JP2002514304A

JP2002514304A - 多重画像化を用いた物体の識別

Info

Publication number: JP2002514304A
Application number: JP54945198A
Authority: JP
Inventors: ラブキン，イリヤ
Original assignee: アプライドイメージングコーポレイション
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-12
Publication date: 2002-05-14
Also published as: AU7482898A; CA2289930C; EP0981732A1; AU739834B2; NO995542L; ATE308747T1; IL132747A; NO995542D0; US6169816B1; HK1029170A1; DE69832167D1; DE69832167T2; IL132747A0; WO1998052018A1; EP0981732B1; CA2289930A1

Abstract

(57)【要約】胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）の検出は、核及び細胞質マーカーの明視野及び螢光画像の組合せを利用することによって達成される。明視野及び螢光画像は全て、単一の多重通過幅ダイクロイックミラーを用いて得られる。サンプル中の物体は、選択的に核を染色する螢光染料及び胎児ＲＢＣの細胞質中のヘモグロビンを選択的に染色する染料で染色される。ＵＶ励起は、染色された細胞核からの螢光発光を提供し、可視照明は、染色された細胞質により吸収される光の明視野透過を提供する。画像は、ＵＶ励起に応じて細胞核による螢光発光及び明視野照明の胎児ヘモグロビンによる吸収が重複するか又はきわめて近接している領域を決定するため処理される。明視野及び螢光画像は、ＵＶ励起及び可視照明が同時に起こる単一の画像から逐次的に取得されるか又は引き出される。

Description

【発明の詳細な説明】多重画像化を用いた物体の識別関連出願に対するクロスリファレンス本出願は、全ての添付文書及び付録を含めその開示全体があらゆる目的のために参考として本書に内含される「螢光発光及び透過走査を用いた有核赤血球といった標的特長の識別」についてのIlya Ravkinの１９９７年５月１４日付けの米国暫定出願第６０/０４６，４７０号からの優先権を請求している。発明の背景本発明は一般に、光学式認識システムに関し、より特に、妊婦の血液サンプル中で母親の細胞から胎児の有核赤血球を識別することに関する。異なる染料がサンプルの異なる部分上に存在し、各々の染料が対象物体を特徴づける特定の特長上に存在する生体サンプルの画像に対して画像処理を実施することは知られている。次に、サンプルは、対象の異なる特長を互いにそして背景から識別することができるような形で、照明を受け画像化される。これには、標準的に、各画像の特定のタイプの特長が認識可能となるように、適切な光源、フィルター及び光学的装置を用いて別々の画像を取得することが必要である。発明の要約本発明は、他の物体と共に散在した対象物体を発見するためのサンプル分析にとって力強く効率的な技術を提供している。簡単に言うと、サンプルは、対象物体が、複数の異なる照明スキームの下で画像化媒体上で画像化されたとき、他の物体が示す特長の組合せとは異なった特長の組合せを示すような形で、物体に対し光学的性質を付与するように調製される。従って、この組合せは、特定の組合せと呼ばれる。対象物体は、異なる画像からの特定の特長の組合せが予め定められた近接拘束（proximity constraint）（例えば重複又は近重複）を満たすインスタンス（instance）を決定するため、それぞれの照明スキームから生じる画像を分析することによって発見される。照明スキーム及び光学的性質は、サンプルと画像化媒体の間の通路の中へ又はそこから外へいずれかの光学要素を移動させる必要なく、サンプルが複数の異なる照明スキームの下で画像化媒体上に画像化されるというものである。かくして、照明スキームに対応する画像は、位置決め上の問題に対して大きく影響を受けず、従って特定の特長組合せの重複は、対象物体の信頼性ある表示をすることができる。画像は、各照明スキームのそれぞれの一つで得た別々に獲得した画像とすることができ、或いは又、その画像は、照明スキームの組合せで事実上同時に得たより少ない数の画像から導くことができる。特定の例においては、対象物体は胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）であり、その他の物体には、無核赤血球（ＲＢＣ）及び有核白血球（ＷＢＣ）が含まれ、サンプル中の物体は、核を選択的に染色する螢光染料及び胎児ＲＢＣの細胞質内の胎児ヘモグロビンを選択的に染色する染料で染色される。照明スキームには異なる２つのものがある。すなわち、それらは、染色された細胞核からの螢光発光を与えるＵＶ励起及び染色された細胞質により吸収される光の明視野透過 (brightfield trasmission)であり、そして、特定の特長の組合せは、ＵＶ励起に応じて細胞核による螢光発光及び明視野照明の胎児ヘモグロブリンによる吸収である。特定の一実施形態においては、最少の特長しか含まないと予想される画像がまず最初に分析され、その後に続く処理のための対象候補領域が決定される。これは、対象物体（ならびにその他の物体）が画像内で示す特長を含む画像内の領域を発見すること、そして次に画像内の対応する領域を検査して、画像が全て対象物体の存在を表わすのに充分に近いそれぞれの特長のインスタンスを含んでいるか否かを決定することによって達成される。特定の実施形態では、画像（又は好ましくはその候補領域）は、画像内の対象物体の場所を提供するために組合わされさらに処理され、それぞれのコントラストマスクを生成するように処理される。その組合せは、それ自体形態的に膨張させられてシード（seed）画像を形成することができるマスク間での論理積演算を内含することができる。さらなる処理には、対象物体の存在を示す対象特長を表わす所望の領域を提供するためにマスク内でシードを再構築することを含めることができる。本発明の特徴及び利点は、明細書の残りの部分及び図面を参照することによって理解することができる。図面の簡単な説明図１は、本発明の一実施形態に従った装置の光学的概略図である。図２は、本発明の一実施形態に従ったコンピュータシステムのブロック図である。図３は、本発明の特定の実施形態において実施される演算シーケンスを示すフローチャートである。図４Ａは、サンプルの同時照明を用いた画像生成段階を示すフローチャートである。図４Ｂは、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）を通しての組合された光強度プロフィールである。