WO2016021310A1 - 胎児の染色体の検査方法 - Google Patents

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fetal
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福井　真一郎
靖幸 石井
兼太 松原
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富士フイルム株式会社
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    • G01N2021/3129—Determining multicomponents by multiwavelength light
    • G01N2021/3133—Determining multicomponents by multiwavelength light with selection of wavelengths before the sample

Definitions

  • the present invention relates to a method of testing a chromosome of a fetus, and more particularly to a method of testing a chromosome of a fetus to be tested using erythrocytes derived from a fetus collected from the blood of a pregnant mother.
  • amniotic fluid test is conventionally performed to examine the chromosomes of fetal cells in amniotic fluid by amniocentesis.
  • this method the possibility of miscarriage is pointed out as a major problem.
  • maternal blood can be used to reproducibly and reliably analyze chromosomal DNA (deoxyribonucleic acid) of fetal cells in maternal blood, a safe prenatal diagnosis with low possibility of abortion is realized. It will be possible to do.
  • Patent Document 1 and Non-patent Document 1 described below use a method of concentrating nucleated red blood cells, for example, density gradient centrifugation to remove plasma components and maternal red blood cell components.
  • Technology technology to separate mother's white blood cells by magnetism (MACS method: Magnetic activated cell sorting) by using antibody that specifically immunoreacts to protein on white blood cell surface (MACS method: magnetic activated cell sorting specifically)
  • AMS method Magnetic activated cell sorting specifically
  • Acquisition of nucleated red blood cells which are fetal cells in maternal blood, is performed using techniques such as fluorescence activated cell sorting (FACS method) that separates fetal nucleated red blood cells using an antibody and a fluorescent dye. .
  • FACS method fluorescence activated cell sorting
  • Non-Patent Document 2 discloses a method of concentrating nucleated red blood cells derived from a fetus and identifying the nucleated red blood cells derived from a fetus from morphological information of cells.
  • Patent Document 5 amplifies the chromosomes of the fetal cells and determines the amount of amplification product, and the disease caused by chromosomal imbalance A method of detecting chromosomal abnormalities in the fetus.
  • JP-A-2010-525832 Japanese Patent Application Publication No. 2002-514304 Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-115346 JP, 2014-14485, A Japanese Patent Publication No. 2004-531271
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and it is a fetus that can reliably obtain fetal nucleated red blood cells from maternal blood and efficiently test fetal nucleated red blood cells in a short time.
  • the purpose is to provide a chromosome inspection method.
  • the present invention provides a collection step of obtaining maternal blood from a pregnant mother, a concentration step of concentrating nucleated red blood cells in maternal blood, and a maternal blood in which nucleated red blood cells are concentrated by the concentration step.
  • a nucleated red blood cell derived from a mother and a nucleated red blood cell derived from a fetus contained in a pregnant mother are shaped as a nucleus and in a light wavelength range of 400 to 650 nm.
  • the sorting step comprises a first sorting step of sorting nucleated red blood cell candidates by at least a shape of a nucleus, and a nucleated red blood cell candidate sorted by the first sorting step according to spectral characteristics. And a second sorting step of sorting.
  • the selection step includes the first selection step including the step of selecting nucleated red blood cell candidates according to the shape of the nucleus, and the second selection step of selecting the nucleated red blood cell candidates according to the spectral characteristics. Therefore, by selecting nucleated red blood cells by different methods, it is possible to reliably select fetal nucleated red blood cells. Further, in the first sorting step, by performing sorting according to the shape of the nucleus, it is possible to remove red blood cells without nuclei, and it is possible to sort nucleated red blood cells. By selecting nucleated red blood cells and then selecting nucleated red blood cells of fetal origin and nucleated red blood cells of maternal origin by spectral characteristics, it is possible to efficiently select nucleated red blood cells of fetal origin.
  • the area of the cytoplasm of the cell to be a nucleated red blood cell candidate is C
  • the area of the nucleus of the cell to be a nucleated red blood cell candidate is N
  • the area of the cell is
  • formulas (1) also referred to as formula 1
  • (2) also referred to as formula 2
  • the first sorting step further comprises two steps, the first step extracting cells possibly having a nucleus, and the second step being a first step It is preferable to select nucleated red blood cell candidates from the cells extracted in the step according to formulas (1) and (2).
  • the first sorting step further comprises two steps, and coarse screening is performed by extracting cells possibly having a nucleus in the first step, and the above-mentioned (1
  • shape information based on the expression (2) it is possible to more reliably select nucleated red blood cells of fetal origin.
  • the first step for example, brightness information of an image obtained by photographing the cells with white light is binarized with a predetermined threshold, and binary The dot-like and island-like continuous regions are extracted from the transformed image. Then, in the continuous region, one having a size of 1 to 5 ⁇ m is taken as a region which may be a cell nucleus, and cells containing the region are taken as cells which may have a cell nucleus.
  • the size may be, for example, the major axis of the minimum ellipse circumscribing the continuous region.
  • the binarized image may be subjected to morphological processing such as Erosion • Dilation to adjust the shape of the continuous region, and then the size may be determined.
  • the spectral characteristic is preferably an absorption coefficient.
  • sorting can be performed using the difference between the absorption coefficients of oxygenated hemoglobin and reduced hemoglobin contained in the red blood cells.
  • the sorting step comprises: a wavelength of a first light wavelength range in which the absorbance of fetal-derived nucleated red blood cells exceeds the absorbance of maternal-derived nucleated red blood cells; and the absorbance of maternal-derived nucleated red blood cells It is preferable to measure the absorbance of nucleated red blood cells at each of at least two types of wavelengths, including a wavelength of a second light wavelength range that exceeds the absorbance of fetal-derived nucleated red blood cells.
  • the wavelength used in the selection step is a first wavelength range in which the absorbance of fetal-derived nucleated red blood cells is higher than the absorbance of maternal-derived nucleated red blood cells;
  • the absorbance of fetal derived nucleated red blood cells at each wavelength of absorbance The size will be reversed by the absorbance of maternally-derived nucleated red blood cells.
  • the difference between maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells can be clarified, and maternal nucleated red blood cells and fetal origin Nuclear red blood cells can be sorted.
  • the difference in absorbance ratio can be increased by selecting the ratio of absorbance measured at each wavelength.
  • the influence of noise can be reduced by measuring with three or more types of each wavelength.
  • the influence of noise can be reduced by measuring the absorbance at a plurality of wavelengths shifted from one another and setting the average value of the absorbances to be used for sorting.
  • the sorting step is carried out based on the difference in absorbance between maternally derived nucleated red blood cells and fetal derived nucleated red blood cells at two or more different wavelengths. It is preferred to rank the possibilities of nuclear red blood cells.
  • this aspect by measuring using two or more types of wavelengths, it is possible to determine the difference between fetal nucleated red blood cells and maternal nucleated red blood cells at each wavelength. Therefore, it is possible to rank the possibility of being fetal nucleated red blood cells from the difference in absorbance, and by selecting fetal nucleated red blood cells based on this ranking, a plurality of nucleated red blood cells can be sorted. From the candidate cells, it is possible to accurately select nucleated red blood cells of fetal origin.
  • the first light wavelength range is a wavelength range of more than 450 nm and less than 480 nm
  • the second light wavelength range is preferably a wavelength range of more than 550 nm and less than 575 nm.
  • This aspect specifically defines the first light wavelength range and the second light wavelength range used for the measurement of the spectral characteristics, and the absorbance can be obtained by using the wavelength of the light wavelength range of this range. Can be reversed, and differences in optical properties between maternally-derived nucleated red blood cells and fetal-derived nucleated red blood cells can be clarified.
  • the concentration step is preferably performed by density gradient centrifugation.
  • the concentration of nucleated red blood cells in maternal blood can be increased without breaking the cells.
  • the method for examining fetal chromosomes of the present invention it is possible to reliably sort maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells. Therefore, it is possible to confirm fetal genetic testing using maternal blood. Can be done efficiently.
  • FIG. 1 is a flow chart showing the procedure of the fetal chromosome inspection method.
  • FIG. 2 is a flow chart showing the procedure of the first sorting step of the sorting step.
  • FIG. 3A is a schematic view showing the shape of cells to be selected.
  • FIG. 3B is a schematic view showing the shape of cells to be removed.
  • FIG. 4 is a graph showing the absorption coefficients of reduced hemoglobin (Hb) and oxygenated hemoglobin (HbO 2 ) with respect to the wavelength.
  • FIG. 5 is a flowchart showing the procedure of the first embodiment of sorting by optical characteristics.
  • FIG. 6 is an explanatory view for explaining a method of selecting a wavelength when measuring the absorbance.
  • FIG. 1 is a flow chart showing the procedure of the fetal chromosome inspection method.
  • FIG. 2 is a flow chart showing the procedure of the first sorting step of the sorting step.
  • FIG. 3A is a schematic view showing the shape of cells to be selected.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining a method of setting a search range based on the number of reference red blood cells.
  • FIG. 8 is a flowchart showing a procedure for setting a search range based on the number of reference red blood cells.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining a method of setting a search range for reference red blood cells based on the area of nucleated red blood cells.
  • FIG. 10 is a flowchart showing a procedure for setting a search range for reference red blood cells based on the area of nucleated red blood cells.
  • FIG. 11 is a flow chart showing the procedure of the second embodiment of sorting by optical characteristics.
  • FIG. 1 is a flow chart showing the procedure of the fetal chromosome inspection method in the present embodiment.
  • the fetal chromosome inspection method according to the present embodiment includes the collecting step (step S12) of collecting maternal blood from the pregnant mother, the concentrating step of concentrating nucleated red blood cells in the maternal blood (step S14), and the concentrating step.
  • the nucleated red blood cells in the maternal blood enriched in nuclear red blood cells are sorted into maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells according to the shape of the nucleus and the spectral characteristics in the light wavelength range of 400 to 650 nm.
  • the step of determining (step S20) and the amount of the determined amplification product are derived from the fetus by comparison with the maternal chromosome or the chromosome of the fetus known to be free from abnormalities.
  • the collecting step is a step of collecting maternal blood which is a blood sample.
  • maternal blood it is preferable that it is peripheral blood of a pregnant mother without a possibility of invasion.
  • peripheral blood of the mother in addition to leukocytes such as eosinophils, neutrophils, basophils, monocytes, lymphocytes derived from mother, and mature red blood cells without nuclei, maternal derived nucleated red blood cells, And it contains nucleated red blood cells of fetal origin. Fetal nucleated red blood cells are said to be present in maternal blood from about six weeks after pregnancy. In the present embodiment in which prenatal diagnosis is performed, maternal peripheral blood is examined about 6 weeks after pregnancy.
  • Fetal nucleated red blood cells are red blood cell precursors that pass through the placenta and are present in maternal blood. During maternal pregnancy, fetal red blood cells may be nucleated. The presence of chromosomes in these red blood cells makes it possible to obtain fetal chromosomes and fetal genes by means of low invasiveness. It is said that this fetal-derived nucleated red blood cell is present in a proportion of 1 in 10 6 cells of maternal blood, and it is very unlikely to be present in maternal peripheral blood.
