JP2010518386A - 子癇前症の診断及び治療 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明は、子癇前症(preeclampsia)のバイオマーカー及び該疾患の治療に関する。詳細には、本発明は、特定物質の上昇したレベルを検出して妊娠雌性哺乳動物の子癇前症を診断する方法又は該診断を補助する方法に関する。これは、早期の診断及び子癇前症状態が発見された場合には臨床的介入を容易にし、可能にする。加えて、本発明は、子癇前症に関連する病的状態を後戻りさせる目的で、子癇前症を有する雌性哺乳動物を治療する方法に関する。
子癇前症(PE)(妊娠性蛋白尿高血圧)は、全妊婦の3〜7%が患い、母体多系障害(multisystem maternal disorder)である。世界中で年に8,500,000症例が報告され、このうち5,000例がスウェーデンで報告されている。今日、これは、妊娠間の子及び母親の最も一般的な死因である。
ステージ1。胎盤形成の間に、らせん動脈の筋肉層中への胎盤細胞、トロホブラストの欠陥侵入が示されている[Brosensら,2002;Page,1939]。増加しつつある多数の証拠により、酸化ストレス(下記参照)が胎盤中の血管機能を更に悪化させ[Roberts,1999]、このことが次に[Shennanら,2001]血液灌流障害を生じる[Hungら,2002]。結果として、血管収縮及び血液の流れに対する上昇した抵抗が次に起こる。本発明者らの多数の結果は、レドックス調節及び炎症の両方で遺伝子の関与を示す[Hanssonら,2005]。
したがって、i)子癇前症を発症するリスクがある妊娠被検体、ii)初期段階の子癇前症を患っている妊娠被検体、及び/又はiii)(そのように診断されているか否かに関わらず)子癇前症を患っている妊娠被検体を確実に同定することができるバイオマーカーを同定する必要性が存在する。更に、上記i)〜iii)の群のいずれかの妊娠女性のための治療レジメンを開発する必要性が存在する。
i)PEを診断する方法
ii)PEの進行及び退行を評価する方法
iii)PE治療の有効性を評価する方法
iv)上記方法の1つにおいて使用するキット
v)PE治療に使用する物質及び組成物
vi)バイオマーカーとしてのヒト白血球抗原DPA1(HLA-DPA1)
本明細書において、他に特に示さない限り、「a」又は「an」は「1又はそれより多い」を意味する。
本明細書で使用される用語「子癇前症」は、米国産科婦人科学会の用語委員会により確立された基準(すなわち、高血圧及び蛋白尿、顕性浮腫又は両方)に従って定義される。例えば、子癇前症は、血圧>140/90mmHg及び蛋白尿>0.3g/Lと定義することができる。
本発明の第1の観点によれば、子癇前症を診断するため又は子癇前症診断を補助するための方法が提供され、この方法は以下の工程を含んでなる:(a)妊娠雌性哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程;(b)前記生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び(c)サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを参照値と比較し、又はサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比を参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか否か又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか否かを決定する工程。
或る実施形態では、生物学的サンプルは、血液、血漿、尿又は胎盤組織である。
好適な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
具体的実施形態において、ELISAは、遊離ヘモグロビンレベルを測定する好適な方法である。
具体的実施形態によれば、遊離ヘモグロビンRNAは、リアルタイムPCRを使用して定量する。
本発明の更なる実施形態では、遊離胎児ヘモグロビン(例えば、遊離胎児ヘモグロビンサブユニット)は、患者の子癇前症の状態(例えば重症子癇前症)を決定するため又は予後(prognosis)(すなわち該疾患の転帰(outcome)の予測)のために用いることができる。例えば、遊離ヘモグロビンの濃度は、子癇前症の重篤度(例えば、軽症又は重症の子癇前症)と相関する。神経学的発現(例えば、痙攣又は昏睡(子癇))、卒中、高血圧性脳症、頭痛、及び視覚異常(視野暗点、複視、黒内障、同側性半盲)は重症子癇前症に一般的であることが知られている[Douglas and Redman,1994]。
群間の差を統計学的に評価するために片側ANOVAを事後(post-hoc)Bonferroni検定と共に使用した。p値<0.05を統計学的に有意とみなした。
*** 本検定によりPEとコントロールとの間に有意差(p<0.001)が示された。
a PE群で出産後24時間以内に母親が死亡した1症例。
b 蛋白尿の値は方法の限界のために不正確である。測定可能な最高値は3g/lであった。
第1の観点で言及した詳細はこの観点及び以下の観点にも適用される。
本発明の第3の観点によれば、子癇前症の治療の効力を評価する方法が提供され、この方法は、以下の工程を含んでなる:(a)治療前の妊娠雌性哺乳動物から得た第1の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;(b)治療後の同じ妊娠哺乳動物からの第2の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び(c)(a)で決定したレベルを(b)で決定したレベルと比較する工程。ここで、第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルの減少又は第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比に対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比の減少は、該治療が子癇前症を治療することに有効であることを示す。
本発明の第4の観点によれば、本発明に従う子癇前症の診断又は該診断の補助のためのアッセイキットが提供され、このキットは、妊娠雌性哺乳動物の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定する手段と該検出手段を使用するための指示書とを含んでなる。
1つの実施形態では、検出手段は、ヘモグロビン(好ましくは、胎児ヘモグロビン)に特異的な抗体(例えば、抗-ヒト-Hbγ抗体)を含んでなる。
本発明の方法に使用すべきキットは、分析物標準物、試薬などを更に含んでなることができる。
第4の観点の或る実施形態では、本アッセイキットは、例えば総Hb 対 胎児Hbの比及び/又は総Hb mRNA 対 胎児Hb mRNAを決定するために、総遊離ヘモグロビンのレベルを検出する手段を更に含んでなる。
或いは、胎児ヘモグロビン-ELISAは、インキュベーション工程1では被覆用のHb-γ、適切な希釈率の臨床サンプル又は胎児ヘモグロビン標準系列に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を用い、第2のインキュベーション工程のウサギ抗-ヘモグロビン-ALPを用いるサンドイッチタイプのELISAであり得る。
本明細書中で報告した、遊離胎児ヘモグロビンがPEの指標であり、Hb Fレベル(又はHbレベル一般)の減少がこの疾患の進行を抑制している可能性が高いとの知見に従って、i)遊離Hb(遊離Hb F又は他の任意のHb)の形成を阻害する能力、ii)遊離Hb(遊離Hb F又は他の任意のHb)に結合する能力、又はiii)循環遊離Hb(遊離Hb F又は他の任意のHb)の濃度を減少させる能力を有する任意の物質がPEの有効な治療及び/又は予防のための可能性のある物質であると考えられる。したがって、本発明の更なる観点では、ヘモグロビン結合剤;ヘム結合/分解剤;鉄結合剤;ヘモグロビン分解、ヘム分解及び/又は鉄隔離を刺激する薬剤;及び/又は胎盤の造血を阻害する薬剤からなる群より選択される少なくとも1つのメンバーのPEの治療のための使用が提供される。更に、本発明の更なる観点では、このような物質の子癇前症の治療又は予防用医薬調製物の製造のための使用が提供される。
ヘモグロビン結合剤:
抗体
ヘモグロビンと強力に結合し、ヘモグロビンのレドックス酵素活性をブロックするモノクローナル抗体を開発することができる。この抗体は、インビボ若しくはインビトロ免疫により産生することができるか、又は既存のライブラリから選択することができる。この抗体は、α-、β-、δ-又はγ-グロビン鎖に対する特異性又はこれらグロビン鎖の共通部分に対する特異性について選択され得る。この抗体は、ヒトにおける治療に適切となるように改変することができる。すなわち、ヒトイムノグロブリンフレームワークを有して提供することができる。抗体の任意の部分を使用し得る:Fv-、Fab-フラグメント又は全イムノグロブリン。