図５は、対象領域を決定するための段階を示すフローチャートである。図６は、有核コントラスト及び細胞質コントラストを表わす２つの別々のマスクを構築するための段階を示すフローチャートである。図７は、各ＮＲＢＣについて生成され記憶された代表的データセットを示す。特定の実施形態の説明１．画像化の概略本発明は、サンプル中の或る対象物体を位置決めするため明視野（透過）画像化に関連して螢光画像化を利用する。特定の利用分野においては、サンプルは、対象物体である有核赤血球（ＮＲＢＣ）について濃縮された妊婦（妊娠６〜９週目）からの血液塗抹サンプルである。特定の実施形態においては、本発明は、ＦＩＳＨといったさらなる分析のためにこのような物体の識別を実施する。ＦＩＳＨは、螢光インサイチュー・ハイブリダイゼーション（Fluorescence In-Situ Hybridization）の略である。ＦＩＳＨサンプルは、サンプル中の染色体内の特定のＤＮＡ配列に結合するプローブを用いて調製され、このプローブは螢光染料で標識づけされている。Ｍ−ＦＩＳＨは多数のプローブを使用することを意味し、各プローブがサンプル中の染色体内の異なるＤＮＡ配列に各々結合しており、各プローブは異なる染料又は２つ以上の染料の組合せで標識づけされている。このような理由から、以下に記述する装置は、本発明を実施するのに必要とされるものを超えた付加的な機能性を有している。所定の螢光染料は、励起（吸収）スペクトル及び発光スペクトルによって特徴づけられる。励起及び発光スペクトルは、時として励起及び発光バンドとも呼ばれる。従って、染料が励起バンド内の波長による光の照射をされると、染料は螢光を発し、発光バンド内の波長で光を放出する。かくして、サンプルが、所定の染料を励起する周波数帯域内の励起放射線で照射されると、所定の染料で標識づけされたプローブが付着されているサンプルの一部分が螢光を発光する。サンプルから放出される光が、ろ過されて、所定の染料の発光バンドより外側の光を受けつけないで画像化された場合、その画像は、名目上、この所定の染料で標識づけされたプローブに結合するサンプルの部分のみを示す。２．サンプルサンプル調製の詳細は本発明の一部を成すものではないが、特定の実施形態の記述のための前後関係を示す目的で、その調製について以下で簡単に記述する。本発明は、母親の血液からの胎児ＮＲＢＣの濃縮、胎児ＮＲＢＣの明確な識別、及び胎児ＮＲＢＣの遺伝子分析を含む３段階評価の２番目の段階に向けられている。上述のように、特定の実施において、装置は、第２段階（識別）及び第３段階（遺伝子分析）の両方において役目を果たすのに適したものとなるように構成されている。濃縮手順は、受胎後９〜１６週目の妊婦からの２０ｍＬのＥＤＴＡ抗擬固化全血で開始される。ＰＣＲ研究〔Bianchi ９７〕から、この血液量には約２０〜１００個の胎児細胞が含まれていることが算出されている。最終目的は、標的ＮＢＲＣを著しく喪失することなく、母親の血液細胞の１００００分の１を達成することにある。これらにより、スライド上に胎児ＮＲＢＣを付着させることができる。濃縮の第１段階は、全血を特別設計のプラスチック試験管〔Saunders９５〕で遠心分離させることによって、血液サンプルを密度分級に分離することにある。ＮＲＢＣは、白血球（ＷＢＣ）と赤血球（ＲＢＣ）の間の界面層から収穫される。第２段階は、残りの母親のＲＢＣの選択的溶解である。第３の最終段階は、緊張過度（hypertonic）条件でゼラチン内に懸濁されたシリカコロイド・パーコール（Percoll）(Pharmacia，Uppsala，スウェーデン)で形成された３層の密度勾配で残りのＷＢＣからのＮＲＢＣを分離する。遠心分離の後、ＮＲＢＣは勾配の底部から収獲され、そしてスライド上に付着される。結果として得られたスライドは、全て考えられる胎児又は母親に由来するＮＲＢＣ，ＲＢＣ及びＷＢＣを含有している。本発明の実施形態においては、胎児ＮＲＢＣを識別する一セットの特長が作り出され、これらをその他のタイプの細胞から区別する。これは、胎児ヘモグロビンを含有する細胞内の１つのコントラストタイプと、核を有する細胞内のもう１つのコントラストタイプを作ることによって行なわれる。スライドは、まず最初に一次抗体すなわちマウス抗胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）抗体と反応させられ、次に二次抗体すなわちビオチンに接合されたヤギ抗マウス抗体(goat anti mouse)と反応させられ、最後に、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）と接合されたストレプトアビジン（stre ptavidin）が添加され、それに続いてベクターブルー(Vector Blue)基質が添加される。結果は、胎児ヘモグロビンを含有する細胞の細胞質上の青色沈降物である。ＤＮＡ挿入剤（ＤＡＰＩ）が全ての核に螢光青色の染色を与え、これらのコントラストの両方の存在が、胎児ＮＲＢＣを決定する。本発明に使用するため、特注のスライドが開発された。これらのスライドは、４つの塗装された正方形をコーナーに有し、各正方形の中には十字形がレーザーエッチングされている。走査に先立ち、基準点の座標が走査データファイル内に記録される。その後の任意に、基準点を容易に発見しかつカメラの視野の中にセンタリングすることができる。走査ファイル内の他の物体全てに対する正確なリロケーションのために、オフセットが用いられる。３．光学システム図１は、螢光発光（好ましくは外部照明された）及び明視野（透過）の組合せを実行し、本発明に従ったサンプル１０の画像化を実施するための代表的な顕微鏡システム５を示す概略図である。サンプルは、３次元直線動作を提供する載物台１１に取りつけられた状態で示されている。以下で記述するように、本発明は、明視野及び螢光画像の逐次的取得、又は明視野及び螢光画像成分の同時取得、及び別々の画像へのその後の分離を伴って実現することができる。光学システムには、これら２つのタイプの画像の各々のための部分が含まれているが、光学器械の重要な部分を分担している。外部照明(epi-illuminated)された螢光画像化のための光学縦列の部分には、励起フィルタ１２（フィルタホイール上のかかる複数のフィルタのうちの１つとして示されている）、多色性（polychroic）ミラー１５、顕微鏡対物レンズ１７（例えば１０〜１００倍）、及び放射（emission）フィルタ２０が内含されている。本発明は単一の励起フィルター、ダイクロイックミラー、及び単一通過帯域をもつ放射フィルタで実現することもできる。しかしながら、付加的な螢光測定（ＦＩＳＨ）を実施することが好ましく、従って、ミラー又は放射フィルターを交換することなく、多重螢光画像をミラーや発光フィルタの変更無く取得できるように多帯域放射フィルタ及び多色性ミラーを使用することが好ましい。