JPS63298046A - 電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ＤＮＡもしくは、ＤＮＡ部分分解物の塩基配
列を決定する為の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法に関するものである。

〔従来の技術〕

従来、平板型電気泳動法において、自己支持性のないア
クリルアミドの高分子濃度グラジェントゲルは、一枚の
支持体の上または二枚の支持体の間に濃度の異なるゲル
を電気泳動方向に層状に形成させ、膜状物として用いら
れて来た。

しかしながら支持体上にゲルを形成して用いる方法は、
支持体上にゲルを形成する時、泳動槽にセットする時、
ゲルの保存中、あるいは分析試料を添加するときなどに
誤まってゲルをこわしたり、試料以外のものをゲルの上
に落してゲルを損なったりすること等があり、操作上細
心の注意と熟練が必要であった。

一方二枚のガラス板などでモールドをつくり、この中で
ゲルを形成させて、そのモールドを垂直に保ったま＼電
気泳動分析を行う垂直式電気泳動法においては、モール
ドの厚さを均一にすることは困難であったり、ゲル形成
液がゲル化しないうちに狭いモールド中にゲル液を注入
しなければならないことなど操作上高度の熟練を要して
いた。

特にＤＮＡの塩基配列決定操作においては、一枚のゲル
で出来るだけ多くのＤＮＡの断片を分析できるように長
いゲルを作ることが望ましいが、そのようなゲルはその
製造および取扱いが難しかった。また、ガラス板を用い
るために、そのガラス板が破損しやすいという欠点があ
った。

近年工業的に電気泳動用グラジェントゲル物質を製造す
る方法として、アクリルアミドモノマー及び架橋剤の混
合物の水溶液または水分散液を作り、光の照射を吸収し
、モノマーの重合を開始する遊離ラジカル発生物質を添
加した後、該溶液を所望のゲル生成物の形に形成し、形
成した溶液に光照射して七ツマー溶液または、分散液を
重合させ架橋させる際、ゲルの多孔度を変えるために七
ツマー溶液に印加する光照射時間を調整する工程を含む
電気泳動グラジェントゲルの製法が開示されている。（
特開昭６１−２８５１２号公報参照）。

さらに又単量体、架橋剤および重合開始剤を含有し、濃
度の相互に異る二種類の水溶液を混合比率を漸次変化さ
せながら混合しつつ成形器に導入し、該成形器中で単量
体と架橋剤との重合を完了させ、電気泳動方向に重合体
の濃度勾配を有する電気泳動用グラジェントゲルの製造
方法。（特公昭６１−２２９０３号公報、特公昭６１−
３９６１７号公報参照）等が開示されている。

しかしながら、前者の方法は光照射の設備と生産性の悪
さによるコスト高と、ゲルの厚みが厚いための解像性が
悪い点２反応開始剤が製造終了後も光の存在下で重合・
架橋反応をおこし、安定性。

再現性のあるグラジェントゲルが得られない等の問題点
を有し、後者の方法はやはりバッチ式製造方式であるた
め生産性が悪く、又電気泳動分離用媒体液を成形器に分
岐流入する際に均一に分岐することが難しく、再現性の
あるグラジェントゲルが得られない等の問題点を有して
いた。

上記問題点を解消し、生産性が高く、再現性の高い電気
泳動用グラジェントゲル膜の製造方法として本出願人は
先に連続的に流量比を変えた濃・淡二種の七ツマー液と
一定量の重合反応開始剤液とをスタティックミクサーで
混合し電気泳動分離用媒体液を調液し、連続的に走行す
るウェブ上に該電気泳動分離用媒体液塗布する電気泳動
用グラジェントゲル膜の製造方法を提案した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、濃・淡二種のモノマー液の流量比の変え
方が第３図に示すように、製品単位長（１）毎に淡より
濃の繰返す方法であったため、製品単位長毎の切換え長
さｔの距離が非常に長く、１）＝０．４ｍに対しｔ＝１
．０ｍの状態であった。

