JP6312835B2 - 有核赤血球の選別方法 - Google Patents

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Description

本発明は、有核赤血球の選別方法に係り、特に、細胞の形状の情報、光学的な情報および遺伝子の情報を利用して、妊娠母体の血液中の胎児由来の有核赤血球を特定する有核赤血球の選別方法に関する。
出生前診断として、従来より、羊水穿刺により羊水中の胎児細胞の染色体を調べる羊水検査が行われている。しかしながら、この方法では、流産の可能性のあることが問題として指摘されている。
一方、妊娠母体（以下、単に「母体」ともいう）の血液中に胎児細胞が移行し、この胎児細胞が母体中を血液とともに循環していることが最近わかってきた。そこで、母体血を用いて、母体血中の胎児細胞の染色体のＤＮＡ（デオキシリボ核酸：deoxyribonucleic acid）を再現性よく確実に分析することができれば、流産の可能性の少ない、羊水穿刺不要な出生前診断を実現することができることとなる。
しかしながら、母体の血液中に存在する胎児細胞（有核赤血球）は、母体血数ｍＬ（１ｍＬ＝１０−６ｍ３）中に１個程度しか存在しない。このように非常に少ない胎児細胞（有核赤血球）を確実に取得することが、母体血を利用した出生前診断を行う上で非常に大きな課題である。
このような課題に対して下記の特許文献１には、有核赤血球を濃縮する方法、例えば、密度勾配遠心分離を用いて、血漿成分、および母親の赤血球成分を取り除く技術が記載されている。また、非特許文献１、非特許文献２には、白血球の表面の蛋白質に特異的に免疫反応する抗体を用いて、磁気により母親の白血球を分離する技術（MACS法：Magnetic activated cell sorting）、胎児ヘモグロビンのγ鎖に特異的に免疫反応する抗体と蛍光色素を用いて胎児の有核赤血球を分離する技術（FACS法：Fluorescence activated cell sorting）などを用いて、母体血中の胎児細胞である有核赤血球を取得することが記載されている。
これらの方法は、血液中の胎児由来の有核赤血球の濃度を増加させ、目的の細胞を取得する確率を高めるのに有用な技術である。しかしながら、胎児由来の有核赤血球の周りには、依然として母体由来の血液細胞が存在するため、確実に短時間で胎児由来の有核赤血球を取得できていなかった。
また、光学的な情報を用いて、細胞の種類を識別し、求める細胞を取得する技術が開示されている。例えば、特許文献２には、スライドガラス上に塗布した胎児由来の有核赤血球を含む血液に、マウス胎児ヘモグロビン抗体を反応させ、次に、ビオチン接合ヤギ抗マウス抗体と反応させ、ＡＬＰ（Alkaline Phosphatase）接合ストレプトアビジンを添加し、ベクターＢＬＵＥ基質を添加し、この方法により母体由来の有核赤血球を含む母体細胞から胎児由来の有核赤血球を分離する方法が記載されている。特許文献３には、ヘモグロビンの最大吸収波長付近の４１５ｎｍの波長の光を利用して、血球種類を識別する装置が記載されている。特許文献４には、生体組織の光学的性質を利用した生体情報分析を行うことが記載されており、酸化ヘモグロビン、および還元ヘモグロビンの光の吸収の差を利用して、組織の酸素投与状態を検出する装置が記載されている。特許文献５には、血液をスライドガラスに塗布し、胎児細胞を形態により識別し、個々に胎児細胞のみを採取することを目的とする有核細胞探索自動化装置が記載されている。特許文献６には、サンプル内の生化学物質、微生物、細胞などを分析するための生化学検査装置が記載されている。
国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報 特表２００２−５１４３０４号公報 特開昭５８−１１５３４６号公報 特開２０１４−１４４８５号公報 特開２００４−２４８６１９号公報 特開２００４−３６１１５８号公報
特許文献２〜５に記載された発明は、有核赤血球を分離可能な技術として有用であるが、特許文献２は、ヘモグロビンは細胞質に存在するため、外部と細胞膜で隔てられており、胎児由来の有核赤血球が高効率で免疫反応が生じるかはわからなかった。特許文献３は、溶液中で赤血球と白血球を分離するものであるが、充分に分離を行うことができず、赤血球と白血球の混入が生じていた。特許文献４および特許文献５は、細胞の形状、光学的な情報を用いて、細胞を分離する技術であるが、母体由来および胎児由来の異なる固体由来の有核赤血球を分離することは記載されていない。したがって、依然として、胎児由来の有核赤血球を確実に分離するという課題が存在していた。また、有核赤血球を胎児由来の有核赤血球に分離するのみならず、有核赤血球の候補細胞として白血球を選択する場合もあるため、候補細胞から赤血球と白血球を分離する必要があった。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、母体血から確実に胎児由来の有核赤血球を分離することができる、有核赤血球の選別方法を提供することを目的とする。
本発明は前記目的を達成するために、細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択する候補細胞選択工程と、候補細胞を含む探索範囲を設定し、探索範囲内の白血球を選択する白血球選択工程と、候補細胞と白血球と、のヘモグロビンの分光特性の比較により、候補細胞が有核赤血球であることを確定する有核赤血球確定工程と、有核赤血球確定工程後の有核赤血球に含まれる対立遺伝子と、候補細胞選択工程で選択されなかった白血球または白血球選択工程で選択した白血球に含まれる対立遺伝子と、の比較により、有核赤血球を母体由来の有核赤血球、あるいは胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法を提供する。
本発明の有核赤血球の選別方法によれば、有核赤血球の候補細胞を選択し、この有核赤血球の候補細胞を含む範囲を探索範囲として設定し、この探索範囲内の白血球を探索し、候補細胞と白血球の比較を行うことで、候補細胞が有核赤血球であるかないかの判断を行うことができる。
従来、候補細胞として、白血球の混入を防止できないときは、候補細胞がすべて白血球由来の細胞である場合もあった。この場合、遺伝子情報を確認し、有核赤血球、特に胎児由来の有核赤血球が存在しないことが確認されると、再度、候補細胞の選別からやり直さなければならず、非効率で時間もかかっていた。
上記有核赤血球の選別方法によれば、有核赤血球確定工程により、候補細胞が有核赤血球であることを確定し、候補細胞中に白血球由来の細胞が混入していないので、より早く、より低コストで、より確実に、次の工程で胎児由来の有核赤血球を確定することができる。
また、選別工程において、有核赤血球確定工程後の有核赤血球と、選別工程以前の工程において既知である白血球と、対立遺伝子を比較する。白血球は母体由来の血液成分であるので、白血球と異なる対立遺伝子を有する有核赤血球を胎児由来の有核赤血球、白血球とほぼ等しい対立遺伝子を有する有核赤血球を母体由来の有核赤血球として選別することができる。
本発明は前記目的を達成するために、細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択する候補細胞選択工程と、候補細胞を含む探索範囲を設定し、探索範囲内の白血球を選択する白血球選択工程と、候補細胞と白血球と、のヘモグロビンの分光特性の比較により、候補細胞が有核赤血球であることを確定する有核赤血球確定工程と、有核赤血球確定工程後の有核赤血球に含まれるＹ染色体の存在の有無を確認することにより、有核赤血球を母体由来の有核赤血球、あるいは胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、を有する有核赤血球の選別方法を提供する。