  • the concentration step is preferably performed by density gradient centrifugation.
  • Density gradient centrifugation is a method of separating based on the difference in density of components in blood, and centrifugation is performed by selecting the first medium and the second medium so as to sandwich the density value of the component to be separated.
  • a component of interest in this embodiment, a nucleated red blood cell derived from a fetus
  • a component of interest can be collected at the interface between the later first medium and the second medium. Then, by collecting the fraction present at the interface between the first medium and the second medium, it is possible to obtain blood enriched in nucleated red blood cells.
  • Laminating the second medium laminating the peripheral blood of the mother, which is a blood sample, on the second medium in the centrifuge tube, the first medium contained in the centrifuge tube, the second medium, and
  • a method comprising the steps of: centrifuging a blood sample; and collecting a fraction containing nucleated red blood cells from a fetus from the layer between the first medium and the second medium after centrifugation.
  • Nuclear red blood cells can be concentrated.
  • the density of maternal blood including fetal nucleated red blood cells is about 1.065 to 1.095 g / mL
  • the density of maternal blood cells is about 1.070 to 1.120 g / mL of red blood cells.
  • the concentration of mononuclear cells is about 1.060 to 1.070 g / mL.
  • the density of the medium to be stacked (the first medium and the second medium) is to separate fetal nucleated red blood cells having a density of about 1.065 to 1.095 g / mL from other blood cell components in the mother's body Is set. Since the density of the center of fetal-derived nucleated red blood cells is about 1.080 g / mL, creating a medium of two different densities sandwiching this density and layering them adjacent to each other produces the desired fetus at the interface. It is possible to collect nucleated red blood cells derived from.
  • the density of the first medium is set to 1.08 g / mL to 1.10 g / mL
  • the density of the second medium is set to 1.06 g / mL to 1.08 g / mL.
  • the density of the first medium is 1.08 g / mL to 1.09 g / mL
  • the density of the second medium is 1.065 g / mL to 1.08 g / mL.
  • plasma components, eosinophils and mononuclear cells can be obtained.
  • the first medium and the second medium may be the same type or different types, but there is no limitation as long as the effects of the present invention can be realized, but it is a preferred embodiment to use the same type of medium.
  • Percoll registered trademark
  • Percoll which is a dispersion of colloidal silica particles with a diameter of 15 to 30 nm coated with polyvinyl pyrrolidone, a side made of sucrose Media such as Ficoll®-Paque, a neutral hydrophilic polymer rich in chains, Histopaque®, a solution of polysucrose and sodium diatrizoate
  • sucrose Media such as Ficoll®-Paque
  • Histopaque® a solution of polysucrose and sodium diatrizoate
  • Percoll® and Histopaque® can be preferably used.
  • Percoll (R) is a commercially available product with a density (specific gravity) of 1.130, and can be diluted to prepare a medium of the target density (specific gravity). Histopaque® is capable of preparing the first and second media to the desired density using commercially available 1.077 density media and 1.119 density media. .
  • [Other concentration method] As a method of concentrating nucleated red blood cells, in addition to the above-mentioned density gradient centrifugation method, it is specific to CD45 (CD: Cluster of Differentiation) (classification number of monoclonal antibody based on CD classification), which is an antigen of ordinary leukocytes. It is also possible to concentrate nucleated red blood cells by separating white blood cells using binding antibodies and magnetic effect.
  • CD45 Cluster of Differentiation
  • the sorting step is a step of sorting nucleated red blood cells in the maternal blood in which nucleated red blood cells are concentrated by the concentration step, into maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells according to the shape and spectral characteristics of the nucleus. is there.
  • Peripheral blood containing nucleated red blood cells concentrated in the concentration step contains not only nucleated red blood cells but also other blood components such as white blood cells. Blood components such as white blood cells can be removed from the maternal blood by the concentration step, but it is difficult to remove them completely. Therefore, in the sorting step, the first sorting step of sorting according to the shape of nuclei, and spectroscopy According to the characteristics, selection is made, and in the second selection step, maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells are sorted.
  • the sorting step is carried out by applying peripheral blood containing nucleated red blood cells concentrated in the concentration step onto a transparent substrate, preferably a slide glass, preparing a sample for analysis, and using the sample for analysis.
  • nucleated red blood cells which are candidates for fetal-derived nucleated red blood cells, are selected from information on cell shape (hereinafter also referred to as “cell shape”) using the above-mentioned sample for analysis.
  • Examples of sorting based on cell shape information include the ratio of the area of the nuclear region to the area of cytoplasm, the degree of circularity of the nucleus, the area of the nuclear region, the brightness of the nucleus, the method of crushing the nucleus, and the like. Above all, it is preferable to select cells having the ratio of the area of the nuclear region to the area of the cytoplasm and the condition satisfying the circularity degree as a nucleated red blood cell candidate of fetal origin.
  • the area of cytoplasm and the area of the nuclear region are the areas in the observed plane of the sample for analysis.
  • FIG. 2 is a flow chart showing the procedure of an example of the first sorting step of sorting according to the shape of the cells (the shape of the nucleus) in the sorting step.
  • cells are extracted (step S32).
  • the determination of whether or not it is a cell is performed using a binarized image.
  • a binarized image is generated using a predetermined threshold value for luminance information of an image obtained by photographing a sample for analysis using a white light source, and point and island shapes are generated from the generated binarized image. Those having continuous regions, that is, regions closed with any closed curve are extracted as cells.
  • the cells extracted in step S32 are selected according to the presence or absence of a nucleus (step S34).
  • the presence or absence of the nucleus is selected based on whether or not the nucleus (dots) is present in the cell.
  • a binarized image can also be used to determine the presence or absence of a nucleus. If there is an area closed with any closed curve having an area smaller than the area extracted as cells in the area extracted as cells, the area can be extracted as a nucleus.
  • the size of the cell nucleus (the size of a dot-like and island-like continuous region) of 1 to 5 ⁇ m is extracted (step S36). Selecting cells with nuclei of 1 to 5 ⁇ m in size is effective for sorting nucleated red blood cells.
  • the size of a point-like and island-like continuous region means that the closed curve representing the outer shape of the nucleus is approximated as a circle or an ellipse, and the diameter of a circle approximating the outer shape of the nucleus or the outer shape of the nucleus is approximated. And the major axis of the oval shape.
  • An example of a circle approximating the outline of the nucleus includes the circle having the smallest diameter among the circles circumscribing the closed curve representing the outline of the nucleus.
  • the ellipse which approximated the outline of a nucleus the thing with the smallest major axis among the ellipse which circumscribes the closed curve showing the outline of a nucleus is mentioned.
  • a circular diameter approximating the outline of the nucleus, or an elliptical major diameter approximating the outline of the nucleus of 1 to 5 ⁇ m is extracted.
  • FIG. 3A is a schematic view showing the shape of cells to be selected
  • FIG. 3B is a schematic view showing the shape of cells to be removed.
  • the sorting by the shape of the nucleus a method of sorting by the ratio of the area of the nuclear region to the area of cytoplasm and a method of sorting by the degree of circularity of the nucleus will be described.
  • the ratio of the area of the nuclear region to the area of the cytoplasm satisfies the following equation (1), it is selected as a nucleated red blood cell to be a candidate for a nucleated red blood cell derived from a fetus.
  • cells having a ratio of N to C of more than 0.25 and less than 1.0 are candidates for fetal nucleated red blood cells Selected as nucleated red blood cells.
  • the selection condition of the degree of circularity of the nucleus is satisfied, there is a case where the following equation (2) is satisfied.
  • the diameter of the nucleus or the major axis of the nucleus is L
  • the ratio of the area of the nucleus to the diameter of the nucleus or the major square of the nucleus is more than 0.65 and less than 0.785. It is selected as a candidate for nucleated red blood cells.
  • the diameter of the nucleus or the major diameter of the nucleus can be determined by the same method as in the case where the size of the nucleus is determined in step S34.
  • Sorting according to the shape of the cells is performed by rough sieving in the first step of steps S32 to S36, and sorting according to the shape of the nucleus in the second step of step S38, so that the fetus is sorted by image processing
  • the number of nucleated red blood cells to be candidates for nucleated red blood cells can be reduced, and the selection of nucleated red blood cells to be candidates for fetal-derived nucleated red blood cells can be performed efficiently.
  • the sorting by shape needs to satisfy all the conditions of steps S32 to S38.
  • those which do not satisfy at least one are not selected as nucleated red blood cells to be candidates for fetal-derived nucleated red blood cells.
  • Examples of the configuration of a system for selecting nucleated red blood cells that are candidates for fetal-derived nucleated red blood cells using information on cell shape include an optical microscope, a digital camera, a stage for slide glass, an optical transfer system, and an image processing PC ( Examples include systems equipped with a personal computer, a control PC, and a display.
  • the optical conveyance system includes an objective lens and a CCD (Charge Coupled Device) camera
  • the image processing PC includes a processing system that performs data analysis and data storage.
  • the control PC has a configuration including a control system that controls the position of a stage for a slide glass and controls the entire processing.
  • FIG. 4 is a graph showing the absorption coefficients of reduced hemoglobin (Hb) and oxygenated hemoglobin (HbO 2 ) with respect to the wavelength (described in JP-A 2014-1485).
  • the absorption coefficient is a constant indicating how much light the medium absorbs when the light enters a certain medium.
  • FIG. 4 it is known that the absorption coefficient of hemoglobin changes due to the interaction with oxygen. That is, oxyhemoglobin has a red color, and becomes bluish as it becomes reduced hemoglobin.
  • fetal nucleated red blood cells are maternally derived by utilizing the difference in the oxygen affinity of hemoglobin to maternal red blood cells and nucleated red blood cells from a small amount of maternal origin.
  • the nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells are sorted. For example, by using a blood component coated on a glass substrate, the difference in spectral characteristics between nucleated red blood cells and red blood cells present in the vicinity of the nucleated red blood cells is utilized to obtain maternal derived nucleated red blood cells and a fetus It separates into nucleated red blood cells derived from.
  • the spectral characteristic is to detect a difference in a wavelength range in which a difference between absorption coefficients of reduced hemoglobin and oxygenated hemoglobin exists.
  • Hemoglobin in adult erythrocytes is tetrameric ⁇ 2 ⁇ 2 (HbA).
  • hemoglobin in fetal red blood cells is a tetrameric ⁇ 2 ⁇ 2 (HbF) formed by two ⁇ chains and two ⁇ chains, and HbA2 is composed of HbA and a small number of HbFs that account for the majority after birth. It is known to replace.
  • HbA pregnancy maternal hemoglobin
  • HbA hemoglobin contained in red blood cells in adult blood is tetrameric ⁇ 2 ⁇ 2, but fetal hemoglobin (HbF) is ⁇ 2 ⁇ 2 and has a feature that oxygen affinity is higher than HbA .