本発明の目的は上記問題点を解消し、製品単位長２に対
し、切換え長さｔを短くし、製品コストの安価な電気泳
動用グラジェントゲル膜の製造方法を提供することにあ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者達は上記問題点について検討した結果、切換え
長さｔが長くなる理由として、切換え時のポンプ流量の
急激な変化、（高流量　低流Ｍ）にか＼る時間、及び送
液系内の塗布液質の切換え完了迄の遅れ時間等が影響し
ていることが判明し、対策として本発明に到った。

即ち、本発明の前記目的は連続的に流量比を変えた濃・
淡二種のモノマー液と一定量の重合反応開始剤液とをス
タティックミクサーで混合し、電気泳動用媒体液を調液
し、連続的に走行するウェブ上に該電気泳動用媒体液を
塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法であ
って、流量比の変え方が低濃度より高濃度に、そして高
濃度より低濃度に漸次変化させることを特徴とする電気
泳動用グラジェントゲル膜の製造方法によって達成され
る。

本発明においてスタティックミクサーとは、流体がミク
サーの中に通される時、流体自身の運動により攪拌作用
を行うものをいい、管状のものとしてはスパイラルチュ
ーブ、左右交互らせん状、又はプロペラ状邪魔板入り等
がある。

本発明における電気泳動分離用媒体液とは、電気泳動分
離用媒体膜を作れるものであれば何でもよく、その代表
的なものとしては、アクリルアミドゲル、アガロースゲ
ル、澱粉ゲル、寒天ゲル。

セルロースアセテート多孔質膜、濾紙等の原料液となる
液をいう。

本発明において連続的、に走行するウェブとは、平面性
のよいシート状のもので非導電性かつ実質的に水不透過
性であれば、どのような材質のものでもよく、ポリエチ
レンテレフタレート、ビスフェノールへのポリカルボネ
ートのようなポリニス７テル、ポリメチルメタクリレー
ト、ポリエチレン。

ポリスチレン、ポリ塩化ビニルなどのビニル系重合体、
ナイロンなどのポリアミドなど、およびそれらの共重合
体（例、塩化ビニリデン、塩化ビニルコポリマー）が好
ましく用いられる。

本発明における電気泳動分離用媒体液の塗布方法として
はスライドビードコート、エクストルージョンコート、
ホッパーコート、カーテンコート等が用いられる。塗布
する媒体膜の厚みは分離の目的に応じて選ばれるが通常
５０μｍから約１．０ｍｍ、好ましくは約２００μｍか
ら約０．５０多孔質膜や濾紙の場合には約７０μｍから
約ＩＭの範囲とされる。

本発明における電気泳動用グラジェントゲル膜とは、一
つの製品単位長内に濃度勾配をもつたものをいう。

本発明の実施態様を図を用いて説明する。

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の１実施例の工程図である。

電気泳動用媒体液１２は、低濃度モノマー液１゜高濃度
上ツマー液２．更に重合反応開始剤液３をスタティック
ミクサー７内で攪拌・混合することによって調液される
。

第２図は本発明の濃・淡二種のモノマー溶液の流量比の
関係の説明図である。連続的に流量比をかえるというこ
とは、例えば当初高濃度モノマー液２はＱ　ｍ　ｌ　／
ｍｉｎ　、低濃度モノマー液１は１９ｍｊ！／ｓｉｎの
流量比で初まるが、電気泳動用グラジェントゲル膜の製
品単位長をｉとすると、図上、高濃度モノマー液２は実
線で、低濃度モノマー液１は点線で示すように流量を変
え、合計の流量は１９ｍ１／ｗｉｎということで一定で
あるが、濃度は連続的に変化することになる。製品単位
長２の終りは高濃度モノマー液１は１９ｍＩ！、／＋＋
＋ｉｎ、低濃度モノマー液１はＱｍ（１／ｍｉｎとなり
濃度の濃い膜成分になっている。従来は第３図に示すよ
うに切換えに入ると高濃度上ツマー液２は１９ｍ１／ｗ
ｉｎより直ちにＱｍｌ／ｌ１ｉｎに下げ、低濃度モノマ
ー液１をＯｍβ／ｍｉｎより１９ｍ／分に急激に上げて
いたが、本発明は第２図に示すように高濃度モノマー液
２と低濃度モノマー液１はそのま−にしておいて次の製
品単位長を濃−淡に作るのである。この様な流量比の変
更を繰返し行うのである。