紫外（ＵＶ）光源２５からの励起放射線は、励起フィルタ１２を通過し、ミラー１５により大部分が反射され、顕微鏡の対物レンズ１７を通過してサンプル１０まで進む。サンプルに向かって走行する励起光は、白抜き矢印により概略的に示されている。サンプル１０から放射された螢光放射線は対物レンズ１７、ミラー１５及び放射フィルタ２０を通って戻り、像平面３０内に１つの画像を形成する。サンプルから遠くへ走行する螢光光は、黒矢印によって概略的に示されている。画像は、ＣＣＤビデオカメラ３２によってデジタル化され、デジタル化された画像は、ひきつづき処理するためコンピュータに送られる。コンピュータ３５は同様に、以下で記述されるように、システム中のさまざまな構成要素を制御するためにも使用される。多色性ミラー１５及び放射フィルタ２０は、標準的には、支持用構造４０（破線で示されている）にしっかりと取付けられ、このアセンブリは往々にしてキューブと呼ばれ、多数のキューブが光路の中へ及びそこから外に移動可能である。反対方向に向けられた矢印４２が、回転可能なターレット又は戻止めされたスライド機構といった適切な機構を表わしている。回転可能なフィルターホイール上には（図示する通り）、多数の励起フィルターが標準的に展開されている。標準的な顕微鏡においては、対物レンズ１７は、ターレット又はそれに類似する構造上に取りつけられた複数のもののうちの１つである。このことは、相対する方向に向いた矢印４３によって概略的に示されている。明視野画像化のための光学縦列の部分には、可視光源４５，通過帯域フィルタ４７（フィルタホイール１の複数のこのようなフィルタのうちの１つとして示されている）、ミラー５０及びコンデンサ５２が含まれている。光源４５からの照明放射線は、通過帯域フィルター４７を通過し、ミラー５０によりコンデンサ５２へ反射される。コンデンサを通過する放射線は、サンプル１０を照明し、顕微鏡対物レンズ１７を通って進む。照明反射線は、多色性ミラー１５及び放射フィルタ２０を通る波長範囲内にある。可視照明光は、網目入り矢印によって概略的に示されている。このシステムは同様に、コンピュータ３５にインタフェースされた単一のコントローラブロック５５として示されている一連のモーター及びランプコントローラをも含んでいる。コントローラ５５は、図１の光学的概略図に示される様々な要素を制御する。これには、顕微鏡の焦点のための制御モータ、励起フィルタ１２及び透過フィルタ４７のためのフィルタホイール、サンプル載物台１１，キューブターレット４２及び対物レンズターレット４３が含まれる。コントローラ１００は、ＵＶ光源２５及び可視光源４５をも制御する。しかしながら、本発明では、全ての制御可能な要素がコンピュータ制御下にあることが必要とされておらず、ただし上述の制御機構が備わっていることが好ましいということを理解すべきである。コンピュータを外部計器にインタフェースするための特定の技術は、当業者にとって既知のものであり、これらはそれ自体本発明の一部を成すものではないことから、ここではさらに詳しくは記述しない。特定の実施形態においては、顕微鏡はオリンパスＥＸ６０顕微鏡（Olympus Am erica Inc.，Melville，NY）であり、これには透過及び螢光発光機能、三眼顕微鏡ヘッド及び１０倍、２０倍及び４０倍の対物レンズが含まれている。載物台１１は、単一又は多重スライド走査用載物台（Maerzhauzer Co.，Upper Saddle River，NJ）であり、７位置透過フィルタホイール、１２位置螢光フィルタホイール及び焦点駆動機構（ＴＯＦＲＡ，Palo Alto，CA）と共に顕微鏡に取りつけられている。これらの装置はステッピングモータによって駆動され、マイクロステッピングモータコントローラ（Intelligent Motion System，Marlborough，CT）によって制御される。ビデオカメラ３２は、光集積能力（ＣＯＨＵ４９１０，Cohu，Inc.，San Diego，CA ）を有し、１０ビットＡＤＣと平均化フレームを内含するフレームグラッバーボード(frame grabber board)に結合されている。ＵＶ光源２５は、標準的には水銀アークランプであり、一方、可視光源４７は標準的にハロゲンランプである。以下でさらに詳述するように、図１の光学的構成は、ＤＡＰＩ螢光発光及びベクターブルー吸収の逐次的又は同時検出のため、そしてそれに続いてＦＩＳＨ画像化のためにも、使用される。重要な１つの利点は、吸収及び螢光発光の両方を検出するために多色性ミラー及び放射フィルターが常時存在することにある。特定の実施形態においては、外部照明は、水銀アークから始まり、ＤＡＰＩ励起フィルタを通過し、多色性ミラーによって下へ反射され、ＤＡＰＩ染色済み細胞の青色螢光発光を励起し、放射された光は対物レンズを通って戻り、そしてミラー及び発光フィルタの両方を通ってカメラまで通過する。透過照明（trans-il lumination）は、ハロゲンランプから始まり、長波長通過（long-pass）(赤色) フィルタを通り、ベクタブルーで染色された細胞により吸収され、そして対物レンズ、多色性ミラー及び放射フィルタを通ってカメラまで進む。ＤＮＡプローブに応じて、Chroma８３０００三重帯域フイルタセット（Chroma Technology Corp .，Brattleboro，VT）又はVysisカッド（quad）ＤＡＰＩ/アクア/グリーン/オレンジフィルタセット（Vysis，Inc.，Downers Grove，IL）が使用される。透過型Kohler照明及びスペクトルフィルターが、スライド上の細胞質の色についてのコントラストを最適化する。４．コンピュータシステム図２は、コンピュータ３５の単純化したブロック図である。コンピュータは、全ての動作を制御し、画像取得及びその処理及びユーザーインタフェース機能を実行するために使用される。特定の実施形態においては、コンピュータ３５は、ウインドウズ９５オペレーティングシステム（Microsoft Corporation，Redmond ，WA）を実行するワークステーションである。既知の手段によれば、コンピュータシステムは、バスサブシステム６５を介して多数の周辺デバイスと通信するプロセッサ６０を含む。これらの周辺デバイスには、標準的にメモリーサブシステム６７，入力装置７０，表示サブシステム７２，例えばプリンタ７３といった出力デバイス及びファイル記憶システム７５が含まれる。これに関連して、「バスサブシステム」という語は、包括的に、意図されたとおりにシステムのさまざまなコンポーネントを互いに通信させるためのあらゆる機構を内含するものとして使用されている。いくつかの入力デバイス及び表示装置を除いて、その他のコンポーネントは、同じ物理的場所にある必要はない。かくして、例えば、ファイル記憶システムの部分は、電話線を含むさまざまなローカルエリア又は広域ネットワークメディアを介して接続されうる。