  • Peripheral blood is usually collected from a vein, and the amount of blood oxygen in the vein is less than the amount of oxygen in the artery.
  • 60-80% of central venous blood oxygen saturation is said to be normal, and this value fluctuates with the demand for systemic oxygen.
  • HbA and HbF have different oxygen affinities, so that even in venous blood, the amount of HbA bound to HbF is different, and the amount of HbF bound to oxygen is higher than the amount of HbA bound to oxygen. .
  • Maternal hemoglobin (HbA) and fetal hemoglobin (HbF) also have differences in oxygen affinity in veins, and as shown in FIG. 4, reduced hemoglobin and oxidized hemoglobin have differences in absorption coefficient, so The difference is used to sort maternal nucleated red blood cells and fetal nucleated red blood cells.
  • a light wavelength range of 400 to 650 nm is applied for the measurement of the absorbance.
  • Absorbance is measured using at least one monochromatic light having a wavelength selected from this light wavelength range.
  • the measurement of absorbance can measure the absorbance of each wavelength using a plurality of single color lights of different wavelengths, and can more reliably select nucleated red blood cells by detecting the ratio of the measured value of each wavelength .
  • the embodiment uses monochromatic light of a wavelength selected from the light wavelength range of 400 to 500 nm, more preferably monochromatic light of a wavelength selected from the light wavelength range of more than 450 nm and less than 480 nm, and more than 550 nm. It is preferable to select using the monochromatic light of the wavelength selected from the light wavelength range of less than 575 nm, respectively, according to the ratio of the absorbance of each wavelength.
  • the light wavelength range uses monochromatic light of a wavelength selected from the light wavelength range of more than 550 nm and less than 575 nm, and monochromatic light of a wavelength selected from the light wavelength range of more than 575 nm and less than 585 nm It is preferable to select according to the ratio of the absorbance of By deriving the ratio of absorbance measured by two or more different monochromatic lights, it is possible to eliminate an error in absorbance caused between cells such as cell thickness and area among individual cells. In these light wavelength regions, as shown in FIG.
  • the light wavelength range to be sorted according to the optical characteristics is a wavelength of each light wavelength range across the wavelength at which the absorption coefficient of the graph shown in FIG. 4 reverses the absorption coefficient of reduced hemoglobin and the absorption coefficient of oxyhemoglobin. It is preferable to measure.
  • Absorbance is measured at a wavelength in a second light wavelength range in which the absorption coefficient of maternal-derived nucleated red blood cells is higher than the absorption coefficient of fetal-derived nucleated red blood cells.
  • the ratio of the absorbance measured at the wavelength of the first light wavelength range and the absorbance measured at the wavelength of the second light wavelength range is determined and compared to the ratio of the nucleated red blood cell derived from the fetus and the maternal origin Since the difference in proportion of nucleated red blood cells can be increased, it is possible to reliably select nucleated red blood cells derived from fetus.
  • the first light wavelength range can include a light wavelength range of more than 400 nm and less than 500 nm, more than 525 nm and less than 550 nm, and more than 575 nm and less than 585 nm. Moreover, as a 2nd light wavelength range, the light wavelength range of more than 550 nm and less than 575 nm can be mentioned.
  • absorbance can be measured at a plurality of wavelengths, and sorting can be performed using the average value of the absorbances. By selecting based on the average value of the absorbance, the influence of noise included in the measured value of the absorbance can be reduced.
  • FIG. 5 is a flow chart showing the procedure of the first embodiment of sorting by optical characteristics.
  • FIG. 6 is an explanatory view of a method of selecting a wavelength when measuring the absorbance.
  • a plurality of nucleated red blood cells to be candidates for fetal-derived nucleated red blood cells are sorted according to the shape of the cells.
  • Two types of wavelengths for measuring the absorbance are selected in order to select the nucleated red blood cells that are candidates for the plurality of sorted nucleated red blood cells derived from the fetus according to the optical characteristics. For example, the wavelengths ⁇ 1 and ⁇ 4 in FIG. 6 are selected. Measuring the absorbance 2 at one wavelength lambda 4 (step S52). Similarly, measuring the absorbance 1 at the other wavelengths lambda 1 (step S54).
  • the wavelengths ⁇ 2 and ⁇ 3 shifted from the wavelength ⁇ 1 , the wavelengths ⁇ 5 and ⁇ shifted from the wavelength ⁇ 4 also measure the absorbance for each of the six .
  • the average value of absorbance measured at wavelength ⁇ 1 , wavelength ⁇ 2 , and wavelength ⁇ 3 is determined, and this average value is defined as absorbance 1, and the average of absorbance measured at wavelength ⁇ 4 , wavelength ⁇ 5 , and wavelength ⁇ 6 is determined.
  • This average value can also be taken as absorbance 2.
  • the influence of noise included in the measured value of the absorbance can be reduced.
  • step S56 it is determined from the absorbance 1 and the absorbance 2 whether the cell actually has hemoglobin.
  • the presence or absence of hemoglobin is determined by comparing the absorbance to the known wavelength of hemoglobin. Having the hemoglobin confirms that the cell is a nucleated red blood cell.
  • the ratio of absorbance is determined by calculation for each nucleated red blood cell to be a candidate for fetal-derived nucleated red blood cells (step S58 in FIG. 5), and the values of the ratio of absorbance are arranged in descending order Step S60 of FIG.
  • nucleated red blood cells that are candidates for fetal-derived nucleated red blood cells are sorted into maternal-derived nucleated red blood cells and fetal-derived nucleated red blood cells by comparing with the ratio of the absorbance of the nucleated red blood cells that are candidates for nuclear red blood cells. (Step S62 of FIG. 5).
  • Second Embodiment As a method of selecting between nucleated red blood cells derived from fetuses and nucleated red blood cells derived from mothers according to spectral characteristics, red blood cells having no nuclei present around nucleated red blood cells to be selected are used as reference red blood cells. By comparison, the nucleated red blood cells to be sorted are selected from whether they are fetal nucleated red blood cells or maternal nucleated red blood cells.
  • FIG. 7 to 10 illustrate a method of selecting a reference red blood cell
  • FIG. 7 illustrates a method of setting a search range based on the number of reference red blood cells
  • FIG. 8 illustrates a method of selecting a reference range on the basis of the number of reference red blood cells. It is the flowchart figure which showed the procedure which sets search range.
  • FIG. 9 is a view for explaining a method of setting a search range based on the area of nucleated red blood cells being focused
  • FIG. 10 is a procedure for setting a search range based on the area of nucleated red blood cells being focused It is the flowchart figure shown.
  • FIG. 8 illustrates the case where five reference red blood cells are searched.
  • reference red blood cells 32 are selected until the set number of reference blood cells to be searched is reached, centering on the nucleated red blood cell candidates 30 to be sorted (step S76 in FIG. 8).
  • the reference red blood cells 32 are selected in order of decreasing distance D from the center of the nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted to the center of the reference red blood cells 32.
  • the center of the nucleated red blood cell candidate 30 can be a circular center when the plane shape of the nucleated red blood cell candidate 30 is approximated to a circular shape.
  • the center of the reference red blood cell 32 can be a circular center when the planar shape of the reference red blood cell 32 approximates a circle.
  • the reference red blood cells may be selected in order of decreasing distance from the center of gravity of the nucleated red blood cell candidate 30 to the center of gravity of the reference red blood cells 32.
  • the selection number of reference red blood cells is described as five, it is preferable that the selection number of reference red blood cells is 2 or more and 20 or less.
  • the selection number of reference red blood cells is 3 or more and 10 or less. The larger the number of reference red blood cells, the more the optical information can be averaged, so this is preferable, but when the number increases, it takes time to measure the reference red blood cells, so the above range is preferable.
  • 9 and 10 are explanatory diagrams of a method of setting a search range based on the area of nucleated red blood cells to be sorted. Also in this method, similarly to the method of setting the search range based on the number of reference red blood cells, first, the nucleated red blood cell candidates 30 to be sorted are determined (step S82 in FIG. 10). Next, the search range 36 of the reference red blood cell 32 is set (step S84 in FIG. 10). In FIG. 9, the search range 36 is illustrated by a solid line. The search range 36 illustrated in FIG. 9 is for 100 cells (10 ⁇ 10 cells) of the nucleated red blood cell candidates 30 to be sorted.
  • one side centering on the nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted is a square of 10 cells of the nucleated red blood cell candidate 30, or a circle of 10 cells in diameter.
  • the search range 36 be set in stages, and if the reference red blood cells are not found in the search range 36, the search range 36 be expanded.
  • the search range 36 is a square of 10 cells of one side of the nucleated red blood cell candidate 30 or a circle of 10 cells in diameter
  • the reference red blood cells 32 can not be found, one side is further 20
  • nucleusless red blood cells in the search range 36 are searched as reference red blood cells 32 (step S86 in FIG. 10).
  • the criteria to be selected as the reference red blood cells 32 are determined based on whether the center or the center of gravity of the reference red blood cells 32 is within the search range 36.
  • the number of selected reference red blood cells 32 and the area of the search range 36 are not particularly limited, and can be set arbitrarily.
  • FIG. 11 is a flowchart showing the procedure for selecting nucleated red blood cells to be sorted after selecting the reference red blood cells 32. As shown in FIG.
  • nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted After selecting the reference red blood cell 32, (1) nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted, (2) reference red blood cell 32, (3) surrounding nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted and reference red blood cell 32 (FIGS. (Indicated by a broken line) and the absorbance 2 at the selected wavelength (step S92 in FIG. 11).
  • the nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted and the surrounding 34 of the reference red blood cell 32 are in the range of 9 cells (3 ⁇ 3 cells) around the target red blood cell in FIGS.
  • nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted (2) reference red blood cell 32, (3) nucleated red blood cell candidate 30 to be sorted and reference red blood cell 32 at a wavelength different from the wavelength selected in step S92 of FIG.
  • Absorbance 1 of ambient 34 is measured (step S94 in FIG. 11).
  • the absorbance of the surrounding 34 of the nucleated red blood cell candidate 30 is subtracted from the nucleated red blood cell candidate 30 to obtain (4) true values of the absorbances 1 and 2 of the nucleated red blood cell candidate 30. Further, (5) True values of the absorbances 1 and 2 of the reference red blood cell 32 are obtained by subtracting the absorbance of the periphery 34 of each of the reference red blood cell 32 from the absorbance of the reference red blood cell 32 (step S96 in FIG. 11).
  • step S98 in FIG. 11 From the absorbance 1 and the absorbance 2 of the nucleated red blood cell candidate 30, it is determined whether the nucleated red blood cell candidate 30 actually has hemoglobin (step S98 in FIG. 11). The presence or absence of hemoglobin is determined by comparing the absorbance to the known wavelength of hemoglobin. Having the hemoglobin confirms that the nucleated red blood cell candidate 30 is a nucleated red blood cell.