本発明の有核赤血球の選別方法によれば、有核赤血球の候補細胞を選択し、この有核赤血球の候補細胞を含む範囲を探索範囲として設定し、この探索範囲内の白血球を探索し、候補細胞と白血球の比較を行うことで、候補細胞が有核赤血球であるかないかの判断を行うことができる。
また、胎児が男児である場合は、選別工程において、有核赤血球確定工程後の有核赤血球にＹ染色体の存在を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。
本発明の別の態様においては、探索範囲は、候補細胞から候補細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、白血球選択工程は、探索範囲内の白血球を選択し、選択された白血球の数により探索範囲を広げることが好ましい。
この態様は、探索範囲を設定する方法を規定したものであり、探索範囲は、候補細胞の大きさに基づいて段階的に設定することができる。探索範囲を段階的に設定し、最初に設定した探索範囲内で、所望の白血球の数を選択することができない場合は、探索範囲を段階的に広げることで、白血球の数を所望の値とすることができる。白血球の数を増やすことで、白血球の光学的な情報を平均することができるので、選別する有核赤血球との差異となる基準を平均することができ、ばらつきを抑えることができる。
本発明の別の態様においては、探索範囲は、候補細胞からの距離が最も短い白血球から順次、距離が長くなる白血球を選択し、白血球の選択数が２個以上２０個以下となる範囲であることが好ましい。
この態様は、探索範囲を設定する別の方法を規定したものであり、探索範囲は候補細胞からの距離が最も短い白血球から順次、選択することができる。白血球の数としては、２個以上２０個以下である。この範囲とすることで、白血球の光学的な情報を平均化することができ、また、白血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるのでより好ましいが、数が多くなると白血球の測定に時間がかかるので、３個以上１０個以下とすることが好ましい。
なお、「候補細胞から白血球の距離」とは、候補細胞の中心と白血球の中心との距離、または、候補細胞の重心と白血球の重心との距離のことである。
本発明の別の態様においては、分光特性は、４００〜６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長から選択される少なくとも１つの単色光における吸光度であることが好ましい。
ヘモグロビンは、４００〜６５０ｎｍの光波長域において、光の吸収を示すため、４００〜６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長における吸光度を用いることで、候補細胞が有核赤血球である場合、白血球との吸光度の差異を明確にすることができる。したがって、候補細胞を白血球と比較することで、有核赤血球であるか否かの判断を行うことができる。
本発明の別の態様においては、候補細胞選択工程は、細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の細胞核の面積をＮとしたとき、細胞の細胞質の面積に対する細胞の細胞核の面積の比率が、（１）式（式１ともいう）を満たす細胞を選択する第１の工程を含むことが好ましい。
０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ （１）
本発明の別の態様においては、候補細胞選択工程は、細胞の細胞核の面積をＮ、細胞の細胞核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをＬ、としたとき、円形の長径または楕円形の長径の長さの平方に対する細胞核の面積の比率が、（２）式（式２ともいう）を満たす細胞を選択する第２の工程を含むことが好ましい。
０．６５＜Ｎ／（Ｌ×Ｌ）＜０．７８５ （２）
上記の態様は、候補細胞選択工程における細胞の形状により、候補細胞を選択する具体的な条件を規定したものであり、（１）式は細胞の細胞質と核の面積比率、（２）式は核の円形度合いを規定したものである。上記（１）式、および（２）式の条件の核を有する細胞は赤血球である可能性が高いため、候補細胞が有核赤血球である可能性を高めることができる。
本発明の有核赤血球の選別方法によれば、細胞の形状により有核赤血球の候補となる細胞を選択し、分光特性により赤血球であることを確定した後、遺伝子情報により有核赤血球を胎児由来か母体由来かに選別している。遺伝子情報により選別する際には、白血球由来の細胞が混入していない有核赤血球を取得することが可能となるので、より早く、より低コストで、より確実性をもって、胎児由来の有核赤血球を確定することができる。
図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。 図２は、確定工程の手順を示したフローチャート図である。 図３は、候補細胞選択工程の手順を示したフローチャート図である。 図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図である。 図４Ｂは、除きたい細胞の形状を示す模式図である。 図５は、白血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。 図６は、白血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。 図７は、白血球を候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図である。 図８は、白血球を候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。 図９は、光学特性による有核赤血球確定工程の手順を示したフローチャート図である。
以下、添付図面に従って、本発明に係る有核赤血球の選別方法ついて説明する。なお、本明細書において「〜」とは、その前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
［胎児の染色体の検査方法］
本発明に係る有核赤血球の選別方法として、胎児の染色体の検査方法を用いて説明する。
図１は、胎児の染色体の検査方法の手順を示したフローチャート図である。胎児の染色体の検査方法は、妊娠母体から母体血を採取する採取工程（ステップＳ１２）と、母体血中の有核赤血球を濃縮する濃縮工程（ステップＳ１４）と、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中から、細胞の形状および核の形状、ヘモグロビンの分光特性により有核赤血球を確定する確定工程（ステップＳ１６）と、少なくとも確定工程で確定した有核赤血球の染色体の核酸を増幅する増幅工程（ステップＳ１８）と、増幅工程により増幅した増幅産物の対立遺伝子を母体由来の白血球と比較することにより、または、増幅工程により増幅した増幅産物のＹ染色体の存在の有無を確認することにより、母体由来の有核赤血球、あるいは胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程（ステップＳ２０）と、確定した増幅産物の量を、母体の染色体、または、異常がないことが既知の胎児の染色体との比較により、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する決定工程（ステップＳ２２）と、を有する。本発明の有核赤血球の選別方法は、確定工程（ステップＳ１６）、および、選別工程（ステップＳ２０）を含む。