同様にして、入力デバイス及び表示装置はプロセッサと同じ場所にある必要はないが、本発明は最も往々にしてＰＣ及びワークステーションという環境の中で施行されることになると期待される。バスサブステーション６５は、概略的に単一のバスとして示されているが、標準的なシステムは、ローカルバス及び単数又は複数の拡張バス（例えば、ＡＤＢ，ＳＣＳＩ，ＩＳＡ，ＥＩＳＡ，ＭＣＡ，ＮａＢｕｓ又はＰＣＩ）といった多数のバス、ならびに直列及び並列のポートを有する。ネットワーク接続は通常、直列ポート上のモデム又はこれらの拡張バスのうち１本の上でネットワークアダプタといったデバイスを通して確立される。コンピュータシステムはデスクトップシステムでもポータブルシステムでもよい。メモリーサブシステム６７には、主ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）８０及び固定した命令が記憶される読出し専用メモリ（ＲＯＭ）８２を含む多数のメモリが含まれている。マッキントッシュコンパチブル・パーソナルコンピュータの場合、そのＲＯＭは、オペレーティングシステムの一部分を含むことになり、ＩＢＭコンパチブル・パーソナルコンピュータの場合には、そのＲＯＭはＢＩＯＳ（基本入出力システム）を含むことになる。入力装置７０には、標準的に、キーボード９０といったユーザー入力デバイスが含み、さらにポインティングデバイス９２及びスキャナ９３が含まれていてもよい。ポインティングデバイスは、マウス、トラックボール、タッチパッド又はグラフィクスタブレットといったような間接的ポインティングデバイスであっても、又は表示装置内に内蔵されるタッチスクリーンといったような直接的ポインティングデバイスでもよい。音声認識システムといったようなその他のタイプのユーザー入力デバイスも可能である。カメラ３２は、入力装置の部分とみなすことができる。表示サブシステム７２は、標準的に、表示コントローラ９４及び表示コントローラに結合された表示デバイス９５を含む。表示デバイスは、陰極線管（ＣＲＴ），液晶表示デバイス（ＬＣＤ）といったフラットパネルデバイス又は投影デバイスでもよい。表示コントローラは、表示デバイスに対する制御信号を提供し、通常表示デバイス上に現われる画素を記憶するための表示メモリ（図示せず）を含んでいる。表示サブシステムは同様に音声出力といった非視覚的表示を提供することもできる。ファイル記憶システムは、プログラム及びデータファイルのための持続性（不揮発性）記憶装置を提供し、標準的には、少なくとも１つのハードディスクドライブ９６及び少なくとも１つのフロッピーディスクドライブ９７（そして付随する取外し可能な媒体）を含む。さらに、ＣＤ−ＲＯＭドライブ９８及び光ドライブ（その全てが付随するその取外し可能な媒体を伴う）といったその他のデバイスが存在していてもよい。さらに、システムは、取外し可能な媒体カートリッジを伴うタイプのドライブを含むことができる。この取外し可能な媒体カートリッジは、例えば、Syquest、Iomege及びその他の会社が市販しているようなハードディスクカートリッジ及びIomegeその他が市販しているようなフレキシブルディスクカートリッジであってよい。上述のように、一つ又はそれ以上のドライブが、ローカルエリアネットワーク上のサーバー内又はインターネットのワールドワイドウェブ上の一つのサイトといったように遠隔場所に配置されていても良い。５．処理の概略説明図３は、高レベルで、本発明の特定の実施形態において実行される一連のオペレーションを示すフローチャートである。上述の通り、本発明は、サンプル中の特定の対象物体を発見することに向けられている。特定の応用として、対象物体は、母親の血液サンプル中の胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）である。濃縮にもかかわらず、ＮＲＢＣの数は、無核赤血球（ＲＢＣ）及び有核白血球（ＷＢＣ）に比べ少ない傾向にある。分析は、細胞質の領域を示すものと核を示すものという２つの異なるコントラストで画像を生成するステップ１２０で始まる。上述の通り、これら２つのコントラストは、細胞質を優先的に染色する（青色）染料による透過可視（赤色）光の吸収及び、螢光染料ＤＡＰＩにより染色された細胞核からの螢光発光から生じるものである。さらに前述の通り、２つの画像は、２つの光源に対しサンプルを逐次的に露光することの結果として別途取得した画像から生成されてもよいし、或いは又両方の光源により同時に照明されたサンプルを用いて、取得した単一の画像から生成されてもよい。画像は、スライド上の複数のフィールドの各々について生成される。１つのフィールドは、標準的に５１２×５１２であるＣＣＤ画像化アレイ上の画素数に対応し、スライド上には、標準的に数百又は数千のフィールドが存在する。これは、サンプルの平面内で両方の軸に沿ってサンプル載物台１１をステッピングさせることによって達成される。対象物体が、画像フィールドの比較的小さい分級（ fraction）を占有する傾向があることから、対象物体を含有することについての候補である各フィールドの部分を迅速に決定するステップ１２５を実行することが好ましい。この方法においてその後に続く処理ステップが、画像に適用されるものとして列挙されているが、その処理ステップは標準的には、各フィールドの候補領域にのみ適用されるものと理解すべきである。個々の画像は、対象物体が存在するか否かを見極めるため、ステップ１３５において相関され又は組合せされる派生的画像（マスク）を提供するべくステップ１３０で別々に処理される。かくして、この方法は対象物体を含有することが予想されているサンプルの領域の場所を示し、物体をステップ１４０においてさらなる分析に付すことを可能にした。例えば、続く分析段階では、コンピュータは、サンプルを手動式検査又はさらなるコンピュータ化した処理のためにこれらの場所に進めるために載物台を制御することができる。かくして、この方法の結果は、物体の特定クラスに入るものとして１つの画像を受け入れ、他のコントラスト、例えば、ＦＩＳＨ分析のための他の螢光色についてより詳細に計数され、又は検査されることである。６．画像の収集６．１．逐次的画像収集サンプルの逐次的照明を用いて、別々の明視野及び螢光画像が全てのフィールド上で取得される。吸収画像については、外部照明は、励起フィルタホイールの不透明セグメントにより遮断され、可視光源４５は、赤色光を供試体を通してカメラまで送る。吸収画像は、抗体染色について陽性である物体を示す。螢光画像については、透過照明は遮断され、供試体は、対物レンズを通して下降するＵＶ光源２５からの光によって励起される。螢光画像は、フィールド内の全ての核を示す。胎児ＮＲＢＣは、吸収画像内に暗い細胞質を有し螢光画像内に明るい核を有する物体である。６．２．同時画像収集図４Ａは、サンプルの同時照明を用いて図３のステップ１２０を実施するために実行されるステップを示すフローチャートである。参照番号１２０’はこの変形形態を表わすのに用いられている。