第１図において流量勾配送液ポンプ４，５はパーソナル
コンピュータ１）の指令によりコンピューターリンケー
ジアダプタ１０を経由してコントローラ９ａによって制
御される。

一方重合反応開始剤液３は定流量送液ポンプ６によって
コントローラー９ｂに制御され一定量をスタティックミ
クサー７に送り込まれ、スタティックミクサー７内で攪
拌混合によって電気泳動用媒体液１２が出来る。電気泳
動用媒体液１２は塗布ヘッド８に供給され、ウェブ１３
上に塗布されることになる。

第２図ｆｂ）は第２図（ａｌの濃度比率によって作られ
る電気泳動用グラジェントゲル膜の平面図、第２図（Ｃ
）は第２図（ｂ）の断面図である。

図上製品単位長β間の切換え長さむは試料注入口の部分
として打抜かれ、カバーシート等によって試料注入口に
なる部分に使われる。

〔作　　用〕

本発明は連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー
液と一定量の重合反応開始剤液とをスタティックミクサ
ーで混合しながら、電気泳動分離用媒体液をＫＲ［し、
連続的に走行するウェブ上に該電気泳動分離用媒体液を
塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法にお
いて、流量比の変え方が低濃度より高濃度に、そして高
濃度より低濃度に漸次変化させることを特徴とする電気
泳動用グラジェントゲル膜の製造方法により、切換え時
間を短縮することが可能となりしかも前後の溶液の混合
がなく、塗布ヘッドに送られる為、従来にない切換え長
しの短い塗布膜を安定して製造することが出来るように
なった。しかも、生産性も従来より上昇させることが出
来た。

〔実　施　例〕

本発明の実施例について第１図、第２図、を用いながら
説明する。

電気泳動分離用媒体液 低濃度モノマーとして□■ アガロース・・・・・・・・・６５ｇ 尿素　・・・・・・・４．２００ｇ アクリルアミド・・・・・・　５４９ｇ１．３．５−）
リアクリ ロイル−へキサヒドロ− ３−）リアジン・・・・・・　５．７ｇ脱イオン水　　
ｕｐ　ｔｏ　９，０００＋ｗ７！を作り高濃度上ツマ−
として□■ アガロース・・・・・・・・・４０ｇ 尿素　・・・・・・・４，２００ｇ アクリルアミド・・・・・　１　、８３０ｇ１．３．５
−トリアクリ ロイル−へキサヒドロ− ８−トリアジン・・・・・・・１９ｇ 脱イオン水　　ｕｐ　ｔｏ　９，０００ｍ１を作り緩衝
液として□■ トリスヒドロキシメチル アミン　　　　・・・・・１２１．１４ｇはう酸　　　
　・・・・・６５．４ｇ エチレンジアミンテトラ 酢ｒ！Ｉｉ２ナトリウム塩・・・・７．４５ｇ脱イオン
水　　１）９　ｔｏ　１．０００ｍｆｆ１を作り緩衝液
■・・・・・・・・・・・・１５０ｍ　１２．９χポリ
ビニルピロリドン水溶液・８００ｍ　７！２５χテトラ
メチルエチレンジアミン液・・・・６．７ｍβ の混合液□■を 低濃度モノマー■９，０００１）１　、高濃度モノマー
■９，０ＯｋＮの各々に加え、夫々を低濃度モノマー液
１．高濃度七ツマ−液２とする。