ハプトグロブリンは血漿中に見出される糖タンパク質である。3つの形態のハプトグロビンが存在する:Hp1-1、Hp2-1及びHp2-2。全ての形態がヘモグロビンと結合し、Hp-Hb複合体を形成する。Hb-Hp複合体は、遊離ヘモグロビンより弱いレドックス酵素活性を有し、したがって酸化的損傷を引き起こすことがより少ない。Hbへの結合は、例えばヘム基からの鉄喪失を予防する。
CD163は、マクロファージ、単球及び血管を裏打ちする網内系に見出されるスカベンジャーレセプターである。このレセプターはHp-Hb複合体を認識し、エンドサイトーシス及びリソソームへのこの複合体の送達、HO-1による分解(下記参照)及び細胞フェリチンによる遊離鉄の隔離を媒介する。したがって、CD163はヘモグロビン誘導性酸化ストレスの排除に寄与する。
ヘモペキシン
ヘモペキシンは、ヒト血漿中に見出され、遊離ヘムと強力(Kd約1pmol/L)に結合し網内系での分解のためにヘムを肝臓に輸送することにより血漿から遊離ヘムを排除する糖タンパク質(60kDa)である。
ヘムオキシゲナーゼは、ヘムをビリベルジン、一酸化炭素及び遊離鉄に変換する細胞性ヘム結合及び分解酵素複合体である。遊離鉄は細胞フェリチンにより隔離され、ビリベルジンはビリベルジンレダクターゼによりビリルビンに還元される。ビリルビンは最終的には尿中に排泄される。構造が非常に異なる3つの形態のヘムオキシゲナーゼ遺伝子HO-1、HO-2及びHO-3が記載されている。HO-1は最も重要である。この遺伝子は、身体中の実質的に全ての細胞において、ヘモグロビン、遊離ヘム、低酸素症、フリーラジカル、ROS(反応性酸素種)及び多くの種々の炎症シグナルによりアップレギュレートされる。HO-1は強力な抗酸化剤である。なぜなら、これは酸化剤であるヘム及び鉄を排除するからであるが、ビリルビン(幾つかの酸化剤に対して抗酸化効果を有する)を産生するからでもある。
アルブミンは、ヘムと結合することができるヒト血漿中の66kDaタンパク質である。アルブミン-ヘム複合体の細胞取込み及び分解の証拠はなく、アルブミンの効果は、おそらく、ヘムの貯蔵庫(depot)として作用し、よってヘムが内皮細胞膜、脈管基底膜などに進入することを予防するためである。
トランスフェリン
トランスフェリンは最も重要な血液中の鉄の輸送体である。トランスフェリン-鉄複合体は、該複合体を内在化し解離させる細胞レセプターにより認識され結合される。
この多量体タンパク質は、2つのタイプの24サブユニットからなり、遊離鉄の主要な細胞内貯蔵庫である。これは4500鉄原子/フェリチン分子の高い鉄貯蔵能を有する。フェリチンへの結合により、鉄は酸化還元反応がほとんど予防され、よって酸化的損傷を引き起こすことがほとんど予防される。
具体的実施形態では、医薬調製物は、ヘモグロビン結合剤及び/又はヘム結合剤及び/又は鉄隔離剤の組合せを含んでなる。
ヘモグロビン分解及び/又はヘム分解を刺激する薬剤としては、タンパク質様ハプトグロビン、ヘモペキシン及びヘムオキシゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の更なる観点は、胎児細胞が異なるので母体の免疫応答をトリガーするという観察に関連する。HLA遺伝子ファミリーの役割は外来抗原を母体の免疫系に提示することである。HLA-DPA1遺伝子を発現する女性は、早期の段階で胎児細胞が「見え」得る。このことは、更なる損傷からの保護を助け得る(本明細書中で報告した研究において、本発明者らは、ノッチを有するがPEを発症していない女性がHLA-DPA1を発現したことを観察している)
本発明の最後の観点では、本発明による子癇前症の予後の方法に従う、子癇前症の予後のため又は予後の助けとするためのアッセイキットが提供される。このキットは、妊娠雌性哺乳動物の生物学的サンプル中のHLA-DPA1のレベルを検出する手段と、前記検出手段を使用するための指示書とを含んでなる。
以下に、本発明をより詳細に説明する。
図1は、母体血漿中にHb-F及びHb-Aを見出したことに基づき、子癇前症の異なるステージのマーカーとしてのHb-F及びHb-Aの出現及びそれらの使用可能性を強調する、子癇前症発症の拡大モデルを示す。
図5は、ヒト胎盤及び胎盤床サンプルのインサイチュハイブリダイゼーションの画像を示す。
図6は、胎盤におけるHbγタンパク質発現の代表的な画像を示す。
図9は、散布図で示した、qPCRで定量化した胎盤中のHbδ mRNA値を示す。
図10は、Hbδ mRNAを発現している子癇前症の胎盤からのインサイチュ画像を示す。
図13。ウェスタンブロッティングによる、癇前症を有する2人の患者(PE1及びPE2)及び正常妊娠の2人のコントロール個体(コントロール1及びコントロール2)の血漿中のHb-Fの決定。血漿サンプルを記載されたようにアルブミン抽出ビーズで処理し、次いで希釈しないでSDS-PAGE/ウェスタンブロッティング手順に適用した(15μl)。濃度(μg/ml)の推定を可能にするために、0.1μgの精製Hb-Fを別のレーンに適用した(「精製Hb-F」)。
図15。子癇前症の妊娠女性(n=30)及び正常妊娠女性(n=30)の血漿中の総α1m濃度。濃度は、血漿を500×に希釈してRIAにより測定した。
胎盤中のHb RNA及びタンパク質の検出
定量的RT-PCR、インサイチュハイブリダイゼーション及び免疫組織化学を行い、PE及びコントロール被検体の胎盤サンプル中のHbα、Hbβ及びHbγ mRNA並びにタンパク質発現を分析した。
胎盤組織はLund University Hospitalの産婦人科で収集した。書面による同意を得て実施したサンプリングは、ヒト被検体における研究のための倫理委員会審査部(Ethical Committee Review Board)により承認された。10人の子癇前症妊婦、15人の正常妊婦、両側のノッチを有する5人の患者並びに両側のノッチ及び子癇前症を有する5人の患者からの胎盤組織を本研究に含めた。PEを有する患者の5人及びコントロールの5人からの胎盤床サンプル(下記参照)もまた収集した。子癇前症は、血圧>140/90mmHgかつ蛋白尿>0.3g/Lと定義した。本態性高血圧又は他の全身性疾患を有する患者は排除した。出産時に胎盤サンプルを収集し、直後に−80℃に凍結して保存した。
胎盤サンプルは出産直後に収集した。胎盤の中央部から、肉眼により壊死部及び梗塞部を避けて10×10×10mm立方体の絨毛組織を取り出した。帝王切開を受けた女性から10×10×10mm立方体の子宮筋層組織を収集した。サンプルを直後にドライアイスで凍結し、RNAを抽出するまで−80℃で保存した。この組織は、最大級のRNA完全性を確実にするために、RNA抽出前にも凍結切片化の前にも解凍しなかった。
Trizol(登録商標)(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いて、凍結組織からトータルRNAを抽出した。0.8Mクエン酸ナトリウム及び1.2M塩化ナトリウムでの高塩沈降を実施してプロテオグリカン及び多糖を除去した。6.7%ホルマリン及び1×MOPS緩衝液を用いる変性1%アガロースゲル電気泳動によりRNA完全性を決定した。使用まで、サンプルはRNAseを含まない水中に−80℃にて保存した。使用前に、サンプルをもう1回沈降させ、70%エタノールで洗浄してTrizol残留物を除去した。
Applied Biosystemsの逆転写酵素をプロトコルに従って用いてcDNAを合成した。0.5mgのトータルRNA、1×TaqMan RT緩衝液、5.5mM MgCl2、500mM dNTP、2.5mMランダムヘキサマー、0.4U/ml RNase阻害剤及び1.25U/ml MultiScribe逆転写酵素を含有する50mlの反応液を使用した。この反応液を25℃にて10分間、48℃にて30分間、最後に95℃にて5分間インキュベートした。分析までサンプルを−20℃で保存した。
ハイブリダイゼーションは、以前に[Hanssonら,2005]に記載されたように行った。クリオスタット切片を解凍して、シアリン処理したスライド上にマウントし、これを使用するまで−80℃にて保存した。新鮮な凍結組織を用いてmRNA検出を最大化した。以前に[Bradleyら,1992]に記載のように、切片を固定し、脱水し、脱脂し、ハイブリダイズさせた。80mlのハイブリダイゼーション緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA(pH8.0)、300mM NaCl、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、1×Denhardtの25mg/ml酵母tRNA、100mg/mlサケ精子DNA、250mg/mlトータル酵母RNA(画分XI、Sigma)、150mMジチオトレイトール(DTT)、0.15%チオ硫酸ナトリウム(NTS)及び0.15%硫酸ドデシルナトリウム(SDS))当たり2×106cpmの変性35S-cRNAプローブを用いて、20〜24時間、55℃でハイブリダイゼーションを行った。洗浄後、スライドをKodak Hyperfilm Biomax MRに2日間並置し、その後核トラック乳剤(nuclear track emulsion)(NTB-3,Kodak)で被覆した。スライドに4℃で3週間(Hbα2、Hbγ2)及び4週間(Hbβ)曝露し、その後Dektol(Kodak)で現像し、固定してギムザ染色で対比染色した。
