JP2021516334A - マイクロチップキャピラリー電気泳動アッセイおよび試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の態様は概して、キャピラリー電気泳動、特にマイクロチップキャピラリー電気泳動の分野を対象とする。
今日の品質管理(QC)ラボに課せられた生物学的製品の検査要求を満たすためには、堅牢で再現性が高く、使用者の使いやすい技術の導入が欠かせない。高品質の分析データを生成し続け、無効な試験結果の数や機器関連の調査を最小限に抑えるようにしつつ、出力結果の増加を促進するには、技術の格上げが必要である。電気泳動は、歴史的に製品の純度のQCと断片化分析に使用されてきたが、その方法は、ゲルを用いたものからキャピラリーを用いたもの、そして最近ではマイクロチップへと移行している。マイクロチップキャピラリー電気泳動(Microchip Capillary Electrophoresis(MCE))により、QC分析に必要な性能と再現性の基準を維持しつつ、サンプル分析時間を劇的に削減することができる(Ouimet,C.,et al.,Expert Opin Drug Discov.,12(2):213−224(2017)(非特許文献1))。
I.定義
本明細書中に別段の指示がない限り、または文脈に矛盾することが明らかでない限り、請求されている本発明について記載する文脈において(とりわけ、特許請求の範囲との関連において)、「a」、「an」、「the」、および同様な指示対象の使用は、単数形および複数形の両方を対象とするものと解釈すべきである。
タンパク質薬物サンプル中の分析物を分析する方法が提供される。好ましいタンパク質薬物には、抗体およびその抗原結合断片、融合タンパク質、および組換えタンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。アッセイは、タンパク質製造物およびタンパク質製造物中の不純物を分離、同定、および定量するためにMCE技術を採用する。不純物には、タンパク質凝集体、タンパク質断片、タンパク質マルチマー、およびアッセイ汚染物質などが挙げられるが、これらには限定されない。還元性緩衝液および非還元性緩衝液も提供される。
1.非還元性緩衝液
一実施形態では、155〜175mMのアルキル化剤、例えば2−ヨードアセトアミドまたはNEM;0.50〜1.5%のドデシル硫酸リチウム;および75〜95mMのリン酸ナトリウムを含む非還元性の水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は7未満のpHを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のpHは6である。別の実施形態では、水性緩衝液は、166mMの2−ヨードアセトアミド、0.81%のドデシル硫酸リチウム、および81mMのリン酸ナトリウムを含む。
還元性緩衝液も提供される。一実施形態では、還元性緩衝液は、0.5〜1.5%のドデシル硫酸リチウム、65〜95mMのリン酸ナトリウム、および還元剤を含む水性電気泳動サンプル緩衝液であり、ここで、水性電気泳動サンプル緩衝液は8より大きいpHを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のpHは9である。
HEPESを用いた緩衝液もまた、本開示の方法と共に使用することができる。一実施形態では、アルキル化剤、例えば、55〜75mMの2−ヨードアセトアミド;0.1〜1.0%ドデシル硫酸リチウム;5〜85mMのHEPES、および5〜115mMの塩化ナトリウムを含む、非還元性のHEPESを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は9未満のpHを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のpHは8である。別の実施形態では、水性緩衝液は、66.4mMの2−ヨードアセトアミド、0.32%のドデシル硫酸リチウム、16.2mMのHEPES、および48.6mMの塩化ナトリウムを含む。
別の実施形態では、0.05〜0.75%のドデシル硫酸リチウム、5mM〜115mMの塩化ナトリウム、5mM〜115mMのHEPES、および還元剤を含む、還元性のHEPESを用いた水性電気泳動サンプル緩衝液が提供され、ここで水性電気泳動サンプル緩衝液は7より大きいpHを有する。好ましい実施形態では、緩衝液のpHは8である。一実施形態では、還元性緩衝液は、35〜50mMのジチオスレイトールを含む。さらに別の実施形態では、0.28%のドデシル硫酸リチウム、41.5mMの塩化ナトリウム、13.8mMのHEPES、および42.5mMのジチオスレイトールを含む還元性緩衝液が提供される。
1.非還元性アッセイ
一実施形態では、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する非還元性MCE法が提供され、この方法は、タンパク質サンプルを、上に考察した非還元性緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップを含む。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、65℃〜85℃の間に5分〜15分間加熱されて、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、70℃に10分間加熱される。次いで、検出可能な標識を、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルに添加し、30〜40℃で20〜40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、標識が添加された変性したタンパク質薬物サンプルは、35℃に30分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。