同様に示されているのは、各ステップにおける画像の小さな部分の非常に様式化された図である。これらの様式化された図は、３つのレベルすなわち、黒、白そして灰色（クロスハッチングによって表わされている）を示している。物体は、円形形状をもつものとして示されている。ステップ１４５では、サンプルが赤色光により透過照明され同時にＵＶ光により外部照明されている状態で、単一画像が取得される。両方の照明システムの光の強度は、空の背景（empty background）が中間レベルの灰色に対応するように平衡される。抗体染色された物体（細胞質）は、背景よりも暗く見え、ＤＡＰＩ染色された物体（核）は背景よりも明るく見える。図４Ｂは、胎児ＮＲＢＣを通しての組合された光強度プロフィールであり、細胞質内での著しい下降、核内での上昇そして細胞質内でのもう１回の下降を示している。概略的表示においては、画像は、核（図中白色）をとり囲む細胞質（図中黒色）をもつＮＲＢＣ，及び周囲の細胞質の無いもう１つの核（図中白色）を、全て灰色背景（図中ハッチング付き）に対して示している。２つの画像は、光学的に組合されていることから、これらをディジタル的に分離する必要がある。この目的に向かっての第１段階として、背景の灰色レベルがステップ１５０で決定される。特定の１実施形態においては、モードが使用される。かくして、フィールド全体が測定され、考えられる各々の強度レベルにおける画素数のヒストグラムが構築される。ヒストグラムは、隣接平均化により平滑化され、ヒストグラム内の最高のピークの頂点に対応する強度が、光強度の背景値として規定される。中間レベルの灰色を特定するために平均画素値を使用することも可能であろう。組合された画像は、ステップ１５５において、抗体吸収を特徴づけする背景以下の成分とＤＡＰＩ螢光発光を特徴づけする背景以上の成分に分けられる。これは、ステップ１５０で決定された背景値を１画素毎のベースでその画像と比較することによって達成される。このプロセスは、飽和を伴う減算と類似している。こうして、基本的に単一画像から解像された２つの別々のコントラストであり、正及び負に進む別々の画像が生成される。このプロセスは、図４Ｂを参照すると、以下の通りであることがわかる。吸収画像については、全ての画素に対して、最大強度値（２５５）と背景強度値の間の差異に対応する値を付加する。これは、細胞質を近黒色（near-b lack）から中間灰色まで領域を通って上昇させ、背景を白色又は近白色（near-w hite）レベルまでもち上げ、さらに螢光ピークを白色でクリッピングする効果をもつ。螢光画像については、全ての画素から背景強度値を減算し、かくして螢光ピークを中間灰色まで下げ、背景を黒色又は近黒色レベルまで下げ、細胞質領域を黒色までクリッピングする。６．３．相対的長所同時照明及び画像取得は、速度の面（取得すべき画像が１つしかなく、各フィールドについてのフィルタ切換えが全くないため）及び顕微鏡下で人間が容易にＮＲＢＣを認識できるという面で利点を有する。一方、その欠点は、細胞定着（ fixation）及びＤＡＰＩ画像の鮮鋭度についての必要条件がより厳しいものであるという点にある。核対比染色画像が不鮮明であり細胞質と重複する状況が存在する。この場合、同時照明は、両方のコントラストをキャンセルし、逐次方法を使用しなければならない。しかしながら、サンプルからカメラまでの光路内の要素のいずれも移動する必要がなく、従ってさらなる処理のための別々の画像の位置決めの容易さが高められることから、逐次的画像取得のために、光学的構成はなおも有利なものであるということを認識すべきである。当然のことながら、単一の組合された画像から２つの画像が生成された場合、これらは自動的に位置決めされている。７．画像の処理及び相関７．１．対象物体を潜在的に含む領域の発見上述の通り、対象物体を含有する確率が高いとみなされている画像（又は画像フィールド）の領域に、さらに精密な処理を制限することが好ましい。サンプル中のＮＲＢＣは、胎児ヘモグロビンを含有する細胞質によりとり囲まれた核を有する。画像内では、このことは、吸収特長及び螢光発光特長の重複していること又はきわめて近接していることへとつながる。両方の特長を含むそれぞれの画像内の対応する領域を発見するためには、その画像がもつ他と区別される特長について画像のうちの１つを走査することが必要である。１つの画像の走査がひとたび候補領域のセットを生み出したならば、それらがその他の画像の他と区別される特長を含んでいるか否かを決定するには、その他の画像内の対応する領域を走査することが必要なだけである。このことは、より少ない特長しか含まないと予想されている画像がまず最初に走査される場合に、さらに効率の良いものとなる。例えば、螢光画像内の螢光発光特長に比べ吸収画像内の吸収特長が著しく多い場合には、螢光画像をまず最初に、特長について走査すべきである。この順序は、ユーザーによって決定されるか又は、実行すべき走査タイプの関数として自動的にセットされてよい。物体タイプの相対度数は、標準的には、サンプルの調製（例えば濃縮度）によって左右される。図５は、図３のステップ１２５を実現するために実行できるステップを示すフローチャートである。プロセス全体の中のこの時点では、別々の光学画像から取得されたか又は図４Ａ及び４Ｂに示されているように単一の光学画像から電子的に分離された、別々の吸収及び螢光画像がすでに提供されている。その特徴づけられた特長を比較的少なく有すると予想されている画像は、「第１」の画像と呼ばれる。ステップ１６０では、第１の画像内のすべての画素に基づいて、第１の画像の背景が決定される。第１の画像が螢光画像である場合、背景値は、画像内の最も暗い（最低の強度値の）画素の値に等しくセットされる。ステップ１６２では、この背景は、画像内の全ての画素から減算される。ステップ１６５では、２進画像を生成するため、その画像についてのしきい値に対し全ての画素が比較される。１つの画素は、それがしきい値より上にある（螢光画像）か又はしきい値より下にある（吸収画像）場合に「オン」であるとみなされる。この段階では、特長の精確なアウトラインを見極めようとすることなく、特長が存在するか否かを知ることのみが望まれることから、しきい値は比較的高い。ステップ１６７では、可能性ある物体の存在を表明するのに充分大きな連結成分（すなわち充分な数の連結されたＯＮ画素のインスタンス）の場所を見極めるため、画像が分析される。これは、当業者にとっては既知の技術に従ったブロブエコー分析(blob analysis)を用いて行なわれる。第１の画像内の連結成分をとり囲む領域は、候補領域セットを規定する。これらの領域は、５１２×５１２フィールドよりもはるかに小さく、標準的には、例えば３２×３２画素又は６４× ６４画素といった、規定されうる画素の最も小さい適切な正方形である。ステップ１７０では、候補領域セットのための座標がさらなる分析のために記憶される。前述のように、さらなる処理は、好ましくはこれらの領域に限定される。７．２．