＜採取工程（ステップＳ１２）＞
採取工程は、血液試料である母体血を採取する工程である。母体血としては、侵襲のおそれのない妊娠母体の末梢血であることが好ましい。
母体の末梢血には、母体由来の好酸球、好中球、好塩基球、単核球、リンパ球等の白血球や、核のない成熟した赤血球に加えて、母体由来の有核赤血球、そして胎児由来の有核赤血球が含まれる。胎児由来の有核赤血球は、妊娠後、６週程度から母体血中に存在するといわれている。出生前診断を行う本実施形態においては、妊娠後６週程度以降の母体の末梢血を検査する。
胎児由来の有核赤血球は、胎盤を通過して、母体の血液中に存在する赤血球前駆体である。母体が妊娠中には、胎児の赤血球は有核であり得る。この赤血球には染色体が存在するため、侵襲性が低い手段で、胎児由来の染色体および胎児遺伝子の入手が可能となる。この胎児由来の有核赤血球は、母体血中の細胞の１０６個に１個の割合で存在しているといわれており、母体の末梢血中には非常に存在確率が少ない。
＜濃縮工程（ステップＳ１４）＞
次に、濃縮工程により、採取工程で採取した母体血中の有核赤血球の濃縮を行う。濃縮工程は、密度勾配遠心分離法により行うことが好ましい。
〔密度勾配遠心分離法〕
密度勾配遠心分離法は、血液中の成分の密度の差により分離する方法であり、分離する成分の密度値を挟むように、第１の媒体および第２の媒体を選択することで、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の界面に目的の成分（本実施形態においては、胎児由来の有核赤血球）を集めることができる。そして、この第１の媒体と第２の媒体の間の界面に存在する画分を採取することで、有核赤血球が濃縮された血液を得ることができる。
具体的には、遠沈管の底部に第１の媒体を注入する工程と、第１の媒体を収めた遠沈管を冷却する工程と、遠沈管内の冷却された第１の媒体の上に第２の媒体を積層する工程と、遠沈管内の第２の媒体の上に血液試料である母体の末梢血を積層する工程と、遠沈管に収容された第１の媒体、第２の媒体および血液試料を遠心分離にかける工程と、遠心分離後の第１の媒体と第２の媒体の間の層から、胎児由来の有核赤血球を含む画分を採取する工程と、を含む方法で有核赤血球の濃縮を行うことができる。
国際公開ＷＯ２０１２／０２３２９８号公報には、胎児の有核赤血球を含めた母体の血液の密度が記載されている。その記載によると、想定される胎児由来の有核赤血球の密度は、１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度、母体の血球の密度は、赤血球が１．０７０〜１．１２０ｇ／ｍＬ程度、好酸球は１．０９０〜１．１１０ｇ／ｍＬ程度、好中球は１．０７５〜１．１００ｇ／ｍＬ程度、好塩基球が、１．０７０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、リンパ球が、１．０６０〜１．０８０ｇ／ｍＬ程度、単核球が、１．０６０〜１．０７０ｇ／ｍＬ程度である。密度の数値に関して、グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］で表される単位からＳＩ単位系への換算は容易であり、１グラム毎ミリリットル［ｇ／ｍＬ］は、１０００キログラム毎立方メートル［ｋｇ／ｍ３］である。
積層する媒体（第１の媒体および第２の媒体）の密度は、密度が１．０６５〜１．０９５ｇ／ｍＬ程度の胎児由来の有核赤血球を、母体中の他の血球成分と分離するために、設定される。胎児由来の有核赤血球の中心の密度は、１．０８０ｇ／ｍＬ程度であるため、この密度を挟む２つの異なる密度の媒体を作成し、隣接して重層することで、その界面に所望の胎児由来の有核赤血球を集めることが可能となる。第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．１０ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度は１．０６ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下として設定することが好ましい。更に好ましくは、第１の媒体の密度を１．０８ｇ／ｍＬ以上１．０９ｇ／ｍＬ以下、第２の媒体の密度を１．０６５ｇ／ｍＬ以上１．０８ｇ／ｍＬ以下である。具体的な例としては、第１の媒体の密度を１．０８５ｇ／ｍＬ、第２の媒体の密度を１．０７５ｇ／ｍＬに設定することで、血漿成分、および好酸球、単核球を、回収する所望の画分から分離することが可能となる。また、赤血球、好中球、リンパ球の一部も分離することが可能となる。本発明では、第１の媒体と、第２の媒体は同じ種類でも、異なる種類でも、本発明の効果を実現できる限りにおいて制限はないが、同じ種類の媒体を用いることが好ましい態様である。
濃縮工程で用いられる、第１の媒体および第２の媒体としては、ポリビニルピロリドンでコートされた直径１５〜３０ｎｍのケイ酸コロイド粒子分散液であるPercoll（登録商標）、ショ糖から作られた側鎖に富んだ中性の親水性ポリマーであるFicoll（登録商標）-Paque、ポリスクロースとジアトリゾ酸ナトリウムによる溶液であるHistopaque（登録商標）等の媒体を使用することができる。本実施形態では、Percoll（登録商標）、およびHistopaque（登録商標）を好ましく使用することができる。Percoll（登録商標）は、密度（比重）１．１３０の製品が市販されており、希釈することで目的とする密度（比重）の媒体を調製することが可能である。Histopaque（登録商標）は、市販されている密度１．０７７の媒体と、密度１．１１９の媒体を用いて、第１の媒体および第２の媒体を所望の密度に調製することが可能である。
〔他の濃縮方法〕
有核赤血球を濃縮する方法として、上記の密度勾配遠心分離法の他に、通常の白血球の抗原であるＣＤ４５（CD: Cluster of Differentiation）（ＣＤ分類に基づくモノクローナル抗体の分類番号）に特異的に結合する抗体を利用し、磁気効果を用いて、白血球を分離することで、有核赤血球を濃縮することもできる。
＜確定工程（ステップＳ１６）＞
確定工程は、濃縮工程により有核赤血球が濃縮された母体血中から、細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択し、この候補細胞が有核赤血球であることを確定する工程である。
濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血には、有核赤血球の他に、白血球などの他の血液成分も含まれる。他の血液成分は、濃縮工程により、母体血から除くことができるが、完全に除去することは困難である。また、単核の白血球は、下記に示す（１）式、（２）式により除くことができるが、この白血球についても完全に除去することは困難である。したがって、有核赤血球であるとして選別した細胞の遺伝子解析を行ったが、白血球由来の細胞であった場合、分析用の標本の作製からやり直す必要があり、分析が非効率である。そこで、確定工程により、有核赤血球であることを確定することで、このような場合を防ぎ、以後の分析を効率よく行うことができる。