  • the ratio of absorbance of nucleated red blood cells and the ratio of absorbance of reference red blood cells are determined (step S100).
  • the ratio of absorbance of nucleated red blood cells is determined by “true value of absorbance 1 / true value of absorbance 2”.
  • the ratio of absorbance of reference red blood cells is the average of the true values of absorbance 1 of a plurality of reference red blood cells, and the average of the true values of absorbance 2, and this “average of true values of absorbance 1 / absorbance 2 The average value of the true values of
  • the “ratio of absorbance of nucleated red blood cells / ratio of absorbance of reference red blood cells” is determined (step S102). Since the reference red blood cells are maternally derived nucleated red blood cells, the smaller the difference from “1” is, the smaller the difference from “1”, the higher the value of “ratio of absorbance of nucleated red blood cells to ratio of absorbance of reference red blood cells”. The higher the difference from “1”, the higher the possibility of being a nucleated red blood cell derived from a fetus, which can be selected as a nucleated red blood cell derived from a fetus (Step S104). ).
  • the ratio of the absorbance of nucleated red blood cells to the ratio of the absorbance of reference red blood cells is determined, and the difference between this value and "1" is the largest difference from nucleated red blood cells to fetal nucleated red blood cells.
  • a method of selecting a reference red blood cell a method of setting a search range based on the reference red blood cell count illustrated in FIG. 7 and FIG. 8 and selecting the reference red blood cell
  • the search range is determined based on the area of nucleated red blood cells to be sorted, and if the number of red blood cells contained in this range exceeds the number set in advance, it is possible to measure all. It is also possible to select and measure the number.
  • the selection is made in order from the one in which the distance between the centers of nucleated red blood cells to be sorted and the reference red blood cells is short or the one in which the distance between the centers of gravity is short.
  • the search range is expanded and the reference red blood cells included in the area increased by the expansion are To detect. This operation is preferably repeated until a predetermined number of red blood cells are obtained.
  • nucleated red blood cells when sorting by comparison with reference red blood cells, it is not limited to the method of sorting using the ratio of absorbance measured at a plurality of wavelengths, but the absorbance is measured with one type of wavelength and nucleated red blood cells to be sorted It can also be determined by comparing red blood cells. Since the reference red blood cells are maternally derived red blood cells, nucleated red blood cells having similar absorbance values to the reference red blood cells are derived from the mother body, and nucleated red blood cells having distant absorbance values can be identified as fetal origin.
  • nucleated red blood cells present in maternal blood can be sorted into fetal nucleated red blood cells and maternal derived nucleated red blood cells by the sorting step.
  • the amplification step is a step of amplifying a nucleic acid contained in at least a fetus-derived nucleated red blood cell chromosome sorted by the sorting step.
  • the nucleated red blood cells from the selected fetus are separated from the sample using a micromanipulator.
  • DNA is extracted from cells isolated and obtained from the sample and whole genome amplification is performed.
  • Whole genome amplification can be performed using a commercially available kit.
  • the obtained cells are eluted from the cells through cell lysis using a surfactant, which is a general method, and a proteolysis step using protease K or the like.
  • a surfactant which is a general method
  • proteolysis step using protease K or the like The genomic DNA obtained by
  • reagents based on polymerase chain reaction Single cell WGA kit (New England Biolabs), GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit (Sigma-Aldrich), MALBAC method (Multiple Annealing) and Looping-Based Amplification Cycles (listed in International Publication WO 2012/166425 A2) can be used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Single cell WGA kit New England Biolabs
  • GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit Sigma-Aldrich
  • MALBAC method Multiple Annealing
  • Looping-Based Amplification Cycles listed in International Publication WO 2012/166425 A2
  • reagents GenomiPhi GE Healthcare
  • REPLI-g QIAGEN
  • the amplification product of DNA obtained by whole genome amplification is preferably confirmed by agarose gel electrophoresis to confirm the presence or absence of amplification. Furthermore, it is preferable to purify the whole genome amplification product using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).
  • DNA which is a nucleic acid present at least in the chromosome of nucleated red blood cells derived from a fetus is amplified.
  • the number of nucleated red blood cells derived from a fetus which is an object of the amplification step may be at least one, but it is preferable to amplify nucleic acids obtained from nucleated red blood cells derived from a plurality of fetuses.
  • chromosomes of nucleated red blood cells derived from mothers in which there are no numerical abnormalities are also possible to select the chromosomes of nucleated red blood cells derived from mothers in which there are no numerical abnormalities, as a criterion for comparing the amounts of amplification products, in order to determine the numerical abnormalities of fetal chromosomes in a later determination step.
  • This is a preferred embodiment.
  • mother-derived nucleated red blood cells are compared with the standard, it is also one of the preferred embodiments to amplify the nucleic acid of the mother-derived nucleated red blood cells sorted by the selection step.
  • the determination step is a step of determining the amount of at least an amplification product of nucleated red blood cells derived from fetuses amplified by the amplification step.
  • DNA which has been identified as cells of nucleated red blood cells of fetal origin and amplified by the polymerase chain reaction, and which is previously determined 100 to 150 bp (base pair: base) to a chromosome to be examined for numerical abnormalities.
  • the amount of amplification product of DNA having the sequence of the region of the pair) is determined by a sequencer.
  • it is a chromosome of nucleated red blood cells derived from a fetus, and the chromosomes to be examined for numerical abnormalities are preferably selected from the group consisting of chromosome 13, chromosome 18, chromosome 21 and X chromosome. Be done.
  • the determination step is a step of determining the presence or absence of the numerical abnormality of the chromosome derived from the fetus by comparing the amounts of the amplification products of the DNA determined by the determination step.
  • a chromosome other than the target chromosome to be examined for the numerical abnormality is selected and has a predetermined sequence of 100 to 150 bp
  • the amount of amplification product of DNA amplification is determined by a sequencer.
  • a mode in which at least one of chromosomes other than the target chromosome whose number abnormality is to be examined is selected from among chromosomes of fetal-derived nucleated red blood cells, or maternal nucleated red blood cells It is selected from the aspect which selects the chromosome which exists in the cell identified as being. In this embodiment, it is preferable to select a chromosome present in cells identified as maternally-derived nucleated red blood cells.
  • the ratio between the amount of amplification product of the DNA of the target chromosome for the examination of the numerical abnormality and the amount of amplification product of the DNA of the reference chromosome determines whether or not the numerical abnormality exists in the fetal chromosome. If the fetus is in a normal state, the amount of amplification products of the DNA of the target chromosome derived from the fetus to be examined for numerical abnormalities and the amount of amplification products of the DNA of the reference chromosome are approximately 1: 1. It is expected to be If it is a numerical anomaly that is a trisomy having three chromosomes, it is expected that the ratio is 1.0: 1.5 (or 2: 3).
  • the amount of amplification product of chromosomal DNA derived from fetus relative to the amount of amplification product of chromosomal DNA derived from mother when pregnant a normal fetus is collected from a plurality of pregnant mothers
  • Distribution of the results of multiple determination of ratio and distribution of results of multiple determination of ratio of the amount of amplification product of fetal DNA from the amount of amplification product of maternal DNA from the mother who gave pregnant trisomy fetus it is possible to set a cutoff value in a region where these two distributions do not overlap, and compare this cutoff value with the ratio of the amount of amplification product of DNA to determine whether or not a numerical abnormality exists. It is possible.
  • Example 1 The present invention will be described in more detail by way of the following examples. However, the present invention is not limited to this embodiment.
  • the other glass substrate With the other hand, bring one end of the second glass substrate into contact with the first glass substrate at an angle of 30 degrees, and contact the lower surface of the second glass substrate
  • the blood fraction When the blood fraction is touched, it spreads in a space surrounded by two sheets of glass by capillary action.
  • the second glass substrate was slid on the first glass substrate in the direction of the area opposite to the area on which the blood was placed, and applied onto the first glass substrate. Then, it was made to fully dry by ventilation for 1 hour or more.
  • This first glass substrate was immersed in May-Gurnwald's staining solution for 3 minutes, immersed in phosphate buffer solution and washed, and then 10 minutes in Giemsa staining solution (diluted with phosphate buffer solution to a concentration of 3%) Soaked. Thereafter, it was washed with pure water and dried. Thus, a plurality of stained glass substrates were produced.
  • Step of sorting based on cell shape A motorized two-dimensional stage (hereinafter referred to as an XY stage), an objective lens, and the like for selecting nucleated red blood cells as candidates for fetal derived nucleated red blood cells from blood after concentration processing applied on a glass substrate.
  • a control unit including a measurement system of an optical microscope provided with a CCD camera, an XY stage control unit, a Z direction control unit for controlling a vertical direction (hereinafter referred to as Z direction) moving mechanism, an image input unit and an image
  • Z direction vertical direction
  • the blood cells coated on a glass substrate prepared as described above are placed on an XY stage, focused on a glass substrate and scanned, and an image obtained by an optical microscope is taken in, and it is a target cell by image analysis We searched for nucleated red blood cells.
  • C is the area of the cytoplasm of the cell to be subjected to image analysis (the area of the region representing the cytoplasm in the image used for analysis)
  • N is the area of the cell nucleus to be subjected to image analysis (the cell nucleus in the analysis image
  • L is the major axis or diameter of the nucleus of the cell to be image analyzed (the major axis of the ellipse when the area representing the cell nucleus in the analysis image is approximated to an ellipse)
  • the area to be represented is defined as a circular diameter when approximated to a circular shape, that is, an elliptical major diameter or circular diameter circumscribing the cell nucleus having a complicated shape.
  • Step of sorting nucleated red blood cells based on optical properties The optical characteristics of ten nucleated red blood cells, which are candidates for fetal-derived nucleated red blood cells selected based on shape information, were analyzed using a microspectroscope. Identify ten nucleated red blood cells that are candidates for fetal-derived nucleated red blood cells on a slide glass substrate, and for one of these nucleated red blood cells, absorb absorbance 1 of monochromatic light of wavelength 460 nm, and wavelength 560 nm Absorbance 2 of monochromatic light was measured, and a ratio of absorbance (absorbance 1 / absorbance 2) was calculated.
  • nucleated red blood cells are selected as reference red blood cells in the order of short distance from the nucleated red blood cell in the vicinity of the nucleated red blood cell, and similarly for each reference red blood cell, The ratio of absorbance (Absorbance 1 / Absorbance 2) was calculated and the mean value was calculated.
  • Cell isolation process The cells A and B determined in the above step were recovered using a micromanipulator.
  • Amplification step [DNA amplification step]
  • the whole genome amplification is performed using Single Cell WGA kit manufactured by New England Biolabs, using cells A of nucleated red blood cells identified as fetal origin and cells B identified as maternal origin, according to the description of the instruction.
  • a trace amount of DNA in cells was amplified about one million-fold.
