子量に適したミ
ス泳動条件を容易に設定することができ。

かつ短時間の泳動操作で高い分画性能が達成されるパル
スフィールド電気泳動方法を提供することである。

［発明の構成コ本発明は。

■濃度勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体膜、及び。

■濃度勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる電気
泳動用媒体膜を用いることを特徴とするパルスフィール
ド電気泳動方法。

である。

［発明の構成の詳細な説明］本発明の濃度勾配を有するアガロース系水性ゲルからな
る電気泳動用媒体膜に用いられるアガロースとしては、
巨大分子量のＤＮＡ分離又は塩基解析に通常用いられる
アガロースを用いろことができる。アガロースとしては
、低電気浸透性、中電気浸透性、高電気浸透性アガロー
スのいずれをも用いろことができる。用いることのでき
ろアガロースの例として、特開昭５５−５７３０．特開
昭５５−１１０９４６、特表昭５７−５０２０９８等の
各公報に記載のアガロース等がある。水性ゲルには水溶
性ポリマーを添加することができる。水ＩＭ性ポリマー
の例として。

ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール等のノニ
オン性水溶性ポリマーがある。水溶性ホリマーの添加量
はアガロースに対して重量比で約２０％以下、好ましく
は約０．１％から約ｌＯ％の範囲である。水性ゲルには
その他に公知の添加剤１例えは界面活性剤（例、ノニオ
ン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤）、ｐ）Ｉバッ
ファー組成物、変性剤、ポリオール化合物（例、グリセ
ロール）、変性剤等を公知の含有量範囲で含有させるこ
とができる。水性ゲルの濃度としては約０．４％〜約４
．０％の範囲内で目的又はＤＮＡ試料の分子量範囲等に
応して選択された適宜な濃度勾配で用いられろ。水性ゲ
ル膜の厚さは、特に制限はないが、約１１００ｕ〜約１
０ｍｍの範囲であり、実用的に好ましい範囲としては約
１００１．ＩＴｒＩ〜約７１１ＩＩＩｌである。

水性ゲル膜の濃度変化は、試料注入１！Ｉ（陰播０！ｌ
Ｉ）のゲル濃度が反対側の側（陽極側）のゲル濃度より
大きいように通常設定される（サンプル注入端部から電
気泳動方向に沿って高濃度−低濃度の順の漸次的濃度変
化又は階段状濃度変化）が、目的又はＤＮＡ試料の分子
量範囲等に応じて逆の濃度変化を採用することもてきる
。

ゲル媒体の濃度勾配は、サンプル注入端部から泳動方向
に沿う距離に対してゆるく折れた直線状。

直線状：あるいは階段間数、指数間数、対数間数。

懸垂線、追跡線、放物線、双曲線、楕円、３次曲線等の
間数で現わされる曲線の一部分状、その他の任意の漸次
的変化の曲線、又は曲線と直線の組合せでゲル濃度が減
少する（所望により９次いて予め定めた長さにわたって
実質的に一定濃度を保つ）ような濃度勾配が基本である
。また、アガロース濃度変化とゲル膜厚変化を組合せる
こともできる。サンプル注入部分の形状は、長方形状、
正方形状、三角形状（シャークスティース状）９円形状
等公知の形状から適宜に選択して設けることができる。

電気泳動用媒体膜を支える支持体として通常ガラス、セ
ラミックス、電気絶縁性有機ポリマーからなる平滑表面
の板又は薄板（シート）を用いることができる。有機ポ
リマーからなる板又はシートの例として、ポリアクリル
酸エステル（例、ポリメチルアクリレート）ポリマーシ
ート、ポリ塩化ビニルシート、ポリエステル（例、ビス
フェノールＡのポリカルボネート、ポリエチレンテレフ
タレート）等がある。好ましい有機ポリマー支持体とし
てポリメチルアクリレート、ポリエチレンテレフタレー
トかある。有機ポリマー支持体の表面は公知の物理化学
的表面処理（例、紫外線照射処理、グロー放電処理）及
びｌ又は下塗層設置（例、セルロースアセテート下塗層
、ゼラチン下塗層）をすることが好ましい。

支持体はゲル媒体膜の片側のみに配置してもよく、また
は９両側からゲルを支持してもよい。ゲル膜の作成方法
としては、２枚のカラス板又はポリマー板をスペーサー
を両端部に介して薄い厚さてかつ所望の厚さを有する空
間を作成し、その内部空間にアガロース濃度を変化させ
ながらアカロース水溶ｉαを注入してゲルを形成させろ
モウルド法、又は支持体の上に７カロースの濃度を変化
させなからアガロース水溶液を塗布してゲル１ヒさせろ
方法によって濃度を変化させてゲル膜を作成することが
できる。