図２は、確定工程の手順を示したフローチャート図である。確定工程は、細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択する候補細胞選択工程（ステップＳ３２）と、次の有核赤血球確定工程で候補細胞を有核赤血球と確定する際の基準となる白血球を選択する白血球選択工程（ステップＳ３４）と、候補細胞と白血球との分光特性の比較により候補細胞が有核赤血球であることを確定する有核赤血球確定工程（ステップＳ３６）と、を有する。
確定工程は、濃縮工程で濃縮された有核赤血球を含む末梢血を、透明基板、好ましくは、スライドガラス上に塗布して作製した分析用の標本を用いて行われる。
（細胞の形状の情報による選別）
≪候補細胞選択工程（ステップＳ３２）≫
確定工程は、上述した分析用の標本を用いて、まず細胞の形状の情報（以下、「細胞の形状」ともいう）により有核赤血球の候補となる有核赤血球の候補細胞を選別する。
細胞の形状による選別としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、核の円形度合い、核領域の面積、核の明度、核のつぶれ方、などを挙げることができる。なかでも、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合、および、核の円形度合いを満たす条件を有する細胞を、胎児由来の有核赤血球候補として選別することが好ましい。細胞質の面積、及び核領域の面積は、分析用の標本の観察される面における面積である。
図３は、確定工程における細胞の形状（核の形状）により選別を行う候補細胞選択工程の一例の手順を示したフローチャート図である。
細胞の形状による選別は、まず、細胞を抽出する（ステップＳ４２）。細胞であるか否かの判断は、２値化画像を用いて行われる。白色光光源を用いて分析用の標本を撮影して得られた画像の輝度情報を所定の閾値を用いて２値化画像を生成し、生成された２値化画像から点状および島状の連続領域を有するもの、すなわち、任意の閉曲線で閉じられている領域を細胞として抽出する。なお、２値化した画像は、Erosion・Dilationなどのモルフォロジー処理を施して、連続領域の形状を整えた上で、大きさを求めてもよい。
次に、ステップＳ４２で抽出した細胞を核の有無により選別する（ステップＳ４４）。核の有無は、細胞内に核（点状物）が存在するかにより決定する。核の有無の判断にも２値化画像を用いることができる。細胞として抽出された領域の中に、細胞として抽出された領域未満の面積を有する任意の閉曲線で閉じられている領域が存在する場合には、当該領域を核として抽出することができる。
次に、細胞の核の大きさ（点状および島状の連続領域の大きさ）が、１〜５μｍのものを抽出する（ステップＳ４６）。１〜５μｍの大きさの核を有する細胞を選択することは有核赤血球を選別するのに有効である。なお、「点状および島状の連続領域の大きさ」とは、核の外形を表す閉曲線を円形、又は楕円形に近似し、核の外形を近似した円形の直径、又は核の外形を近似した楕円形の長径とすることができる。
核の外形を近似した円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する円形のうち直径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した楕円形の例として、核の外形を表す閉曲線に外接する楕円形のうち長径が最小のものが挙げられる。核の外形を近似した円形の直径、または、核の外形を近似した楕円形の長径が１〜５μｍのものを抽出する。
次に、核の形状により細胞を選別する（ステップＳ４８）。図４Ａは、選択したい細胞の形状を示す模式図であり、図４Ｂは除きたい細胞の形状を示す模式図である。核の形状による選別の具体例として、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合により選別を行う第１の工程、および、核の円形度合いにより選別を行う第２の工程を有する方法を説明する。第１の工程としては、細胞質の面積に対する核領域の面積の割合が、下記（１）式を満たす場合に、細胞が有核赤血球の候補細胞として選択される。細胞の細胞質の面積をＣ、細胞の核の面積をＮとした場合、Ｃに対するＮの割合が０．２５を超え１．０未満の核を有する細胞が有核赤血球の候補細胞として選択される。
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０ （１）
また、第２の工程として、核の円形度合いの選択条件を満たす場合としては、下記（２）式を満たす場合が挙げられる。核の直径又は核の長径をＬとしたとき、核の直径又は核の長径の平方に対する核の面積の割合が０．６５を超え０．７８５未満である核を有する細胞が有核赤血球の候補細胞として選択される。なお、核の直径又は核の長径としては、ステップＳ４４で核の大きさを求めた場合と同様の方法により求めることができる。
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５ （２）
細胞の形状による選別は、ステップＳ４２〜ステップＳ４６による第１の工程で、粗ふるいし、ステップＳ４８による第２の工程で、核の形状により選別を行うことで、画像処理により選別を行う候補細胞の数を減らすことができ、候補細胞の選別を効率良く行うことができる。
形状による選別は、ステップＳ４２〜ステップＳ４８のすべての条件を満たす必要がある。ステップＳ４２〜ステップＳ４８の条件のうち、一つでも満たさないものは、候補細胞として選択されない。
細胞の形状の情報を用いて胎児由来の有核赤血球の候補になる有核赤血球を選別するシステムの構成例としては、光学顕微鏡、デジタルカメラ、スライドガラス用のステージ、光学搬送系、画像処理ＰＣ（personal computer）、制御ＰＣ、ディスプレイを装備しているシステムを挙げることができる。光学搬送系は、対物レンズとＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラを備え、画像処理ＰＣは、データ解析、データ記憶を行う処理系を備える構成が挙げられる。制御ＰＣは、スライドガラス用のステージの位置制御や、全体の処理を制御する制御系を備える構成が挙げられる。
（光学特性による選別）
光学特性による選別は、赤血球に含まれるヘモグロビンに起因する分光特性を利用することができる。候補細胞選択工程で選択した有核赤血球の候補細胞と、この候補細胞の周囲に存在する白血球と、の分光特性の差異を利用して、候補細胞が有核赤血球であることを確定する。例えば、ガラス基板上に塗布された血液成分を用いることにより、有核赤血球の候補細胞と、この候補細胞の近傍に存在する白血球との分光特性の差異を利用して、候補細胞が有核赤血球であるか確定する。
有核赤血球と、血液中の１種の有核細胞である白血球とは、ヘモグロビンの有無が異なる。光学的情報が、ヘモグロビンに起因する情報である態様が好ましく、４００〜６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長から選択される少なくとも１つの単色光における吸光度の違いに起因する情報であることが好ましい。有核赤血球は、ヘモグロビンを有するので、４００〜６５０ｎｍの光波長域において、高い吸収係数を示す。白血球は、ヘモグロビンを有さないので、これらの波長域において、吸収係数は低くなる。ここで、吸収係数とは、光がある媒質に入射したとき、その媒質がどのくらいの光を吸収するかを示す定数である。
光波長域は、更に、４００〜４５０ｎｍの光波長域、または、５２５〜５８０ｎｍの光波長域とすることが好ましい。これらの光波長域の吸収係数は、ヘモグロビンが存在することで、有核赤血球では高い値を示すため、白血球の細胞質の吸収係数との差を大きくすることができる。これにより、有核赤血球と白血球との差を明確にし、精度良く、有核赤血球であるかの見極めをすることができる。