  • cells C expected to be leukocytes were collected by a micromanipulator, and SNPs were examined in the same manner as cells A and B. It was confirmed that they coincided with cell B SNPs. From the above, it was confirmed that cell A is fetal nucleated red blood cells and cell B is maternal nucleated red blood cells.
  • fetal nucleated red blood cells can be identified from blood obtained from pregnant mothers, and analysis of numerical abnormality of fetal chromosomes is also possible, confirming the effect of the present invention.
  • Example 2 In Example 1, (concentration step [concentration step for nucleated red blood cells)] was carried out by the method described below, and the same procedure as in Example 1 was carried out except that a glass substrate was produced, and the effects of the present invention were confirmed. .
  • the liquid of density 1.095 was prepared using Histopaque liquid (registered trademark), and 3 mL of liquid of density 1.095 was added to the bottom of the centrifuge tube in the centrifuge tube. Thereafter, 12 mL of a diluted solution of the collected blood was slowly added to the centrifuge tube on a medium with a density of 1.095. Thereafter, centrifugation was performed at 2000 rpm for 20 minutes. The centrifuge tube was then removed and the fraction between density 1.095 and plasma was collected using a pipette. The first glass substrate was held with one hand with the fraction of blood thus collected, and one drop of the fraction of collected blood was placed at one end thereof.
  • the other glass substrate 2 (second glass substrate) with the other hand, bring one end of the second glass substrate into contact with the first glass substrate at an angle of 30 degrees, and contact the second glass substrate When the lower surface is touched with the blood fraction, it spreads in a space surrounded by two sheets of glass by capillary action. Next, with the angle maintained, the second glass substrate was slid on the first glass substrate in the direction opposite to the area on which the blood was deposited, and applied onto the first glass substrate. Then, it was made to fully dry by ventilation for 1 hour or more.
  • This first glass substrate was immersed in May-Gurnwald's staining solution for 3 minutes, immersed in phosphate buffer solution and washed, and then 10 minutes in Giemsa staining solution (diluted with phosphate buffer solution to a concentration of 3%) Soaked. Thereafter, it was washed with pure water and dried. Thus, a plurality of stained glass substrates were produced.
  • Example 3 In Example 1, using the cell obtained from another mother, in the method of determination of maternal origin or fetal origin performed in Example 1, the sex-determining factor (SRY) gene region of Y chromosome was prepared. PCR was performed using a PCR primer using the Multiplex PCR Assay Kit manufactured by Takara Bio Inc., and the presence or absence of a PCR amplified product of Y chromosome was confirmed by a general agarose gel electrophoresis method. The experiment was performed in the same manner as in Example 1 to confirm the effect of the present invention, except that in the sorting step, it was confirmed that the cells identified as derived from fetus obtained from another mother were cells derived from the fetus of a boy.
  • SRY sex-determining factor
  • nucleated red blood cell candidate 32 ... reference red blood cell, 34 ... surrounding, 36 ... search range

Abstract

　母体血から胎児由来の有核赤血球を確実に取得し、効率よく短時間で胎児由来の有核赤血球を検査する胎児の染色体の検査方法を提供する。妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、４００～６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、を有する。

Description

胎児の染色体の検査方法
　本発明は、胎児の染色体の検査方法に係り、特に、妊娠母体の血液から採取した胎児由来の赤血球を用いて検査を行う胎児の染色体の検査方法に関する。
　出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが大きな問題として指摘されている。
　一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性の低い安全な出生前診断を実現することができることとなる。
　しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ（１ｍＬ＝１０－６ｍ３）中に１個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞（有核赤血球）を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。
　このような課題に対して、下記の特許文献１、および、非特許文献１では、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などを用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが行われている。これらの方法は、胎児由来の有核赤血球を濃縮し、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。
　また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、特許文献２には、細胞質を染色して透過可視光の吸収画像を生成し、励起光を照射して核の蛍光画像を形成し、細胞質と核のコントラスト画像を用いて有核赤血球を判別することが記載されている。また、特許文献３には、ヘモグロビンの最大波長域付近の波長の光を用いて測定を行い、血球の種別を判別する血球種判別装置が記載されている。特許文献４には、生体組織の光学的性質を利用した生体情報分析装置が記載されている。非特許文献２には、胎児由来の有核赤血球を濃縮し、細胞の形態情報から胎児由来の有核赤血球を識別する方法が開示されている。
　また、胎児細胞（有核赤血球）を取得した後、胎児における染色体異常を検出する方法として、特許文献５に、胎児細胞の染色体を増幅し、増幅産物の量を確定し、染色体不均衡による疾患を検出する方法が記載されている。
特表２０１０－５２５８３２号公報 特表２００２－５１４３０４号公報 特開昭５８－１１５３４６号公報 特開２０１４－１４４８５号公報 特表２００４－５３１２７１号公報
鈴木稚子、他「母体血からの有核赤血球の濃縮と自動解析による同定の効率化」昭和医学会雑誌 第72巻 第4号〔471-478頁，2012〕 D.Cha et al., "A simple and sensitive erythroblast scoring system to identify fetal cells in maternal blood", Prenat Diagn 2003; 23: 68-73
　このように、妊娠母体の母体血から胎児由来の有核赤血球を選択する方法が各種検討されているが、出生前診断を効率よく行うためには、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を分離し、胎児由来の有核赤血球を確実に取得する方法が求められている。上記先行技術文献に記載されている方法は、母体血中から胎児由来の有核赤血球を取得する確率を上げることはできるが、母体由来の有核赤血球または胎児由来の有核赤血球であるかは、染色体を検査するまでわからなかった。したがって、検査を行った細胞が母体由来の有核赤血球であった場合、胎児由来の有核赤血球を選別するまで、染色体の検査を行う必要があり、再度、検査を行うため時間がかかっていた。
　本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、母体血から確実に胎児由来の有核赤血球を取得し、効率よく短時間で胎児由来の有核赤血球を検査することができる胎児の染色体の検査方法を提供することを目的とする。
　本発明は前記目的を達成するために、妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、４００～６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、確定した増幅産物の量と、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体の増幅産物との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、を有する胎児の染色体の検査方法を提供する。
　本発明の胎児の染色体の検査方法によれば、妊娠母体中に含まれる母体由来の有核赤血球と、胎児由来の有核赤血球と、を核の形状、および、４００～６５０ｎｍの光波長域における分光特性により選別することで、確実に胎児由来の有核赤血球に選別することができる。したがって、母体血を用いた遺伝子による胎児の染色体の検査を効率良く、確実に行うことができる。
　本発明の別の態様においては、選別工程は、少なくとも核の形状により有核赤血球候補を選別する第１の選別工程と、第１の選別工程により選別された有核赤血球候補を、分光特性により選別を行う第２の選別工程と、からなることが好ましい。
　この態様によれば、選別工程を核の形状により有核赤血球候補を選別する工程を含む第１の選別工程と、分光特性により有核赤血球候補を選別する第２の選別工程と、を有しているから、異なる方法で有核赤血球の選別を行うことで、確実に胎児由来の有核赤血球を選別することができる。また、第１の選別工程で、核の形状により選別を行うことで、核のない赤血球を除くことができ、有核赤血球を選別することができる。有核赤血球を選別した後、分光特性により胎児由来の有核赤血球および母体由来の有核赤血球を選別することで、効率よく胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
　本発明の別の態様においては、第１の選別工程は、有核赤血球候補となる細胞の細胞質の面積をＣ、有核赤血球候補となる細胞の核の面積をＮ、有核赤血球候補となる細胞の核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをＬとしたとき、（１）式（式１ともいう）および（２）式（式２ともいう）を満たす有核赤血球候補を選択する工程を含むことが好ましい。
　　　０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０　　　（１）
　　　０．６５＜Ｎ／（Ｌ×Ｌ）＜０．７８５　　　（２）
　この態様は、核の形状による選別の具体的な条件を規定したものであり、（１）式は細胞質と核の面積比率、（２）式は核の円形度合いを規定したものである。上記（１）式、および（２）式の条件の核を有する細胞は赤血球である可能性が高いため、分光特性による選別で、胎児由来の有核赤血球を選択する可能性を高めることができる。
　本発明の別の態様においては、第１の選別工程は、さらに、２つの工程からなり、第１の工程は核を有する可能性のある細胞を抽出し、第２の工程は、第１の工程で抽出した細胞から（１）式および（２）式により有核赤血球候補を選別することが好ましい。
　この態様によれば、第１の選別工程が、さらに２つの工程からなり、第１の工程で核を有する可能性のある細胞を抽出することで粗ふるいし、第２の工程で上記（１）式、（２）式に基づいて形状情報で選別することで、より確実に胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
　第１の工程の「核を有する可能性のある細胞を抽出する」方法としては、例えば、細胞を白色光で撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値で２値化し、２値化した画像から点状および島状の連続領域を抽出する。そして、連続領域のうち、大きさが１～５μｍのものを細胞核である可能性がある領域とし、該領域を含む細胞を、細胞核を有する可能性のある細胞とする。大きさとしては、例えば、連続領域に外接する最小楕円の長径とすることができる。なお、２値化した画像は、Erosion・Dilationなどのモルフォロジー処理を施して、連続領域の形状を整えた上で、大きさを求めてもよい。
　本発明の別の態様においては、分光特性が、吸収係数であることが好ましい。
　分光特性として吸収係数を用いることで、赤血球中に含まれるヘモグロビンの酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの吸収係数の差を用いて選別を行うことができる。
　本発明の別の態様においては、選別工程は、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定することが好ましい。
　この態様によれば、まず、第一に、選別する有核赤血球（胎児由来の有核赤血球の候補となる細胞）が、ヘモグロビンの吸収係数を有するかどうかの選別が可能となり、ヘモグロビンの吸収係数をもたない白血球由来の細胞を除外することが可能となる。次に、ヘモグロビンの吸収係数をもつ細胞において、選別工程で用いられる波長を、胎児由来の有核赤血球の吸光度が母体由来の有核赤血球の吸光度より高い第１の波長域と、母体由来の有核赤血球の吸光度が胎児由来の有核赤血球の吸光度より高い第２の波長域と、から選ばれる各々の波長で測定することで、それぞれの波長の吸光度において、胎児由来の有核赤血球の吸光度と母体由来の有核赤血球の吸光度とで大きさが逆転することになる。したがって、各々の波長で測定した吸光度を比較することで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との差を明確にすることができ、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別することができる。吸光度の比較としては、各々の波長で測定した吸光度の比を求めることで、吸光度の比の差が大きくなり選別することができる。
　なお、３種類以上の各々の波長で測定することにより、ノイズの影響を低減することができる。３種類以上の波長を用いる場合は、波長をずらした複数波長において吸光度を測定し、それらの平均値を選別に用いる吸光度とすることで、ノイズの影響を低減することができる。