マスクの新規作成図６は、図３のステップ１３０及び１３５を実現するために実行できるステップ、すなわち核コントラスト及び細胞質コントラストを表わす２つの別々のマスクの構築に導く１セットの特長のために２つの画像を別々に処理する段階を示すフローチャートである。この段階における入力は、ステップ１６２及び１７２で減算された状態にある背景を用いて、ステップ１２０で生成された細胞質及び核画像である。前述の通り、さらなる処理は、ステップ１２５で識別された画像領域についてのみ行なわれる。ステップ１８０では、画像は、さらなる背景減算オペレーションに付されるが、ここでは、背景は領域毎のベースで決定される。ステップ１８２では、画像は、２進マスクを作成するようしきい値演算される。細胞質画像については、しきい値より暗い画素がオン（図中白色）にセットされ、しきい値より暗い画素がオフ（図中黒色）にセットされる。核画像については、しきい値より明るい画素がオン（白色）にセットされ、しきい値より暗い画素がオフ（黒色）にセットされる。グレースケール画像を検分する場合には、画像内の特長が重複するか否かの概念は、むしろ主観的なものとなる傾向をもつ。画像がひとたびしきい値演算されて２進画像が生成された時点で、分離を直接数量化することができる。２進画像を作成するのに用いられるしきい値及び物体の幾何形状に基づいて、オブザーバーにとって主観的にグレースケール画像内で重複すると思われる特長は、２進画像内できわめて近接しているものの、互いに共通要素をもたない可能性がある。このとき、１つの重複ひいては対象物体についての候補を表わすとなおもみなされることになる（２進画像内の）特長の最大の分離を規定づけすることが可能である。対象細胞の明確な特長は、抗体陽性及びＤＡＰＩ陽性領域が重複していること又はきわめて近接していることである。これらの重複又は近接性を発見するために、２進マスクはステップ１８５で、第１のセットの形態画像処理ステップ〔Se rra ８９〕を受ける。特に、画像は、識別されて局所に制限された特長の一部を成していない小さなランダムシグナルを除去するべく形態的に「開放される」（ open）。開放は、実際にはフィルタリングプロセスである。開放されたマスクは次に、形態的に「膨張され」（dilate）、このことは各々の残りの特長（図中白色として示されているオン画素の領域）を全ての方向に指定量だけ拡張させる効果をもつ。膨張が、穴（オン画素の領域により囲まれているか又はその中に侵入するオフ画素の領域）を収縮させる効果をもつことをに留意されたい。指定拡張量は、形態的膨張オペレーションにより決定される。より特定的に言うと、オン画素の領域の縁部が膨張によって拡張される程度は、構造化要素(str ucturing element)と呼ばれるもののサイズによって決定される。かくして構造化要素のサイズは、特長が分離されかつそれでもなお「重複」とみなされうるような量を考慮に入れて選択される。これは、画像倍率の関数である。１画素だけ境界を移動させる構造化要素が１０倍〜２０倍の倍率でうまく動作することがわかっている。このことはすなわち、ちょうど接触する２つの物体が、膨張されたとき、２画素の重複を有することを意味している。構造化要素について適切なサイズは、直接的な要領で経験的に決定される。例えば、特長がグレースケール画像内で重複すると思われる代表的物体サンプルを、しきい値演算に付し、２進画像中の分離の分布を決定することができる。さらに、結果が構造化要素のサイズにさほど敏感でないこともわかっている。例えば、２つの画素による拡張も適切であろう。ステップ１９０では、真の重複特長を発見するべく開放され膨張されたマスクは、組合わされるか又は同じフィールド上で重複させられる。これは、２つのマスクが重複する場所の縁のみを残す論理積演算である。これは同様に、２つのマスクの交差とも呼ばれる。ステップ１９５では、交差マスクは、シード画像を生成するべく形態的に膨張される。ステップ２００では、最終的に２つの画像内の真の細胞質及び核領域を識別するためこのシード画像が使用される。これは、ステップ１８５に入力された細胞質及び核コントラスト画像内でシードを再構築することによって行なわれる。図を見ればわかるように、周囲の細胞質を有していた核のみが、最終的マスク内に現われる。８．作業の流れ及び性能スライドの分析のための作業の流れは、走査、再検分、及びプローブ取得（ＦＩＳＨ）という３つの主要段階から成る。第１段階は、１枚のスライドで始まり、検出された物体の画像及び測定値を含むデータファイルを生成する。第２の段階では、オペレータは、走査の結果を再検分し、細胞を分類し注釈付けし、プローブ取得のため対象細胞を選択する。再検分はまずスクリーン画像から行なわれるが、直ちにリロケートし顕微鏡の下で検査するためにスライドを利用することができる。最後に、選択された細胞のプローブ画像が取得され、プローブスポットが計数される。再検分のための情報を提示する主要な形態は、画像、測定された特長、分類及び注釈を含むデータグリッド（grid）である。図７は、各々のＮＲＢＣについて生成され記憶される代表的データセットを示している。軸の比率というのは〔０〜１００〕の範囲で正規化され、短い主慣性軸(main inertia axis)対長い主慣性軸の比率である。小さい値は、細長い形状に典型的であり、大きい値は、画像においてより一層円形に近いと思われる物体に典型的なものである。コンパクト性というのは、所定の形状と同じ面積をもつディスクの慣性モーメント対その形状の慣性モーメントの比率である。この比率は〔０〜１００〕の範囲で正規化される。小さい値は、輪状、星状又は不規則形状に典型であり、大きい値は、コンパクトで丸い物体に典型的である。走査をセットアップするために、ユーザーは以下の作業を行なう。スライド上の実際の塗抹サンプルの場所に対応するよう走査領域を規定する。代表的フィールドを選択し、走査で使用されるフィルタの各々について画像デジタル化パラメータを調整する。（時としてディジタイザ調整は、較正スライド上で行なわれる。）選択されたフィールド上で発見アルゴリズムを実行し、必要とあらばパラメータを調整する。将来における正確なリロケーションに備えて基準点の位置をセットする。走査に名前を付け、走査を開始する。走査は、物体を見、走査を再開する前にパラメータを再調整するために、任意の時点で中断することができる。走査が完了した後、ユーザーは再検分に戻る。物体を、任意の回数だけ再アクセスすることができ、そして複数の画像のグループを各物体について取得することができる（例えば、走査からの原画像、より高い倍率での同じフィルタ画像、及びプローブ画像）。各々の画像グループは異なる形で示すことができる（例えば、モノクロ、カラー、又はその両方で）。再検分プロセスは、測定された特長のうちの任意の２つの２次元分布プロットにより補助される。分布内の各々のクラスは、異なる色で示され、表示は、フロー・サイトメトリにおけるものに似ている。