ゲル媒体の７ガロ一ス濃度勾配を形成する方法として、
２枚の平板状ガラスく支持体とカバーシート）の間にス
ペーサ板を固定したガラスモールドの中に、泳動方向に
予め定めた長さになる量の相対的に高濃度の７カロース
水溶液（ゲル形成液）を注入してゲル化させた後、泳動
方向に予め定めた長さになる量の相対的に低濃度の７ガ
ロース水溶液を注入してゲル化させろ工程を順次繰り返
す方法；堀尾、山下編「蛋白質・酵素の基礎実験法」（
南江堂、１９８１年発行）３０４〜３０８頁、特開昭５
４−４３８８１に記載されているように、アガロース含
有量の異なる高低濃度の２種類のアガロース水溶液をそ
れぞれ収容する２個の容器を底面のすぐ上部を導管で連
結し、さらに一方の容器底面のすぐ上部から混合液送出
導管を結合し、混合液送出導管の接続されている側の容
器（低濃度液側又は高濃度液側のいずれか一方）の中の
液を撹拌しながら混合液送出導管の途中に設けられてい
るポンプで混合液を送り出す方法；特開昭６２−１６７
４５９に記載されているように、高低濃度の２種類のア
ガロース水溶液をそれぞれ収容する２個の液収容容器、
２種類のアガロース水溶液を受は入れて混合撹拌する１
個の混合撹拌容器、２個の液収容容器それぞれから１ｇ
の混合撹拌容器に液を輸送するｉ夜輸送導管。

各液輸送導管の途中に設けられている＋α輸送流速設定
手段、各液軸送流速設定手段を予め定めた流速の漸次変
化函数に対応した情報（信号）に従って各液輸送流速に
設定するためのコントロール手段。

混合撹拌容器から出ている１個の液輸送導管とその先端
部に接続されている流延塗布手段を有する装置を用いる
方法；特願昭６２−１２９９２４に記載されているよう
に、高低濃度の２種類の７ガロース水溶）夜の流量比を
予め定めた漸次変化に対応する函数に従って液送出手段
（ポンプ）で送り出し、スタティックミキサー中で混合
する方法等がある。

本発明の電気泳動方法の特徴をなす電界の印加方法につ
いて説明する。電界の印加方法としてはＣＡＮＴＯＲら
の方法、０ＦＡＧＥ法等の公知の方法を適用することが
でき、制限はない。従来の一定の方向に直流電圧をかけ
ろ電気泳動法と異なり９本発明のパルスフィールドくパ
ルス電界）電気泳動法では周期的に電場の向きを１８０
度（正反対の方向に）反転させながら電気泳動を実施す
る。Ｎ場はパルス状に印加する。泳動方向の長さ約５Ｏ
ｎ＋ｍから約５０ｃｍの範囲のゲル膜について９両端く
陽極と陰極）に印加する電圧（電位差）は約＋ＩＯＶか
ら約十５ｏｏｏｖ又は約−１０〜′から約−５０００Ｖ
、好ましくは約＋３０Ｖがら約＋２０００Ｖ又は約−３
０Ｖから約−２０００Ｖの範囲内で適宜に選択された電
圧値で、かつ約１ミリ秒から約１０００秒。

好ましくは約１００ミリ秒から約１０００秒の範囲内で
適宜に選択された時間で電位を周期的に変化させる。

巨大ＤＮＡ（数十Ｋｂｐから数千Ｋｂｐ）の分離のため
には約＋５０Ｘから約＋１０００Ｓ’又は約−５０ｖカ
ら約−１０００Ｖの範囲の電圧が用いられろ、電界印加
の方法としては特に制限はないが１例えば順方向の電圧
を大きく逆方向の電圧を小さくしてもよい。また逆に順
方向の電圧を逆方向の電圧よりも小さくしてもよい。実
質的に順方向の泳動速度が逆方向の泳動速度より大きく
なるように電圧の印加時間を選ぶことが原則である。パ
ルスの印加時間としては特に制限はないが分画する分子
量の大きさにより選択されろものであるが、好ましい印
加時間は約１ミリ秒から約１０００秒、好ましくは約１
００ミリ秒から約１０００秒、特に巨大ＤＮＡの分離に
おいては約１秒から約１０００秒の範囲が好ましい。作
用させるパルス電場の波形は０例えば、矩形波、鋸歯波
、正弦波等のいかなる波形でもよく、制限はない。