　本発明の別の態様においては、選別工程は、母体由来の有核赤血球と、胎児由来の有核赤血球とを２種類以上の各々の波長で測定した吸光度の違いに基づいて、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることが好ましい。
　この態様によれば、２種類以上の波長を用いて測定することにより、それぞれの波長で、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球の差を求めることができる。したがって、これらの吸光度の違いから、胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることができるので、この順位に基づいて胎児由来の有核赤血球を選別することで、複数の有核赤血球である候補細胞の中から胎児由来の有核赤血球を精度良く選別することができる。
　本発明の別の態様においては、第１の光波長域は、４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の波長域であり、第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域であることが好ましい。
　この態様は、分光特性の測定に用いられる第１の光波長域、および、第２の光波長域を具体的に規定したものであり、この範囲の光波長域の波長を用いることで、吸光度の大きさを逆転することができ、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球との光学特性の差異を明確にすることができる。
　本発明の別の態様においては、濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
　この態様によれば、濃縮工程を密度勾配遠心分離法により行うことで、細胞を壊すことなく、母体血中の有核赤血球の濃度を高くすることができる。
　本発明の胎児の染色体の検査方法によれば、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とを、確実に選別することができるので、母体血を用いた胎児の遺伝子検査を、確実に効率よく行うことができる。
図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。 図２は、選別工程の第１の選別工程の手順を示したフローチャート図である。 図３Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図である。 図３Ｂは、除きたい細胞の形状を示す模式図である。 図４は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である。 図５は、光学特性による選別の第１実施形態の手順を示したフローチャート図である。 図６は、吸光度を測定する際の波長の選択方法を説明する説明図である。 図７は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。 図８は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。 図９は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。 図１０は、参照赤血球を有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。 図１１は、光学特性による選別の第２実施形態の手順を示したフローチャート図である。
　以下、添付図面に従って、本発明に係る胎児の染色体の検査方法について説明する。なお、本明細書において「～」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
　［胎児の染色体の検査方法］
　図１は、本実施形態における胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。本実施形態の胎児の染色体の検査方法は、妊娠母体から母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、４００～６５０ｎｍの光波長域における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する選別工程（ステップＳ１６）と、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程（ステップＳ１８）と、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程（ステップＳ２０）と、確定した増幅産物の量を、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程（ステップＳ２２）と、を有する。以下、各工程について詳説する。
　＜採取工程（ステップＳ１２）＞
　採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
　母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査する。
　胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
　＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
　次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
　〔密度勾配遠心分離法〕
　密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第１の媒体および第２の媒体を選択することで、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の界面に目的の成分（本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球）を集めることができる。そして、この第１の媒体と第２の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
　具体的には、遠沈管の底部に第１の媒体を注入する工程と、第１の媒体を収めた遠沈管を冷却する工程と、遠沈管内の冷却された第１の媒体の上に第２の媒体を積層する工程と、遠沈管内の第２の媒体の上に血液試料である母体の末梢血を積層する工程と、遠沈管に収容された第１の媒体、第２の媒体および血液試料を遠心分離にかける工程と、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の層から、胎児由来の有核赤血球を含む画分を採取する工程と、を含む方法で有核赤血球の濃縮を行うことができる。
　国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５～１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０～１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０～１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５～１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が、１．０７０～１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が、１．０６０～１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が、１．０６０～１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。密度の数値に関して、グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］で表される単位からＳＩ単位系への換算は容易であり、１グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］は、１０００キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］である。
　積層する媒体（第１の媒体および第２の媒体）の密度は、密度が１．０６５～１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第１の媒体と、第２の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
　濃縮工程で用いられる、第１の媒体および第２の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５～３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll（登録商標）-Paque、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるHistopaque（登録商標）等の媒体を使用することができる。本実施形態では、Percoll（登録商標）、およびHistopaque（登録商標）を好ましく使用することができる。Percoll（登録商標）は、密度（比重）１．１３０の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度（比重）の媒体を調製することが可能である。Histopaque（登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の媒体および第２の媒体を所望の密度に調製することが可能である。
　〔他の濃縮方法〕
　有核赤血球を濃縮する方法として、上記の密度勾配遠心分離法の他に、通常の白血球の抗原であるＣＤ４５（CD: Cluster of Differentiation）（ＣＤ分類に基づくモノクローナル抗体の分類番号）に特異的に結合する抗体を利用し、磁気効果を用いて、白血球を分離することで、有核赤血球を濃縮することもできる。
　＜選別工程（ステップＳ１６）＞
　選別工程は、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状および分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する工程である。
　濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血には、有核赤血球の他に、白血球などの他の血液成分も含まれる。白血球などの血液成分は、濃縮工程により、母体血から除くことができるが、完全に除去することは困難であるため、選別工程において、核の形状により選別を行う第１の選別工程と、分光特性により選別を行い第２の選別工程により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。
　選別工程は、濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布し、分析用の標本を作製し、分析用の標本を用いて行われる。
　（細胞の形状の情報による選別）
　上記分析用の標本を用いて、まず細胞の形状の情報（以下、「細胞の形状」ともいう）により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別する。
　細胞の形状の情報による選別としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い、核領域の面積、核の明度、核のつぶれ方、などを挙げることができる。なかでも、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および、核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。細胞質の面積、及び核領域の面積は、分析用の標本の観察される面における面積である。
　図２は、選別工程における細胞の形状（核の形状）により選別を行う第１の選別工程の一例の手順を示したフローチャート図である。
　細胞の形状による選別は、まず、細胞を抽出する（ステップＳ３２）。細胞であるか否かの判断は、２値化画像を用いて行われる。白色光光源を用いて分析用の標本を撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値を用いて２値化画像を生成し、生成された２値化画像から点状および島状の連続領域を有するもの、すなわち、任意の閉曲線で閉じられている領域を細胞として抽出する。
　次に、ステップＳ３２で抽出した細胞を核の有無により選択する（ステップＳ３４）。核の有無は、細胞内に核（点状物）が存在するか否かにより選別する。核の有無の判断にも２値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
　次に、細胞の核の大きさ（点状および島状の連続領域の大きさ）が、１～５μｍのものを抽出する（ステップＳ３６）。１～５μｍの大きさの核を有する細胞を選択することは有核赤血球を選別するのに有効である。なお、「点状および島状の連続領域の大きさ」とは、核の外形を表す閉曲線を円形、又は楕円形に近似し、核の外形を近似した円形の直径、又は核の外形を近似した楕円形の長径とすることができる。
　核の外形を近似した円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する円形のうち直径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した楕円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する楕円形のうち長径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した円形の直径、または、核の外形を近似した楕円形の長径が１～５μｍのものを抽出する。
　次に、核の形状により細胞を選別する（ステップＳ３８）。図３Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図３Ｂは除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う方法、および、核の円形度合いにより選別を行う方法を説明する。細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記（１）式を満たす場合に、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の核の面積をＮとした場合、Ｃに対するＮの割合が０．２５を超え１．０未満の核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。
　０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０　　　（１）
　また、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記（２）式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をＬとしたとき、核の直径又は核の長径平方に対する核の面積の割合が０．６５を超え０．７８５未満である核を有する細胞が胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップＳ３４で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
　０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５　　　（２）
　細胞の形状による選別は、ステップＳ３２～ステップＳ３６による第１の工程で、粗ふるいし、ステップＳ３８による第２の工程で、核の形状により選別を行うことで、画像処理により選別を行う胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の数を減らすことができ、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の選別を効率良く行うことができる。
　形状による選別は、ステップＳ３２～ステップＳ３８のすべての条件を満たす必要がある。ステップＳ３２～ステップＳ３８の条件のうち、一つでも満たさないものは、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球として選択されない。
　細胞の形状の情報を用いて胎児由来の有核赤血球の候補なる有核赤血球を選別するシステムの構成例としては、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ（personal computer）、制御ＰＣ、ディスプレイを装備しているシステムを挙げることができる。光学搬送系は、対物レンズとＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラを備え、画像処理ＰＣは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える構成が挙げられる。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える構成が挙げられる。
　（光学特性による選別）
　光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンの酸素親和性の違いに起因する分光特性を利用することができる。図４は、還元ヘモグロビン（Ｈｂ）と、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）の波長に対する吸収係数を示すグラフ図である（特開２０１４－１４８５号公報に記載）。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。図４に示すように、ヘモグロビンは酸素との相互作用によって、吸収係数が変化することが知られている。即ち、酸化ヘモグロビンは赤い色調を有しており、還元ヘモグロビンになるに従い、青味を帯びてくる。