胎盤サンプルの14μm厚の新鮮凍結切片を、4%緩衝液化ホルムアルデヒド中に室温にて10分間浸漬することにより固定した。次いで、ブロッキング溶液(Powerblock;Zymed)中RTにて30分間切片をインキュベートした。PBS洗浄後、切片を1:500希釈の(ヒツジで惹起させた)抗-ヒト胎児Hb抗体(Bethyl Laboratories)中に移した。1時間のRTインキュベーション後、切片をリンスし、1:1000希釈の(ロバで惹起させた)抗-ヒツジCY3抗体(Jackson laboratories)中にRTにて1時間移した。次いで、切片をリンスし、0.1M Trisで覆ってLeica DMA 6000倒立蛍光顕微鏡下で観察した。Volocityソフトウェアを用いて写真を撮影した。
図4は、胎盤中のHbα、Hbγ及びHbβのリアルタイムPCR定量化を示す。全ての値をβ-アクチンの量に対して規格化し、散布図で表す。(A)胎盤中のHbα mRNA発現。PEとコントロールとの間(p=0.004)及びPE&ノッチ(ノッチを有するPE)とコントロールとの間(p=0.03)に有意な変化が見出された。(B)PEとコントロールとの間(p=0.003)及びPE&ノッチとコントロールとの間(p=0.03)の有意な変化を示すHbγ mRNA相対値。(C)Hbβは、コントロールに対してPE(p=0.02)及びコントロールに対してPE&ノッチ(p=0.04)で有意な過剰発現を示した。
定量的RT-PCRは、PEにおいて、コントロールに対して増大したHbα及びHbγ mRNA発現を示した。インサイチュハイブリダイゼーションは、PEからの胎盤サンプル中で、コントロール被検体からの胎盤サンプルに対して増加した数のHb発現細胞を示した。Hb発現細胞が管壁に結合して位置していたという事実は、細胞が管の中又は外へ移動中であることを示しているか、又は管壁にこれら細胞用の結合部位が存在することを示しているかのいずれかであろう。子宮筋層の管が胎盤の管(下記のような細胞に富んでいる)に対してHb mRNAを発現する有核細胞に乏しいという事実は、これら細胞が母体起源ではない可能性を示唆する。(胎児)Hbγ mRNAが胎盤のHb-陽性細胞に存在し、子宮筋層血管管腔にはHb発現細胞の数が少ないという本発明者らの知見は、PE胎盤中及び血液中で見られる増加したHb発現を担っているのは胎児細胞であることを示している。
母体血液中の胎児Hbの検出
定量的RT-PCRを実施して、PE被検体の血液サンプル中のHbγ mRNAを分析した。
リアルタイムPCR
QIAamp Viral RNAミニキット(Qiagen)を製造業者の指示に従って用いてRNAを抽出した。簡潔には、3.6mlのAVL緩衝液を36μlのキャリア-RNA(Qiagen)と、試験管を10回転倒させることにより混合した。1mlの血漿サンプルを1150gで10分間遠心した。900μlの血漿及び3.6μlの99%エタノールをAVL緩衝液溶液に加えた。約650μlのこの溶液をQIAampカラムに加え、6000gで1分間遠心した。総血漿容量がカラムに加えられるまで、これを繰り返した。カラムをAW1緩衝液で1回洗浄し、次いで6000gで1分間遠心し、続いてAW2緩衝液で洗浄し、次いで20,000gで3分間遠心した。50μlのRNAseを含まない水でRNAを溶出させた。
胎児Hb RNAをリアルタイムPCRで定量した。
図7は、リアルタイムPCRにより定量した、PEを有する女性から出産前に採取した母体血漿中の胎児Hbγ mRNAレベルの散布図を示す。この図は、サンプル中のHbγ mRNAレベルの推定量を与えるCt値を左軸に示す。これは、母体の血液サンプル中のヘモグロビンγのタンパク質レベルを測定することが可能であるだけでなくmRNA量も測定することが可能であることを示す。
2D-ゲル電気泳動を用いた子癇前症胎盤のタンパク質発現プロファイリング
コントロール胎盤と比較してPE胎盤で異なって発現するタンパク質についてスクリーニングするために、本発明者らは、PEを有する女性(n=30)及び健常コントロール(n=30)から出産時に胎盤サンプルを収集した。プロテオミック技術(2次元ゲル電気泳動)を用いて、本発明者らは、種々の胎盤サンプル中のヘモグロビンδ(Hbδ)発現レベルを比較した。
Lund University Hospitalの産婦人科に入院した60人の女性を含ませ、2群に割り振った;PE(n=30)及びコントロール(n=30)(表2)。PEは血圧>140/90mmHg及び蛋白尿>0.3g/l、又は妊娠第1三半期から20mmHgを上回る血圧上昇と定義した。胎盤を取り出した直後に10×10×10mm立方体の胎盤組織を収集した。サンプルを直ぐにドライアイス上で凍結させ、−80℃で保存した。他の全身疾患を有する患者は本研究から排除した。本研究は、ヒト被検体における研究のための倫理委員会審査部により承認され、全ての女性に対して書面によるインフォームドコンセントを得た。
Trizol(登録商標)(Invitrogen)を製造業者の指示に従って用いてタンパク質を抽出した。簡潔には、氷上のTrizol中で胎盤組織をホモジナイズし、次いで12000gにて10分間4℃で遠心分離した。クロロホルムを用いてタンパク質画分を分離し、2-プロパノールを用いて沈降させた。タンパク質ペレットを1.5mlの0.3M塩酸グアニジン中で3回及び1.5mlの75%エタノール中で1回洗浄した。ペレットを0.8M尿素及び2% chapsに溶解し、分光測光手順を用いてタンパク質濃度を測定した。使用まで、タンパク質を−20℃で保存した。
等電点電気泳動(IEF)の前に、サンプルをアセトンで沈降させてタンパク質分解性酵素を不活化し、塩及び干渉物質を除去した。各胎盤から抽出したタンパク質(400μg)を、80%アセトンの最終濃度まで氷冷アセトンと混合した。サンプルを1時間−20℃にてインキュベートし、続いて9000×gで2分間遠心分離した。アセトンを除去し、タンパク質ペレットを風乾させた。
Immobiline Dryストリップ(180×3×0.5mm、pH3〜10 NL、GE Healthcare Life Sciences)を、8M尿素、2% CHAPS、10mMジチオトレイトール(DTT)及び2% IPG 3-10緩衝液を含有する350μlの可溶化溶液中で、400又は800μgのサンプルと共に、室温にて一晩再水和させた。Multiphor IIを用いてIEF工程を20℃で行い、以下のスケジュールで泳動した:(1)150Vで1時間、(2)300Vで3時間、及び(3)3000Vで約60 000vhrに到達するまで。ストリップを、65mM DTT、6M尿素、30%(w/v)グリセロール、2%(w/v)ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及び50mM Tris-HCl(pH8.8)を含有する溶液中で10分間平衡化した。第2の平衡工程も、259mMヨードアセトアミドで置換したDTTを除き同じ溶液中で10分間行った。第2次元の直前に、ストリップを電気泳動緩衝液(24mM Tris塩基、0.2Mグリシン及び0.1% SDS)中に浸漬した。ストリップを12.5%の均質なDuracryl Slabgel(240×190×1mm又は290×245×1mm)に適用した。ストリップの上に電気泳動緩衝液(60℃に維持)中1%アガロース溶液を載せた。Hoefer DALTゲル装置(Amersham Pharmacia Biotech, San Francisco, CA,米国)を使用して20℃にて80Vの低電圧で19時間、又は上記と同じ電気泳動緩衝液を用いるゲル装置を使用して20℃にて18mAで色素の先端がゲルの底に到達するまでのいずれかで電気泳動を行った。泳動時間は、約17時間であった。
ゲルを銀染色し、染色後、ゲルドライヤー(Slab gel Dryer SGD2000, Savant)を使用してゲルを乾燥させた。
CanoScan 995OF(Canon)を使用してゲルを走査した。PDQUEST(バージョン7.1.0)二次元ゲル分析システム(Bio-Rad discovery series, Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg,スウェーデン)を使用してスポット分析を行った。