また、各光波長域で、複数の波長で吸光度を測定し、それらの吸光度の平均値を用いて有核赤血球の判別を行うこともできる。吸光度の平均値により選別することで、吸光度の測定値に含まれるノイズの影響を低減することができる。
分光特性により、有核赤血球であることを確定する方法として、有核赤血球の候補細胞の周囲に存在する白血球と、候補細胞とを比較することで、候補細胞が有核赤血球であるか決定する。例えば、白血球を、有核赤血球の候補細胞と同じ波長の単色光で吸光度を測定し、白血球の吸光度に対する候補細胞の吸光度の比（候補細胞の吸光度／白血球の吸光度）を求める。候補細胞が有核赤血球である場合は、高い吸光度を示すので、吸光度の比は、「１」より大きくなる。また、候補細胞が白血球である場合は、候補細胞の吸光度は、白血球の吸光度にほぼ等しくなるので、吸光度の比が「１」に近くなる。したがって、複数の候補細胞において、吸光度の比を測定し、数値の大きい細胞から有核赤血球である可能性に順位をつけて遺伝子解析を行うことで、遺伝子解析を行う候補細胞が有核赤血球である可能性を高めることができる。
≪白血球選択工程（ステップＳ３４）：白血球の選択方法≫
白血球の選択は次の方法により行うことができる。図５〜８は、白血球を選択する方法を説明する図であり、図５は白血球の数に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図６は白血球の数に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。また、図７は候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する方法を説明する図であり、図８は候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する手順を示したフローチャート図である。
｛白血球の数に基づき探索範囲を設定する方法｝
図５、６は、白血球の数に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。まず、有核赤血球の候補細胞３０を決定する（図６のステップＳ７２）。有核赤血球の候補細胞３０は、先に説明したように候補細胞選択工程により決定することができる。次に、探索する白血球の数を設定する（図６のステップＳ７４）。図５には、探索する白血球を５個とした場合を説明する。次に、候補細胞３０を中心に、設定された探索する白血球の数になるまで、白血球３２を選択する（図６のステップＳ７６）。白血球３２は、候補細胞３０の中心から、白血球３２の中心までの距離Ｄが短い順に選択される。
候補細胞３０の中心は候補細胞３０の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。同様に、白血球３２の中心は、白血球３２の平面形状を円形と近似した場合の円形の中心とすることができる。以下の説明においても同様である。また、候補細胞３０の重心から、白血球３２の重心までの距離が短い順に白血球を選択してもよい。
なお、図５においては、白血球の選択数を５個で説明しているが、白血球の選択数は２個以上２０個以下であることが好ましい。白血球の選択数を上記範囲とし、複数の白血球の光学的情報を取得して平均することで、候補細胞との差異となる基準をばらつきなく決定することができる。また、白血球の選択数は、３個以上１０個以下とすることがより好ましい。白血球の数は多いほど光学的な情報を平均化することができるので、好ましいが、数が多くなると白血球の測定に時間がかかるので、上記範囲とすることが好ましい。
なお、選択する白血球３２としては、候補細胞選択工程において、核を有するが、上記式（１）、（２）を満たさない細胞を選択する。血液中に核を有する細胞としては、有核赤血球と白血球が存在するが、式（１）、（２）を満たさない細胞を選択することで、白血球である可能性を高めることができる。
｛候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する方法｝
図７、８は、候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定する方法の説明図である。かかる方法においても、白血球の数に基づき探索範囲を設定する方法と同様に、まず、有核赤血球の候補細胞３０を決定する（図８のステップＳ８２）。次に、白血球３２の探索範囲３６を設定する（図８のステップＳ８４）。図７において、探索範囲３６は実線により図示する。図７に図示した探索範囲３６は、候補細胞３０の１００細胞分（１０×１０細胞分）とする。
探索範囲３６は、有核赤血球の候補細胞３０を中心とした１辺が候補細胞３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とすることが好ましい。また、探索範囲３６は、段階的に設定しておき、探索範囲３６内に白血球が見つからない場合は、探索範囲３６を広げていくことが好ましい。例えば、探索範囲３６が、一辺が候補細胞３０の１０細胞分の正方形、または、直径が１０細胞分の円形とした場合に、白血球３２が見つからない場合は、更に、１辺が２０細胞分の正方形、または、直径が２０細胞分の円形まで探索範囲を広げて、白血球を決定することが好ましい。
次に、探索範囲３６内の白血球３２を探索し、白血球を選択する（図８のステップＳ８６）。白血球３２として選択する基準は、白血球３２の中心、または、重心が探索範囲３６内に入っているか否かで判断する。また、ここで選択する白血球についても、白血球の数に基づいて探索範囲を設定する場合と同様に、核を有するが、上記式（１）、（２）を満たさない細胞を白血球３２として選択する。
なお、白血球３２の選択数、および、探索範囲３６の面積については特に限定されず、任意に設定することが可能である。
また、白血球を選択する方法としては、図５及び図６に図示した白血球の選択数に基づき探索範囲を設定して白血球を選択する方法、図７及び図８に図示した候補細胞の面積に基づき探索範囲を設定して白血球を選択する方法を例示したが、これに限定されず、これらを組み合わせた方法で選別することも可能である。例えば、候補細胞の面積により探索範囲を決定しておき、この範囲内に含まれる白血球数が予め設定した個数を上回る場合には、すべてを測定することも可能であり、予め設定した個数を選択して測定することも可能である。選択する方法としては、上述したように、候補細胞と白血球との中心同士の距離が短いもの、または、重心同士の距離が短いものから、順次選択する。また、探索範囲内の白血球の数が、予め設定した個数を下回る場合には、下回ることが判明した時点で、探索範囲を拡大して、拡大したことにより増加した面積に含まれる白血球を検出する。この操作を、予め決められた個数の白血球が得られるまで、繰り返すことが好ましい。
≪有核赤血球確定工程（ステップＳ３６）≫
図９は、有核赤血球確定工程の手順を示したフローチャート図である。
白血球３２を選択した後、（１）有核赤血球の候補細胞３０、（２）白血球３２、（３）候補細胞３０および白血球３２の周囲３４（図５、７に破線で示す）を、選択した波長で吸光度を測定する（図９のステップＳ９２）。候補細胞３０および白血球３２の周囲３４とは、図５、７においては、対象となる候補細胞３０および白血球３２の９細胞分（３×３細胞分）の範囲である。なお、候補細胞３０および白血球３２の周囲３４内にも白血球が存在するため、周囲３４の吸光度の測定では、周囲３４内の白血球以外の領域の吸光度を測定する。