　光学特性による選別においては、胎児由来の有核赤血球が、母親の赤血球、および、わずかに存在する母体由来の有核赤血球に対して、ヘモグロビンの酸素親和性が異なることを利用して母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球と、を選別する。例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球と、この有核赤血球の近傍に存在する赤血球との分光特性の差異を利用して、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別するものである。
　分光特性とは、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンとの吸収係数の差異の存在する波長域で差を検出するものである。成人の赤血球中のヘモグロビンは、４量体α２β２（ＨｂＡ）である。一方、胎児の赤血球中のヘモグロビンは、２本のα鎖と２本のγ鎖によって作られた４量体α２γ２（ＨｂＦ）であり、生後、大部分を占めるＨｂＡと少数のＨｂＦからなるＨｂＡ２に置き換わっていくことが知られている。胎盤中では、血液中の妊娠母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）から酸素の提供を受けることで、胎児のヘモグロビンは酸素を得ている。そして、成人の血液中の赤血球に含まれるヘモグロビン（ＨｂＡ）は、４量体α２β２であるが、胎児型のヘモグロビン（ＨｂＦ）はα２γ２であり、ＨｂＡに比べて酸素親和性が高いという特徴を有する。出生前診断においては、血液試料として妊娠母体の末梢血を採取し、検査を行うことが好ましい。末梢血は、通常、静脈から採取するものであり、静脈中の血液の酸素の量は、動脈中の酸素の量より乏しくなる。健常人では、中心静脈血の酸素飽和度は、６０～８０％が正常値といわれており、この値は、全身の酸素需要により上下する。ＨｂＡとＨｂＦは、酸素親和性が異なるため、静脈血中においても、ＨｂＡとＨｂＦの酸素結合量が異なり、ＨｂＦの酸素結合量がＨｂＡの酸素結合量よりも高くなるという特徴を有している。
　母体のヘモグロビン（ＨｂＡ）と胎児のヘモグロビン（ＨｂＦ）においても、静脈中で酸素親和性に差があり、図４に示すように、還元ヘモグロビンと酸化ヘモグロビンは、吸収係数に差が生じるので、この差を用いて母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球を選別する。吸光度の測定には、４００～６５０ｎｍの光波長域が適用される。この光波長域から選択される波長を有する少なくとも１つの単色光を用いて吸光度が測定される。
　また、吸光度の測定は、異なる波長の複数単色光を用いて、各波長の吸光度を測定し、各波長の測定値の割合を検出することでより確実に有核赤血球の選別を行うことができる。好ましくは、４００～５００ｎｍの光波長域から選択された波長の単色光を用いる態様であり、より好ましくは４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。また、光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域から選択された波長の単色光をそれぞれ用い、各波長の吸光度の割合により選別することが好ましい。２種類以上の異なる単色光により測定した吸光度の割合を導出することで、個々の細胞間に、細胞の厚みや面積などの細胞間に起因する吸光度の誤差を排除することができる。これらの光波長域は、図４に示すように、酸化ヘモグロビン（ＨｂＯ２）と還元ヘモグロビン（Ｈｂ）とで、吸収係数の差が大きいので、この光波長域を用いることで、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球のとの選別を確実に行うことができる。
　また、光学特性により選別する光波長域は、図４に示すグラフの吸収係数が還元ヘモグロビンの吸収係数と酸化ヘモグロビンの吸収係数の大きさが逆転する波長を挟んでそれぞれの光波長域の波長で測定することが好ましい。すなわち、胎児由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が高い）の吸収係数が、母体由来の有核赤血球（酸化ヘモグロビンの割合が低い）の吸収係数より高い第１の光波長域の波長と、母体由来の有核赤血球の吸収係数が胎児由来の有核赤血球の吸収係数より高い第２の光波長域の波長と、で吸光度を測定する。そして、第１の光波長域の波長で測定した吸光度と、第２の光波長域の波長で測定した吸光度の割合を求め、比較することで、胎児由来の有核赤血球の割合と母体由来の有核赤血球の割合の差を大きくすることができるので、胎児由来の有核赤血球の選別を確実に行うことができる。
　第１の光波長域としては、４００ｎｍを超え５００ｎｍ未満、５２５ｎｍを超え５５０ｎｍ未満、および、５７５ｎｍを超え５８５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。また、第２の光波長域としては、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の光波長域を挙げることができる。
　また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それら吸光度の平均値を用いて選別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
　≪第１実施形態≫
　図５は、光学特性による選別の第１実施形態の手順を示すフローチャート図である。図６は、吸光度を測定する際の波長の選択方法の説明図である。
　まず、細胞の形状により胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を複数選別する。選別された複数の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球に対して、光学特性により選別を行うために、吸光度を測定する波長を２種類選択する。例えば、図６の波長λ１、及び波長λ４を選択する。一方の波長λ４で吸光度２を測定する（ステップＳ５２）。同様に、他方の波長λ１で吸光度１を測定する（ステップＳ５４）。上述したように、吸光度を測定する波長を２種類λ１、及びλ４を選択した後、波長λ１からずらした波長λ２および波長λ３、波長λ４からずらした波長λ５および波長λ６のそれぞれについても吸光度を測定する。波長λ１、波長λ２、及び波長λ３で測定した吸光度の平均値を求め、この平均値を吸光度１とし、波長λ４、波長λ５、及び波長λ６で測定した吸光度の平均を求め、この平均値を吸光度２とすることもできる。このように、複数の波長で測定した吸光度の平均値を吸光度１、および、吸光度２とすることで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
　次に、吸光度１および吸光度２から、細胞が、実際にヘモグロビンを有するかの判別を行う（ステップＳ５６）。ヘモグロビンの有無は、既知のヘモグロビンの波長に対する吸光度と比較することにより判別する。ヘモグロビンを有することで、細胞が有核赤血球であることを確定する。続いて、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球ごとに吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算により求め（図５のステップＳ５８）、吸光度の比の値が大きい順に並べる（図５のステップＳ６０）。最後に、それぞれ選択した波長での酸化ヘモグロビンと還元ヘモグロビンの関係を基に、測定した波長、および、酸化ヘモグロビン、還元ヘモグロビンの吸光度から、吸光度の比の理論値を求め、測定した胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の吸光度の比と比較することで、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球とに選別する（図５のステップＳ６２）。
　≪第２実施形態≫
　分光特性により、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とを選別する方法として、選別対象の有核赤血球の周囲に存在する核を有さない赤血球を参照赤血球とし、この参照赤血球と比較することで、選別対象の有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かを選別する。参照赤血球を、選別対象の有核赤血球と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、その割合を求め、選別する有核赤血球の吸光度の割合と、参照赤血球の吸光度の割合を比較することで、より確実に選別対象の有核赤血球の中から胎児由来の有核赤血球を選別することができる。
　＜参照赤血球の選択方法＞
　参照赤血球の選択は次の方法により行うことができる。図７～１０は、参照赤血球を選択する方法を説明する図であり、図７は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図８は参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。また、図９は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図１０は注目している有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
　｛参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法｝
　図７及び８は、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、選別対象の有核赤血球候補３０を決定する（図８のステップＳ７２）。選別対象の有核赤血球候補３０は、先に説明したように形状により決定することができる。次に、探索する参照血球数を設定する（図８のステップＳ７４）。図８には、探索する参照赤血球を５個とした場合を説明する。次に、選別対象の有核赤血球候補３０を中心に、設定された探索する参照血球の数になるまで、参照赤血球３２を選択する（図８のステップＳ７６）。参照赤血球３２は、選別対象の有核赤血球候補３０の中心から、参照赤血球３２の中心までの距離Ｄが短い順に選択される。
　有核赤血球候補３０の中心は有核赤血球候補３０の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。同様に、参照赤血球３２の中心は、参照赤血球３２の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。以下の説明においても同様である。また、有核赤血球候補３０の重心から、参照赤血球３２の重心までの距離が短い順に参照赤血球を選択してもよい。
　なお、図７においては、参照赤血球の選択数を５個で説明しているが、参照赤血球の選択数は２個以上２０個以下であることが好ましい。参照赤血球の選択数を上記範囲とし、複数の参照赤血球の光学的な情報を取得して平均することで、選別対象の有核赤血球候補との差異となる基準を、ばらつきなく決定することができる。また、参照赤血球の選択数は、３個以上１０個以下とすることがより好ましい。参照赤血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので、好ましいが、数が多くなると参照赤血球の測定に時間がかかるので、上記範囲とすることが好ましい。
　｛選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法｝
　図９、１０は、選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。かかる方法においても、参照赤血球の数に基づき探索範囲を設定する方法と同様に、まず、選別対象の有核赤血球候補３０を決定する（図１０のステップＳ８２）。次に、参照赤血球３２の探索範囲３６を設定する（図１０のステップＳ８４）。図９において、探索範囲３６は実線により図示する。図９に図示した探索範囲３６は、選別対象の有核赤血球候補３０の１００細胞分（１０×１０細胞分）とする。
　探索範囲３６は、選別対象の有核赤血球候補３０を中心とした１辺が有核赤血球候補３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とすることが好ましい。また、探索範囲３６は、段階的に設定しておき、探索範囲３６内に参照赤血球が見つからない場合は、探索範囲３６を広げていくことが好ましい。例えば、探索範囲３６が、一辺が有核赤血球候補３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とした場合に、参照赤血球３２が見つからない場合は、更に、１辺が２０細胞分の正方形、または、直径が２０細胞分の円形まで探索範囲を広げて、参照赤血球を決定することが好ましい。
　次に、探索範囲３６内の核のない赤血球を参照赤血球３２として探索する（図１０のステップＳ８６）。参照赤血球３２として選択する基準は、参照赤血球３２の中心、または、重心が探索範囲３６内に入っているか否かで判断する。
　　なお、参照赤血球３２の選択数、および、探索範囲３６の面積については特に限定されず、任意に設定することが可能である。
　図１１は、参照赤血球３２を選択した後、選別対象の有核赤血球を選別する手順を示すフローチャート図である。
　参照赤血球３２を選択した後、（１）選別対象の有核赤血球候補３０、（２）参照赤血球３２、（３）選別対象の有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４（図７、９に破線で示す）を、選択した波長で吸光度２を測定する（図１１のステップＳ９２）。選別する有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４とは、図７、９においては、対象となる赤血球の周囲の９細胞分（３×３細胞分）の範囲である。同様に、図１１のステップＳ９２で選択した波長と異なる波長で、（１）選別する有核赤血球候補３０、（２）参照赤血球３２、（３）選別する有核赤血球候補３０および参照赤血球３２の周囲３４の吸光度１を測定する（図１１のステップＳ９４）。
　吸光度１、２を測定後、有核赤血球候補３０から有核赤血球候補３０の周囲３４の吸光度を引くことで、（４）有核赤血球候補３０の吸光度１、２の真値を求める。また、参照赤血球３２の吸光度から、参照赤血球３２のそれぞれ赤血球の周囲３４の吸光度を引くことで、（５）参照赤血球３２の吸光度１、２の真値を求める（図１１のステップＳ９６）。
　有核赤血球候補３０の吸光度１および吸光度２から、有核赤血球候補３０が、実際にヘモグロビンを有するかの判別を行う（図１１のステップＳ９８）。ヘモグロビンの有無は、既知のヘモグロビンの波長対する吸光度と比較することにより判別する。ヘモグロビンを有することで、有核赤血球候補３０が有核赤血球であることを確定する。
　次に、有核赤血球の吸光度の比、参照赤血球の吸光度の比を求める（ステップＳ１００）。有核赤血球の吸光度の比は、「吸光度１の真値／吸光度２の真値」により求める。また、参照赤血球の吸光度の比は、複数の参照赤血球の吸光度１の真値の平均値、および、吸光度２の真値の平均値を求め、この「吸光度１の真値の平均値／吸光度２の真値の平均値」により求めることができる。
　最後に、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」を求める（ステップＳ１０２）。参照赤血球は、母体由来の有核赤血球であるため、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」の値が、「１」からの差が小さいほど、有核赤血球は、母体由来の有核赤血球である可能性が高く、「１」からの差が大きいほど、胎児由来の有核赤血球である可能性が高く、胎児由来の有核赤血球として選別することができる（ステップＳ１０４）。このように、「有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比」を求め、この値の「１」からの差が一番大きく異なる有核赤血球から胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつけることで、胎児由来の有核赤血球の選別を行うことができる。
　参照赤血球を選択する方法としては、図７及び図８に図示した参照赤血球数に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法、図９及び図１０に図示した選別対象の有核赤血球の面積に基づき探索範囲を設定して参照赤血球を選択する方法を例示したが、これに限定されず、これらを組み合わせた方法で選別することも可能である。例えば、選別対象の有核赤血球の面積により探索範囲を決定しておき、この範囲内に含まれる赤血球数が予め設定した個数を上回る場合には、すべてを測定することも可能であり、予め設定した個数を選択して測定することも可能である。選択する方法としては、上述したように、選別対象の有核赤血球と参照赤血球との中心同士の距離が短いもの、または、重心同士の距離が短いものから、順次選択する。また、探索範囲内の参照赤血球の数が、予め設定した個数を下回る場合には、下回ることが判明した時点で、探索範囲を拡大して、拡大したことにより増加した面積に含まれる参照赤血球を検出する。この操作を、予め決められた個数の赤血球が得られるまで、繰り返すことが好ましい。
　また、参照赤血球との比較により選別する場合は、複数の波長で測定した吸光度の比を用いて選別する方法に限定されず、１種類の波長で吸光度を測定し、選別する有核赤血球と参照赤血球を比較することで判別することもできる。参照赤血球は、母体由来の赤血球であるので、参照赤血球と吸光度の値が近い有核赤血球が母体由来であり、吸光度の値が遠い有核赤血球を胎児由来として判別することができる。
　以上の方法により、選別工程により、母体血液中に存在する有核赤血球を胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とに選別することができる。
　＜増幅工程（ステップＳ１８）＞
　増幅工程は、選別工程により選別された少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。
　選別工程により、選別された胎児由来の有核赤血球は、マイクロマニュピュレータを用いて標本から分離される。標本から分離され取得された細胞からＤＮＡを抽出して、全ゲノム増幅を行う。全ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
　本実施形態で用いる全ゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