電気泳動操作様式としては垂直式電気泳動法。

水平式電気泳動性等公知のいずれの様式を用いてもよい
。

巨大ＤＮＡのような二重鎖ＤＮＡの検出には、電気泳動
後エチジウムプロミドのような蛍光剤を用いて発色させ
て可視化させた後写真を撮り分離状況を解析する。別法
として、ニトロセルロース微多孔性膜のようなメンプラ
ン膜にＤＮＡをトランスファー（ＳＯＵＴＨＥＲＮブロ
ッティング法）させ、ついで放射性同位元素てラベルし
たＤＮＡプローブでパイプリダイゼーションさせた後、
オートラジオグラフィー処理、又はイメージングプレー
トを有するコンピユーテッドラジオグラフィー装置によ
る処理を行って９分離パターンを可視化する。色素又は
蛍光色素でラベルした核酸フラグメントを含む試料を用
いて電気泳動分離する場合には９分離パターンを光−電
気変換素子を含む装置により分離パターンを可視化する
ことができろ。

圓１１ｆ理実施例１［Ｊ度グラジェントアガロースゲル膜の調製コ下記キ且
成のＴＨＥバッファー水溶水溶イアカロースを、′；７
解して７カロース濃度２．０％と０．５％の２１４類の
アカロースＴＢＥバッファー水溶液（ゲル形成液）を調
製した。高低濃度２種類のアカロース水溶液を、特願昭
６２−１２９９２４に記載の方法に従い、塗布方向に２
０ｃｍの長さにわたってゲル濃度０．５％から２．０％
（ゲル膜１）及び帆５％から２．５％（ゲル膜２）に直
線状のＪ！４度勾配になるように漸次流量比を変化させ
ながら（初めに低濃度アカロース水溶ｉ夜の比率を大き
くシ、徐々に高濃度アガロース水溶液の比率を大きくし
た）、スタティックミキサて２．αを混合し、一定流量
て流延塗布ヘットに混合液を供給した。この混合液を一
定ｔｉ？Ｆ２０ｃｍ角の平滑表面のガラス板量の上に、
ゲル膜厚が−様な厚さ２．０ｍｍになるようにして流延
塗布した後、低温度に侃ちゲル化させて、調度勾配の異
なる２１類の７カロース水性ゲル膜を作成した。

■ＴＢＥバッファーの組成Ｔｒｉｓ（）リス（ヒドロキシメチル）アミノ−メタン
の慣用名）　　　　　　　　　　　２０（３ｇ■故　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　
ｌｏｇＥＤＴＡ・２Ｎａ塩　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１８．６３水を加えで　　　　　　
　　　　２０．ＯＬにする■高濃度アカロース水ｊ容液
の組成７カロース　　　　　　　　　　　　　　２００ｇ上３
己ＴＢＥバ・ンフ７−　　　　　　　　　　　１０Ｌ■
低濃度７カロース水溶液の組成７カロース　　　　　　　　　　　　　　　５０ｇ上記
上記ｌＥバッファー　　　　　　　　　　　１０Ｌつい
て得られたアガロース水性ゲル膜の濃度の大きい側の端
部近傍にサイズｌｏｍｍＸＩｓｍｍのウェル型のコーム
を用いて常法によりサンプル用ウェルを作成した。

［濃度グラジェントアガロースゲル膜の性能評価実験］ＤＮＡ試料として、ＴｄＣＤＮＡ（１６＋３にｂ）、入
ＤＮＡ　（４８にｂ）。

入ＤＮＡのＨｉｎｄ　ｍによる分解物を用いた。各ＤＮ
Ａ試料の０．０２μｇを、１０％クリ七ロール、０．０
０１５％プロむフェノールブルーを含む上記と同じ成分
濃度のＴＢＥバッファー水宿液５　Ｂ　Ｌに溶解して用
いた。試料はピペットの先端をカットしたＧ１１ｓｏｎ
　Ｐｉｐｅｔ＋ｎａ１１を用いてウェルに充填した。つ
いて、パルスを印加する前に一方向の直流電界下で１５
分かけて試料をアカロースゲル膜中に導入した。

電気泳動操作はゲル濃度の大きい割の端部を陰極側に接
続し、温度を１４．０’Ｃに維持してパルス・インバー
ジョン法に従って電気泳動を行った。電気泳動条件は第
１表に示したとおりてあった。

泳動終了後に、　ＴＯεバッファー１ｍ１．当たり０．
５μ８の臭化エチジウムを含有する染色液にゲルを浸漬
してＤＮＡの泳動像を可視化した。ついて可視泳動像を
フジインスタント白黒フィルム（商品名ＦＰ−３０００
Ｂ）を用い短波紫外光照射下で写真撮影した。