吸光度を測定後、候補細胞３０の吸光度から候補細胞３０の周囲３４の吸光度を引くことで、（４）候補細胞３０の吸光度の真値を求める。また、白血球３２の吸光度から、白血球のそれぞれの周囲３４の吸光度を引くことで、（５）白血球の吸光度の真値を求める（ステップＳ９４）。
次に、白血球３２の吸光度に対する候補細胞３０の吸光度の比を求める（ステップＳ９６）。なお、白血球３２を複数選択している場合、白血球３２の吸光度は、それぞれの白血球の吸光度の平均値とする。白血球には、ヘモグロビンが存在しないため、候補細胞３０が有核赤血球である場合、候補細胞３０の吸光度は白血球３２の吸光度より高くなり、吸光度の比は、「１」より大きくなる。また、候補細胞３０が白血球である場合、候補細胞３０の吸光度は、白血球３２の吸光度とほぼ等しくなるため、吸光度の比は、「１」に近い数値を示す。したがって、吸光度の比を求めることで、候補細胞３０が有核赤血球であるかの見極めをすることができ、有核赤血球であるか確定することができる（ステップＳ９８）。
また、吸光度の比を求め、吸光度の比が「１」より大きい候補細胞から有核赤血球である可能性が高いと順位をつけることができる。順位の高い候補細胞３０から遺伝子情報を確認することで、効率的に有核赤血球の確定、遺伝子解析を行うことができる。
また、上記では、候補細胞３０の吸光度と白血球３２の吸光度との割合（比）を求めることで、候補細胞３０が有核赤血球であるかを見極める方法を説明したが、候補細胞３０の吸光度と白血球の吸光度との差分を取ることで、有核赤血球の見極めをすることもできる。この場合、候補細胞３０の吸光度と白血球の吸光度の差分を取り、その数値の絶対値が大きい候補細胞３０は、有核赤血球である可能性が高く、その数値の絶対値が小さい候補細胞は白血球の可能性が高いとして順位をつけることができる。
以上の方法により、候補細胞を選択し、この候補細胞が有核赤血球であることを確定することができる。
＜増幅工程（ステップＳ１８）＞
増幅工程は、確定工程により有核赤血球であると確定した細胞の染色体に含まれる核酸を増幅する工程である。また、次の選別工程（ステップＳ２０）で、対立遺伝子を比較することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球であるか選別する場合は、候補細胞選択工程で選択されなかった白血球、または、白血球選択工程で選択した白血球についても染色体に含まれる核酸の増幅を行うことが好ましい。
確定工程により有核赤血球であると確定した細胞は、マイクロマニュピュレータを用いて標本から分離される。標本から分離され取得された細胞からＤＮＡを抽出して、全ゲノム増幅を行う。全ゲノム増幅は、市販のキットを用いて行うことが可能である。
本実施形態で用いる全ゲノム増幅法としては、取得した細胞から、一般的な方法である界面活性剤を用いた細胞溶解、プロテアーゼＫ等を用いたタンパク質分解工程を経ることで、細胞から溶出することにより得られたゲノムＤＮＡを用いる。
全ゲノム増幅試薬としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐolymerase chain reaction）に基づく試薬Single cell WGA kit（New England Biolabs社）、GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification kit（Sigma-Aldrich社）、ＭＡＬＢＡＣ法（Multiple Annealing and Looping-Based Amplification Cycles）（国際公開ＷＯ２０１２／１６６４２５Ａ２号公報に掲載）を用いることが出来る。また、鎖置換型ＤＮＡ合成反応に基づく試薬GenomiPhi（ＧＥヘルスケア社）、REPLI-g（QIAGEN社）も同様に用いることが出来る。本実施形態では、Single cell WGA kit（New England Biolabs社）を用いることが好ましい。
全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により増幅有無を確認することが好ましい。更に、全ゲノム増幅産物をQIAquick PCR Purification Kit（QIAGEN社）を用いて精製することが好ましい。
また、全ゲノム増幅により得られたＤＮＡの増幅産物の濃度について、NanoDrop（Thermo Fisher Scientific社）、BioAnalyzer（Agilent社）を用いて測定することが好ましい。
増幅工程においては、確定工程で有核赤血球であると確定した複数の細胞から取得した核酸を増幅することが好ましい。本実施形態においては、出生前診断の適用を想定しているため、胎児由来の有核赤血球を選別する必要がある。確定工程後においては、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球であるか、母体由来の有核赤血球であるか不明であるため、複数の有核赤血球から取得した核酸を増幅し、次の選別工程で選別することが好ましい。
＜選別工程（ステップＳ２０）＞
選別工程は、確定工程により確定した有核赤血球を、胎児由来の有核赤血球と母体由来の有核赤血球とに選別する工程である。
（遺伝子解析）
〔対立遺伝子による分析〕
増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、対立遺伝子の配列を決定することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か、母体由来の有核赤血球かの選別をすることができる。
有核赤血球であると確定し、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたＤＮＡであって、胎児由来の有核赤血球であるか、母体由来の有核赤血球であるか検査する対象となる染色体に対して、あらかじめ決定された１００〜１５０ｂｐ（base pair：ベースペア）の領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の量をシークエンサーで求める。本実施形態においては、検査する対象となる染色体は、１３番染色体であることが好ましい。胎児由来の有核赤血球は、通常、父親および母親から１組ずつの染色体を受け継いでおり、性染色体を除き、２本ずつの染色体を有している。これらの１組の染色体の対立遺伝子を分析し、父親由来の遺伝子の存在を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か母体由来の有核赤血球かを選別することができる。
父親由来の遺伝子の存在の確認は、母親由来の細胞についても同時に遺伝子解析を行い、母親由来の細胞にはない対立遺伝子が存在する場合に、この対立遺伝子が父親由来の遺伝子であると認定することができる。父親由来の遺伝子が確認された場合、その有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。母親由来の細胞は、候補細胞選択工程において、選択されなかった白血球、または、白血球選択工程において選択された標本（スライドガラス上）に存在する白血球からのＤＮＡ分析を行う。
分析する対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ（ＳＮＰｓ）：Single Nucleotide Polymorphism）、または、縦列型反復配列（ＳＴＲ：short tandem repeat）を分析することが好ましい。