目的のスポットを0.5ml Milli-Q水で1時間洗浄し、続いて25mM重炭酸アンモニウム中40%アセトニトリル(ACN) 0.5mlで各30分間4回洗浄した。次いで、ゲル片をSpeedVacコンセントレータ中で乾燥させた後、一晩37℃にて25mM重炭酸アンモニウム中のトリプシン(配列決定等級,Promega)を用いてタンパク質を特徴的フラグメントに分解させた。20μlの2%トリフルオロ酢酸(これはまたゲルからペプチドを抽出した)を添加して消化を終結させた。室温にて2時間後、C18 Ziptips(Millipore)を使用して消化緩衝液からペプチドを精製した。簡潔には、2×10μlのMilli-Q水中50% ACN、0.1% TFAを用いて固相を馴化した。10μlの0.1% TFAでの2回の洗浄により有機溶媒を洗い流した。サンプルを数回吸引分配し、続いて0.1% TFAで2回洗浄して塩及び未結合物質を除去した。精製ペプチドを(0.7μlのマトリックス、2,5-ジヒドロキシ安息香酸(30% CAN中3mg/ml)が添加された)サンプルターゲット(Anchorchip target, Bruker Daltonik)に直接溶出した。正帯電イオンの質量スペクトルを、リフレクターモードで稼動したBruker Reflex III装置(Bruker Daltonik)に記録した。各サンプルから合計160〜210のシングルショットスペクトルを蓄積した。製造業者から提供されたXMASS 5.0及びMS Biotoolsソフトウェアパッケージをデータ処理に使用した。トリプシンからの公知の自己タンパク質分解産物を内部キャリブレーションに使用した。
ペプチド抽出物の各々から、ステンレス鋼製MALDIターゲット上に直接0.5μlをスポット状に塗布し、乾燥させた。5mg/mlのα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸、50%アセトニトリル、0.1% TFA及び50mMクエン酸を含有する0.5μlのマトリックス溶液を添加し、乾燥させた。4700 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems, Framingham, CA,米国)マススペクトロメータをポジティブリフレクターモードで使用して、MALDI-TOF-MS及びMS/MSスペクトルを獲得した。m/z値が842.51及び2211.097の2つのトリプシン自己タンパク質分解ペプチドを使用して、得られたMSスペクトルを内部較正した。NCBI非冗長データベースを検索するインハウスMascotサーチエンジン(Matrix Science, London,英国){Perkins, 1999 #132}と共にGPS Explorerソフトウェアを用いてタンパク質同定を行った。検索で指定したパラメータは以下のとおりであった:taxa、Mammalia;missed cleavages、1;peptide mass tolerance、±30ppm;fragment ion mass tolerance、±0.15Da;variable modifications、none。
タンパク質同定のために、ProFoundペプチドマッピング(バージョン4.10.5, The Rockefeller University Edition)及びMascotソフトウェア(Matrix Science Ltd)を用いて、NCBIデータベース中のヒトタンパク質配列を検索した。
製造業者の指示に従って12% Bis-Trisゲル(Invitrogen,米国)でウェスタンブロットを行った。簡潔には、20μgのタンパク質を2.5mlのLDSサンプル緩衝液(Invitrogen,米国)と共にゲルにロードし、1×MOPSランニング緩衝液中で50分間200Vで泳動した。電気泳動後、ゲルを1時間30VでPDVFメンブレン(Bio-Rad,米国)上にブロットし、その後メンブレンを、0.1% Tween20(登録商標)(ICN Biomedichals Inc., Ohio,米国)及び2%脱脂粉乳(Bio-Rad,米国)を含有するTris緩衝化生理食塩水(TBS)と一晩4℃でインキュベートした。
RNEasy(Qiagen)を製造業者の指示に従って用いて、上記と同じ患者の10のPE-サンプル及び10のコントロール-サンプルからトータルRNAを抽出した。簡潔には、RNEeasy溶解緩衝液(RLT緩衝液t及びβ-メルカプトエタノール)(Qiagen)中でTissueLyzerを用いて胎盤サンプルをホモジナイズした。70%エタノール中でサンプルを沈降させ、次いでRNEasyミニカラムを製造業者のプロトコルに従って用いて分離した。50μlのRNAseを含まないH2O中にサンプルを溶出させた。
逆転写酵素を製造業者のプロトコル(Applied Biosystems)に従って用いてcDNAを合成した。簡潔には、50mlの反応ミックス(0.5mgのトータルRNA、1×TaqMan RT緩衝液、5.5mM MgCl2、500mM dNTP、2.5mMランダムヘキサマー、0.4U/ml RNase阻害剤及び1.25U/ml MultiScribe逆転写酵素)を使用した。この反応液を25℃(10分間)、48℃(30分間)、最後に95℃(5分間)でインキュベートした。分析までサンプルを−20℃で保存した。
インサイチュハイブリダイゼーションは、18のPEサンプル及び19のコントロールサンプルについて行った。クリオスタット切片を解凍して、シアリン処理したスライド上にマウントし、これを使用するまで−80℃にて保存した。新鮮な凍結組織を用いてmRNA検出を最大化した。切片を固定し、脱水し、脱脂し、ハイブリダイズさせた。80mlのハイブリダイゼーション緩衝液(20mM Tris-HCl(pH7.4)、1mM EDTA(pH8.0)、300mM NaCl、50%ホルムアミド、10%硫酸デキストラン、1×Denhardtの25mg/ml酵母tRNA、100mg/mlサケ精子DNA、250mg/mlトータル酵母RNA(画分XI、Sigma)、150mM DTT、0.15%チオ硫酸ナトリウム(NTS)及び0.15% SDS)当たり2×106cpmの変性35S-cRNAプローブを用いて、20〜24時間、55℃でハイブリダイゼーションを行った。洗浄後、スライドをKodak Hyperfilm Biomax MRに2日間並置し、その後核トラック乳剤(nuclear track emulsion)(NTB,Kodak)で被覆した。スライドに4℃で4週間曝露し、その後Dektol(Kodak)で現像し、固定してギムザ染色で対比染色した。
抽出した胎盤タンパク質を2D-PAGEにより分離し、PEを有する患者と健常コントロールとの間のタンパク質発現の差を調べた。第1の実験設定では、400μgのサンプルをIPG-ストリップにロードし、Hoefer DALTゲル装置を用いて第2次元目を泳動した。唯一のスポットが2群間で有意に異なって提示された。このスポットを同定するために、800μgのサンプルをゲルにロードし、2つのPE及び2つのコントロールサンプルの合計4つのサンプルを泳動した。定性分析のために、第2次元目を泳動した。その際、PEサンプル中に、2つ目の異なって発現するスポットを裸眼で検出した(図8)。この目的の2つのタンパク質スポットをゲルから打ち抜き、酵素消化し、MALDI-TOF MSを用いて同定した。第1のタンパク質をトランスフェリンと、第2のタンパク質をヘモグロビンと同定した。
本発明者らの現在の知見は、本明細書において、PE中のHbδ-タンパク質及び対応する遺伝子の増加した発現を証明することによって胎盤の造血を支持している。
胎盤では、増加したレベルのHbδ mRNAがタンパク質に翻訳される。本発明者らは本明細書中で、このタンパク質がPE胎盤中に蓄積されることを示した。しかし、産生されるHb鎖がポルフィリン環及びFeイオンを有する機能的なHb分子に編成されるかは確かではない。鉄の輸送及び細胞取り込みはトランスフェリン(TF)により促進される。本発明者らの2D-ゲルにより、PE胎盤は細胞内TFが欠乏していることが示される。PE胎盤中でのTFタンパク質の欠乏は、Hbδ発現細胞集団中への鉄輸送の損傷を反映している可能性がある。よって、Hb産生細胞は鉄供給を欠損し、PE胎盤中でのHb鎖及び/又は機能不全Hb分子の蓄積を導いている可能性がある。
HLA-DPA1 RNA発現の検出
定量的RT-PCRを行って、HLA-DPA1 RNA発現を分析した。
サンプル収集;組織サンプリング及び取扱い;RNA抽出;及びリアルタイムPCR増幅は、必要な改変を加えて実施例1に記載のように行った。
主要組織適合性複合体クラスII、DPα1(HLA-DPA1)は、他の全ての群と比較してノッチを有する群で有意にアップレギュレートされた(ノッチを有さないPEに対してはp=0.01、ノッチを有するPEに対してはp=0.02、コントロールに対してはp=0.01)(図4Dを参照)。