次に重合反応開始剤液３として ２χｄｉ−２エチルへキシルスル ホサクシネート液・・・・・・１００ｍ　ｌｔｏ、３７
５％リボフラビンリン酸 エステルナトリウム塩水溶液・１５０ｅ　（１３，７５
χテルオキソニ硫酸ア ンモニウム水溶液・・・・・・１６０ｍ　ｊ！の混合溶
液を作り、夫々の３液をタンクに入れる。

流量勾配送液ポンプ４．５で低濃度モノマー液１、高濃
度モノマー液２の流量和を１９ｍ１ｌ／ｗｉｎとし、流
量比を低濃度より高濃度に、そして高濃度より低濃度に
漸次変化させた。それに重合反応開始剤３の流量１．４
６ｍｆｆ、＾ｉｎを定流量送液ポンプ６で、スタティッ
クミクサー７内に送液する。

スタティックミクサー７内では上記３液が自刃により混
合攪拌し、電気泳動分離用媒体液１２が出来る。

塗布ヘッド８より電気泳動分離用媒体液１２がウェブ１
３上に塗布される。

その時の低濃度モノマー液１と高濃度モノマー液２との
流量比は、第２図ｆａｒに示したとおりであり、塗布さ
れたゲル膜の濃度は第２図（ｂ）、第２図（Ｃ）の状態
になる。本発明の実施により製品単位長１−０．４ｍに
対し切換え長さｔ−０，５ｍとなり、結果として生産性
が５０％上昇し、製造コストを大幅に減少さすことが出
来た。

尚、電気泳動分離用媒体膜としての製品は、例えば特開
昭６０−２０３８４７号公報に開示しである様に、ウェ
ブ上にあらかじめ両端部にスペーサーを貼付ける工程、
塗布後硬化処理をする工程。

試量注入口としてコーム（櫛）を打抜く工程、カバーシ
ートを貼付ける工程、製品長さに切断する工程１等を経
て初めて製品となる。

しかしこれらの工程は如何なる方法、手段を用いても本
発明とは関係がない。

〔発明の効果〕

本発明は連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー
溶液と一定量の重合反応開始剤液とをスタティックミク
サーで混合しながら、電気泳動分離用媒体液を開成し、
連続的に走行するウェブ上に該電気泳動分離用媒体液を
塗布する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法にお
いて、流量比の変え方が低濃度より高濃度に、そして高
濃度より低濃度に漸次変化させることを特徴とする電気
泳動用グラジェントゲル膜の製造方法により従来よりも
製品ロスが半減し生産性も約５０％上昇させることが出
来た。尚製品の安定性、再現性を向上することも出来た
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動用グラジェントゲル膜の製造
方法の工程図、第２図は本発明の濃・淡二種のモノマー
溶液の流量比の関係と製品の説明図。第３図は従来の濃
度切換による流量比及び製品についての説明図である。 １・・・低濃度上ツマー液 ２・・・高濃度モノマー液 ３・・・重合反応開始剤液 ４．５・・・流量勾配送液ポンプ ６・・・定流量送液ポンプ ７・・・スタティックミクサー ８・・・塗布ヘッド ９ａ、９ｂ・・・コントローラー １０・・・コンピュータリンケージアダプタ１）・・・
パーソナルコンピューター １２・・・電気泳動用媒体液 １３・・・ウエブ 手続補正書 功６２年７月２日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）連続的に流量比を変えた濃・淡二種のモノマー液
   と一定量の重合反応開始剤液とをスタティックミクサー
   で混合しながら、電気泳動分離用媒体液を調液し、連続
   的に走行するウェブ上に該電気泳動分離用媒体液を塗布
   する電気泳動用グラジェントゲル膜の製造方法であって
   、流量比の変え方が低濃度より高濃度に、そして高濃度
   より低濃度に漸次変化させることを特徴とする電気泳動
   用グラジェントゲル膜の製造方法。