胎児の遺伝子は、両親から一対ずつの遺伝子を受け継いでおり、遺伝情報は４種類の塩基の化学物質の配列で記録されている。ヒトの場合には、約３０億個の塩基があるが、１０００〜２０００個に１個の割合で、個人によって異なる配列部分が存在し、これを一塩基多型という。この一塩基多型を分析し、母体由来の細胞である白血球と比較することで、有核赤血球に一塩基多型の配列を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来であると選別することができる。
縦列型反復配列とは、ＤＮＡの中に、あるＤＮＡ配列が一つの単位となり、このＤＮＡ配列が直列に、繰り返し並んでいる領域があり、この繰り返し領域のことである。胎児は、縦列型反復配列を父親および母親から引き継ぐため、母体由来の白血球と異なる縦列型反復配列を有する有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。
〔Ｙ染色体による分析〕
胎児が男児である場合、増幅工程により全ゲノム増幅を行った後、Ｙ染色体の存在の有無を確認することで、有核赤血球が胎児由来の有核赤血球か母体由来の有核赤血球であるかを選別することができる。
Ｙ染色体は、男性にしか存在しないため、母体由来の有核赤血球には存在しない。したがって、胎児が男児である場合、Ｙ染色体の存在を確認することができれば、有核赤血球は胎児由来の有核赤血球であると選別することができる。
＜決定工程（ステップＳ２２）＞
決定工程は、選別工程により選別した胎児由来の有核赤血球のＤＮＡの増幅産物の量を比較することで、胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する工程である。
胎児由来の染色体の数的異常の存在の有無を決定する基準（あるいは参照）として、数的異常を検査する対象染色体以外の染色体を選択し、予め決定された１００〜１５０ｂｐの領域の配列を有するＤＮＡの増幅産物の増幅量をシークエンサーで求める。基準となる染色体（基準染色体）としては、胎児由来の有核赤血球の染色体の数的異常を検査する対象染色体以外の染色体の少なくとも１つを選択する態様、または、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択する態様から選ばれる。本実施形態においては、母体由来の有核赤血球であると同定された細胞に存在する染色体を選択することが好ましい。
次に、数的異常の検査の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量との比率により、胎児由来の染色体に数的異常が存在するか決定する。胎児が正常な状態であれば、数的異常を検査する胎児由来の対象染色体のＤＮＡの増幅産物の量と、基準染色体のＤＮＡの増幅産物の量とは、ほぼ、１：１の量比となると予想される。正常であれば２本である染色体が３本存在するトリソミーである数的異常である場合には、１．０：１．５（あるいは２：３）の比になると予想される。
また、決定工程に先立って、予め、複数の妊娠母体から採取した、正常な胎児を妊娠した場合の母体由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来の染色体のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布と、トリソミーの胎児を妊娠した母体の、母親由来のＤＮＡの増幅産物の量に対する胎児由来のＤＮＡの増幅産物の量の比を複数求めた結果の分布とを求め、この２つの分布が重ならない領域にカットオフ値を設定しておき、このカットオフ値と、ＤＮＡの増幅産物の量の比を比較して数的異常が存在するかどうかを決定することも可能である。この場合、ＤＮＡの増幅産物の量の比がカットオフ値以下であれば、胎児は正常であり、カットオフ値以上であれば、トリソミーである数的異常であると、検査結果を解釈することができる。
＜実施例１＞
以下に実施例を挙げ、本発明をより詳細に説明する。ただし、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
（採取工程［末梢血液試料取得工程］）
７ｍＬ採血管に抗凝固剤として、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）のナトリウム塩を１０．５ｍｇ添加した後、母体のボランティアから、インフォームドコンセントを行った後にボランティア血として末梢血７ｍＬを採血管内に得た。その後、生理食塩水を用いて、血液を希釈した。
（濃縮工程［有核赤血球の濃縮工程］）
Percoll液（登録商標）を使用して、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液を調製し、遠沈管に、遠沈管の底部に密度１．０９５ｇ／ｍＬの液２ｍｌを添加した。続けて、密度１．０９５ｇ／ｍＬの液の上に、界面が乱れないようにゆっくり、密度１．０７０ｇ／ｍＬの液２ｍＬを重層した。その後、密度１．０７０ｇ／ｍＬの媒体の上に、上記で採血した血液の希釈液１１ｍＬをゆっくり、遠沈管に添加した。その後、遠心分離を２０００ｒｐｍ（回転数毎分）で２０分間行った。その後、遠沈管を取り出し、密度１．０７０ｇ／ｍＬと、密度１．０９０ｇ／ｍＬの液の間に沈積した画分をピペットを用いて採取した。片手で第１のガラス基板を保持し、その１端にこのように採取した血液の画分を１滴置いた。もう一方の手で別のガラス基板（第２のガラス基板）を持ち、第２のガラス基板の１端を第１のガラス基板に３０度の角度で接触させ、第２のガラス基板の接触下面を血液の画分に触れると、毛管現象で２枚のガラスに囲まれた空間に広がる。次に角度を保ったまま、第２ガラス基板を第１のガラス基板の血液を置いた領域と反対の領域の方向に滑らせて、第１のガラス基板上に塗布した。その後、送風で１時間以上十分に乾燥させた。この第１のガラス基板をメイ・ギュルンワルド染色液に３分浸漬し、リン酸Buffer液に浸漬して洗浄後、ギムザ染色液（リン酸Buffer液で希釈して濃度３％とした）に１０分浸漬した。その後、純水で洗浄後乾燥させた。このようにして染色済みのガラス基板を複数枚作製した。
（確定工程）
＜候補細胞選択工程［細胞の形状に基づき選別する工程］＞
ガラス基板上に塗布した濃縮処理後の血液から、胎児由来の有核赤血球の候補となる有核赤血球を選別するため、電動二次元ステージ（以下、ＸＹステージと記載する。）と、対物レンズ、ＣＣＤカメラを備えた光学顕微鏡の測定系と、ＸＹステージ制御部、垂直方向（以下、Ｚ方向と記載する）移動機構を制御するＺ方向制御部とを備えた制御部と、画像入力部と画像処理部、およびＸＹ位置記録部とを備えた制御ユニット部を準備した。上記のように準備した、ガラス基板上に塗布した血液細胞をＸＹステージに乗せて、ガラス基板上に焦点を合わせてスキャンし、光学顕微鏡より得られた画像を取り込み、画像解析により標的細胞である有核赤血球を探索した。
画像解析は、以下の式（１）、式（２）の条件を満たす細胞を検出し、解析対象の画像に直交する二軸からなる座標系を設定し、二軸の一方をＸ軸、二軸の他方をＹ軸とした場合の、検出された細胞のＸ方向の細胞の位置、及びＹ方向の位置を記録した。
０．２５＜（Ｎ／Ｃ）＜１．０ （１）
０．６５＜（Ｎ／（Ｌ×Ｌ））＜０．７８５ （２）
ここで、Ｃは、画像解析を行う細胞の細胞質の面積（解析に用いられる画像における細胞質を表す領域の面積）、Ｎは、画像解析をおこなう細胞の核の面積（解析画像における細胞の核を表す領域の面積）、Ｌは、画像解析する細胞の核の長径又は直径（解析画像における細胞の核を表す領域を楕円形に近似した際の楕円形の長径、又は解析画像における細胞の核を表す領域を円形に近似した際の円形の直径）、即ち、複雑な形をした細胞核に外接する楕円形の長径または円形の直径と定義する。これら（１）、（２）を満たすスライドガラス基板上に存在する胎児由来の有核赤血球の候補となる候補細胞を選択した。