別の実施形態では、タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する還元性MCE法が提供される。この方法は、タンパク質薬物サンプルを、上記の還元性緩衝液のうちのいずれか1つに添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成することから始まる。緩衝化されたタンパク質薬物サンプルは、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを65〜85℃、好ましくは70℃に10分間、加熱することにより変性させ、変性したタンパク質薬物サンプルを形成する。次いで、標識を添加されたタンパク質薬物サンプルを30〜40℃で20〜40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成する。好ましい実施形態では、標識を付加されたタンパク質薬物製造物サンプルは、35℃に30分間、加熱される。過剰な標識は任意で、例えばスピンフィルターを使用することによって、サンプルから除去される。好ましい検出可能な標識には、ダイノミクス社製DY−631 NHSエステルなどが挙げられるが、これには限定されない。使用され得る他の検出可能な標識には、他の染料、フルオロフォア、クロモフォア、マスタグ、量子ドットなど、および参照によりその全体が援用される米国特許第6,924,372号に開示のものなどが挙げられる。
本開示のMCEアッセイを実行するための計測装置は、市販されている。好ましい実施形態では、本開示のMCEアッセイは、LabChip GXIIまたはLabChip GXII Touch HT、およびLabChip(登録商標)HT Protein Express Chipを用いて実行される。
本開示のMCEアッセイおよび試薬を用いてアッセイされる、対象のタンパク質、例えばタンパク質薬物製造物は、原核細胞または真核細胞での発現に適した対象のタンパク質であれば、どのようなものであってもよく、提供される人工宿主細胞システムにおいて使用することができる。例えば、対象のタンパク質としては、限定されるものではないが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、ScFvもしくはそのフラグメント、Fc融合タンパク質もしくはそのフラグメント、成長因子もしくはそのフラグメント、サイトカインもしくはそのフラグメント、または細胞表面受容体もしくはそのフラグメントの細胞外ドメインが挙げられる。対象のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単純なポリペプチドである場合もあれば、あるいは2つ以上のサブユニットを含む複雑なマルチサブユニットタンパク質である場合もある。対象のタンパク質は、生物医薬品、食品添加物、または保存料、または精製および品質基準の対象となるいかなるタンパク質製造物であってもよい。
本開示のMCEアッセイおよび試薬を用いてアッセイされるタンパク質薬物製造物は、細胞培養物である。細胞培養は、回分培養を指す「流加回分細胞培養」または「流加回分培養」であり得る。本回分培養では、まず細胞および培地を培養容器に供給する。追加的な培養栄養素は、培養中に離散的増分にて培養物にゆっくり供給される。この栄養素供給は、培養終了前に、細胞および/または産物を定期的に採取することの有無に関係なく為される。流加回分培養には、培養物全体(細胞および培地を含み得る)を定期的に取り除いて新鮮な培地と交換する、「半連続流加回分培養」が含まれる。流加回分培養は、単純な「回分培養」とは区別される。この回分培養において、細胞培養用の全てのコンポーネント(動物細胞および全ての培養栄養素を含む)が、回分培養の培養プロセスの開始時に培養容器に供給される。流加回分培養は、標準的な流加プロセス中に培養容器から上澄みが除去されない限り、「灌流培養」とは異なり得る。この灌流培養では、細胞は、例えば濾過によって培養物中に拘束され、培養培地が連続的または断続的に導入されて培養容器から除去される。対照的に、流加細胞培養中には、試験目的でサンプルを取り除くことが想到される。流加プロセスは、ワーキングボリューム(working volume)および/またはタンパク質産生が最大限に到達したことが判別され、且つ以後にタンパク質が回収されるまで継続される。
一実施形態では、1つまたは複数の本開示の緩衝液または成分を含む、本開示の緩衝液を製造するキットが提供される。キットは、緩衝液または成分のための容器を含むことができる。緩衝液は、溶液状態、または凍結乾燥された形態とすることができる。キットはまた任意で、凍結乾燥された製剤のための希釈剤すなわち再構成溶液を含む第2の容器を含み;そして任意で、溶液または再構成溶液の使用、および/または凍結乾燥された緩衝液または粉末状成分の使用についての指示書を含む。
方法および材料:
材料:
キャピラリー電気泳動分離およびデータ収集には、LabChip GXIIまたはLabChip GXII Touch HTおよびLabChip(登録商標)HT Protein Express Chipを使用した(パーキンエルマー社(Perkin Elmer))。上記の開示された非還元性および還元性変性緩衝液を、MCEアッセイに使用した。
表1に、MCEアッセイ用のサンプルを調製するワークフロー手順を示す。簡潔には、タンパク質サンプルを0.5mg/mlに希釈した。1μlの非還元性(NR)または還元性(R)変性緩衝液と4μlの希釈サンプルを96ウェルプレートに加えた。サンプルを混合、遠心分離し、製造物に指定された温度、通常は75℃で10分間、加熱した。次いで、サンプルを5μMの市販の色素(例えば、ダイノミクス社製DY−631 NHSエステル)で標識した。サンプルを混合、遠心分離し、次いで35℃で30分間、加熱した。次いで、標識されたサンプルを105μlの希釈停止溶液で希釈した。サンプルを、LabChip GXIIまたはLabChip GXII Touch HTを用いて分離した。
200mMのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物、200mMのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、および10%のドデシル硫酸リチウム(LDS)のストック溶液を調製した。このストック溶液とMilli−Q(登録商標)水を使用して、100mMのリン酸ナトリウム、1%のLDSでpH6のもの、および100mMのリン酸ナトリウム、1%のLDSでpH9のものの溶液を調製した。
マイクロチップキャピラリー電気泳動(MCE)により、QC分析に必要な性能と再現性の基準を維持しつつ、サンプル分析時間を劇的に削減することが可能になる。MCEアッセイを、本明細書に開示の還元されていないおよび還元された変性緩衝液を使用して発展させた。図1A〜1Bに、還元されていないサンプルおよび還元されたサンプル中のタンパク質の分析結果を示す代表的な電気泳動図を示す。