ノッチを有すると診断された女性は、妊娠後期にPEを発症するリスクがより高い。しかし、ノッチを有する全ての女性がPEを発症するわけではないという事実は、ノッチを有する女性が保護遺伝子を発現するか有害遺伝子を抑制する可能性を示唆する。マイクロアレイ及びqPCRの両方が、他の全ての群に対するノッチ群におけるHLA-DPA1の発現増大を示した。HLA-DPA1は、そのメンバーが適応免疫応答の一部として外来抗原の提示を担うクラスII主要組織適合性複合体(MHC)ファミリーの一部である。クラスI MHC分子(HLAタイプG及びE)のみがトロホブラスト細胞で発現する。これらは、胎児-母体境界で、母体免疫応答を変化させ、母体の免疫応答から胎児を保護すると考えられている。よって、MHCクラスII分子であるHLA-DPA1は、トロホブラストにより製造されない可能性がある。代わりに、それは、胎盤中の胎児細胞の存在に対する母体の反応であり得る。
血漿及び尿中のヘモグロビン及びα1-ミクログロブリン濃度、α1-ミクログロブリンによる抗酸化及びインビトロ胎盤灌流
材料及び方法
ヘモグロビン
ヘモグロビンはSigmaより購入した。オキシヘモグロビン-Aは本発明者らの研究室で以下のとおり調製した。50mlのヒト血液からの赤血球を遠心分離(1200×g,10分)により単離し、10容量のリン酸緩衝化食塩水(PBS,10mMリン酸,pH7.4;120mM NaCl及び3mM KCl)で4回洗浄した。次いで、氷上で低張性緩衝液(20容量のH2O:1容量のPBS)中に再懸濁することにより血液細胞を溶解させた。遠心分離(14000×g,20分)によりサイトゾルから膜を分離し、上清を4℃で15mM Tris-HCl(pH8.0)に対して3回透析した。200mlのDEAE-Sephandex A-50(Amersham Biosciences AB, Uppsala,スウェーデン)をカラムに詰め、透析した上清をゲルに適用し、15mM Tris-HCl(pH8.0)及び15mM Tris-HCl(pH8.0)+0.2M NaClからなるグラジエントにより分離した。画分を収集し、280nm、577nm及び630nmで吸光度を測定してオキシヘモグロビン-Aを同定してその濃度を決定したオキシヘモグロビンFは同じプロトコルに従ってヒト臍帯血から調製した。
[Kwasekら,2007]に記載のとおりに、組換えヒトα1-ミクログロブリン(α1m)をE.coliで発現させ、精製し、リフォールディングさせた。ウサギ抗-マウスイムノグロブリン、ウサギ抗-ヘモグロビン及びブタ抗-ウサギイムノグロブリン-アルカリホスファターゼ(ALP)はDako(デンマーク)から購入した。マウスモノクローナル抗-ヘモグロビンγ鎖抗体は、Santa Cruz Biotechnologies Inc(カタログ番号sc-21756)から購入した。ウサギ抗-ヒトα1m及びヤギ抗-ウサギイムノグロブリンはそれぞれ[Elbashirら,1990、Bjorckら,1977]に記載のように調製した。ヒトα1mに対するモノクローナルマウス抗体(BN11.10)は、[Babiker-Mohamedら,1991]に記載のように調製した。
クロマリン-T法[Greenwoodら,1963]を用いて、タンパク質を125I(Bio-Nuclear AB, Stockholm,スウェーデン)で標識した。Sephadex G-25 カラム(PD-10,GE Healthcare)でのゲル濾過により、標識タンパク質を遊離ヨウ素から分離した。比活性は、α1mについては約0.3MBq/μgタンパク質であり、イムノグロブリンについては0.5MBq/μgタンパク質であった。
胎盤及び血液サンプルは、Lund University Hospitalに入院した女性から収集した(30のコントロール、30のPE)。サンプリングは、書面による同意を得て実施し、スウェーデン倫理委員会審査部により承認された。子癇前症は、140/90mmHgを上回る血圧かつ0.3g/Lを上回る蛋白尿と定義した{Milne、2005 #89}。両側にノッチを有する患者のみをPEなしでノッチを有する群としてサンプリングした。
競合酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を固相ラジオイムノアッセイ(SPRIA)について記載したように使用し、[Nilsonら,1986]に記載のような緩衝液、洗浄手順及びインキュベーション時間を用いてヘモグロビン-A濃度を測定した。ヘモグロビン(Sigma)を4μg/mlで被覆し、プレートを洗浄し、ウサギ抗-ヘモグロビンと標準オキシヘモグロビン-A又は未知のサンプルのいずれかとの混合物とインキュベートし、洗浄し、ブタ-抗-ウサギIgG-ALP(Dako)とインキュベートし、洗浄し、最後に基質とインキュベートした。各工程の適切な希釈物及び試薬を別々に力価測定した。吸光度は415nmで読み取った(Bio-Rad Model 550、マイクロプレートリーダー)。全てのインキュベーション工程に使用した容量は、100μlであった。全ての実験を3連で行った。
[Plesnerら,1975;Akerstrom,1985]に記載のようなラジオイムノアッセイ(RIA)によりα1m濃度を決定した。簡潔には、ヒトα1mに対するヤギ抗血清(0.2ml、1:6000希釈)を125I-標識α1m(0.1ml、約0.05pg/ml)及び未知のサンプル又は標準α1m-濃度(0.2ml)と混合した。希釈は0.1Mリン酸ナトリウム(pH7.5)+0.1% BSA(RIA緩衝液)で行った。室温にて一晩インキュベート後、0.3mlのウシ血清及び1.6mlのRIA-緩衝液中15%ポリエチレングリコールを添加することにより抗体結合α1mを沈降させ、1500×Gで40分間遠心分離し、ペレットの125I-活性をWallac Wizard 1470 γカウンター(Perkin Elmer Life Sciences)で分析した。
Montage Albumin Depleteキット(カタログ番号LSKAD0024;Millipore)を用いて血漿アルブミンを除去した後に、ヘモグロビンFの血漿濃度をウェスタンブロッティングにより決定した。簡潔には、10のカラムからのビーズを1つのバッチ中にプールし、PBSで洗浄し、50の同じアリコートに分けた。遠心分離後、各アリコートの上清を廃棄し、40μlの血漿(PBSで1:1希釈)を加え、RTにて1時間2回インキュベートした。チューブを遠心分離し、上清を残し、ビーズを1mlの0.1Mグリシン-HCl(pH2.3)及び1mlの0.1M Tris-HCl(pH8)で続けて洗浄した。遠心分離及び上清の除去後、血漿を加え、再びRTにて1時間インキュベートした。遠心分離及びペレットの廃棄後、このようにアルブミンを除去した血漿10μlをSDS-PAGE(T=13.5%;C=3.3%)により分離し、600×希釈したマウス抗-ヒトHb-F/γ-鎖で、続いてウサギ抗-マウスIg(1μg/ml)及び125I-標識ヤギ抗-ウサギIgGで下記のとおりにブロットした。Image Gauge V4.0ソフトウェア(Fuji, Tokyo,日本)及び標準ヘモグロビンF(15及び75ng/ウェル)を用いる陽性バンドの濃度測定によりヘモグロビンFの定量化を達成した。同じプロトコールを使用したがMontage Albumin Depleteキットを用いる工程を省略して、ヘモグロビンFの尿濃度を決定した。
SDS-PAGE(T=12%、C=3.3%)を[Laemmli,1970]に記載のとおりに行った。高分子量標準(Rainbow markers, Amersham Biosciences, Buckinghamshire,英国)を用い、還元条件下でゲルを電気泳動した。分離したタンパク質を、[Matsudaira,1987]に記載のようにポリビニリデンジフルオリド(PVDF)メンブレン(Immobilon, Millipore, Bedford, MA,米国)に移した。次いで、メンブレンを適切な抗体とインキュベートし、Westerら[1997]により以前に記載されたように125I-標識二次ヤギ抗-ウサギイムノグロブリンを用いてウェスタンブロットを行い、Fuji FLA 3000 phosphoimaging system(Fujifilm Sweden AB, Stockholm,スウェーデン)を用いてメンブレン上に現像した。
[Berggardら,1999]に記載のように、α1mを含有する分子を胎盤組織から精製した。出産後3時間以内に採取した約200gの見かけ上正常期のヒト胎盤を、200mlの50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.25Mスクロース、2mM EDTA、ペプスタチン1mg/l、アンチパイン5mg/l、及びロイペプチン10mg/l中でPotter-Elvehjem装置及びタイトフィットのテフロン(登録商標)ペストルを使用してホモジネートした。ホモジネートを10,000Gで10分間遠心分離した。ホモジナイゼーション緩衝液中への1:1懸濁及び10,000Gで10分間の再遠心分離を繰り返すことにより、このペレットを洗浄した。上清を100,000Gで90分間遠心分離した。胎盤膜及び膜結合タンパク質を含有するこのペレットを、0.5%(w/v) Nonidet P-40(BDH Chemicals)も含有する40mlのホモジナイゼーション緩衝液中に溶解させ、20,000Gで30分間遠心分離して微粒子物質を除去した。全ての工程を氷上又は4℃で行った。Affigel Hz(20mg/ml)に製造業者の指示(Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA,米国)に従って固定化したモノクローナルマウス抗-α1m(BN11.10)を用いて免疫吸着アフィニティークロマトグラフィーを行った。