記憶された細胞画像、特長空間内での細胞分布及び顕微鏡リロケーションの間での視野の切換えは瞬間的なものである。もう１つの有用な機能は、測定された特長の線形組合せによる選別にあり、最も確率の高い候補を第１にする順序で再検分のため細胞が提示される。再検分の結果は、プローブ取得のための細胞の分類及び選択である。この時点で、発見アルゴリズムは、（アルゴリズム及びそのパラメータによって規定される）１つのクラスの物体を探索するように設計され、特長空間内にはさらなる自動的な分類は全くない。分類はユーザーにより手動式に行なわれる。１つの特長組合せ、すなわちＤＡＰＩ螢光発光及びＨｂＦ抗体吸収の重複についての探索は強力であることが実証されており、わずかな細胞しか欠けない（３％未満）。偽陽性は、ＲＢＣ，ＷＢＣ及びデブリの重複である。偽陽性からＮＲＢＣを分離するためには、次のパラメータ、すなわち、核及び細胞質内の平均及び総合的強度、及び核及び核と細胞質の合体物の面積及び形状が用いられる。４cm²（標準的塗抹サンプル）を走査するための速度は（１０倍の倍率で）１/ ２時間である。平均リロケーション誤差は２mm（最大４mm）である。プログラムは、訓練されたオペレータによって発見されたＮＲＢＣの９７．２％を発見する。結論としては、本発明が、１つの画像中の対象物体を効率良くしかも高い信頼性で識別するための方法及び装置を提供していることがわかる。本発明に従ったシステムは、特定の実施形態において、オペレータによる対話型の再検分、分類及び選択を用いて、自動化された細胞発見、細胞画像及びそのスライド座標の記憶を提供している。本発明は、供試体間の高い変動性に直面しても強力であり、染色強度及びプローブの輝度の差異、スライド上の細胞付着タイプ（塗抹サンプル又はサイトスピン）、細胞密度、異なるサンプル種類及び異なる細胞型の有病率に適合する。以上に記したのは、本発明の特定の実施形態の完全な記述であるものの、さまざまな修正、代替的構成及び等価物を使用することができる。例えば、ＵＶ励起のために外部照明を備えることが好ましいが、ＵＶ励起に透過照明を用いることも可能である。同様に、特定の実施形態は、標準的顕微鏡をベースにしていたが、特別構成の光学的セットアップを用いて本発明を実施することも可能である。従って、上述の記述は、クレームにより規定されている本発明の範囲を制限するものとみなされるべきものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/49 Ｇ０１Ｎ 33/49 ＨＧ０２Ｂ 21/08 Ｇ０２Ｂ 21/08 21/16 21/16 21/36 21/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプル中で他の物体と共に散在している対象物体を発見する方法であって、複数の異なる照明スキームの下で画像化媒体上で画像化されたとき、対象物体が他の物体により示される特長の組合せとは異なる特定の組合せと呼ばれる特長の組合せを示すように、物体が光学性質を有しているサンプルを提供する段階と、前記サンプルを複数の照明スキームに付す段階と、対応する複数の画像を生成する段階と、及び異なる画像からの特長の前記特定の組合せが、予め定められた近接拘束を満たしているインスタンスを決定するため、前記複数の画像を分析する段階と、を含み、前記サンプルは、前記サンプルと前記画像化媒体の間の経路内へ又はそこからいかなる光学要素も移動させることなく、複数の異なる照明スキームの下で前記画像化媒体上で画像化される前記方法。２．所定時点で複数の前記照明スキームのうちのそれぞれ１つのみで別々に前記複数の画像が取得される請求項１に記載の方法。３．前記複数の画像は、より少ない数の画像から引き出され、このより少ない数の画像の各々が同時に有効な前記照明スキームの組合せで得られる請求項１に記載の方法。４．第１及び第２の画像が、第１及び第２の照明スキームに対応する特長がそれぞれ背景レベル以上及び以下の強度となるように、前記第１及び第２の画像に対応する前記照明スキームを構成する段階と、及び背景領域が一般に最低の強度となるように、第１の量だけ単一画像内の各々の画素値を低減させることによって第１の画像を生成する段階と、及び背景領域が一般に最高の強度となるように第２の量だけ単一画像内の各画素値を増大させることによって第２の画像を生成する段階と、によって前記単一画像から引き出される請求項３に記載の方法。５．前記複数の画像の分析には、特長を含む特定の画像の領域セットを見い出すため前記複数の画像のうちの特定の１つの画像を検査する段階と、及び前記複数の画像の対応する領域のみを分析する段階と、が含まれている請求項１に記載の方法。６．前記複数の画像の分析には、前記画像内の特長の存在を表わす領域内にＯＮ画素を有するそれぞれの２進マスクを作成するため各画像にしきい値を適用する段階と、連結されたＯＮ画素の領域を拡張するべく各マスクを形態的に処理する段階と、及び前記画像内に存在する特長の重複又は近重複領域を規定するためマスクの論理積をとる段階と、が含まれる請求項１に記載の方法。７．前記対象物体が、胎児有核赤血球（ＮＲＢＣ）であり、他の物体には、無核赤血球ＲＢＣ）及び有核白血球（ＷＢＣ）が含まれ、前記サンプル中の物体は、核を選択的に染色する螢光染料及び胎児ＲＢＣの細胞質内で胎児ヘモグロビンを選択的に染色する染料で染色され、複数の異なる照明スキームには、染色された細胞核からの螢光発光を提供するためのＵＶ励起及び染色された細胞質により吸収された光の明視野透過が含まれ、特長の特定の組合せが、ＵＶ励起に応じて細胞核による螢光発光及び明視野照明の胎児ヘモグロビンによる吸収をするものである請求項１に記載の方法。８．付加的な物体を含有するサンプル領域内で胎児有核赤血球を検出する方法であって、胎児ＲＢＣの細胞質内の胎児ヘモグロビンを優先的に染色する第１の染料及び細胞核を優先的に染色する第２の染料で染色されたサンプルを提供する段階と、前記第１の染料により吸収される波長範囲内の第１の光でサンプルを透過照明する段階と、前記第２の染料が螢光発光し第３の光を放出するように第２の光でサンプルを同時に照明する段階と、前記サンプル内を通過する第１の光及び前記サンプルにより放出された前記第３の光の単一画像を形成する段階と、及び染色された細胞質及び核の両方を有する細胞を識別するため前記単一画像を処理する段階と、を含んで成る方法。９．前記単一画像を処理する段階には、前記単一画像について背景レベルを決定する段階と、背景領域が一般に最低の強度となるように第１の量だけ前記単一画像内の画素値を低減させることによって核画像を生成する段階と、背景領域が一般に最高の強度となるように第２の量だけ単一画像内の画素値を増大させることによって細胞質画像を生成する段階と、細胞質の存在を示す領域を有する細胞質コントラストマスクを生成するため細胞質画像を処理する段階と、細胞核の存在を示す領域を有する核コントラストマスクを生成するため核画像を処理する段階と、可能性ある胎児有核赤血球の存在を表わすため核コントラストマスク内の連結されたＯＮ画素の領域に充分近い細胞質コントラストマスク内の連結されたＯＮ画素の領域を決定するために、前記核コントラストマスクと前記細胞質コントラストマスクを組合わせる段階と、が含まれている請求項８に記載の方法。 