写真の泳動像で各ＤＮＡの移動距離を調べたところ。

′＠１表に記載の結果が邊られた。

比較例１ゲル膜厚一定（２，０ｍｍ）、ゲル濃度−定（１，５％
）である他は実施例１と同様のアカロース水性ゲル膜（
ゲル膜３）を作成した。ついて実施例１と同様にして性
能評価実験を実施したところ、第１表に記載の結果が１
７られた。

第１表の結果から１本発明の濃度グラジェントを有する
アカロースゲル膜を用いたパルスフィールドミス泳動方
法ににおいでは、ＤＮＡ試料の移動距雛は比較例の厚さ
−様なゲル膜を用いた方法に比へて顕著に広くなってお
り２本発明のり”ル媒体及び泳動方法の効果は明らかで
ある。

実施例２実施例１と同様にして高低濃度２種類のアカロースＴＢ
Ｅバッファー水溶液を調製し、厚さ２５０μｍの無色ポ
リエチレンテレフタレートフィルムの上に第１表と同様
の水性ゲル膜を作成した。この７カロースゲル膜を用い
て実施例１と同様にして電気泳動を行ったところ、実施
例１と同様な結果か得られた。この性能評価実験により
、支持体としてポリエチレンテレフタレートフィルムを
用いたアガロースゲル膜においてもカラス板を支持体と
して用いた場合と同様のＤＮＡ分画性能を有することか
明１）かになった。

実施例３厚さ２５０７１ｍの無色透明ポリエチレンテレフタレー
トフィルムを支持体として用い、支持体の上に実施例１
と同様にしてゲル濃度を０．５％から２．０％（ゲル膜
４）及び０．５％ｍから２．５％（ゲル膜６）に指数関
数曲線状に変化させた濃度勾配の異なる膜厚−定（２，
０ｍｍ）の２種類のアガロース水性ゲル膜を調製した。

ゲル濃度の大きい端部近傍の一部を鋭いカッターナイフ
を用いて切取り試料注入用のウェルを作成した。

上記の７ガロースゲル膜を用いて実施例１と同様にして
電気泳動を行ったところ、第２表に示すとおり、このゲ
ル膜も分画可能なりＮＡ分子量範囲が広く、解像度が高
いことが明らかになった。

皿工Ｉ亘第　　１　　表第　　２　　表

Claims

【特許請求の範囲】

（１）濃度勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる
電気泳動用媒体膜。
（２）試料注入側（陰極側）のゲル濃度が反対側（陽極
側）のゲル濃度より大きい特許請求の範囲第１項に記載
の電気泳動用媒体膜。
（３）ゲル濃度勾配が直線、指数間数、対数、階段状関
数又は前記関数の任意の組み合わせで表わされる直線、
折れ線又は曲線である特許請求範囲第１項に記載の電気
泳動用媒体膜。
（４）前記ゲル膜が有機ポリマーシートに支持されてい
る特許の請求範囲第１項に記載の電気泳動用媒体膜。
（５）前記ポリマーシートがポリエチレンテレフタレー
ト、ポリメチルメタアクリレートからなるシートである
特許請求の範囲第４項に記載の電気泳動用媒体膜。
（６）前記ゲル膜が試料注入のための注入孔を有するも
のである特許請求の範囲第１項に記載の電気泳動用媒体
膜。
（７）濃度勾配を有するアガロース系水性ゲルからなる
電気泳動用媒体膜を用いることを特徴とするパルスフィ
ールド電気泳動方法。
（８）試料注入側（陰極側）のゲル濃度が反対側（陽極
側）のゲル濃度より大きい特許請求の範囲第７項に記載
のパルスフィールド電気泳動方法。
（９）ゲル濃度勾配が直線、指数間数、対数、階段状関
数又は前記関数の任意の組み合わせで表わされる直線、
折れ線又は曲線である特許請求範囲第７項に記載のパル
スフィールド電気泳動方法。
（１０）前記ゲル膜が有機ポリマーシートに支持されて
いる特許の請求範囲第７項に記載のパルスフィールド電
気泳動方法。
（１１）前記ポリマーシートがポリエチレンテレフタレ
ート、ポリメチルメタアクリレートからなるシートであ
る特許請求の範囲第１０項に記載のパルスフィールド電
気泳動方法。
（１２）前記ゲル膜が試料注入のための注入孔を有する
ものである特許請求の範囲第７項に記載のパルスフィー
ルド電気泳動方法。