　全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）に基づく試薬Single cell WGA kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit（Sigma-Aldrich社）、ＭＡＬＢＡＣ法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）（国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号公報に掲載）を用いることが出来る。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬GenomiPhi（ＧＥヘルスケア社）、REPLI-g（QIAGEN社）も同様に用いることが出来る。本実施形態では、Single cell WGA kit(New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
　全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。更に、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製することが好ましい。
　また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）を用いて測定することが好ましい。
　増幅工程においては、少なくとも胎児由来の有核赤血球の染色体に存在する核酸であるＤＮＡを増幅する。増幅工程の対象物である胎児由来の有核赤血球の数は、少なくとも１つでよいが、複数の胎児由来の有核赤血球から取得した核酸を増幅することが好ましい。更には、後の決定工程で胎児の染色体の数的異常を決定するために、増幅産物の量を比較する基準として、数的異常が存在しない母体由来の有核赤血球の染色体を選択することも好ましい態様である。母体由来の有核赤血球を基準と比較する場合、選別工程により選別した母体由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅することも好ましい態様の一つである。
　＜確定工程（ステップＳ２０）＞
　確定工程は、増幅工程により増幅した少なくとも胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する工程である。
　（核酸断片の数の決定）
　胎児由来の有核赤血球の細胞として同定され、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡであって、数的異常を検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された１００～１５０ｂｐ（base pair：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシークエンサーで求める。本発明においては、胎児由来の有核赤血球の染色体であり、数的異常を検査する対象となる染色体は、好ましくは１３番染色体、１８番染色体、２１番染色体、およびＸ染色体からなる群から選択される。
　＜決定工程（ステップＳ２２）＞
　決定工程は、確定工程により確定したＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
　胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準（あるいは参照）として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された１００～１５０ｂｐの領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準となる染色体（基準染色体）としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の中から数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも１つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
　次に、数的異常の検査の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量との比率により、胎児の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。染色体が３本存在するトリソミーである数的異常である場合には、１．０：１．５（あるいは２：３）の比になると予想される。
　また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、ＤＮＡの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、ＤＮＡの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
　（実施例１）
　以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
　（取得工程［末梢血液試料取得工程］）
　７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
　（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
　Percoll液（登録商標）を使用して、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５ｇ／ｍＬの液２ｍｌを添加した。続けて、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０ｇ／ｍＬの液２ｍＬを重層した。その後、密度１．０７０ｇ／ｍＬの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍ（回転数毎分）で２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９０ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第１のガラス基板を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２ガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Buffer液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
　（細胞の形状に基づき選別する工程）
　ガラス基板上に塗布した濃縮処理後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ（以下、ＸＹステージと記載する。）と、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、垂直方向（以下、Ｚ方向と記載する）移動機構を制御するＺ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した、ガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
　画像解析は、以下の式（１）、式（２）の条件を満たす細胞を検出し、解析対象の画像に直交する二軸からなる座標系を設定し、二軸の一方をＸ軸、二軸の他方をＹ軸とした場合の、検出された細胞のＸ方向の細胞の位置、及びＹ方向の位置を記録した。
　０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０　　　（１）
　０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５　　　（２）
　ここで、Ｃは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積（解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積）、Ｎは、画像解析をおこなう細胞の核の面積（解析画像における細胞の核を表す領域の面積）、Ｌは、画像解析する細胞の核の長径又は直径（解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径）、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら式（１）、式（２）を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選択し、次の工程の胎児由来の有核赤血球の候補とした。
　（光学特性に基づき有核赤血球を選別する工程）
　形状の情報により選択された胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の１０個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球１０個を特定し、そのうちの１つの有核赤血球に対して、波長が４６０ｎｍの単色光の吸光度１、および波長が５６０ｎｍの単色光の吸光度２を測定し、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算した。次に、その有核赤血球の近傍位置にある、当該有核赤血球からの距離の短い順に参照赤血球として、核のない赤血球を５個選択し、同様にして一つ一つの参照赤血球に対して、吸光度の比（吸光度１／吸光度２）を計算し、平均値を計算した。
　同様の方法で、ガラス基板上の胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球の残りの９個の細胞に対しても同様の計算を行った。この計算結果から、（有核赤血球の吸光度の比／参照赤血球の吸光度の比の平均値）を求め、この値の「１」からの差が一番大きく異なる細胞を胎児由来の有核赤血球と見なして細胞Ａとし、「１」からの差が一番小さい細胞を母体由来の有核赤血球と見なして細胞Ｂとした。
　（細胞単離工程）
　上記工程で決定された細胞Ａ、細胞Ｂを、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
　（増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］）
　有核赤血球の、胎児由来と識別された細胞Ａと、母体由来と識別された細胞Ｂを用いて、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。
　（確定工程［母体由来または胎児由来の確定工程］）
　各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）（SNP　ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、細胞Ａと細胞ＢのＳＮＰが異なることが確認出来た。別途、白血球と予想される細胞Ｃをマイクロマニュピュレータで回収し、細胞Ａ、細胞Ｂと同様にしてＳＮＰを調べたところ、細胞ＢのＳＮＰと一致することが確認された。以上より、細胞Ａが胎児由来の有核赤血球、細胞Ｂが、母親由来の有核赤血球であることが確認された。
　（決定工程［数的異常の決定工程］）
　細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれから増幅したＤＮＡの増幅産物を等分割した残りの一方を用いて、胎児由来の有核赤血球が２１トリソミーであるかを判別した。細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれから得られたＤＮＡの増幅産物を用いて、SureSelect target enrich system（Human All exon v5 アジレント社製）を用いて、説明書記載に則り夫々の細胞のexon部分のみを濃縮しILLUMINA社製ゲノムアナライザーHiseqで、exon部分のシーケンスリード数を算出、細胞Ａ及び細胞Ｂのそれぞれにおける２１番染色体のexon部分で算出されたシーケンスリード数を比較することにより２１トリソミーを検出することが可能であった。
　以上のごとく、妊娠母体から得られた血液から胎児由来の有核赤血球を同定でき、胎児の染色体の数的異常の解析も可能であることがわかり、本発明の効果が確認された。
　（実施例２）
　実施例１において、（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）を、以下に記載の方法で行い、ガラス基板を作製した以外は、実施例１と同様に行い、本発明の効果を確認した。
　（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
　Histopaque液（登録商標）を使用して、密度１．０９５の液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５の液３ｍＬを添加した。その後、密度１．０９５の媒体の上に、採血した血液の希釈液１２ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍで２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０９５と、血漿の間の画分を、ピペットを用いて採取した。このように採取した血液の画分を片手で第１のガラス基板を保持し、その１端に１滴採取した血液の画分を置いた。もう一方の手で別のガラス基板２（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２のガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Buffer液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
　（実施例３）
　実施例１において、別の母体から得られた細胞を用いて、実施例１で行った、母体由来または胎児由来の確定の方法において、Ｙ染色体のsex-determining factor(SRY)遺伝子領域で作製したPCRプライマーを用いてタカラバイオ社製Multiplex PCR Assay Kitを用いてPCRを行い、Y染色体のPCR増幅物の有無を一般的なアガロースゲル電気泳動法で確認し、実施例１の胎児有核赤血球の選別工程で、別の母体から得た胎児由来と識別した細胞が男児の胎児由来の細胞であることを確認した以外は、実施例１と同様に実験を行い、本発明の効果を確認した。
　３０…有核赤血球候補、３２…参照赤血球、３４…周囲、３６…探索範囲

Claims (9)

  1. 　妊娠母体から母体血を取得する採取工程と、
    　前記母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程と、
    　前記濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中の有核赤血球を、核の形状、および、４００～６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長における分光特性により、母体由来の有核赤血球と胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、
    　少なくとも前記胎児由来の有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程と、
    　前記増幅工程により増幅した少なくとも前記胎児由来の有核赤血球の増幅産物の量を確定する確定工程と、
    　確定した前記増幅産物の量と、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体の増幅産物との比較により、前記胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程と、
    　を有する胎児の染色体の検査方法。
  2. 　前記選別工程は、少なくとも前記核の形状により有核赤血球候補を選別する第１の選別工程と、前記第１の選別工程により選別された前記有核赤血球候補を、前記分光特性により選別を行う第２の選別工程と、を含む請求項１に記載の胎児の染色体の検査方法。
  3. 　前記第１の選別工程は、前記有核赤血球候補となる細胞の細胞質の面積をＣ、前記有核赤血球候補となる細胞の前記核の面積をＮ、前記有核赤血球候補となる細胞の前記核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをＬとしたとき、式１および式２を満たす有核赤血球候補を選択する工程を含む、請求項２に記載の胎児の染色体の検査方法。
    　　　０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０　　　式１
    　　　０．６５＜Ｎ／（Ｌ×Ｌ）＜０．７８５　　　式２
  4. 　前記第１の選別工程は、さらに、２つの工程からなり、第１の工程は核を有する可能性のある細胞を抽出し、第２の工程は、前記第１の工程で抽出した細胞を前記式１および前記式２により前記有核赤血球候補を選別する請求項３に記載の胎児の染色体の検査方法。
  5. 　前記分光特性が、吸光係数である請求項１から４のいずれか１項に記載の胎児の染色体の検査方法。
  6. 　前記選別工程は、前記胎児由来の有核赤血球の吸光度が前記母体由来の有核赤血球の吸光度を超える第１の光波長域の波長と、前記母体由来の有核赤血球の吸光度が前記胎児由来の有核赤血球の吸光度を超える第２の光波長域の波長とを含む、少なくとも２種類以上の各々の波長で有核赤血球の吸光度を測定する請求項５に記載の胎児の染色体の検査方法。
  7. 　前記選別工程は、前記母体由来の有核赤血球と、前記胎児由来の有核赤血球とを２種類以上の各々の波長で測定した吸光度の違いに基づいて、前記胎児由来の有核赤血球である可能性に順位をつける請求項５または６に記載の胎児の染色体の検査方法。
  8. 　前記第１の光波長域は、４５０ｎｍを超え４８０ｎｍ未満の波長域であり、前記第２の光波長域は、５５０ｎｍを超え５７５ｎｍ未満の波長域である請求項７に記載の胎児の染色体の検査方法。
  9. 　前記濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行う請求項１から８のいずれか１項に記載の胎児の染色体の検査方法。
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