Claims (25)
- 155〜175mMの2−ヨードアセトアミドと、
0.50〜1.5%のドデシル硫酸リチウムと、
75〜95mMのリン酸ナトリウムと
を含み、
7未満のpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - pHが6である、請求項1に記載の水性緩衝液。
- 166mMの2−ヨードアセトアミドと、0.81%のドデシル硫酸リチウムと、81mMのリン酸ナトリウムとを含む、請求項1または2に記載の水性緩衝液。
- 166mMの2−ヨードアセトアミドと、
0.81%のドデシル硫酸リチウムと、
81mMのリン酸ナトリウムと
から成り、
6.0のpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - 0.50〜1.5%のドデシル硫酸リチウムと、
45〜75mMのリン酸ナトリウムと、
還元剤と
を含み、
8より大きいpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - pHが9である、請求項5に記載の水性緩衝液。
- 135〜155mMのジチオスレイトールを含む、請求項5または6に記載の水性緩衝液。
- 0.69%のドデシル硫酸リチウムと、69mMのリン酸ナトリウムと、142mMのジチオスレイトールとを含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の水性緩衝液。
- 0.69%のドデシル硫酸リチウムと、
69mMのリン酸ナトリウムと、
142mMのジチオスレイトールと
から成り、
9.0のpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する方法であって、
前記タンパク質薬物サンプルを請求項1〜4のいずれか一項に記載の緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、65〜85℃に5〜15分間、加熱して、変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した緩衝化されたタンパク質薬物サンプルに検出可能な標識を添加し、30〜40℃で20〜40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを希釈し、MCEにかけて、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上で、希釈されたタンパク質薬物サンプルを分離し、電気泳動図を作成するステップと、
汚染物質または不純物に対応する、前記電気泳動図におけるピークを同定するステップと
を含む、方法。 - 前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、70℃で10分間、加熱する、請求項10に記載の方法。
- 前記標識されたタンパク質薬物サンプルを、35℃で30分間、加熱する、請求項10または11に記載の方法。
- 前記希釈されたタンパク質薬物サンプルが9mg/mlである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- タンパク質薬物サンプル中の汚染物質または不純物を同定する方法であって、
前記タンパク質サンプルを請求項5〜9のいずれか一項に記載の緩衝液に添加して、緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを65〜85℃に5〜15分間、加熱して、変性したタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性したタンパク質薬物サンプルに、検出可能な標識を添加し、30〜40℃で20〜40分間、加熱して、変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを形成するステップと、
前記変性した標識されたタンパク質薬物サンプルを希釈し、マイクロチップキャピラリー電気泳動システム上でMCE分析にかけて、電気泳動図を作成するステップと、
汚染物質または不純物に対応する、前記電気泳動図におけるピークを同定するステップと
を含む、方法。 - 前記緩衝化されたタンパク質薬物サンプルを、70℃で10分間、加熱する、請求項14に記載の方法。
- 前記サンプルを、35℃で30分間、加熱する、請求項14または15に記載の方法。
- 前記希釈されたタンパク質薬物サンプルが9μg/mlである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記検出可能な標識がDY−631 N−ヒドロキシスクシンイミジルエステルである、請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の緩衝液と、前記緩衝液中での電気泳動のためにサンプルを調製するための書面による指示書とを含む、キット。
- 55〜75mMの2−ヨードアセトアミドと、
0.1〜1.0%のドデシル硫酸リチウムと、
5〜115mMの塩化ナトリウムと、
5〜85mMのHEPESと
を含み、
9未満のpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - 66.4mMの2−ヨードアセトアミドと、
0.32%のドデシル硫酸リチウムと、
48.6mMのNaClと、
16.2mMのHEPESと
を含み、
9未満のpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - pHが8である、請求項20または21に記載の水性緩衝液。
- 0.05〜0.75%のドデシル硫酸リチウムと、
5mM〜115mMのNaClと、
5mM〜85mMのHEPESと、
35〜50mMのジチオスレイトールと
を含み、
7より大きいpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - 0.28%のドデシル硫酸リチウムと、
41.5mMのNaClと、
13.8mMのHEPESと、
42.5mMのジチオスレイトールと
を含み、
7より大きいpHを有する、
水性電気泳動サンプル緩衝液。 - pHが8である、請求項23または24に記載の水性緩衝液。
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