今日まで、PEの妥当な動物モデルは存在しない。遊離ヘモグロビンの効果を調べるため、本発明者らは、Henning Schneider(Greifswald,ドイツ)と共同でデュアル胎盤灌流モデルを構築している。デュアル-胎盤灌流は、胎盤血流をインビトロで研究するための十分に確立したモデルである[Schneiderら,1985]。最近、このモデルは、キサンチン及びキサンチンオキシダーゼでROS形成を誘導することによりPEを模擬するために使用された[Di Santoら,2007]。本発明者らのごく最近のデータは、キサンチンを灌流した胎盤がPE胎盤と類似する遺伝子プロフィールを有することを示している。
ヘモグロビン-Aは子癇前症の血漿中で上昇する
結果
結果を図11〜12に示す。30人の子癇前症を有する患者及び30人のコントロール妊婦の血漿中の総ヘモグロビン濃度のELISAによる決定は、子癇前症群におけるほぼ2倍の増加を示した。患者群の平均値±SDは3.01±0.39ug/mlであり、コントロール群では4.44±1.0であった。この差は有意である(P<0.05)。
ヘモグロビン-Fは子癇前症の血漿及び尿中で上昇する
血漿及び尿中の胎児ヘモグロビンは、ウェスタンブロッティングで、抗-γ鎖と反応する15kDa-バンドとして観察された。図13は、2人の患者(PE1及びPE2)及び2人のコントロール被検体(コントロール1及び2)の血漿に適用したウェスタンブロッティング法の例を示す。この方法の検出限界は、血漿中では約5μg/ml、尿中では1ug/mlであった。Hb-Fの濃度を濃度測定により推定した。表1は、PE群及びコントロール群からの血漿サンプル及び尿サンプル中のHb-Fの頻度を示す。9人の患者の血漿中でバンドが見られた一方、陽性であったコントロール個体はいなかった。よって、9人の患者女性が血漿中5μg/mlより多い胎児ヘモグロビンを有しており、コントロール女性はそのような多い胎児ヘモグロビンを有していなかった。コントロール女性の血漿濃度(すなわち、正常血漿濃度)がTurpeinenら[1992]の研究により示唆されているように0.04ug/mlであると仮定すると、本発明者らの結果は、PEを有する患者の20%において胎児ヘモグロビンが125倍増加していることを示している。8人の患者及び2人のコントロールの尿がバンドを含んでいた(表3)。これら2人のコントロール個体は、マラリア感染の発生率が高いタンザニア人女性に見出された。67kDaの弱い陽性バンド(アルブミンを示す可能性が最も高い)は、全てのサンプルで等しい強度で見られた。
血漿ヘモグロビン-A及びFの時間依存性
子癇前症の可能性のある初期病原因子は、例えば灌流揺らぎ(faltering perfusion)、異常着床又は飢餓による、低酸素症である。低酸素症は、胎児及び成人の両方の造血幹細胞及び始原細胞でのHb-F発現をアップレギュレートし得る[Narayanら,2005]。これは、胎盤の物理的障壁に対する傷害と共に、ステージ1と2との間で胎児細胞及び遊離Hb-Fの母体循環中への漏れを導き得る(図15を参照)。この疾患が進行するにつれて、数は増加し、このことは増加した遊離胎児ヘモグロビンレベルとしてモニターすることができる。母体の脈管壁が遊離胎児ヘモグロビンにより損傷を受けると、母体の血液細胞もまた死に始める。これは遊離母体ヘモグロビンレベルの増加を導き、この疾患の負のスパイラルを更に駆動する。この仮説は、Hb-Fが総Hbに先行することである。
α1mは子癇前症の血漿及び尿中で上昇する
小さな血漿及び組織タンパク質α1-ミクログロブリン(α1m)がヘム-結合体[Allhornら,2002;Larssonら,2004]及びラジカルスカベンジャー[Akerstromら,2007]であり、α1mが遊離ヘモグロビンと混合されると、C末端テトラペプチドLIPRのタンパク質分解的除去によりヘム分解形態t-α1mが誘導される[Allhornら,2002]。遊離ヘモグロビン及び反応性酸素種は、肝臓細胞及び血液細胞におけるα1mの増大した産生を引き起こす[Allhornら,2002]。したがって、α1mは、細胞及び組織成分に対するヘム誘導性及びヘモグロビン誘導性の損傷から保護することができる可能性のあるヘムアンタゴニストかつヘモグロビンアンタゴニストである。
α1mは抗酸化及びヘム結合により細胞成分及び組織成分を保護する
α1mの抗酸化特性を図16及び17で説明する。第1に、細胞外に与えたα1mは、細胞サイトゾル及びサイトゾルタンパク質チオール基のレドックス電荷を減少させ、ヘム及びROSによるこれら成分の酸化を阻害することができることが示された。細胞外に与えたα1mはまた、ヘムにより誘導される細胞溶解(すなわち、細胞死)を阻害する(図16)。コラーゲン及び低比重リポタンパク質(LDL)の酸化的改変は、多くの疾患の病因に関与し、子癇前症におけるHb-誘導性酸化の標的でもあり得る。α1mはコラーゲン、LDL、膜脂質及び全細胞のヘム-及びROS-誘導性酸化を阻害した。α1mはまた、コラーゲン及びLDL上の予め形成された酸化産物を除去した(図17)。これら作用の可能性のある機序は、酸化剤を還元するα1mのレダクターゼ特性、酸化改変、又はその両方であり得る。
ヘモグロビンのインビトロ灌流は胎盤漏れ及びα1m-アップレギュレーションを誘導する
インビトロ胎盤灌流モデルを使用して、2つの別々の循環系、胎児側及び母体側で子癇前症を研究した。両方の循環系をまずリンスした。次いで、胎盤を、胎児側ではHb-A溶液(2mg/ml)で120分間、母体側では緩衝液のみで120分間灌流し(「第1灌流」)、そして両側で緩衝液のみで120分間灌流した(「第2灌流」)。両方の循環から定期的に小さなアリコートを採取し、Hb-A、Hb-F及びα1mの濃度を測定した。図19(左側)に示すように、Hb-Aは、第1灌流の間に母体側に迅速に出現し、第2灌流の間により少ない程度になった。これは、Hb-Aの漏れ若しくは胎盤組織中の内因性産生又はその両方の結果であり得る。α1mはまた、両方の灌流期間の間に母体側に出現した(図19(右側))。このことは、α1mが、ヘモグロビン灌流の結果、胎盤組織で産生されることを示唆する。最後に、Hb-Fは、おそらくは胎盤における産生及び母体の循環中への漏の結果として、第1灌流(120分)の終わりに母体循環中に出現した。
互いに結合したα1m及びヘモグロビンからなる胎盤中の新たな分子
2つの分子を溶液中で混合するとα1mがヘモグロビンからヘム基を「盗む」ことができることは以前に示された[Allhornら,2002;Larssonら,2004]。これをインビボで達成するために、ヘモグロビン及びα1m分子は互い必需であるべきである。このようなα1m-ヘモグロビン分子の証拠は、α1m-含有分子種の単離に続く抗-Hbブロッティングでの分析後に、胎盤抽出物中で観察された(図20)。43-kDaタンパク質バンドは、α1m及びHb-Aの両方に対する抗体と反応した。このバンドは、Maldi-MSペプチドマッピングにより、α1m並びにα-及びβ-の両方のグロビン鎖を含有することが示された(示さず)。この分子のサイズは、該分子がα1mからなる一方の鎖及びHbα又はHbγのいずれかであり得る別の1つの鎖から構成されることを示唆している。このバンドは、メルカプトエタノールの添加後には観察できなくなった。このことは、これら鎖がジスルフィド結合により一緒に保持されていることを示している。
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1.以下の工程:
(a)妊娠雌性哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程;
(b)前記生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び
(c)サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを参照値と比較するか又はサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比を参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか否か又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか否かを決定する工程
を含んでなる子癇前症を診断するため又は子癇前症診断を補助するための方法。