10．前記核及び細胞質画像の処理段階には、特長を含む前記核及び細胞質画像のうちの１つの画像の領域セットを見い出すため、前記核及び細胞質画像のうちの１つを検査する段階と、及び、前記核及び細胞質画像のうちのもう１方の画像の対応する領域のみを処理する段階と、が含まれている請求項９に記載の方法。 11．前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスクが、前記連結ＯＮ画素の領域を拡張するため各マスクを形態的に処理する段階と、及び前記画像内に存在する特長の重複又は近重複領域を規定するため、形態的に処理された状態のマスクの論理積をとる段階と、によって組合わされる請求項９に記載の方法。 12．前記単一画像を処理する段階には、細胞質の存在を表わす領域を有する前記細胞質コントラストマスク及び細胞核の存在を表わす領域を有する前記核コントラストマスクを生成する段階と、前記連結ＯＮ画素の領域を拡張するため各マスクを形態的に処理する段階と、交差画像を生成するため前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスクの間で論理積演算を行なう段階と、及び、前記第１の染料で染色された細胞質及び前記第２の染料で染色された細胞核を含む領域を特定するマスクを提供するため、前記交差画像及び前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスクを処理する段階と、が含まれている請求項８に記載の方法。 13．付加的な物体を含有するサンプル領域内で胎児有核赤血球を検出する方法であって、細胞質を優先的に染色する第１の染料及び細胞核を優先的に染色する第２の染料で染色されたサンプルを提供する段階と、前記第１の染料により吸収される波長範囲内の第１の光で前記サンプルを透過照明する段階と、前記サンプル内を通過する前記第１の光の第１の画像を形成する段階と、細胞質の存在を表わす領域を有する細胞質コントラストマスクを生成するため第１の画像を処理する段階と、前記第２の染料が螢光を発し第３の光を放出するように第２の光で試料を照明する段階と、前記サンプルにより放出された前記第３の光の第２の画像を形成する段階と、細胞核の存在を表わす領域を有する核コントラストマスクを生成するため第２の画像を処理する段階と、可能性ある前記胎児有核赤血球の存在を表わすため前記核コントラストマスク内の連結されたＯＮ画素の領域に充分近い前記細胞質コントラストマスク内の連結された前記ＯＮ画素の領域を決定するため、前記核コントラストマスクと前記細胞質コントラストマスクを組合わせる段階と、を含んで成る方法。 14．所定時点で前記サンプルを照明する前記第１及び第２の光のうちのそれぞれ１方のみで別々に前記第１及び第２の画像が取得される請求項１３に記載の方法。 15．前記サンプルを同時に照明する前記第１の光及び第２の光で得られた単一画像から前記第１及び第２の画像が誘導される請求項１３に記載の方法。 16．前記第１及び第２の画像が、螢光発光及び吸収に対応する特長がそれぞれ背景レベルより上及び下の強度となるように前記第１及び第２の光の照明を構成する段階と、及び背景領域が一般に最低の強度となるように第１の量だけ前記単一画像内の各々の画素値を低減させることによって前記第１の画像を生成する段階と、及び背景領域が一般に最高の強度となるように第２の量だけ前記単一画像内の各画素値を増大させることによって前記第２の画像を生成する段階と、によって前記単一画像から引き出される請求項１５に記載の方法。 17．前記細胞質コントラストマスクを生成するため前記第１の画像を処理する段階には、その画像内の特長の存在を表わす領域内にＯＮ画素を有する２進マスクを作り出すため前記第１の画像にしきい値を適用することが含まれている請求項１３に記載の方法。 18．前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスクを組合わせる段階には、連結ＯＮ画素の領域を拡張させ、かくして処理済みマスクを生成するため、各マスクを形態的に処理する段階と、及び画像内に存在する特長の重複又は近重複領域を規定する交差画像を生成するため、前記処理済みマスクの論理積をとる段階と、が含まれている請求項１３に記載の方法。 19．連結ＯＮ画素の領域を拡張させ、かくしてシード画像を生成するため、前記交差画像を形態的に処理する段階と、及び胎児有核赤血球である可能性の高い物体について細胞質及び核を表わすため、前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスク内で前記シード画像を再構築する段階と、をさらに含む請求項１８に記載の方法。 20．付加的な物体を含有するサンプル領域内で胎児有核赤血球を検出する方法であって、胎児細胞質を優先的に染色する第１の染料及び細胞核を優先的に染色する第２の染料で染色されたサンプルを提供する段階と、前記第１の染料により吸収される波長範囲内の第１の光で前記サンプルを透過照明する段階と、前記第２の染料が螢光を発し第３の光を発出するように第２の光で前記サンプルを同時に照明する段階と、前記サンプル内を通過する前記第１の光及び前記サンプルにより発出された前記第３の光の単一画像を形成する段階と、前記単一画像のための背景レベルを決定する段階と、背景領域が一般に最高の強度となるように第２の量だけ前記単一画像内の画素値を増大させることによって細胞質画像を生成する段階と、前記第１の染料によって染色された物体の存在を表わすＯＮ画素をもつ領域を有する２進細胞質コントラストマスクを作り出すため細胞質画像をしきい値演算する段階と、背景領域が一般に最低の強度となるように第１の量だけ前記単一画像内の画素値を低減させることによって核画像を生成する段階と、前記第２の染料によって染色された物体の存在を表わすＯＮ画素をもつ領域を有する２進核コントラストマスクを作り出すための核画像をしきい値演算する段階と、連結ＯＮ画素の領域を拡張させかくして処理済みマスクを生成するため各マスクを形態的に処理する段階と、前記第１の染料により染色された細胞質画像内の物体及び前記第２の染料により染色された核画像内の物体の重複又は近重複領域を規定する交差画像を生成するため処理済みマスクの論理積をとる段階と、連結ＯＮ画素の領域を拡張し、かくしてシード画像を生成するため、交差画像を形態的に処理する段階と、及び胎児有核赤血球である可能性の高い物体について細胞質及び核を表わすため前記細胞質コントラストマスク及び前記核コントラストマスク内で前記シード画像を再構築する段階と、を含む方法。