＜白血球選択工程、有核赤血球確定工程［光学特性に基づき有核赤血球を選別する工程］＞
形状の情報により選択された候補細胞の１０個について、顕微分光装置を用いて、光学特性の解析を行った。スライドガラス基板上の有核赤血球の候補細胞１０個を特定し、そのうちの１つの有核赤血球に対して、波長が４１５ｎｍの単色光を照射し、吸光度１を測定した。次に、その候補細胞の近傍位置にある核の形状が上記式（２）を満たさない白血球について、当該候補細胞からの距離の短い順に白血球を５個選択し、同様にして一つ一つの白血球に対して、波長が４１５ｎｍの単色光を照射し、吸光度を測定し、その平均を吸光度２として求めた。
同様の方法で、ガラス基板上の候補細胞の残りの９個の細胞に対しても同様に吸光度１を測定し、それぞれの候補細胞の近傍位置にある白血球５個に対して、吸光度を測定し、その平均値を算出し、吸光度２とした。
この計算結果から、吸光度２に対する吸光度１（吸光度１／吸光度２）の比を求め、吸光度の比が１以上となる細胞を抽出した結果、明らかに１以上である細胞が６個検出された。白血球はヘモグロビンが存在しないため、候補細胞が赤血球である場合、吸光度の比を求めることで、数値が高くなる。したがって、吸光度の比を求め、明らかに値が１以上である候補細胞は有核赤血球であると確定することができる。
（細胞単離工程）
上記工程で検出された、吸光度の比が１以上となる細胞６個を、マイクロマニュピュレータを使用して回収した。
（増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］）
マイクロマニュピュレータを使用して回収した６個の細胞について、New England Biolabs社製Single Cell WGA kitを用いて全ゲノム増幅を行い、説明書記載に則り細胞中の微量なＤＮＡを約１００万倍に増幅した。
（選別工程［母体由来または胎児由来の確定工程］）
各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、ILLUMINA社製ゲノムアナライザーMiseqを用いて、13番染色体のC1QTNF9B遺伝子領域、PCDH9遺伝子領域、BRCA2遺伝子領域、MTRF1遺伝子領域のＳＮＰ（SNP ID：rs3751355、rs1799955、rs2297555、rs9571740）を比較することで、６個の細胞のうち、１個の細胞が異なるＳＮＰ情報を有することが確認できた。別途、白血球選択工程で選択した細胞をマイクロマニュピュレータで回収し、有核赤血球であると確定した６細胞と同様にしてＤＮＡを増幅し、ＳＮＰを調べたところ、５個の細胞のＳＮＰと一致することが確認された。以上より、有核赤血球であると確定した６個の細胞のうち、１個の細胞が胎児由来の有核赤血球であり、５個の細胞が、母体由来の有核赤血球であることが確認された。
＜実施例２＞
実施例１で採血した母体とは別の母体から、末梢血を採血し、実施例１と同様にして、有核赤血球選別工程において５個の細胞を回収し、増幅工程［ＤＮＡ増幅工程］まで同様に行った。その後、各細胞から増幅した全ゲノム増幅産物を等分割してその一方を用いて、選別工程を行った。
（選別工程）
Ｙ染色体のsex-determining factor(SRY)遺伝子領域で作製したPCRプライマーを用いてタカラバイオ社製Multiplex PCR Assay Kitを用いてPCRを行い、Y染色体のPCR増幅物の有無を一般的なアガロースゲル電気泳動法で確認したところ、１つの細胞に対してＹ染色体由来の情報が検出された。この細胞が胎児由来であり、しかも男児であることが確認できた。他の４個の細胞はＹ染色体由来の情報が観察されず、母体由来の有核赤血球であると認識された。
３０…候補細胞、３２…白血球、３４…周囲、３６…探索範囲

Claims (6)

  1. 細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択する候補細胞選択工程と、
    前記候補細胞を含む探索範囲を設定し、前記探索範囲内の白血球を選択する白血球選択工程と、
    前記候補細胞と前記白血球と、のヘモグロビンの分光特性の比較により、前記候補細胞が有核赤血球であることを確定する有核赤血球確定工程と、
    前記有核赤血球確定工程後の有核赤血球に含まれる対立遺伝子と、前記候補細胞選択工程で選択されなかった白血球または前記白血球選択工程で選択した白血球に含まれる対立遺伝子と、の比較により、前記有核赤血球を母体由来の有核赤血球、あるいは胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、を有し、
    前記探索範囲は、前記候補細胞から前記候補細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、
    前記白血球選択工程は、前記探索範囲内の前記白血球を選択し、
    選択された白血球の数により前記探索範囲を広げる、有核赤血球の選別方法。
  2. 細胞の形状により有核赤血球の候補細胞を選択する候補細胞選択工程と、
    前記候補細胞を含む探索範囲を設定し、前記探索範囲内の白血球を選択する白血球選択工程と、
    前記候補細胞と前記白血球と、のヘモグロビンの分光特性の比較により、前記候補細胞が有核赤血球であることを確定する有核赤血球確定工程と、
    前記有核赤血球確定工程後の有核赤血球に含まれるＹ染色体の存在の有無を確認することにより、前記有核赤血球を母体由来の有核赤血球、あるいは胎児由来の有核赤血球に選別する選別工程と、を有し、
    前記探索範囲は、前記候補細胞から前記候補細胞の大きさに基づいて段階的に設定した範囲であり、
    前記白血球選択工程は、前記探索範囲内の前記白血球を選択し、
    選択された白血球の数により前記探索範囲を広げる、有核赤血球の選別方法。
  3. 前記探索範囲は、前記候補細胞からの距離が最も短い白血球から順次、前記距離が長くなる白血球を選択し、
    前記白血球の選択数が２個以上２０個以下となる範囲である請求項１または２に記載の有核赤血球の選別方法。
  4. 前記分光特性は、４００〜６５０ｎｍの光波長域に含まれる波長から選択される少なくとも１つの単色光における吸光度である請求項１から３のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
  5. 前記候補細胞選択工程は、前記細胞の細胞質の面積をＣ、前記細胞の細胞核の面積をＮとしたとき、前記細胞の細胞質の面積に対する前記細胞の細胞核の面積の比率が、式１を満たす細胞を選択する第１の工程を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
    ０．２５＜Ｎ／Ｃ＜１．０ 式１
  6. 前記候補細胞選択工程は、前記細胞の細胞核の面積をＮ、前記細胞の細胞核に外接する円形の直径の長さまたは楕円形の長径の長さをＬ、としたとき、前記円形の直径または前記楕円形の長径の長さの平方に対する前記細胞核の面積の比率が、式２を満たす細胞を選択する第２の工程を含む請求項１から５のいずれか１項に記載の有核赤血球の選別方法。
    ０．６５＜Ｎ／（Ｌ×Ｌ）＜０．７８５ 式２
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