4.生物学的サンプルが尿である項目1又は2に記載の方法。
5.生物学的サンプルが胎盤組織である項目1又は2に記載の方法。
6.遊離胎児ヘモグロビンのレベルが、サンプル中のヘモグロビンγ鎖(Hbγ)のレベルを測定することにより測定される項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
8.免疫学的アッセイがELISAである項目7に記載の方法。
9.遊離胎児ヘモグロビンレベルが遊離胎児ヘモグロビンRNAを測定することにより決定される項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
10.遊離胎児ヘモグロビンRNAがリアルタイムPCRを使用して測定される項目9に記載の方法。
11.前記哺乳動物がヒトである項目1〜10のいずれか1項に記載の方法。
(b)前記妊娠雌性哺乳動物からその後に単離した第2の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定すること;及び
(c)工程(a)及び(b)で測定した値を比較すること
を含んでなり、ここで、第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルの増加又は第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比に対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比の増加が、子癇前症の進行を示し;第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルの減少又は第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比に対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比の減少が子癇前症の退行を示す、子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。
(a)治療前の妊娠雌性哺乳動物から得た第1の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;
(b)治療後の同じ妊娠哺乳動物からの第2の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び
(c)(a)で決定したレベルを(b)で決定したレベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンレベルの減少又は第1のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比に対する第2のサンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比の減少が、前記治療が子癇前症の治療に対して効果的であることを示す、子癇前症ついての治療の効力を評価する方法。
15.遊離胎児ヘモグロビンのレベルがヘモグロビンγ鎖(Hbγ)のレベルを測定することにより測定される項目14に記載のアッセイキット。
16.総遊離ヘモグロビンのレベルを検出するための手段を更に含んでなる項目14又は15に記載のアッセイキット。
(a)妊娠雌性哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程;
(b)前記生物学的サンプル中の遊離ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離ヘモグロビンサブユニットのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び
(c)サンプル中の遊離ヘモグロビンのレベルを参照値と比較するか又はサンプル中の遊離ヘモグロビンサブユニットのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比を参照値と比較して、前記妊娠雌性体が子癇前症を有するか否か又は子癇前症を発症するリスクが増大しているか否かを決定する工程
を含んでなる子癇前症を診断するため又は子癇前症診断を補助するための方法
20.生物学的サンプルが尿である項目17又は18に記載の方法。
21.生物学的サンプルが胎盤組織である項目17又は18に記載の方法。
23.遊離ヘモグロビンレベルが免疫学的アッセイを使用して測定される項目17〜22のいずれか1項に記載の方法。
25.遊離ヘモグロビンレベルが遊離ヘモグロビンRNAを測定することにより決定される項目17〜22のいずれか1項に記載の方法。
26.遊離ヘモグロビンRNAがリアルタイムPCRを使用して測定される項目25に記載の方法。
27.前記哺乳動物がヒトである項目17〜26のいずれか1項に記載の方法。
(b)前記妊娠雌性哺乳動物からその後に単離した第2の生物学的サンプル中の遊離ヘモグロビンのレベルを測定すること
を含んでなり、ここで、第1のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルの増加が、子癇前症の進行を示し;第1のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルの減少が子癇前症の退行を示す、子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。
(a)治療前の妊娠雌性哺乳動物から得た第1の生物学的サンプル中の遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;
(b)治療後の同じ妊娠哺乳動物からの第2の生物学的サンプル中の遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程;及び
(c)(a)で決定したレベルを(b)で決定したレベルと比較する工程
を含んでなり、ここで、第1のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルに対する第2のサンプル中の遊離ヘモグロビンレベルの減少が、前記治療が子癇前症の治療に対して効果的であることを示す、子癇前症ついての治療の効力を評価する方法。
33.遊離ヘモグロビンのレベルが、ヘモグロビンα鎖(Hbα)、ヘモグロビンβ鎖(Hbβ)、ヘモグロビンδ鎖(Hbδ)、ヘモグロビンγ鎖(Hbγ)及び/又は総遊離ヘモグロビンのレベルを測定することにより測定される項目32に記載のアッセイキット。
35.前記ヘモグロビン結合剤及び/又はヘム結合剤がα1-ミクログロブリンである項目34に記載の使用。
36.前記ヘモグロビン結合剤及び/又はヘム結合剤がヘモグロビン及び/又はヘムに対して特異的な抗体である項目34に記載の物質の使用。
38.前記ヘモグロビン結合剤及び/又はヘム結合剤がα1-ミクログロブリンである項目37に記載の方法。
39.前記ヘモグロビン結合剤及び/又はヘム結合剤がヘモグロビン及び/又はヘムに対して特異的な抗体である項目37に記載の方法。
(a)妊娠雌性哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程;
(b)前記生物学的サンプル中のヒト白血球抗原DPA1(HLA-DPA1)のレベルを測定する工程;及び
(c)サンプル中のHLA-DPA1のレベルを参照値と比較する
を含んでなる子癇前症の予後のための方法。
41.工程(a)〜(c)が、前記妊娠雌性体が子癇前症を発症するリスクが増大しているか否か又は重篤形態の子癇前症を発症するリスクが増大しているか否かを決定するために行う項目40に記載の方法。
42.妊娠雌性哺乳動物の生物学的サンプル中のHLA-DPA1のレベルを検出するための手段及び前記検出手段を使用するための指示書を含んでなる項目40〜42のいずれか1項に記載の方法に従う、子癇前症の予後又は該予後を補助するためのアッセイキット。
Claims (47)
- 子癇前症のマーカーとしての胎児ヘモグロビンの使用。
- 前記胎児ヘモグロビンを妊娠雌性哺乳動物の非胎児生物学的サンプル中で測定する請求項1に記載の使用。
- 前記非胎児生物学的サンプルが血液サンプル、血漿サンプル、尿サンプル又は胎盤組織のサンプルである請求項2に記載の使用。
- 前記サンプルが血漿サンプルである請求項3に記載の使用。
- 胎児ヘモグロビンの血漿濃度が血漿中の胎児ヘモグロビンの正常濃度と比較して約20倍又はそれ以上増大している場合、妊娠雌性哺乳動物が子癇前症を有するか、又は子癇前症を発症するリスクが増大している請求項2〜4のいずれか1項に記載の使用。
- 胎児ヘモグロビンの血漿濃度が約0.5μg/ml又はそれ以上である場合、妊娠雌性哺乳動物が子癇前症を有するか、又は子癇前症を発症するリスクが増大している請求項2〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 胎児ヘモグロビン尿濃度が約0.06μg/ml又はそれ以上である場合、妊娠雌性哺乳動物が子癇前症を有するか、又は子癇前症を発症するリスクが増大している請求項2〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 以下の方法:
i)子癇前症を診断する方法又は子癇前症の診断を補助する方法、
ii)子癇前症の進行又は退行をモニターする方法、
iii)子癇前症治療の効力を評価する方法
の1又はそれ以上における請求項1〜7のいずれか1項の使用。 - 子癇前症のマーカーとしての胎児ヘモグロビン。
- 以下の工程:
i)妊娠雌性哺乳動物から非胎児生物学的サンプルを得る工程;
ii)前記生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程
を含んでなる子癇前症を診断するか又はその診断を補助する方法。 - iii)前記サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを参照値と比較するか又は前記サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルと総遊離ヘモグロビンのレベルとの間の比を参照値と比較する工程
を更に含んでなる請求項10に記載の方法。 - i)妊娠雌性哺乳動物から単離した第1の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程、
ii)前記妊娠雌性哺乳動物から後に単離した第2の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程
を含んでなる子癇前症の進行又は退行をモニターする方法。 - iii)工程i)及びii)で測定した値を比較する工程
を更に含んでなる請求項12に記載の方法。 - i)治療前に又は時間t1で妊娠雌性哺乳動物から得た第1の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程、
ii)同じ妊娠雌性哺乳動物から後の時点t2に得た第2の生物学的サンプル中の遊離胎児ヘモグロビンのレベルを測定するか又は遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び総遊離ヘモグロビンのレベルを測定する工程
を含んでなる子癇前症の治療の効力を評価する方法。 - iii)工程i)及びii)で測定した値を比較する工程
を更に含んでなる請求項14に記載の方法。 - 前記生物学的サンプルが血液サンプル、血漿サンプル、尿サンプル又は胎盤組織のサンプルである請求項10〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離胎児ヘモグロビンのレベルを、前記サンプル中のヘモグロビンγ鎖(Hbγ)のレベルを測定することにより測定する請求項10〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 遊離胎児ヘモグロビンのレベル及び/又は該当する場合には総遊離ヘモグロビンを、免疫学的アッセイを用いて測定する請求項10〜17のいずれか1項に記載の方法。
- アッセイがELISAである請求項18に記載の方法。
- 遊離胎児ヘモグロビンレベルを、遊離胎児ヘモグロビンRNAを測定することにより決定する請求項10〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記レベルを、リアルタイムPCRを用いて測定する請求項20に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである請求項10〜21のいずれか1項に記載の方法。
- i)前記生物学的サンプル中のヒト白血球抗原DPA1(HLA-DPA1)のレベルを測定することを更に又は択一的に含んでなる請求項10〜22のいずれか1項に記載の方法。
- ii)前記サンプル中のHLA-DPA1のレベルを参照値と比較すること
を更に含んでなる請求項23に記載の方法。 - i)妊娠雌性哺乳動物の生物学的サンプル中の遊離胎児及び該当する場合には総ヘモグロビンのレベルを検出する手段と、
ii)前記検出手段を使用するための指示書と
を含んでなる請求項10〜22のいずれか1項に規定の方法で使用するアッセイキット。 - i)胎児ヘモグロビンを予め被覆した固相表面と、
ii)妊娠雌性哺乳動物からの単離遊離胎児ヘモグロビン又はその免疫原性ペプチド、フラグメント若しくはエピトープに特異的に結合する1又はそれより多い抗体又はその免疫反応性フラグメントと、
iii)抗原-抗体複合体の形成を検出する手段と、
iv)任意に、使用指示書と
を含んでなる請求項25に記載のキット。 - サンプル中の総ヘモグロビン濃度を測定する構成要素を更に含んでなる請求項26に記載のキット。
- サンプル中の総ヘモグロビン濃度を測定するために必要な構成要素が
i)ヘモグロビンを予め被覆した固相表面と、
ii)妊娠雌性哺乳動物からの単離遊離ヘモグロビン又はその免疫原性ペプチド、フラグメント若しくはエピトープに特異的に結合する1又はそれより多い抗体又はその免疫反応性フラグメントと、
iii)抗原-抗体複合体の形成を検出する手段と、
iv)任意に、使用指示書と
を含んでなる請求項27に記載のキット。 - 前記固相表面i)がマイクロタイタープレート中の1又はそれより多いウェルである請求項26〜28のいずれか1項に記載のキット。
- 前記抗体又は抗体フラグメントi)が、ヘモグロビンα鎖、ヘモグロビンβ鎖、ヘモグロビンδ鎖、ヘモグロビンγ鎖又はその免疫原性ペプチド、フラグメント若しくはエピトープに特異的である請求項26〜29のいずれか1項に記載のキット。
- 前記抗体i)がモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である請求項26〜30のいずれか1項に記載のキット。
- 前記抗体がウサギから得られた請求項31に記載のキット。
- 前記抗原-抗体複合体の検出手段が標識モノクローナル又はポリクローナル抗体を含んでなる請求項26〜32のいずれか1項に記載のキット。
- 前記標識抗体がii)の抗体又はその免疫原性ペプチド、フラグメント若しくはエピトープに特異的に結合する請求項33に記載のキット。
- 前記標識抗体が例えばアルカリホスファターゼ標識抗体のような酵素-標識抗体である請求項34又は35に記載のキット。
- 前記抗原-抗体複合体の形成を検出する手段が、ブタ-抗-ウサギIgG-アルカリホスファターゼ抗体を含んでなる請求項26〜35のいずれか1項に記載のキット。
- 即時使用可能な瓶入りのヘモグロビンの標準希釈系列を更に含んでなる請求項25〜36のいずれか1項に記載のキット。
- 子癇前症の予防又は治療のための、ヘモグロビン結合剤、ヘム結合剤、ヘム分解剤及び/又は鉄結合剤から選択される1又はそれより多い物質の使用。
- 子癇前症の予防又は治療用の医薬組成物の製造のための、ヘモグロビン結合剤、ヘム結合剤、ヘム分解剤及び/又は鉄結合剤から選択される1又はそれより多い物質の使用。
- 前記物質が
i)ヘモグロビンの抗体又はそのフラグメント
ii)ハプトグロブリン
iii)CD163
iv)α1-ミクログロブリン
v)ヘモペキシン
vi)ヘムオキシゲナーゼ
vii)アルブミン
viii)トランスフェリン
ix)フェリチン
から選択される請求項38又は39に記載の使用。 - 前記医薬組成物が非経口使用のためである請求項38〜40のいずれか1項に記載の使用。
- 前記医薬組成物が経口使用のためである請求項38〜40のいずれか1項に記載の使用。
- その必要がある妊娠雌性哺乳動物に、ヘモグロビン結合剤、ヘム結合剤、ヘム分解剤及び/又は鉄結合剤から選択される1又はそれより多い物質の有効量を投与することを含んでなる子癇前症を予防又は治療する方法。
- 以下の工程
i)妊娠雌性哺乳動物から生物学的サンプルを得る工程と;
ii)前記生物学的サンプル中のヒト白血球抗原DPA1(HLA-DPA1)のレベルを測定する工程と;
iii)前記サンプル中のHLA-DPA1のレベルを参照値と比較する工程と
を含んでなる子癇前症の予後法。 - 工程(a)〜(c)を実行して、前記妊娠雌性体が子癇前症を発症するリスクが増大しているか否か、又は子癇前症の重篤形態を発症するリスクが増大しているか否かを決定する請求項44に記載の方法。
- HLA-DPA1の発現又は高発現がHLA-DPA1の無発現より良好な予後を示す請求項44又は45に記載の方法。
- 妊娠雌性哺乳動物の生物学的サンプル中のHLA-DPA1のレベルを検出する手段と前記検出手段を使用するための指示書とを含んでなる、請求項44〜46のいずれか1項に記載の方法による子癇前症の予後のため又は子癇前症の予後を補助するためのアッセイキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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